Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Krooninen fibrosing maksavaurio on merkittävä riskitekijä hepatokarsinogeneesin ihmisillä. Hiiret kohdennettuja poistamisen Mdr2 (hiiren ortologi MDR3) jatkuvia fibrosing maksavaurioita. Maksasolusyövän (HCC) syntyy spontaanisti sellaisissa hiirissä 50-60 viikon iässä, tarjoaa malli fibroosin liittyvän hepatokarsinogeneesin. Käytimme Mdr2

– /- hiiret tutkimaan hypoteesi, että aktivointi siili (Hh) signalointireitin edistää kehitystä sekä maksafibroosin ja HCC.

Methods

maksavaurioita ja fibroosia , Hh-reitin aktivaatio, ja maksa kantaisä populaatiot verrattiin Mdr2

– /- hiiret ja ikä Hyväksytty villi tyypin valvontaa. Annos havainto kokeesta Hh signalointi antagonisti GDC-0449 tehtiin optimoimiseksi Hh-reitin estäminen. Hiiriä käsiteltiin sitten GDC-0449 tai ajoneuvon 9 päivää, ja vaikutukset maksafibroosin ja kasvaintaakkaa arvioitiin immunohistokemiallisesti, qRT-PCR, Western blot, ja magneettikuvaus.

Tulokset

Toisin kuin ohjaimet, Mdr2

– /- hiirillä toistuvasti ilmaissut Hh-ligandien ja vähitellen kertynyt Hh-reagoiva maksan myofibroblasteja ja progenitorien iän. Hoito ikäinen Mdr2-hiirissä kanssa GDC-0449 esti merkittävästi maksan Hh aktiivisuus, vähentynyt maksan myofibroblasteja ja progenitoreja, maksan fibroosi, edistänyt regressio sisäisen maksan HCCs, ja vähensi metastaattisen HCC lisäämättä kuolleisuutta.

Johtopäätökset

Hh-reitin aktivaatio edistää maksafibroosi ja hepatokarsinogeneesin, ja estämällä Hh signalointi turvallisesti vaihtaa molemmat prosessit vaikka fibroosi ja HCC ovat kehittyneet.

Citation: Philips GM, Chan IS, Swiderska M Schroder VT, Guy C, Karaca GF, et al. (2011) Siili Signaling Antagonistiominaisuudet Edistää regressio Sekä maksafibroosin ja Maksasolusyövän hiirimallissa ensisijainen maksasyövän. PLoS ONE 6 (9): e23943. doi: 10,1371 /journal.pone.0023943

Editor: Pranela Rameshwar, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 27 heinäkuu 2011; Julkaistu: 02 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Philips et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health (NIH) RO1 DK077794, NIH RO1 AA010154, NIH T32 DK007568, ja NIH T32 CA071341. Osa kuvantaminen tehtiin Duke Center for In vivo Microscopy tukemana, osittain National Center for Research Resources National Biomedical Technology Research Center (P41 RR005959) ja National Cancer Institute pieneläinlääketieteen Imaging Resource Program (U24 CA092656). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on salakavala syöpä, jonka osuus jopa 1 miljoonaa kuolemaa vuodessa ja on kolmas johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1]. Kirroosi, seurauksena progressiivinen maksavaurion ja fibroosia, on suurin yksittäinen riskitekijä HCC [2]. Muuntunut haavan paranemista vastaus kroonisen maksavaurion, jossa tuloksena säädeltyyn aktivointi myofibroblasteja ja progenitorisolupopulaatioilla, on ollut mukana kirroosi synnyssä ja lopulta syövän syntymistä [3].

Loss-of-function mutaatioita hepatosyyttien pienten kanavien fosfolipidiä flippase MDR3 (ABCB4) on liittynyt monenlaisia ​​ihmisen sapen sairaudet, kuten progressiivinen familiaalinen maksan kolestaasi tyyppi 3 (PFIC3), kolestaasi raskauden, lääkkeen aiheuttama kolestaasi ja aikuisen maksakirroosi kanssa samoja piirteitä primaarinen sklerosoiva kolangiitti (PSC) [4], [5], [6], [7]. Hiiriä kohdennettu deleetio Mdr2 (hiiren ortologi MDR3) puuttuu maksaspesifiset P-glykoproteiini, joka kuljettaa fosfatidyylikoliini (PC) poikki pienten kanavien kalvon. Puuttuminen fosfolipidit sappeen tuloksia etenevä sklerosoiva sappitietulehdus kanssa mukana portaalin tulehdus, ductular leviämisen ja portaalin fibroosia. Maksavaurio ilmenee pian syntymän jälkeen ja hepatosellulaarikarsinoomien spontaanisti välillä 50-60 viikkoa iässä [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Toisin ksenograftimalleja jotka ovat laajalti käytössä tutkimaan mekanismeja of- ja hoitoja anteeksi HCC, Mdr2

– /- hiirillä tarjota mallin rinnasteinen luonnollista kehitystä HCC on taustalla krooninen tulehdus, maksavaurion ja fibroosia [15] .

geeniekspressio analysoidaan Mdr2-hiirissä ja heterotsygootti valvonta ovat osoittaneet vahvaa ja jatkuvaa induktio useita adaptiivisia mekanismeja, jotka ohjaavat soluvasteita, jotka liittyvät oksidatiiviseen stressiin, tulehdus, rasva-aineenvaihduntaan, ja proliferaatiota, pakottaen spekuloidaan, että nämä prosessit edistää hepatokarsinogeneesin [16]. Vaikka ei muodollisesti arvioinut aiemmissa tutkimuksissa Mdr2-hiirillä, toinen polku, joka voisi olla rooli fibroosia liittyvien hepatokarsinogeneesin on Hedgehog (Hh), koska Hh signalointi on todettu olevan yhteydessä sekä fibrogenic korjaus maksavaurion ja HCC.

Hh-reitin on evoluutiossa konservoituneen signalointireitin, joka aktivoituu, kun Hh-ligandien (Sonic hedgehog ja Indian hedgehog) sitoutuvat Patched (Ptc), kalvon läpäisevä reseptori, joka ilmentyy pinnalla Hh-responsiivisten solujen. Ligandin sitoutuessa, Pte inaktivoituu, lievittää sen tukahduttamisen Smoothenedin (SMO), trans-kalvo proteiini, joka välittää Hh signalointi solun sisällä. Smo aktivointi huipentuu ydinvoiman lokalisoinnin Gli-perheen transkriptiotekijöitä, Gli1, Gli2, ja Gli3, mikä puolestaan ​​säätelevät alavirtaan geenin ilmentymistä. Reitti on lepotilassa normaalissa maksassa [17], [18], mutta tulee uudelleen kuin korjautumismekanismi kroonisen maksavaurion [19], [20], [21], [22], [23]. Hh ligandit edistää kasvua ja kannattavuuden myofibroblasteja, kertyminen, joka johtaa maksan korjaus, fibroosi ja lopulta kirroosi [24], [25]. Hh ligandit toimivat myös elinkelpoisuus ja proliferatiivisia tekijät maksan epiteelin progenitorit, ja laajentaminen tämän osaston on yhdistetty muodostumiseen ja ylläpitoon maksasolukarsinoomat [26]. Se mahdollisuus, että Hh-reitin aktivaatio edistää hepatokarsinogeneesin tukee se, että Sonic hedgehog (Shh) ligandin ilmentyminen on havaittu noin 60% ihmisen HCCs, ja ilmaisun Hh-geenien, Gli1 ja Ptc, esiintyy 50% ihmisen kasvaimista [27], [28], [29], [30].

näiden havaintojen perusteella, me olettaisi, että Hh-reitin aktivaatio edistää synnyssä sekä maksan fibroosi ja fibroosin liittyvä HCC. Tämän hypoteesin testaamiseksi käsittelimme aged Mdr2-hiirissä, joilla Hh-reitin estäjä, GDC-0449, pienimolekyylinen inhibiittori, joka sitoutuu Smoothenedin (SMO). Tämä aine oli valittu sen ihmisen turvallisuusprofiili vaiheessa 1 tutkimuksissa sekä sen tehokkuutta kiinteiden elinten kasvaimia kuin tyvisolusyöpä (BCC) ja varhaissolukasvaimesta [31], [32], [33]. Meidän tavoitteena oli selvittää, onko hiirillä ja edennyt maksasairaus ja HCCs siedä Hh-reitin estäminen ja kokemus parannuksia maksafibroosin ja /tai kasvaimen taakkaa.

Methods

Hiiret

Mdr2

– /- hiiret olivat lahja tri Detlef Schuppan (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA). Ikä Hyväksytty FVB /NJ villityypin hiiret saatiin Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Kaikki hiiret sijoitettiin kanssa 12 tunnin valo-pimeä-sykli ja juotettava ja tavallinen Chow

halun

. Iässä, 2, 4, 12, 36 52 ja 62 viikkoa, hiiret tapettiin yleisanestesiassa. Maksan paino ja kehon paino rekisteröitiin, seerumi ja maksakudosta kerättiin. Eläinkokeet hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean säännellään National Institute of Healthin ”Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals”, Duke University Animal Welfare Assurance Number A3195-01.

Serum ASAT /ALT määritys

Serum aspartaattiaminotransferaasin (ASAT) ja alaniiniaminotransferaasin (ALAT) mitattiin käyttämällä sarjat kaupallisesti saatavissa Biotron Diagnostics (66-D ja 68-D vastaavasti, Hemet, CA) mukaan valmistajan ohjeiden .

Western Blot

Yhteensä proteiini eristettiin jäädytettiin koko maksakudosta sisään RIPA puskuriin. Näytteet yhdistettiin iän (2-4 näytettä per ikäryhmässä), ellei toisin mainita. Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu. Kalvot koetettiin seuraavilla ensisijainen vasta: Sonic hedgehog (sc-9024; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Intian siili (ab39634; Abcam), β-aktiini (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), Gli2 (18 -732-292462, Genway, San Diego, CA). Kaikki vasta-aineet laimennettiin 1:1000 ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Western blot kuvat hankittiin käyttäen FluorChem HD2 digitaalinen pimiöön järjestelmä (Cell Biosciences, Santa Clara, Kalifornia).

immunohistokemia

4 pm formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut näytteet poistettiin vaha ja nesteytyksestä. Arvioida kudosrakenne, Objektilasit värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Invitrogen, Carlsbad, CA) 10 minuutin ajan. Kohdat blokattiin (Dako Envision, Carpinteria, CA), ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: glioblastooma-2 (Gli-2; 18-732-292462, 1:2000, Genway, San Diego, CA); sytokeratiini 19 (Troma-III; Hybridoma Bank, Iowa City, IA, 1:500); α fetoproteiinigeenin (AFP) (Dako, 1:1000); Indian hedgehog (Abcam; 1:750, Cambridge, MA); Polymer-HRP anti-kani (K4003, Dako) tai anti-hiiri (K40011; Dako) tai MACH3 hiiri AP polymeerin Kit (MP530, Biocare Medical, Concord, California, USA) käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita. 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) Alustan Kromogeeni System (K3466, Dako) ja /tai Ferangi Blue (biocare) käytettiin havaitsemiseen menettelyyn. Jättämällä ensisijainen vasta reaktioista eliminoida virheitä, jotka osoittivat värjäyksen spesifisyys. Kuvat hankittiin Olympus IX71 (Tokio, Japani) käännettyä mikroskooppia käyttäen DP2-BSW (Olympus) Image Acquisition ohjelmistosta.

Quantitative Real-Time Käänteinen transkriptio-PCR

RNA eristettiin koko maksa, samoin kuin resektoidun kasvain näytteet oli vakio TRIzolia louhinta kuten on kuvattu aiemmin [24]. Taulukko alukkeiden on sisällytetty Täydentävä Materials.

morfometria

Formaliinifiksoidusta maksan ja tuumorisektioiden värjättiin CD44 ja osteopontiinissa edellä kuvatulla tavalla, ja kvantitoitiin morfometrisiin analyysin kanssa MetaView ohjelmistot (Universal Imaging, Downington, PA). Vähintään 5 satunnaisesti valitun 10 × tai 20 × kenttiä /jakso arvioitiin kunkin hiiren.

kvantitatiivinen immunohistokemiallinen analyysi

Formaliinifiksoidusta maksan ja kasvaimen leikkeitä costained varten Gli2 ja CK19. Vähintään 5 ductular alueiden, 20 x kentät kappaleessa, arvioitiin kunkin hiiren laskemalla solujen lukumäärä co-leimattu.

Maksan hydroksiproliinimäärityksen

hydroksiproliinipitoisuus kokonaan maksan yksilöiden kvantifioitiin kolorimetrisesti kuten aiemmin raportoitu [34].

GDC-0449 hoito

alkuperäisessä, annoshakuvaiheesta kohortin eläimiä, 16 Mdr2

– /- hiiret (ikä 57- 68 viikkoa) jaettiin hoidon ajoneuvon ohjaus (DMSO, n = 5), 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), tai 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6). Miesten ja naisten suhde oli molemmissa ryhmissä. GDC-0449 (Selleck Chemicals, Houston, TX) oli juuri perustettu päivittäin DMSO. Kaikki hiirille annettiin päivittäin intraperitoneaalinen injektio 9 päivää. Päivänä 10 eläimet lopetettiin. Näytteitä kerättiin kuten edellä. Toinen kohortti 20 Mdr2

– /- hiiret (ikä 51-59 viikkoa iässä) altistettiin koko kehon magneettikuvaus arvioida kasvaintaakkaa ja sitten paria hiirten verrattavissa kasvaintaakat määrättiin hoitoon joko DMSO (kontrolli, n = 10) tai 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10). Drugs toimitettiin kuten yllä on kuvattu; MRI toistettiin jälkeen 9

päivänä hoidon; hiiret uhrattiin ruumiinavaus ja kudosten sato.

Patologian

H 0,05.

Tulokset

Progressive kertymistä Hh-reagoivien solujen Mdr2

– /- hiirillä

Erilaiset akuuttien ja kroonisten maksavaurio indusoi maksassa ilmentymisen Hh ligandien ja aktivointi Hh reagoivien solujen. Seerumin ASAT ja ALAT olivat jatkuvasti korkeampia Mdr2

– /- hiirillä kuin ikä-verrokeilla (Kuva S1), joka vahvistaa, että hiirissä, oli krooninen maksavaurioita. Niinpä tutkituista maksa alkaen Mdr2

– /- hiirten Hh-reitin aktivoinnin. Verrattuna maksan proteiinilysaattien villin tyypin valvonnan, lysaatit Mdr2

– /- hiiret osoittivat kasvua Sonic hedgehog (Shh) ja Indian hedgehog (Ihh) Western blot-analyysi. Tämä kävi ilmi ensimmäisessä aikapisteessä tutkittu (2 viikon kuluttua syntymästä) ja ylläpitää koko elinkaaren eläinten (enintään 64 viikon iässä) (kuvio 1A). Immunohistokemiaallisesti Hh-säännelty transkriptiotekijä, Gli2, osoitti asteittaista ikään liittyvät kertyminen solujen ydin- Gli2 värjäytymistä Mdr2

– /- hiirissä. Tällaiset Gli2-positiivisten solujen mukana stroomasolut, sekä hepatosyyttiset ja ductular soluja (kuvio 1 B-C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Hh -systeemi aktivoituu kroonisesti loukkaantunut maksa Mdr2-hiirillä, jolloin asteittainen laajeneminen eri Hh-reagoiva solupopulaatioiden.

. Western blot analyysi Sonic Hedgehog (SHh-) ja Intian Hedgehog (IHh) kokonaan maksauutteista yhdistettiin nuorten Mdr2

– /- hiiret (2-16 viikkoa vanhoja), vanha (36-64 viikkoa vanha) Mdr2

– /- hiiret ja ikä verrokit (n = 3-5 hiirtä /ryhmä /aika kohta). Edustava Western blot osoittavat tulokset nuorten hiirillä näkyy. Mean ± SEM tietoja vanhempien hiirien piirretään. B. Edustavia maksa kohdat värjätään osoittamaan Gli2 nuorilta (4 vk vanha), keski-ikäinen (36 vk vanha) ja vanha (52 vk vanha) Mdr2

– /- hiirissä. Pieni Gli2 ilmentyminen todettiin villityypin hiirillä iässä tahansa, joten tulokset edustavasta 36 vk vanha villityypin hiiren näkyy. (10 ×) C. Quantitative Gli2 immunohistokemiallista dataa. Määrä ydin- Gli2 (+) solut laskettiin vähintään 5 HPF (HPF) per maksan osio Mdr2

– /- hiiret ja villityypin valvontaa 4, 36 ja 64 viikon iässä (n = 3 -4 hiirtä /ryhmä /aika kohta) ja keskiarvo ± SEM piirretään. * P 0,05, ** p 0,01 Mdr2

– /- ryhmät vs. verrokkeihin nähden.

hoito Mdr2

– /- hiirten kanssa tasoittaa estäjän, GDC- 0449, on turvallinen ja vähentää Hedgehog-reitin signalointi

määrittää sopivan annoksen GDC-0449, pilottitutkimus tehtiin 16 vuotiaiden (57-68 viikkoa vanha) Mdr2

– /- hiirissä. Eläimille annettiin päivittäin injektoimalla vatsaonteloon 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6), tai DMSO: vehikkelikontrolli (n = 5) ja 9 päivää ja lopetettiin sitten. Ei ollut tilastollista eroa kuolleisuuden välillä kontrolliryhmän ja suuren annoksen (40 mg /kg) GDC-0449 ryhmiä. Lopetettaessa maksa /kehon painosuhteet hiirten kolmessa ryhmät olivat myös samanlaiset, mikä viittaa siihen, että suhteellisen lyhytkestoinen systeemistä hoitoa GDC-0449 40 mg /kg on hyvin siedetty hiirillä, joilla on edennyt maksasairaus ja HCC (kuviot S2A -B). Western blot -analyysi maksan lysaatit tämän kohortti eläimiä, osoittivat, että GDC-0449 hoito vähensi Shh ligandin tasot suuremmalla annoksella, ja Gli2 ilmentymisen vaimennusta molemmilla annoksilla (kuvio S2C).

Hedgehog signalointi inhibition kanssa GDC-0449 kumotaan vaikutuksia Hh-signaloinnin on kohdegeenin ilmentymisen

tietojen perusteella hankittu meidän annoshakuvaiheesta tutkimus, toisen kohortin Mdr2

– /- hiirillä (51-59 viikkoa iässä ) määrättiin hoitoon ajoneuvon (DMSO; n = 10) tai 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10) kautta päivittäin ip injektio 9 päivää. Kokonaiselossaoloaika näiden kahden ryhmän välillä toisessa kohortissa oli sama, ilman kuolemantapausta DMSO hoitoryhmässä ja 1 kuoleman GDC-0449 hoitoryhmässä toissijainen iatrogeeninen vammoja. Sekä maksan parenkyymiin ja kasvaimia käsiteltyjen hiiret osoittivat vähentynyttä ilmentymistä Hh-reitin kohde Gli2 (kuviot 2A-B). Reaaliaikainen PCR-analyysi resektoitiin kasvainten paljasti, että GDC-0449 hoidon julkaisi estäviä vaikutuksia Hh-signaloinnin on PPARa, mikä aiheuttaa merkittävää kasvua sen geenin ilmentymistä (kuvio 2C). Hoito GDC-0449 myös aiheutti merkittävän laskun ilmentymä Gli1 toinen Hh kohdegeenin (kuvio 2D).

. Maksa leikkeet oli värjätty Gli2 edustavien DMSO ja GDC-0449- käsiteltyihin hiiriin (40 x). Kvantitatiivinen Gli2 immunohistokemia tietoja ei ollut kasvainta maksa käsiteltyjen hiirien DMSO tai GDC-0449 (n = 9-10 /ryhmä) piirretään keskiarvona ± SEM (

** p 0,01

. Määrä ductular soluja Gli2 positiivista värjäytymistä laskettiin jokaisen suuaukon suolikanavan /osan 40-kertaisella suurennuksella. B. tuumorisektioiden samasta hiiristä värjättiin myös osoittaa Gli2. tulokset edustava DMSO ja GDC-0449 hoidetuissa hiirissä näytetään. Quantitative Gli2 immunohistokemia data luotiin laskemalla ydin- Gli2 positiivinen ductular ja hepatosyyttiset solujen tuumorisektioiden alle 40-kertaisella suurennuksella. tulokset piirretään keskiarvona ± SEM Gli2-positiivisten solujen /40 × suuritehoiset kenttä (** p 0,01) C-D Quantitative käänteinen transkriptio-PCR (qRT-PCR) analyysi koko maksan RNA DMSO (avoin baari) ja GDC-0449 (musta palkki) käsitellyistä hiiristä. C. PPAR-γ, geeni, joka on normaalisti tukahdutettu Hh signalointi. D. Gli1 geeni, joka indusoi Hh signalointi. keskiarvo ± SEM piirretään (** p 0,01).

Hedgehog signalointi inhibitio GDC-0449 vähentää maksafibroosi

Mdr2

– /- hiiret osoittivat asteittaista ikään liittyvä nousu maksan ilmentyminen alfa-sileän lihaksen aktiini (α-SMA), merkkiaine myofibroblastic maksan tähtisolut (kuvio 3A, yläpaneeli). Tämä liittyi lisääntynyt ilmentyminen pro-fibrogenic tekijät, kuten transformoiva kasvutekijä TGF-β ja verihiutaleperäisen kasvutekijän PDGF-β (kuviot S3A-B), ja etenevän fibroosin, mistä on osoituksena Sirius punaisella värjäyksen (kuvio 3A, alhaalta paneeli) ja määrällisesti maksan hydroksiproliinipitoisuus (kuvio 3B). Hoidon GDC-0449 laski α-SMA-ilmentävien myofibroblastic soluja, maksan TGF-β ja PDGF-β, Sirius red värjäys, ja hydroksiproliinipitoisuus, osoittaa, että Hh-reitin inhibitio maksan fibroosi (kuviot 3C-D ja kuvioissa S3C- D).

. Immunohistokemiallinen värjäys α-SMA (yläpaneeli) ja Sirius red (alapaneeli) kohdissa kuin kasvain maksan edustavien samanikäisiin Mdr2

– /- ja villityypin hiirillä (10 x). B. Yhdistetty Maksan hydroksiproliinipitoisuutta 2-

52 vk-vanha Mies villityypin (WT) ja samanikäisiin Mdr2

– /- hiiret (n = 3-5 /ryhmä). Tulokset Mdr2

– /- hiiret normalisoitiin kuin samanikäisiin WT hiiret ja graafisesti kertainen muutos. Tiedot näkyvät keskiarvona +/- SD (* p 0,05) C. Ei-kasvain maksan leikkeet oli värjätty α-SMA (yläpaneeli, 20 x) ja Sirius red (alapaneeli, 10 x) edustavassa DMSO ja GDC – käsitelty Mdr2

– /- hiirissä. D. Heptic hydroksiproliinipitoisuus on DMSO ja GDC- käsiteltyihin hiiriin (n = 9 /ryhmä). Tulokset GDC-0449-käsiteltyjen hiirten normalisoitiin kuin DMSO ajoneuvon käsiteltyjen hiirten ja graafisesti kertainen muutos. Tiedot näytetään Mean +/- SEM (* p 0,05).

Hedgehog signalointi inhibitio GDC-0449 vähentää kertymistä maksan progenitorisolujen

Vastauksena vahinkoa, kantaisä populaatiot maksassa lisääntyä. Näin ollen, immunohistokemiallinen analyysi progenitorimerkkiaineiden, kuten sytokeratiini-19 (CK-19) ja α-fetoproteiini (AFP), osoitti, ikään liittyvän kasvaa Mdr2

– /- hiirillä (kuvio 4A). Co-värjäys CK19 ja Gli2 vahvisti, että progenitoripopulaation oli Hh reagoiva (kuvio 4B). Käsiteltäessä GDC-0449, progenitorimerkkiaineiden vähentynyt (kuvio 4C), mikä osoittaa, että Hh signalointi tarvitse pitää kantaisä populaatiot aikana tuumorigeneesiprosessin ja että Hh esto riitti supistaa kantaisä populaatioiden myös hiirillä, joilla on edennyt HCC.

. Immunohistokemiallinen värjäys maksan osien edustavien, samanikäisiin Mdr2

– /- ja villityypin hiiriin progenitorimerkkiaineiden, sytokeratiini-19 (CK-19) (ylälevyissä) ja ai a-fetoproteiinin (AFP) (alapaneeli) (20 x). B. edustaja micrograph portaalin kolmikko maksassa olevan Mdr2

– /- hiiri, joka osoittaa kolokalisaation CK-19 (sininen) ja Gli2 (ruskea) on ductular osastoon (40 x). C. Kvantitatiivinen Gli2 ja CK19 immunohistokemia DMSO ja GDC-0449-käsitellyn Mdr2

– /- hiiret (n = 9-10 /ryhmä). Määrä Gli2 ja CK19 kaksinkertainen positiivinen ductular-esiintyvät solut laskettiin kasvaimiin alle 20-kertainen suurennus. Keskiarvo ± SEM kaksinkertainen (+) solujen t kohti suuritehoiset kenttä (HPF) piirretään (* p 0,05) D. QRT-PCR-analyysi AFP kasvaimen RNA hiirille on DMSO (avoin baari) tai GDC-0449 (suljettu bar) tulokset GDC-0449-käsitellyissä hiirissä olivat normalisoitu kuin hiirillä, joita hoidettiin DMSO ajoneuvon ja piirretään keskiarvona ± SEM (* p 0,05).

pienentäminen Hedgehog signalointi vähentää ilmentymistä osteopontiinin ja estää kerääntymisen osteopontiinin reagoiva (CD44-positiivisia soluja)

Stem /progenitorisolupopulaatioilla monien syöpien, mukaan lukien HCC, arvellaan on rikastunut soluilla, jotka ilmentävät CD44, reseptori varren solun kasvutekijä, osteopontiinissa [35], [36]. Osteopontiinin ilmentymistä säätelee Hh signalointi [37]. Siksi tutkimme vaikutuksia GDC-0449 on osteo- ja sen reseptori, CD44. Immunohistokemia ja määrälliset morfometria osoitti, että inhibitio Hh-reitin kanssa GDC-0449 merkittävästi vähentynyt osteopontiinissa värjäystä perusterveydenhuollossa maksakasvain (kuvio 5A). Samanlaisia ​​hoitoon liittyvän vähentyneen CD44 + kasvainsoluissa todettiin myös (kuvio 5B). Geenien ilmentyminen analyysi osoitti, että geenien molempien osteopontiinin ja CD44 mRNA: t myös taipumus vähentyä vuonna GDC-0449-hoidetut hiiret (kuvio 5C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Hh-signalointi voi säädellä oletetun maksasyövän kantasolujen /esisolujen moduloimalla saatavuus osteopontiinin.

. Tuumorisektioiden edustavien DMSO ja GDC-0449 käsiteltiin Mdr2

– /- hiiret värjättiin osoittamaan osteopontiinissa (OPN) edustaja ovat näkyvissä (

Oikea paneeli

). OPN värjäytyminen kvantitoitiin morfometrisiin analyysi ainakin 5 HPF per kasvain jakso käyttäen 20-kertainen suurennus (n = 5 hiirtä /ryhmä). Tulokset GDC-0449-hoidetussa ryhmässä normalisoitiin kuin ryhmässä, jota käsiteltiin DMSO ajoneuvon ja graafisesti kertainen muutos. Tiedot näkyvät keskiarvona ± SEM (** p 0,01). B. immunohistokemiallinen värjäys varten osteopontiiniin reseptorin, CD44, peri kasvaimen kudokset edustavien DMSO ja GDC-0449- käsitelty Mdr2

– /- hiirissä. (

Oikea paneeli

) CD44-värjäys kvantitoitiin morfometrisiin koskeva arviointi A. Tulokset GDC-0449-käsiteltyjen hiiret normalisoitu kuin vehikkelillä hoidettuihin kontrolleihin ja piirretään keskiarvona ± SEM (** p 0.01). C. QRT-PCR-analyysi maksakasvain RNA DMSO (avoin baari) ja GDC-0449- (suljettu bar) käsiteltiin Mdr2

– /- hiirten OPN (vasemmalla) ja CD44 (oikealla). Sen jälkeen normalisoinnin tuloksia DMSO-hoidetussa ryhmässä, keskiarvo ± SEM piirrettiin (* p 0,05).

MRI ja histologiset maksakasvain involuution seuraavat GDC-0449 hoito

arvioidaan mahdollisia muutosten vaikutusta matriisin ja progenitorisolujen HCC, esi- ja jälkikäsittely kasvainten tilavuudet analysoitiin magneettikuvaus (kuviot 6A-B). Analyysi hiirissä ilman ilmeistä etäpesäkkeiden osoitti, että kasvaimen pienenivät hiirissä, jotka saivat 9 päivää aikana GDC-0449-hoidon, kun taas vehikkelillä hoidetuilla eläimillä osoittaa pysyviä kasvaimen kasvua (kuvio 6C; -6,7% + /- 11,7% vs 22,7% +/- 9,1%, p = 0,03). Tämä data korreloi ruumiinavauslöydökset: Vain 56% GDC-0449-käsitellyillä hiirillä oli näkyvissä maksakasvaimien kyhmyt, verrattuna 80%: n DMSO: ta hiirillä (taulukko 1). Lisäksi sekä MRI ja ruumiinavaus osoitti määrän väheneminen etäpesäkkeiden GDC-0449-käsitellyissä hiirissä verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin (taulukko 1). Histologinen analyysi H kuvio 6D, yläpaneeli), microvesicular steatosis (40% vs 0%, kuvio 6D, keskimmäinen paneeli), asidofiilisiä kuolion ja rappeuttavat soluliman muutokset (70% vs. 40%, kuvio 6D, alapaneeli) verrattuna kasvaimiin ajoneuvojen hoidettujen eläinten. Siten havainnot MRI, ruumiinavauksessa, ja maksan histologia olivat johdonmukaisia ​​ja osoittaneet, että Hh-reitin estäminen aiheutti merkittävää regressiota primaarinen ja metastaattinen HCC.

. Edustavia poikkileikkaus kuvan maksansisäisten kasvain yksilöinyt varjoainetehosteisiin MRI seuraavat GDC-0449 hoitoa. B. Edustavia MRI kuvia sagittaalista, koronan, ja viistot näkökulmia käytetään tilavuuden analyysiä. C. muutos kasvaimen tilavuuden kvantitoitiin tietokoneistaa syntyy tilavuuden mittaukset ja piirretään keskiarvona ± SD (* p 0,05). D. micrographs edustavista histologisia aiheuttamien muutosten, GDC-0449, hoito. Top paneeli esittää tuumorinekroosi; keskimmäinen paneeli osoittaa rasva rappeutumista; pohjapaneeli näytä vakuoleja kasvainsolujen pyknotic ytimeksi.

Keskustelu

Tutkimme Mdr2

– /- hiirillä onko vai ei aktivointia Hh-reitin vaikuttaa omalta että hepatokarsinogeneesin aikana kroonisen fibrosing maksavaurioita. Mdr2-hiirillä puuttuu fosfolipidin flippase joka tarvitaan normaaliin sappi muodostumista, ja näin ollen niillä maksavaurion ja ductular leviämisen nuorena. Kaikki kärsivissä hiirissä lopulta kehittää merkittävää maksan fibroosi ja metastaattisen HCC. Tuloksemme osoittavat, että tämä patologia liittyy progressiivinen aktivoitumisen Hh-reitin. Käyttöön erityinen estäjä keskeisten Hh signalointi väli, tasoittaa, vähentää signalointia ja osoittaneet, että jatkuva Hh signalointi tarvitaan ylläpitämään kasvatettujen populaatioiden maksan myofibroblasteja ja esisolujen joka oli kertynyt vaurioitunut maksa. Lisäksi hoitoon ikäinen Mdr2-hiirillä (joka oli jo kehittynyt maksan fibroosi ja HCC) Hh-reitin estäjä vähensi maksafibroosin ja kasvaintaakkaa, mikä osoittaa ensimmäistä kertaa, että estämällä Hh signalointi on kliinisesti merkityksellisiä, terapeuttista arvoa sekä maksan fibroosia ja HCC. Vielä kiinnostavampaa on näyttöä siitä, että estävää vaikutusta maksan kasvainten kasvua

in vivo

koskee sekä sisäistä maksan HCC ja etäinen etäpesäke.

Lisäksi tuloksemme tarjoavat tietoa joitakin taustalla mekanismeista. Maksan tuotanto Hh ligandien nostettiin hiirillä, jotka kehittyi progressiivinen maksafibroosin ja invasiivisia HCC. Nämä hiiret osoittivat myös jatkuvasti korkeammat seerumin aminotransferaasiarvot, sopusoinnussa muun todistusaineiston Mdr2 puute provosoi krooninen maksasolujen vahinko [38], [39]. Erilaiset stressitekijät, jotka vähentävät maksasoluviljelmissä elinkelpoisuus on osoitettu aiheuttavan tuotannon ja vapautumisen Hh-ligandien haavoittunut maksasolujen [40], [41]. Siten maksasolujen vahinko todennäköisesti yksi tekijä, joka lisää Hh ligandi sukupolven mdr2 puutteesta maksa. Myofibroblastic solut ja ductular-tyyppinen esisolujen joka vähitellen kertyvät kroonisesti loukkaantunut maksa tuottavat myös Hh ligandeja, sekä muista tekijöistä, kuten PDGF-β, jotka stimuloivat autocrine-paracrine synteesiä Hh ligandien [20], [42].