Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

syöpään liittyvän fibroblasteja, jotka koostuvat aktivoituneiden fibroblastien tai myofibroblasteja, löytyy stroomaan ympäröivään kiinteitä kasvaimia. Nämä myofibroblasteja invaasiota ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen. Sääntelymekanismeissa aktivointi fibroblasteissa ja aloittamisen invasiivisen tumorigeneesin ovat erittäin kiinnostavia. Säätelyä tukirankaproteiinin proteiinin, palladinin, on havaittu strooman myofibroblasteja ympäröivän monet kiinteät syövät ja ilmaisun näytöt osallistuvien geenien hyökkäystä. Käyttämällä haimasyöpä malli, tutkimme funktionaalisen seurausta yli-ilmentymisen eksogeenisia palladinin normaaleissa fibroblasteissa

in vitro

ja sen vaikutus alkuvaiheessa kasvaimen invaasion.

Keskeiset havainnot

Palladinin ilmaisun strooman fibroblasteissa esiintyy hyvin varhaisessa kasvainten synnyssä.

In vivo

, yhtäpitävät ilmaus palladinin ja myofibroblastin merkki, alfa sileän lihaksen aktiini (α-SMA), tapahtuu varhainen klo dysplastic vaiheissa peri kasvaimen strooman ja vähitellen kasvaa haiman kasvainten synnyssä.

In vitro

eksogeenisten 90 kD palladinin normaaliin ihmisen ihon fibroblasteista (HDFS) indusoi aktivoitumisen strooman fibroblastien myofibroblasteja merkitty induktion α-SMA ja vimentiinista, ja sen kautta fyysisen muutoksen solun morfologiassa. Lisäksi palladinin ilmentyminen fibroblasteissa lisää solumigraatiota, invaasion kautta soluväliaineen, ja luominen tunnelien läpi jotka syöpäsolut voivat seurata. Fibroblastien hyökkäys ja luominen tunnelien tuloksia kehittämisestä invadopodia kaltaisten solujen ulokkeet, jotka ilmentävät invadopodia proteiinit ja proteolyyttiset entsyymit. Palladinin ilmentyminen fibroblasteissa laukaistaan ​​yhdessä viljelemisen normaalien fibroblastien k-ras-ilmentävien epiteelisolujen.

Johtopäätökset

Kaiken palladinin ilmentyminen voi antaa myofibroblastin ominaisuuksia, puolestaan ​​edistää invasiivisia mahdolliset näistä peri-kasvainsolujen kanssa invadopodia perustuva solunulkoinen matriksi rappeutuu. Palladinin ilmentyminen fibroblasteissa voidaan laukaista k-ras-ilmentymisen viereisten epiteelisolujen. Nämä tulokset tukevat sellaista mallia, että palladinin aktivoituvan fibroblastien helpottaa strooman riippuvia etäpesäke ja seuraus tuumorigeenisen epiteelin.

Citation: Brentnall TA, Lai LA, Coleman J, Bronner MP, Pan S, Chen R (2012) kiihottumisen syöpään liittyvien Stroma: n yli-ilmentyminen palladinin Aktivoi Sidekudosmuodostussolujen edistää syövän leviämisen. PLoS ONE 7 (1): e30219. doi: 10,1371 /journal.pone.0030219

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 22 maaliskuu 2011; Hyväksytty 15 joulukuuta 2011; Julkaistu: 23 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Brentnall et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Gene ja Mary Ann Walters rahaston Haimasyöpä Research (TAB), Kanarian Foundation (TAB), ja NIH NCI 5K07 CA116296 (RC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sidekudosmuodostussolujen on keskeinen rooli syövän invaasio, etäpesäke, ja chemoresistance [1] – [7]. Syöpään liittyvän fibroblasteja ovat myofibroblasteja kanssa supistuvien ominaisuuksia ja alfa-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) värjäys on tunnusmerkki näiden solujen [8]. Mekanismi, jolla myofibroblasteja parantaa kasvaimen kehittymisen alleviivaa kolme keskeistä tutkimuksia, jotka paljastavat: 1) syöpään liittyvän fibroblastit esiliina syöpäsoluja ensisijaisen sivuston osaksi metastasoitunut kapealla 2) estämällä aktivoitujen fibroblastien

ennen

kasvaimen invaasiota vihittyjen voi ehkäistä syöpää; mutta pysäytetään myofibroblasteja jälkeen hyökkäys on alkanut on liian myöhäistä ehkäistä syöpää ja 3) terapeuttiseen hoitoon haimasyöpä, joka vähentää syöpään liittyvän fibroblastien on tehokkaampi pidentämisessä selviytymisen kuin tavanomaisen kemoterapian, joka kohdistuu ainoastaan ​​syöpäsolut [9] – [11 ].

90 kD isoformia palladinin, alkion ja tukirangan proteiini elintärkeä solun liikkuvuus, on yli-ilmentynyt vuonna syöpään liittyvän fibroblasteissa lukuisia kasvaimen muodoissaan, mukaan lukien haima-, rinta-, keuhko-, munuais-, ja munasarja mutta on ilmaistu alemmilla tasoilla normaalissa strooman fibroblasteissa [12] – [15]. Palladinin ilmentävien fibroblastien löytyy myös vieressä syöpäsoluja imusolmuke ja metastaaseja [12]. Dysregulation palladinin viljellyistä soluista johtaa poikkeavaan aktiini organisaatiossa, säädeltyyn soluadheesiota ja liikkuvuus, ja brutto häiriöt solumorfologian [16] – [20]. Ei ole yllättävää, palladinin on havaittu ilmaisun näytöt invasion-geenejä haiman ja rintasyövän [21], [22].

Mielenkiintoinen yhteydestä syöpään liittyvän fibroblasteja ja palladinin asettaminen haimasyövän on tullut esiin. Olemme raportoineet erittäin läpitunkevaa nestettä, harvinainen familiaalinen haimasyövän (Family X), jonka aiheuttaa mutaatio erittäin konservoitunut alue 90 kD palladinin. Tämä mutaatio aiheuttaa solun tukirangan poikkeavuuksia ja parantaa muuttoliikkeen kun transfektoida soluihin, jotka tavallisesti ilmentävät pieniä määriä 90 kD palladinin isoformi [19]. Oli kiehtovaa löytää että palladinin proteiini on yli-ilmentynyt ensisijaisesti ja kaikkialle in strooman osastoon haimasyövän sijaan duktaaliseen epiteelisolujen [12], [23].

keskeistä asemaa palladinin soluliikkuvuus ja nouseva tietoisuus siitä, että aktivoituneiden fibroblastien voi todella kumppani syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden johti näihin tutkimuksiin. Tässä käytetään haimasyövän mallina, me murenee 1)

jos

neoplastisissa eteneminen tekee palladinin aktivoida fibroblastit, 2)

mekanismi

taustalla siirtyminen normaalin fibroblasti aktivoituun myofibroblastin vuonna asettaminen syövän ja 3)

miten

myofibroblastin voisi tukea syöpäsolut paeta. Lisäksi olemme myös tutkittu vaikutuksia perinnöllinen mutatoitunut 90 kD palladinin fibroblastit on suvulle alttiita haimasyövän (Family X tai FX). Voisiko palladinin-mutatoitunut strooman fibroblastien aloittaa syöpä?

Tulokset

Palladinin ilmentymistä kasvaimeen liittyvien fibroblastien tapahtuu aikaisin neoplastisia etenemistä ja lokalisoituu α-SMA ihmisen haimasyövän

immunohistokemiallinen (IHC) värjäys myofibroblastin merkki, α-SMA, ja 90 kD palladinin tehtiin samanaikaisesti ihmiskudoksella microarray lohkot sisältää kaikki histologisia vaiheissa ihmisen haimasyövän lukien syövän esiasteita (kuvio 1). Normaali haima puuttui 90 kD palladinin proteiinin ilmentymisen paitsi limakalvon endoteelisolujen. Sitä vastoin 90 kD palladinin ilmaisun kasvoi neoplastisen etenemisen ennalta syövän dysplastic vaurioita ja silmiinpistävin piirre oli se, että palladinin värjäys rajattiin fibroblastien välittömässä läheisyydessä dysplastic duktaaliseen soluja (kuvio 1). Haimasyövän, hajanainen ja vahva palladinin ilmentymistä havaittiin kaikkialla strooman, erityisesti ympäröivän alueen adenokarsinoomasolua yhteisymmärryksessä aiempien raporttien [12], [23]. Expression of α-SMA syövän strooman läheisesti rinnastettavissa että palladinin kuten aiemmin raportoitu munuaissolusyövässä [15]. Koekspressoimalla α-SMA ja palladinin fibroblastien ympäröivä syövän esiasteista viittaa siihen, että myofibroblastin fenotyyppi aktivoidaan aikaisin neoplastisia etenemiseen ja yleistyessä syövässä.

A) Expression palladinin ja α- SMA tutkittiin kautta IHC värjäytymistä haimassa yksilöitä. Vasen: ei juurikaan ole värjäytymistä normaalissa haimassa. Keskellä: ilmaus kasvaa ympäröivä kasvaimen fibroblastien haiman dysplasian tai Panin 2. Oikea: ilmaisu on korkein ja yleisintä fibroblasteissa ympäröivään haimasyöpä. B) Semi-kvantitatiivinen lukemat tarjoavat IHC pistemäärät kudosten microarray värjäytymisen normaali (NL), matala-asteista dysplasiaa (Panin 2), dysplasiaan (Panin 3) ja syöpä (CA) by palladinin ja α-SMA. Värjäys palladinin tai α-SMA pisteytettiin 0 4. Katso myös taulukko S1.

Palladinin up-regulation α-SMA ja aktivoi fibroblastit tulla myofibroblasteja

Perustuu proteiinin ilmentymistä palladinin ja α-SMA peri kasvaimen fibroblastien, pyrimme purkaa suhde näiden proteiinien. Palladinin on selvästi ylöspäin säädelty aikana fibroblasti-to-myofibroblastin siirtyminen hoidon jälkeen TGF-β1 [4] on a-SMA [3]. Sileän lihaksen soluissa, palladinin ilmentyminen vaaditaan α-SMA säätelyä [24], [25]. Mietimme mitä sääntelyn vaikutus näiden kahden myofibroblastin liittyvien proteiinien voi olla yhteydessä toisiinsa ja myofibroblastin fenotyypin (katso tiedot alla). Transfektio 90 kD: n isoformia villityypin (WT) tai mutantti-P239S (FX) palladinin normaaliin ihmisen ihon fibroblastit (HDFS) up-regulation myofibroblastin markkereita, α-SMA ja vimentiinin, ja riittää laukaisemaan myofibroblastin fenotyyppi seuraavat palladinin induktio. Päivänä 5-palladinin transfektion, α-SMA on merkittävästi kohonnut (27,4% ± 2,8%), ja jopa vielä lisätä päivänä 9 (79% ± 15,7%) (kuvio 2). Transfektio palladinin johti myös ylösajon 11 myofibroblastin supistuvien proteiinien raportoineet Malstrom et al. [26] (mukaan lukien cofilin, vimentiinistä, profiliinia, caldesmon, tropomyosin, alfa- enolaasi, beeta aktiini, tubuliinin, Rho GTP dissosiaatio estäjä 1, calponin ja peptidyyli-prolyyli cis-trans-isomeraasi A). Tämä proteomiikka analyysi käsitellään tarkemmin myöhemmin.

A) HDF-solut transfektoitu 90 kD palladinin (WT tai FX) tai tyhjän vektorin (EV) tutkittiin myofibroblastin markkereita α-SMA ja vimentiinista kautta IF. Punainen = α-SMA tai vimentiinista; Sininen = DAPI. B) HDF-solut käsiteltiin kuten edellä (A) ja ilmentymistä α-SMA analysoitiin RT-PCR: llä. RNA kerättiin klo ilmoitettujen päivien määrä transfektion. C) Expression of α-SMA analysoitiin RT-PCR: llä. GAPDH käytettiin sisäisenä lastaus valvonnan ja suhteellinen ekspressio kunkin näytteen verrattuna TGF-β1 käsiteltyjen näytteiden piirrettiin kertainen induktio ± SD.

Palladinin-aktivoituneiden fibroblastien kehittää myofibroblastin fenotyyppi

käyttöönotto 90 kD palladinin (WT tai FX) osaksi HDF soluihin (myöhemmin kutsutaan HDF-WT tai HDF-FX) johti muutokset solun morfologiassa (kuvio 3A). Normaaleissa kasvuolosuhteissa (täydellinen media), palladinin ilmentävien fibroblastien osoitti laskua solun alueella, ja kasvu ohut solujen ulokkeet piikki lisäkkeitä verrattuna lapsilukon soluja. Cytoskeletal muutoksia olivat sekä pidentämällä ja paksuuntuminen /niputtaminen aktiini stressin kuitujen (kuvio 3A). Ohut solujen ulokkeet piikki lisäkkeitä näkyvät elektronimikroskoopilla on palladinin ilmentävien fibroblastien (kuvio 3B). Koska monet syövät muodostua tulehduksellinen ympäristössä, ja koska syöpä pidetään haavan, joka ei parane [27], myös tutkinut palladinin ilmentävien fibroblastien inkuboinnin jälkeen haavoittaen media (väliaine fibroblasteista, jotka on haavoittunut pipetillä kärki ), voiko edelleen muutokset olivat merkittäviä (kuvio 3A). Morfologiset muutokset olivat merkittävästi parannettu verrattuna tyhjän-vektorisäätö fibroblasteissa (kuvio 3C). Solut kehittänyt enemmän fusiform tai mesenkymaalisten muotoinen pitkä ohut ulokkeita verrattuna tyhjän-vektorisäätö fibroblasteissa (kuvio 3C).

A) HDF transfektoitu WT-palladinin (WT) tai FX-palladinin (FX) verrattiin tyhjän vektorin (EV) käyttäen IF analyysi phalloidin värjäytyneiden solujen kasvatettiin täydellisessä media tai haavoittaen media. B) falloidiinia-värjätty HDF-WT solujen pullistuma ylistettiin elektronimikroskopian micrography (

upotettavat

). C) HDF käsiteltiin kuten edellä (A) ja viljeltiin haavoittaen media. Falloidiinia värjätään solut analysoitiin IF. Tontit kuvaavat suhteellinen pinta-ala solujen (

Top) ja keskimääräinen kesto ulokkeita (

alhaalla

). Tiedot edustavat kahden riippumattoman kokeen; arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. (T-testi, *, p-arvo 0,05; **, p-arvo 0,01).

Palladinin ilmentävien fibroblastien plus stimuloiva laukaista lisää invasiivisia ja muuttavien käyttäytyminen

Me seuraavaksi kysytään 90 kD palladinin ilmaisu vaikuttaisi muuttoliike ja /tai invasiivisia kapasiteetti fibroblasteissa. Migration testattiin käyttämällä siirtokuoppaan järjestelmä, jossa solut voivat kulkea suoraan huokosten ylemmästä kammiosta alempaan kammioon. Invasion testattiin käyttämällä Matrigel päällystettyä transwell. Pitoisuus tuloksia verrattiin inkuboida täydellinen media, haavoittaen media (väliaine kerätään konfluenteis- HDF soluista käsin haavoittunut pipetillä kärki), tai elatusaineesta peräisin Pancin-1 epiteelisolujen. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että solujen altistaminen haavan tekemistä media, lisää maahanmuuttoluku epiteelisolujen [28]. Suostumuksella viimeaikaiset tutkimukset osoittavat anti-muuttavien vaikutusten palladinin ilmaisun rintasyöpäsoluissa [29], että puuttuessa haavoittuminen signaalin palladinin-aktivoituneiden fibroblastien ei ole lisätä maastamuuttoa tai hyökkäystä. Kuitenkin haavoittaen signaali kasvanut dramaattisesti migraation ja invasiivisen kapasiteetti palladinin-aktivoitua fibroblasteja (WT ja FX) verrattuna tyhjän vektorin ohjaus (HDF-EV) (kuviot 4A 4B). Kun taas epidermaalinen kasvutekijä (EGF), oli samanlainen tulos on solujen haavoittuneen media (tuloksia ei ole esitetty), inkubointi vakioitua elatusainetta haimasyövän soluja (Panc-1) ei lisätä invasiivisuus palladinin-ilmentävien solujen (kuvio 4B) .

A) Migration poikki siirtokuoppaan verrattiin varten HDF transfektoitu tyhjällä vektorilla (EV), WT-palladinin (WT), FX-palladinin (FX) altistuessaan normaali täydellinen median tai haavoittaen media. Näytetyt tiedot edustava keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (T-testi, *, p-arvo 0,05) B) Invasion poikki Matrigel peittämä siirtokuoppaan verrattiin varten HDF-solut käsiteltiin kuten edellä kohdassa (A), kun se altistetaan loppuun media, haavoittaen media tai elatusaineesta peräisin Pancin-1 solut. Näytetyt tiedot edustava keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. (T-testi, **, p-arvo 0,01) C) HDF-solut transfektoitiin kuten edellä kohdassa (A) ja maljattiin peitinlasit päällystetty Texas Red-leimattua gelatiinia. Kuvat ovat otettu kautta IF on esitetty. DAPI (sininen) käytettiin visualisoimaan ytimiä. D) Proteiinin lysaatit HDF-solut transfektoitiin kuten edellä kohdassa (A) testattiin RhoA toimintaa. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena kahdessa riippumattomassa kokeessa. Virhe palkit osoittavat SD. (T-testi, **, p-arvo 0,01) E) Proliferaatiomääritys HDF transfektoitu kuten edellä kohdassa (A). Data osoittaa keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kaivoja.

Voit tarkistaa, onko palladinin ilmentävien solujen kykenivät hajottamaan soluväliaineen, HDF-EV, HDF-WT, ja HDF-FX kasvatettiin coverslip päällystetyn fluoresoivasti-leimatun liivate. Läsnäollessa haavoittamiseen median, liivate niputtaminen havaittiin ja liivate pinta tuhoutui palladinin ilmentävien HDF-WT tai HDF-FX-soluissa, mutta ei normaali vanhempien HDF-EV (kuvio 4C). Nämä tuhoisa muutokset ovat paljon dramaattisempi ja laajaa kuin odottaisi kanssa invadopodia yksin. Mietimme palladinin aiheuttama myofibroblasteja oli parannettu contractility joka voi aiheuttaa ”rippaus” matriisin. Voit vastata tähän, me tutkimme, RhoA, proteiini osallistuu solun tukirangan liikkuvuutta ja remontin [30], aktivoitiin palladinin ilmentävien solujen ja havaitsi, että RhoA kohoamiseen lähes 2-kertaiseksi (kuvio 4D). Tämä viittaa siihen, että eksogeeninen palladinin ilmaisu edistää kykyä myofibroblasteja sekä hyökätä ja tuhota soluväliaineen (kuvio 4C). Invasiivista vaikutukset loukkaantumisesta median ja EGR palladinin-ilmentäviä fibroblastit eivät johtuneet eroa leviämisen hinnat (kuvio 4E).

Aiemmat tutkijat ovat ehdottaneet, että kasvaimeen liittyvät fibroblastit voi johtaa syöpäsoluja kautta soluväliaineen [31]. Me pohti palladinin-aktivoituneiden fibroblastien mahtuisi paradigma. Tutkia tämän hypoteesin, teimme 3D hyökkäystä, joissa käytetään liukuu kehittämä Bellbrook Labs (kuvio 5A). Kaksi pyöreää kuopat yhdistetty keskeinen suora kanava 1 mm × 1,8 mm. Kanavan täytettiin laimennettua loisteputki matrigeeliä; EGF lisättiin hyvin toisella puolella kanavan kuin houkuttimena ja HDF tai palladinin-aktivoitu HDF ladattiin vastakkaiseen hyvin. Soluinvaasiota osaksi matrigeelin täytetyn kanavan arvioitiin 12 tunnin välein fibroblasteissa siirtyi kohti houkutinta. Suostumuksella meidän siirtokuoppaan invaasio määrityksiä, palladinin-aktivoituneiden fibroblastien tunkeutuneet kanavia nopeammin ja muuttivat kanaalin huomattavasti enemmän kuin kontrolli fibroblasteissa (kuvio 5B). Vaikka pitkään aikaan, yksikään HDF soluja ilman palladinin pystyivät ylittämään kanavalle. Sen sijaan palladinin-aktivoituneiden fibroblastien kokonaan ylittänyt 1 mm kanavan 72 tuntia, luoda tunneleita, joita käytettiin muiden aktivoituneiden fibroblastien, joka seurasi takana. Musta tunnelit luoma palladinin-aktivoitujen fibroblastien ovat melko selvästi nähtävissä fluoresoiva punainen kanava 3D hyökkäyksen kammio (kuvio 5C). Lisäksi laaja tunneloinnin luoma palladinin-aktivoituneiden fibroblastien kohti houkutinta, The palladinin sisältävien solujen näytti olevan paremmin suuntaa liikkeen kohti EGF houkutusaine kuin kontrollisolut (kuvio 5B); jälkimmäinen usein kiersi takaisin kotiin hyvin missä ne alkoivat.

A) Kaavio 3-D invaasiomääritys osoittaa Texas Red leimattua gelatiinia /Matrigel seos kanavan 5 ng /ml EGF kuin attraktantti vuonna vasen portti ja soluja (HDF ± palladinin merkitty QTracker 585 kanssa tai ilman Pancin-1 merkitty QTracker655) kylvetään oikeaan porttiin. Solujen liikkuvuus arvioitiin solujen kulki kanavan (oikealta vasemmalle Suuntaisliike) käyttäen konfokaalimikroskopia. B) Palladinin-aktivoitua fibroblasteja (vihreä) hyökätä syvemmälle punainen matrigeelin kanavalla kaikkina testattuina ajankohtina (24 ja 72 tuntia)

(oikea paneeli) B verrattuna HDF EV

(vasen paneelit)

. Edustavia otettuja kuvia konfokaalimikroskopialla näkyvät. Palkit osoittavat 100 pm. C) Keltainen pakatun alue on esitetty suurennettuna oikealle.

Top, Red Matrigel on tasainen koko tyhjän kanavan ennen hyökkäystä.

keski

, Palladinin-aktivoitua fibroblasteja (vihreän fluoresenssin emissio) luodaan musta tunnelit (vailla Texas Red signaalin; katso nuoli) matriisiin.

Bottom

, fibroblastit (valkoinen phalloidin tahra) voi liikkua yhden tiedoston tunnelien kautta. Esitetyt tulokset edustavat otetut kuvat konfokaalimikroskopia. Palkit osoittavat 50 pm. D) Pancin-1-solut (vaaleanpunainen; ks nuolenpäät) seurata palladinin-aktivoitua fibroblasteja (valkoinen) kanavan läpi, kun ne eivät noudata HDF-EV. Esitetyt tulokset edustavat otettuja kuvia konfokaalimikroskopia 72 tunnin kuluttua yhteistyön kulttuuri. Kanavat kiinnitettiin ja värjättiin DAPI.

Pancin-1-soluja lisättiin yhden päivän kuluttua fibroblastien arvioimaan, ovatko nämä epiteelisolujen hyödyntäisi tunnelien aiemmin luoma tunkeutuvat fibroblastit. Todellakin, pystyimme tunnistamaan Pancin-1-soluissa seuraavan palladinin-aktivoitua fibroblastisoluista tunnelien kautta (kuvio 5D). Palladinin-aktivoituneiden fibroblastien oli suora vaikutus käyttäytymiseen ja ulkonäkö Pancin-1 haimasyöpä epiteelisolujen. Sen jälkeen yhteistyö kulttuurin Pancin-1 ja palladinin aktivoituva fibroblastisoluja kotona hyvin 3D-invaasio Objektilaseja Panc-1 syöpäsolujen siirtyneet paljon pidemmälle etäisyys- joitakin täysin rajan kanavan- kun ohjaus palladinia vapaa co -cultures paljasti Pancin-1-soluissa tuskin lähtevät kotiin hyvin. Lisäksi, kun läsnä on palladinin-aktivoituneiden fibroblastien, The Panc-1-soluja kehitetty pitkänomainen ulkonäkö (kuvio 5D).

Palladinin edistää hyökkäyksen kehittämällä invadopodia täytetty matriisi-tuhoavien entsyymien

purkaa taustalla oleva mekanismi invasiivisia kykyä palladinin ilmentävien fibroblastien, selvitimme ”jalat” on palladinin-aktivoituneiden fibroblastien, josta oli tullut yhä näkyvämpi kanssa siirtyminen myofibroblasteja (kuvio 3B). HDF, transfektoitu ja ilman palladinin, maljattiin Matrigel kuorrutettu siirtoaltaat. Vaikka huokoskoko transwell oli liian pieni koko solun läpi, se voi majoittaa podosomes, joka oli ensin tunkeutua Matrigel kerros (kuvio 6A). Invadopodia /podosomes että hyökkäsi läpi matriisin peitossa huokosia katkesivat solusta runko partaveitsi. Leimatun kvantitatiivinen proteomiikka-analyysiä käytettiin vertaamaan proteiinien ”jalat” päässä palladinin ilmentävien fibroblastien suhteen ”jalat” normaalista vanhempien fibroblasteissa. Proteomiikka-analyysi paljasti, että yli 200 proteiinit väärin säädellystä mukaan ≥1.5 kertaiseksi ”jalat” palladinin ilmentävien fibroblastien suhteessa niille leimattujen valvonnan soluja. Nämä väärin säädellystä proteiinit kuten invadopodia proteiinit [30], [32], [33], ras liittyviä ja GTP sitovia proteiineja, ja proteolyyttiset entsyymit, (valitut proteiinit, katso kuva 6B, täydellinen lista, katso taulukko S2). Olimme erityisen kiinnostuneita invadopodia proteiineja, kuten cortactin, filamiini A, beeta-integriinin 1, vinkuliini, profiliinia, alfa-aktiini, ja cofilin [32], [33]. Lähes puolet säädelty proteiinit tunnistettu meidän proteomiikka analyysi äskettäin raportoitu uusina invadopodia osia [34].

) alapuoli on 3 pm siirtokuoppaan osoittaa podosomes /invadopodia peräisin HDF-WT fibroblastien että on vallannut läpi matrigeelin kautta IF. ”Jalat” katkesivat partakoneen varten Proteomiikan analyysiä. B) HDF-solut transfektoitu GFP-tyhjän vektorin (EV) tai GFP-villityypin palladinin (WT) tutkittiin phalloidin värjäys kautta IF. Palladinin ilmentävien fibroblastien on lineaarinen ulokkeita (

nuolenpäät

) täynnä proteaaseilla ja lysotsyymejä kuten katepsiini D. Kuvassa ovat edustavia kuvia. C) proteomiikan analyysi ”jalat”, paljastaa yliekspressio proteolyyttisiä entsyymejä, Rho aktivointi proteiineja, ja todentaa proteiinien läsnäolo aikaisemmin tunnistettu invadopodia. Näkyy ovat proteiini suhde fibroblasteista WT tai FX palladinin suhteessa tyhjän vektorin. Katso myös taulukko S2. D) HDF-solut transfektoitu villityyppisen palladinin kasvatettiin Matrigelillä katettu peitinlasit. Erosive huonontuneen kappaleita havaittiin kautta elektronimikroskoopilla. Palkki osoittaa 1 pm.

kvantitatiivinen proteomiikka-analyysi paljasti ajan sääntely palladinin sitovan proteiinin, alfa-aktiini, joka on toinen invadopodia kaltainen proteiini, joka on yhteydessä huonoon ennusteeseen munasarjojen ja haiman [ ,,,0],35], [36]. Merkitty lisäys alfa-aktiini stroomaan Haimasyöpä ja ennalta syövän validoitiin IHC (kuva S1). Validointi lisääntyneen ilmentymisen valittu invadopodia proteiinien -cofilin, cortactin, ja profiliinin-havaitsee proteomiikka-analyysi suoritettiin immunofluoresenssilla ja /tai Western blot -analyysillä (kuva S2).

Lisäksi invadopodia proteiineja, proteolyyttinen entsyymit olivat myös ajan säännelty ”jalat” palladinin ilmentävien fibroblastien lukien ADAM22, aminopeptidaasien, ja katepsiini D ja B (kuvio 6C). Immunofluoresenssivärjäyksellä katepsiini D, vahvisti, että proteiini on selektiivisesti yliekspressoituu HDF-FX ja WT-solut, mutta ei vanhempien fibroblasteissa tyhjällä vektorilla (kuvio 6C). Mielenkiintoista, katepsiini D on osoitettu stimuloivan fibroblastien invaasion ja seuraus ja on tiettävästi mukana parakriinisella vuorovaikutukset kasvain epiteelin ja fibroblastit [37]. Lisäksi ilmaus proteolyyttisen ja matriisi-remontin proteiinien tuhoutuminen matrigeelin jonka palladinin ilmentävien HDF-WT soluissa on ilmeistä elektronimikroskoopilla (kuvio 6D).

Palladinin on säädelty vahvistavasti fibroblastien jonka viereisen k-ras-aktivoidun epiteelisolujen

Palladinin ei yleensä mutatoitu satunnaisesti haimasyövän (tietoja ei ole esitetty) tai familiaalinen haimasyöpä, muut kuin Family X [38] – [41]. Vielä ilmentyminen 90 kD palladinin on raportoitu fibroblastit, jotka ympäröivät haiman dysplastic tai syöpä duktaalinen soluja 96% haiman syövät, kun taas fibroblastit, jotka ympäröivät normaalit ductal solut eivät [12], [23] (kuvio 1). Oletimme, että paracrine välinen signalointi syöpä epiteelisolujen ja fibroblastien todennäköisesti vastuussa ylössäätöä palladinin ilmaisun fibroblastien, lopulta kääntämällä ne kasvaimeen liittyvät myofibroblasteja. Tämän hypoteesin testaamiseksi, ihmisen normaalit fibroblastit olivat yhdessä viljeltiin transwell kanssa kuolemattomaksi normaali haimatiehyen solut (HDPE-solut) ja haimatiehyen syöpäsolun radat, joilla on k-ras-mutaatioiden (MiaPaca ja Panc-1). Päivällä 5 yhteistyön kulttuurin, palladinin oli säädelty vahvistavasti fibroblastien vieressä molemmat haimasyövän duktaaliseen solulinjoissa (kuvio 7A). Vertailun, normaalien fibroblastien, jotka olivat lähellä normaalia haimatiehyen solut eivät näihin palladinin (kuvio 7B).

A) HDF-soluja tutkittiin palladinin ilmentymisen kautta IF seuraavat yhdessä viljelemisen haimasyöpä solulinjoissa, MiaPaca tai Panc-1, ja 7 päivää. TGFp 1 näkyy positiivisena kontrollina jopa säätelevä palladinin normaaleissa fibroblasteissa ei epiteelisolujen on negatiivinen kontrolli. Scale palkit osoittavat 20 pm. B) HDF-solut tutkittiin α-SMA tai palladinin ilmaisun kautta IF seuraavat yhdessä viljelemisen normaali haimatiehyt- epiteelisolujen (HDPE), jotka olivat valetransfektoidut tai transfektoitu villin tyypin tai mutantti K-ras. Scale palkit osoittavat 20 pm.

Seuraavaksi mietimme mikä signaali oli peräisin syöpäsolut joka säätää ylös palladinin viereiseen fibroblasteissa? Kun otetaan huomioon tietomme osoittavat aikaisimpana kurssin säätely ylöspäin palladinin ympäröivä kasvaimen fibroblastien tapahtuu huonolaatuisen dysplasia (tunnetaan Panin 2 haimassa), me arveltu, että palladinin asetusta täytyy tapahtua suhteellisen varhaisessa kasvainten synnyssä . K-ras-mutaatioiden ovat läsnä kaikkialla haimasyövän: läsnä sekä syöpä- ja syövän esiasteiden ductal soluihin [42]. Koska palladinin yli-ilmentyminen on huomattava, että myofibroblasteja välittömässä läheisyydessä syöpää edeltävän ductal soluissa (kuvio 1), me arveltu, onko k-ras aktivointi yksin duktaalisessa soluissa riitti aiheuttamaan säätely ylöspäin 90 kD palladinin lähialueiden normaalien fibroblastien . Samanlainen rinnakkaisviljelmätilanteessa kokeessa käyttäen siirtoaltaat laadittiin normaalia fibroblastien alemmassa kammiossa; ylempi kammio sisälsi normaalia haimatiehyen epiteelisolujen (HDPE), jotka on transfektoitu villin tyypin k-ras, mutatoitu k-ras, tai tyhjä vektori. Expression joko constituently aktivoitua villityypin

tai

mutatoitunut k-ras HDPE soluissa oli riittävä aiheuttamaan ylössäätöä palladinin ja α-SMA viereisessä normaalissa fibroblasteissa (kuvio 7B). Kumpikaan palladinin eikä α-SMA ilmaisua korotettiin samanakaiseen kulttuuri vanhempien haimatiehyen soluja (HDPE) transfektoitu tyhjällä vektorilla.

lisääntymisen merkkejä α-SMA ja palladinin fibroblasteissa jota viereinen syöpäsolut estetään hiljentäminen 90 kD palladinin

onko ras aiheuttamaa muutosta fibroblastien myofibroblasteja tukeutunut palladinin riippuvaisen reitin, käytimme shRNA tuottamaan vakaa klooneja HDF kanssa palladinin knockdown ja sitten mitataan palladinin ja α-SMA tuotanto 9 päivän kuluttua yhteistyön kulttuurin normaalien fibroblastien kanssa haimasyöpä solulinja, Panc-1. Emme onnistuneet havaitsemaan α-SMA ilmentymisen RT-PCR seuraavista co-viljelmä HDF-soluja transfektoitiin stabiilisti tahansa kolmesta erillisestä shRNA konstrukteja suunnattu 90 kD palladinin (kuvio 8A; tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin säätelyä α-SMA havaittiin, kun co-kulttuuri Panc-1-soluja, jos HDF-soluja transfektoitiin kontrollina shRNA plasmidi tai käsittelemättömien HDF-soluissa. Myös toimiva seuraus hiljentäminen palladinin fibroblasteissa osoituksena muuttoliike ja invaasion määritykset (kuviot 8B 8C). Palladinin hiljentäminen vähentynyt toimintoja aikaisemmin yhdistetty myofibroblastin fenotyyppi. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ductal sisältäviä soluja aktivoituu k-ras riittävät säätää ylös palladinin ilmentymistä viereisissä fibroblasteissa kautta paracrine signalointi. Tämä puolestaan ​​aiheuttaa fibroblastien muuntua myofibroblastin. Täydellinen hiljentäminen palladinin kumoaa prosessin.

A) HDF-solut transfektoitiin stabiilisti ohjaus shRNA (C) tai shRNA vastaan ​​90 kD palladinin (Pal shRNA). a-SMA ilmentymisen jälkeen, co-kulttuuri Panc-1-soluissa analysoitiin RT-PCR: llä. Analyysi käsittelemättömän HDF (U) on esitetty vertailun. Ensimmäinen kaista on ei-mallin negatiivinen kontrolli; GAPDH näkyy sisäisenä latauskontrollina. Näkyy on dataa yhden edustajan shRNA vakaa klooni (kolmen itsenäisen shRNA konstruktioita testattu). B) Invasion poikki Matrigel pinnoitettu siirtokuoppaan verrattiin varten HDF transfektoitu kuten (A). Näkyy on keskiarvo ± SD. Näkyy on dataa yhden edustajan shRNA vakaa klooni (kolmen shRNA konstruktioita testattu). C) HDF-solut kuten kohdassa (A) kasvatettiin konfluenssiin coverslip ja haavoittui kanssa raaputuskokeen. Migration arvioitiin kautta IF 24 tunnin kuluttua haavoittaen. Vähintään 3 havaintoja jokaisen kunnon analysoitiin. Sininen = DAPI. Näkyy tiedonsiirrolla yhdestä edustavasta shRNA vakaa klooni (kolmen shRNA konstruktioita testattu).

mutaation palladinin (FX) annetaan joitakin eroja proteiiniekspressiossa käyttäytymisestä fibroblasteissa verrattuna villityypin palladinin (WT)

useista syistä, olemme mukana näissä kokeissa tutkimuksen P239S mutaation erittäin konservoitunut alue 90 kD palladinin joka aiheuttaa harvinainen peittyvästi hallitseva familiaalinen haimasyöpä. Miten dysregulation on solun tukirangan proteiini peri kasvaimen fibroblastien altistaa sellainen tappava, erittäin läpitunkeva neste syöpä? Näissä tutkimuksissa havaittiin, että FX palladinia ilmentävien fibroblastien oli huomattavasti enemmän invasiivisia kuin fibroblastit, jotka sisältävät villin tyypin palladinin. Lisäksi kvantitatiivinen proteomianalyysi havaittu ilmentyminen 88 proteiineja, jotka olivat ainutlaatuisia HDF-FX (taulukko S2) eikä havaittu HDF-WT.