Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

On tarpeen täydentää tai syrjäyttää perinteisiä diagnostisia työkaluja, nimittäin cystoscopy ja B-tyypin ultraääni, virtsarakon syövän (BC). Meidän tavoitteena oli tunnistaa uusia DNA metylaatio merkkiaineita BC kautta genominlaajuisten profilointi BC solulinjojen ja myöhemmät metylaatiospesifistä PCR (MSP) seulonta kliinisten virtsanäytteitä.

Experimental Suunnittelu

metyyli -DNA sitova alue (MBD) kaapata tekniikkaa, methylCap /seuraavat, suoritettiin seuloa tietyn hypermetyloitunut CpG saaret kaksi BC solulinjoissa (5637 ja T24). Top sata hypermetyloitunut tavoitteet peräkkäin seulottiin MSP virtsanäytteistä vähitellen kaventaa kohdenumero ja optimoida kokoonpano diagnostisten paneelin. Diagnostinen suorituskyky saatu paneelin arvioitiin eri kliinisissä tilanteissa.

Tulokset

Yhteensä 1627 hypermetyloitunut promoottorin tavoitteet BC solulinjoissa tunnistettiin Illumina sekvensoinnilla. Top 104 hypermetyloitunut tavoitteita alennettiin kahdeksaan geenejä (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20, ja LMX1A) jälkeen virtsan DNA seulonta pienen otoksen koko 8 normaalin valvonnan ja 18 BC aiheita. Validation itsenäisessä näyte 212 BC potilaiden käytössä optimointi viiden metylaation tavoitteita, mukaan lukien VAX1, KCNV1, TAL1, PPOX1, ja CFTR, joka saatiin edellisessä tutkimuksessa, BC diagnoosi herkkyydellä ja spesifisyys 88,68% ja 87,25 %, vastaavasti. Lisäksi metyloinnin VAX1 ja LMX1A todettiin liittyvän BC toistuminen.

Johtopäätökset

tunnistaneet lupaava diagnostinen markkeripaneelin varhaisen ei-invasiivisia tunnistus ja myöhemmin BC valvontaa.

Citation: Zhao Y, Guo S, Sun J, Huang Z, Zhu T, Zhang H, et al. (2012) Methylcap-Seq paljastaa Novel DNA Metylointi Markers varten diagnoosi ja uusiutuminen ennustaminen Virtsarakon syövän kiinalaisessa väestöstä. PLoS ONE 7 (4): e35175. doi: 10,1371 /journal.pone.0035175

Editor: Angela H. Ting, Cleveland Clinic Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 tammikuu 2012; Hyväksytty 9 maaliskuuta 2012 Julkaistu: 17 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science Foundation avustukset (30872963); valtion Key Laboratory of Onkogeenit ja liittyvät geenit Foundation (91-11-01); Lääkintäopas projekti Science and Technology komissio Shanghai (114119a4100); Shanghai Science Foundation avustukset (09ZR1429900); ja Shanghai Cancer Institute, Master tohtorin Foundation (SB09-07). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä (BC) on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien sairastuvuutta ja kuolleisuutta ja kuudes yleisin syöpä maailmassa [1]. Kiinassa, esiintyvyys BC jatkaa nousuaan [2]. BC esiintyvyys lisääntyy iän; keski-ikä aikaan diagnoosi on noin 60 vuotta, ja se on 3 kertaa yleisempää miehillä kuin naisilla [3]. Tupakointi ja altistuminen karsinogeeneille on todettu riskitekijöitä [4]. Noin 75-80% uusista BC tapauksia esiintyy pinnallinen tai karsinooma

in situ

vaurioita, kun taas loput 20-25% läsnä kehittyneempää tautien, joissa on huono ennuste. Kuitenkin jopa pinnallinen kasvaimet, vain 20% on parannettavissa. Noin 60-70%: lla potilaista uusiutumisen 5 vuoden kuluessa, ja 10-20% kasvaimista etenee entistä aggressiivinen tauti [5], mikä edellyttää usein seuranta tauti uusiutuu [6]. Kystoskopia on yleisin diagnostinen BC menettely, ja se osoittaa suurta herkkyyttä (SN) ja spesifisyys (SP). Kuitenkin cystoscopy vaatii suurta operaattori taitoa, ja invasiivisia luonnetta kystoskopian alentaa arvoa seulontatyökaluna. Muita optimaaliset tarvitaan menetelmiä varhaisen, ei-invasiivisia havaitseminen ja valvonta BC.

epigeneettiset puoli genomin yhdistää genotyyppi yksittäisen ympäristön vaikutuksista, jotka vaikuttavat periytyviä geenin transkription kuvio ja Näin ollen vaikuttaa solun fenotyypin tutkimisen [7]. Sääntelyä epigeneettinen taso on kriittinen kehittämistä varten korkeammissa eukaryooteissa [8], ja poikkeuksellisesta säätelystä voi suoraan ja /tai epäsuorasti vaikuttaa geneettinen eheys ja geeniekspressiomalli solujen, jolloin kehitys erilaisten häiriöiden, mukaan lukien syövän [ ,,,0],9]. Paikallinen hypermetylaatiota kasvaimen synnyssä [10] ja maailmanlaajuinen hypometylaatio genomisen DNA: n [11], [12], [13], esiintyy usein ihmisen syövissä, [14], [15]. Viimeaikaiset edistysaskeleet ovat osoittaneet, että epänormaali hypermetylaatiota kasvaimen synnyssä on syntymässä biomarkkeri syövän diagnoosissa ja prognoosissa. BC, useat metyloituja geenejä on tunnistettu, ja niiden rooli virtsan merkkiaineita on myös arvioitu [16]. Nämä tutkimukset ovat selvästi osoittaneet etuja käyttämällä useita geenin hypermetylaation analysoi kudosten ja virtsanäytteet hankkia ja ennustavia tietoa. Esimerkiksi edellisessä tutkimuksessa, tunnistimme paneeli 11 metyloituneiden geenien voitaisiin käyttää virtsa-pohjainen merkkiaineita BC seulontaan; kuitenkin, tämä paneeli oli rajoituksia. Geeni numero paneelissa oli liian suuri kätevä kliinisiä testejä, ja spesifisyys oli riittämätön [17]. Tehostaa diagnoosin ja tunnistaa geeni tavoitteet, jotka voivat ennustaa uusiutuvan tai etenevän, on välttämätöntä löytää uusia tavoitteita ja vahvistamaan niiden kliinistä arvoa suuressa kohortissa. Kuitenkin tähän mennessä harvat BC tutkimuksissa on käytetty genominen mittakaavan high-throughput lähestymistapa seulomiseksi differentiaalisesti metyloituneiden geenien [18], [19]

MethylCap-kohdat on äskettäin kehitetty tekniikka genominlaajuisten profilointi DNA: n metylaatio; Tämä tekniikka koostuu syömällä metyloitua DNA-fragmentit niiden metyyli-CpG sitovaa domeenia (MBDs) ja myöhemmin syvä sekvensointi eluoitunut DNA. Suolaisen gradienttieluointi luokittelee genomin fraktioiksi eri metyloinnin valtioissa. Profiileja tällä tavalla saatu annettava yksityiskohtainen genomin laajuinen kartta metyloitujen alueiden ja voidaan havaita DNA: n metylaation eri genomialuetta [20].

genominen konteksti määritellään ne, jotka esiintyvät UCSC tietokantaan. Esillä ero metylointi alue (DMR) jakeluun BCC ja BM: (A) yleinen jakelu; (B) jakautuminen refGene; (C) jakelu sekä refGene ja CGI.

Tässä tutkimuksessa ensin palveluksessa MBD MethylCap-seq saada kokonaiskuva metylaatio profiilia BC solulinjojen (BCC), jota uskotaan antavat tietoa koskien BC-erityisiä poikkeava metylaatio. Tämän jälkeen DNA virtsasta BC potilaista seulottiin top 100 hypermetyloitunut tauluja BCC tunnistaa BC-erityisiä metylaatiokohtia. Tämä määrä vähitellen pieneni, ja merkitsin laatu parani seulontaprosessin aikana vaiheet. Lopuksi saimme uutta vianmäärityssignaalisarjan DNA: n metylaatio markkereita, joita voidaan käyttää aikaisin, ei-invasiivisia havaitseminen ja valvonta BC.

Materiaalit ja menetelmät

Patient ja kontrollinäyte kokoelma

tietoisen suostumuksen ja hyväksynnän Medical Institutional Review Board of Zhongshan sairaala, Fudanin yliopiston virtsanäytteitä kerättiin 212 potilasta, joilla on vahvistettu BC diagnoosi, 41 potilaalla noncancerous virtsateiden vaurioita sairaalaan samana ajanjaksona, ja 149 normaalia valvontaa. Joukko pariksi mitätöidään virtsanäytteistä kerätään myös 21 BC potilaiden ennen ja jälkeen leikkauksen, jotka sisälsivät höyläysleikkaus virtsarakon syövän plus rakkoon kemoterapiaa (TURBC + IC). Lisäksi, toinen ryhmä 48 virtsanäytteet kerättiin potilailta voimakkaasti, jolla epäillään olevan pahanlaatuinen virtsarakon kasvain. Kaikki BC potilaiden ja verrokkien tuli kaksi sairaalaa: urologian osaston Zhongshan sairaala, Shanghai, Kiina ja nro 2 Shimen Street Community Health Center, Jingan District, Shanghai. Näytteet kerättiin vuosien 2006 ja 2009. kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) lavastus /luokitus BC potilaan näytteissä määritettiin American sekakomitean Cancer suuntaviivat [21] (taulukko 1). Näytteet (50 ml tuoretta virtsassa) sentrifugoitiin nopeudella 3000 rpm 10 minuutin ajan. Sitten supernatantti dekantoitiin ja pelletti pestiin kerran 1 x fosfaattipuskurisuolaliuosta (PBS), ja ne pakastettiin välittömästi -80 ° C: ssa.

Wig-kuva UCSC tietokanta on vasemmalla, ja BSP tulos jossa vähintään 5 kloonia sekvensoitiin kullekin paikka on oikealla. Musta ympyrä ilmaisee metyloituja C CpG yhteydessä; valkoinen ympyrä ilmaisee metyloitumattomia C CpG yhteydessä.

Solulinjat ja normaalin virtsarakon limakalvon kudos

Kaksi BCC, T24 (ATCC nro: HTB-4) ja 5637 (ATCC nro : HTB-9), hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin, kunnes ne saavuttivat tukin vaihe L-DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa 5 % CO

2 kostutetussa inkubaattorissa. Solut kerättiin kaapimalla, ja solupelletit huuhdeltiin kahdesti 1 x PBS: llä. Kaksi normaalia virtsarakon limakalvon kudoksissa (PU1 ja BM2) saatiin terveiltä elinten luovuttajia. Taloudellisista syistä, nämä kaksi BCC yhdistettiin rakentaa BCC kirjasto, samoin kuin kaksi BM näytettä. Tällä tavoin voisimme hankkia kaikki metylaation tiedot kustakin 2 näytettä.

MBD methylCap-seuraavissa tietoja käytetään valitsemaan geenejä differentiaalisesti hypermetyloitunut virtsarakon syöpään. Näyte numero kuvassa viittaa, että seulonnan prosessia. Metylaatiostatuksen kohdegeenin seulottiin näytteitä eri kokoja. Tässä vaiheessa, näytteiden lukumäärä kasvoi progressiivisesti, kun taas määrä geenejä vähitellen pieneni.

MBD-methylCap-sekvensointi

DNA: n valmistus jäädytetystä kudoksia ja solulinjoja muodostettiin tavanomaisella proteinaasi K /orgaaninen uuttamismenettelyssä kuten aikaisemmin on kuvattu [22]. Yhtä suuret määrät DNA: ta 5637 ja T24-solut muodostavat yhdessä BCC-kirjasto, ja yhtä suuret määrät DNA: ta BM1 ja BM2 solut yhdistettiin BM-kirjasto. 1,5 ml: n sentrifugiputkiin, 1,5 ug yhdistettyä DNA-näytteitä (BCC tai BM) 100 ul: aan TE-puskuria sonikoitiin, jolloin saatiin haluttu kokoalue (200-300 bp). End-korjaus, adenosiini emäsadditiosuoloja ja sovitin ligaatio vaiheet suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23].

kaupallinen MethylMiner ™ Metyloitu DNA Enrichment Kit (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) käytetään valitsemaan metyloitu DNA sekvensointi. Kullekin ryhmälle, 1,2 ug käsitellyn DNA prosessoitiin valmistajan protokollaa. Sen jälkeen kun NaCl gradienttieluointi, keräsimme lopullinen kaksi fraktiota erittäin metyloitua DNA: ta, mikä vastasi 1 M ja 2 M NaCl pitoisuuksia. Piikki-DNA ohjaus toimittama kit käytettiin varmistamaan tarkkuuden määritys. Talteen DNA (nanogrammoina alue) kvantifioitiin Qubit ™ (Invitrogen), ja 12 sykliä PCR-monistus suoritettiin saamiseksi riittävästi materiaalia (siinä mikrogramman välillä) syvälle sekvensointia. Lopuksi, 1 ug PCR-tuotetta levitettiin Genome Analyzer II (Illumina, Inc., San Diego, CA) tuottaa 75 bp pitkä parittomia lukee. PCR kaksoiskappaleet poistettiin analyysistä. Käytimme BWA kohdistustyökalut oletusasetuksilla kartoittaa näitä lukee, että hg19 ihmisen genomin viite kokoonpano (UCSC) [24]. Seuraavaksi huiput (hypermetyloitunut alueet) tunnistettiin käyttämällä MACS ohjelmistoa [25], ja ihmisen CpG-saarekkeiden (CGI) on ladattu UCSC tietokannasta. Genominen metylaatio profiili syntyy ladattiin julkiseen tietokantaan (Gene Expression Omnibus: GSE 33839)

MSP ja BSP

Bisulfiittikonversio ja PCR-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22] . Bisulfiitti sekvensointi PCR (BSP) ja metylaatiospesifinen PCR (MSP) alukeparia suunniteltiin avustuksella asianmukaiset online-ohjelmisto (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html; taulukko S1, Taulukko S2). MSP tuotteet kloonattiin ja varmistettiin sekvensoimalla.

in vitro

metyloituja DNA 5637 ja T24-solujen, jotka on saatu CpG-metyylitransferaasi M. Sss I (NEB) ja käytettiin positiivisena kontrollina. Vettä käytettiin ei-mallin valvontaa. Bisulfiitti sekvensointi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17], ja PCR-amplikonit geelipuhdistettiin ja kloonattiin pBS-T-II-vektoriin (TianGen sis., Peking, Kiina). Vähintään 5 kloonia erikseen sekvensoitiin varmistua metylaation kohdennettujen lokuksen. BSP metylaatio prosenttiosuus laskettiin määrä metyloitua sytosiinien jaettuna kokonaismäärä sytosiinien kaikissa amplikoneista analysoitu.

Tilastot

Suurin tilastollinen päätepisteet Tässä Tutkimuksessa verrattiin metylointi tilat geenien ajatellaan liittyvän BC ja niiden kliiniset muuttujia ohjaus ja syöpäpotilailla. Läsnäolon tai puuttumisen metylaation käyttäen MSP arvioitiin määrittämiseksi assosiaatioita metylaatiostatus ja syövän tai sen kliinisten muuttujien avulla ristiintaulukointeja ja sopivaa χ

2 tai Fisherin t-testejä. Yhdistyksen BC toistumisen geenien metylointi ja kliinisen muuttujia arvioitiin avulla yksi- ja monimuuttuja logistinen-regressioanalyyseilla. Lopputulos valittu seurantaa analyysi oli kumulatiivinen vaara uusiutumisen, joka määriteltiin aika BC diagnoosista päivämäärä kasvaimen uusiutumisen. Uni- ja monimuuttuja Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin vaikutusten arvioimiseksi geenin metylaation ja muiden kliinisten muuttujien taudin uusiutumisen. Kumulatiivinen toistuminen vaara käyrä muodostettiin Kaplan-Meier menetelmällä ja tarkistaa log-rank-testi. Kaikki tilastolliset laskelmat tehtiin käyttäen SPSS 13.0 ohjelmisto tilastopaketista (SPSS Inc., Chicago, IL). Kaksipuolinen P-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

useita muuttujan logistista regressiota suoritettiin käyttämällä metylaation datan 9 geenien arvioida suhdetta geenin metylaatio ja kliinis ominaisuudet BC. Yksityiskohdat on kuvattu tekstissä. * P 0,05.

Tulokset

Perimän metylaatio profilointiin BCC ja BM kirjastot paljasti ominaisuus metylaatiovyöhykkeiden BC

profiloitu genomi- laaja DNA metylaatiotilan BCC ja BM kirjastot tuottamalla MBD-methylCap rikastettua DNA-kirjastoja. MBD fraktiolla tehtiin korkean suoritustehon sekvensointi käyttäen Illumina Genome Analyzer II kattavien metylaatio karttoja. Käsitteellisesti hypermetyloitunut DNA-fragmentit rikastettiin aikana kirjaston rakentamisen; siksi, hankitun sekvensointi lukee vastaamaan hypermetyloitunut alueiden genomissa. Syvä sekvensointi valmis BCC ja BM kirjastoista tuotettiin noin 6.000.000 lukee (75 emästä /lue) kunkin kirjaston, jotka olivat peräisin noin 470000000 emästä (taulukko S3). Tämä määrä sekvensointi pohjat voivat kattaa genomisen CGI noin 10 kertaa syvyys. Siten tietokokonaisuuksien tarjosi genominlaajuisten tiedot.

Kun nämä lukee kartoitettiin genomiin, epätasainen jakautuminen muodostuu piikkejä, jotka edustavat hypermetyloitunut genomin alueita. Kaikkiaan saimme 210051 huiput (keskipituus Piikkien: 778 emäsparia) että BCC ja 229538 huiput (keskipituus Piikkien: 659 emäsparia) että BM (

P

0,001, MACS2.0; Taulukko S3).

Voit hankkia suhteellisen metylaatio tiedot, vertasimme huiput välillä BCC ja BM. Lähes kaksi kolmasosaa kaikista huiput olivat yleisiä kahden kirjastojen, ja me huomiotta niitä tähän analyysiin. Jäljellä oleva kolmannes huiput olivat ainutlaatuisia joko BCC tai BM, jota kutsutaan differentiaalisesti-metyloitua aluetta (DMRs), jotka ovat suhteellisen korkea metylaatiostatuksen genomisen alueiden verrattuna sen vastine. Saimme 70432 ja 83690 DMRs että BCC ja BM, vastaavasti (taulukko S3, kuva 1 A). Tämä suuri määrä DMR oli hajallaan sisällä eri genomista yhteyksissä, ja olemme analysoineet yhdistys DMR kanssa eri genomista yhteyksissä. RefGene liittyvä DMR oli 55237 ja 45522, että BCC ja BM, vastaavasti, mikä osoittaa suurin piirtein tasapainossa jakauma molemmissa kirjastoissa (taulukko S3, kuvio 1 B). Kuitenkin, kun DMRs sisällä CGI tutkittiin, olemme huomanneet, että BCC: t säilytetään 21179 DMRs, kun BM säilytetään vain 1945; tämä merkitsee kymmenkertaista ero. Kun DMRs, että tapahtunut CGI on refGene tutkittiin, yhteyskeskuksien ja BM sisälsi 4256 ja 201 DMRs kunkin kirjaston, vastaavasti. Lopuksi kun promoottori osallistuminen laskettiin, 1627 ja 66 DMRs liittyi tällä alueella on BCC ja BM, vastaavasti (taulukko S3, kuvio 1 C). Yhdessä poikkeava hypermetylaation esiintyi useammin CGI ja promoottori alueilla BCC. Seuraavat tutkimukset metylaation merkki valinta keskittynyt BCC promoottorit.

validointi erillisen BCC metylaatio profiilin käyttäen bisulfiitti sekvensointia

Varmista, että kirjaston tarkasti heijastanut todellinen metylaatiostatuksen tutkittavalla materiaalilla valitsimme 24 eri hypermetyloitunut tavoitteita bisulfiitin sekvensointia tarkastusta. Näistä 22 tavoitteet hajallaan sisällä 1627 promoottori liittyvät DMRs että BCC, joista 17 ylhäältä 100 tavoitteet ja 5 päässä 100 1627 alue; muut 2 tavoitteet olivat 66 DMRs että BM. On rohkaisevaa, joukossa 24 tavoitteet tarkastetaan, BSP tulokset 23 geenit olivat erittäin yhdenmukaisia ​​metylaation tiedot hankittu kirjastossa (edustaja tulos on esitetty kuviossa 2, taulukko S4), mikä viittaa siihen, että BCC ja BM kirjastot olivat erittäin luotettava metylaation tietoja. Voidaan arvioida kirjaston epäillä kliinisten diagnostisten tavoitteet, etsimme metylointi tiedot tavoitteiden tunnistettu edellisessä työssä näillä kahdella kirjastot [17]. Noin 90% (19/21) ja näitä tavoitteita hypermetyloitunut BCC-kirjaston (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi olemme myös tutkineet BC-spesifisten raportoitu muiden [19], [26]. Kahdeksan 9 tavoitteet sijaitsee meidän BCC kirjaston hypermetylaation loci. Yhdessä esillä BCC ja BM kirjastot tarjotaan ääntä hypermetylaation tietoja suhteen BC tila.

MSP seulonta pienen kohortin virtsanäytteitä mahdollisia biomarkkereita syntyy 8 geenikohteet

Esitetty kanssa suuri poikkeava metylaatio antamat tiedot methyCap-kohdat, tarvitsimme menetelmä suodattaa BCC metylointituloksia tunnistaa toteutettavissa BC markkereita. Me hyväksyi strategian alkaa seulontamenettely, jossa on suuri määrä tavoitteita muutamia näytteitä ja vähentämällä asteittain tavoitteet kasvun kanssa näytteissä (kuvio 3). Kun alistetaan MSP rajoituksia, vain ylin 104 1627 hypermetyloitunut edistäjiä BCC seulottiin virtsassa DNA-näytteiden 8 normaalin valvonnan (BNS); sama BCC ja BM käytettyjen näytteiden MethylCap-seq osan tutkimuksessa otettiin mukaan kontrolleina. Näissä olosuhteissa vain tavoitteet, jotka osoittivat metylaatio ainakin toinen BCC, mutta ei yli 2 8 BN eteni seuraavaan seulontaan (edustaja MSP tulos on esitetty kuviossa S1). Koska he eivät täytä näitä kriteerejä, 55 tavoitteet poistettiin ensimmäisen kierroksen seulonta. Neljäkymmentäyhdeksän tavoitteet eteni toiselle kierrokselle virtsan DNA seulonta ylimääräisestä 8 BNs ja 18 BC potilasta. Valitsimme tavoitteet, jotka osoittivat metylaatio vähintään 3 18 BC näytteet, mutta 0 tai 1 8 BN näytteitä. Tässä vaiheessa, 8 geenit (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20, ja LMX) täytti ja valittiin niiden mahdollisten syrjiä eKr BN (kuva 3).

Assessment diagnostisen arvon 8 tavoitteiden suuren ikäluokan

Jotta potentiaalia BC Ehdokaskohteiden oli arvioida luotettavasti, me seulotaan 8 ehdokkaat itsenäisen testissä kohortin, jossa on suuri otoskoko. Saimme virtsanäytteiden suuren ikäluokan (n = 402), jotka sisältyvät 212 BC potilasta, 149 normaali valvonta, ja 41 potilasta, joilla noncancerous virtsan vaurioita.

metylaatio taajuus 8 Uusien geenien virtsaan DNA BC potilasta (212 tapausta) vaihteli 9,43%: sta 42,45%, kun taas metylointi taajuus terveillä (149 tapausta) vaihteli 1,34%: sta 6,04%. Kaikki 8 tavoitteita oli merkitsevä ero kasvainten ja normaalin valvonnan (

P

0,0001), joka suotuisasti väitti niiden mahdollista käyttöä diagnostisina markkereita (taulukko 2).

erottamaan kasvain erityisiä metylaatio mahdollisista metylaatio liittyy hyvänlaatuinen sairaus, 41 noncancerous virtsan leesioita mukana tutkimuksessamme (taulukot 1 ja 2). Metylointi taajuus 8 geenien tässä potilasryhmässä vaihteli 0,00%: sta 12,19%, tukee käsitystä, että alkuperä hypermetylaation oli enemmän sidoksissa kasvaimia kuin hyvänlaatuinen tauti (

P

0,04; Taulukko 2). Siksi nämä 8 tavoitteet saattavat olla markkereita kliinisen havaitsemiseksi BC ja erottaa BC normaaleista valvontaa ja hyvänlaatuisia virtsan vaurioita.

Koska heterogeenisen luonteen kasvain metylaation, yksittäinen metyloitu markkeri eivät pysty antamaan riittävää SN ja SP kasvaimen diagnosoinnissa [27]. Siksi yhdistämällä joukko geenejä kuin paneeli oli vaihtoehtona [28]. Kun pinta-ala (AUC) kuin tuomio diagnostisten kyky, yhdistelmä 4 geenien (VAX1, KCNV1, TAL1, PROX1) valittiin muodostamaan diagnostinen paneeli, joka osoitti SN on 76,89% ja SP 88.59% (Taulukko S5).

entisestään parantamaan diagnostista potentiaalia tämän paneelin, lisäsimme CFTR ja SALL3, kahdessa ylimmässä BC tavoitteet aikaisemmista työstä [17], jotka myös sijaitsevat 1627 promoottorit liittyvät DMRs että BCC. CFTR näytteillä kunnon potentiaali diagnosoinnissa BC, jossa SN ja SP 52.36% ja 96,64%, vastaavasti (taulukko 2). Kuitenkin, SALL3 ei antanut hyvän SP suuri-kohortti arviointi ja näin ollen poistettiin (tuloksia ei ole esitetty). Lopuksi 5-geeni paneeli (VAX1, KCNV1, TAL1, PROX1 ja CFTR) hyväksyttiin joka paljastui diagnostinen tehokkuus, jossa on SN, SP, positiivinen ennustearvo (PPV), ja negatiivinen ennustearvo (NPV) 88,68%, 87,25% , 90,82%, ja 84,42%, vastaavasti (taulukko 2). Samanlainen Tulokset myös obtaind on itsenäinen pieni kohortin validointi analyysi koostui 24 BC ja 22 ohjaa (tuloksia ei ole esitetty).

diagnostinen kyky viiden geenin paneeli on verrattavissa kystoskopian

suorituskyky viisi tavoitetta arvioinnissa epäillään kliinisen potilaita on kriittinen. Siksi käytimme MSP arvioida virtsassa potilasta, jotka olivat epäillyt uroepithelial syöpäsairauksia. 48: potilaat, 32 BC potilaat lopulta vahvistettiin kystoskopian, ja 25 näistä olivat MSP-positiivisia ainakin yksi viidestä geenejä. Niistä 16 potilailla, jotka eivät näytä maligniteetti kystoskopian, 14 olivat negatiivisia MSP. Siksi 5-geeni tavoite oli hyvä mukaisia ​​kystoskopialla (81,25%; 25 positiivista ja 14 negatiivista kaikkiaan 48 potilasta molemmat menettelyt).

Viiden geenin paneeli voisi myös ennustaa tehokkuutta kirurgisen resektio

21 (100,0%) BC potilaista oli MSP-positiivisia ainakin 1 5 geenien ennen leikkausta, kun taas vain 2 21 (9,5%) BC potilaista säilytti MSP-positiivisia geenipaikkojen leikkauksen jälkeen (

P

0,0001). Nämä tulokset lisätä tukea edellisessä löytö ja hypoteesi [17] ja vahvistavat ajatusta, että läheinen suhde välillä metylaatio havaittiin virtsan sedimentin ja vastaava virtsarakon kasvain.

Euroopan hypermetylaatiota VAX1 ja LMX1A on tärkeä ennustamiseksi syövän uusiutumiseen

lisäksi suhde geenin metylaatiostatuksen ja pahanlaatuisen fenotyypin itse kasvain, tutkimme myös yhdistyksen välillä metyloitu tavoitteiden ja eri kliinisten parametrien.

useiden univariate logistista-regressioanalyysillä 9 geenikohteet (VAX1, KCNV1, ECEL1, TMEM26, TAL1, PROX1, SLC6A20, LMX1A ja CFTR) osoitti, että VAX1 ja LMX1A metylaatio oli yleisempää virtsanäytteistä toistuvia tapauksia kuin näytteissä ensisijainen tapausten alustavan analyysin 212 BC potilaat (ensisijainen: 157; toistuminen: 55), jossa HR = 2,37 (CI 95%, 1,27-4,44, P 0,05) ja HR = 2,59 (CI 95%, 1,01-6,65, P 0,05 ), vastaavasti (kuvio 4). Monimuuttuja logistinen-regressiomalleja paljasti, että HR VAX1 ja LMX1A oli 2,27 (95% CI, 1,20-4,32;

P

= 0,047) ja 2,63 (95% CI, 1,01-6,85;

P

= 0,012), (taulukko 3). Ja yhdistys oli selvää, kun nämä kaksi geeniä analysoitiin yhdessä, HR 4,73 (95% CI, 1,39-16,08;

P

= 0,013). Tiivis osallistuminen näiden geenien kanssa toistuminen näkyi seurantatiedot perustuvat 145 tapausta (no toistuminen: 108; toistuminen: 37), jossa ehjä seurantatiedot. Coxin monimuuttuja suhteellinen vaara malleja paljasti, että HR VAX1 ja LMX1A oli 2,11 (95% CI, 1,08-4,11;

P

= 0,029) ja 3,31 (95% CI, 1,27-8,59;

P

= 0,014; taulukko 4), vastaavasti. Yhdistelmä kahden geenin paljasti enemmän korkean HR 7,25 (95% CI, 2,41-21,79;

P

= 0,014). Lisäksi Kaplan-Meier tonttien paljasti, että kumulatiivinen vaara uusiutumisen metyloituja ja metyloimattomien VAX1 ja LMX1A erosivat merkittävästi (

P

= 0,034 ja

P

= 0,013, tässä järjestyksessä). Enemmän sigficance saatiin, kun VAX1 ja LMX1A analysoidaan yhdessä (

P

0,0001, kuvio 5). Validointi pieni itsenäinen kohortin koostui 24 BC ja 22 ohjaa kertovat samaa suuntausta HR 9,11 (95% CI, 0,89-93,7,

P

= 0,063) kahden geenin yhdistettynä marginaalinen merkitys Omistaminen pieni otoskoko ehkä (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot korostettaisiin määrittämiseksi metylaatiostatuksen VAX1 ja LMX1A ennustamiseksi tauti uusiutuu.

additioin on LMX1 /VAX1, Yritimme myös arvioida osallistumista muiden 7 geenejä muodossa kaksi -geenin pari yhdistelmä. Hypermetylaation asema joillakin näistä geeneistä osoittivat korkea sattumaa BC toistuminen, mutta tämä yhdistys ei voi jatkua analysoitaessa seurannan tiedot. Siksi poikkeava metylaatio nämä geenit saattavat olla pikemminkin tuloksiin kuin liipaisinta BC toistuminen.

metylaatiostatuksen ECEL1 ja TMEM26 merkitsevästi liittyvä korkea kasvain eriyttäminen, jossa HR = 2,43 (95% CI, 1,19-4,97; p = 0,01) ja 2,32 (95% CI, 1,11-4,85;

P

= 0,03), vastaavasti (kuva 4), mikä viittaa siihen, että he ovat mukana BC maligniteetti ja etenemistä.

keskustelu

tässä tutkimuksessa raportoimme yksityiskohtia perustamisesta biomarkkereiden liittyvien BC metyloinnin, jotka ovat seuraavat: (i) maailmanlaajuinen metylaatio profiilia sekä BCC ja BM by MBD methylCap-seq ; (Ii) poikkeava DNA BC metylaatio karttoja vertailun metylaation profiilia yhteyskeskukset kanssa BM; (Iii) paneelin lupaavien metylaation tavoitteiden ominaisia ​​BC; (Iv) kaksi informatiivinen geenikohteet informatiivinen BC uusiutuminen; ja (v) kaksi metylaatio liittyviä geenejä BC histologisia erilaistumista.

Perustettu syövän solulinjat ovat yleensä odotetaan jakavan monet (jos ei kaikki) geneettiset ja epigeneettiset ominaisuuksia kasvaimia

in vivo

, ja syöpäsolulinjoissa käytetään laajasti tuumorigeneesiä tutkimuksiin. Tutkimus ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän havaittu, että 6 syöpäsolulinjoissa oli metylaation, jotka olivat hyvin samanlaisia ​​kuin primaarikasvaimen suhteessa 60 metylaatio geenikohteet [29]. Siksi aloitimme genominlaajuisten metylaatio profiloinnin BCC ja käytetään kliinistä näytettä seulonta kerätä BC-erityisiä metylaation tietoja.

Kaplan-Meier arvioita toistumisen elinaika seurannassa kohortin 145 potilasta mukaan läsnäolo metyloitua VAX1 ja LMX1A (A ja B). VAX1 tai LMX1A metylaatio oli merkitsevästi yhteydessä huonoon ennusteeseen BC potilailla (P = 0,034 ja P = 0,013, tässä järjestyksessä). Analyysi kahden geenin yhdistettynä osoittaa enemmän staattinen voima (P 0,0001).

Monet geenit on raportoitu hypermetyloitunut BC. Viime aikoina tutkimukset uusilla seulonnan lähestymistavat, kuten metylaatio paneelit, ovat tunnistaneet metylaatio merkkiaineita korkea SN ja SP [30], [31], [32]. Tämä genominen seulontaan tarjoaa tehokkaan ja luotettava menetelmä perustamisesta poikkeava metylaatio profiilin yhteydessä sairauteen. Hyväksyimme MBD methylCap-kohdat tekniikkaa tutkimuksissamme, koska se on avoin alusta romaani metylaation loci ilman erillistä paikallista järjestyksessä tietoon. Siksi me seulotaan BCC ja verrattiin niitä BM yrittää löytää poikkeava BC metylaatio tietoja.

Lisäksi geenin promoottorin metylaatiostatus, saimme koko genomin laajuisia metylaatio profiilitietoja, joka sisältää erilaisia ​​genomisen yhteyksissä , kuten parantajia, alavirran sääntelyviranomaiset, 5’UTR, eksonit, intronit ja MikroRNA. Voimassaolo vertailevan metylaation tilat vahvistettiin BSP ja MSP. Tämä merkitsee enemmän DNA: n metylaatio tietoa eri genomista yhteydessä ominaisuuksia kuin array metodologia, jota rajoittaa koetin sekvenssit.

diagnostinen menetelmä, jossa korkea SN ja SP on tärkeää, että kliinisesti liittyvien testi. On ollut useita raportteja, jotka koskevat metylaatio profilointi virtsan sedimentin BC havaitsemiseen [17], [19], [26], [33], [34], [35], [36]. Tekniikoita käytetään näissä tutkimuksissa ovat tavanomaiset MSP, qPCR, sisäkkäisiä-MSP, ja MethyLightTM. Diagnostinen markkeri paneelit koostuvat yleensä 3-11 geenikohteet jotka vaihtelevat SN 77%: sta 94% ja SP 67%: sta 100% (taulukko S6).