Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monissa syöpätyyppeihin, puoli väestö (SP) on tunnistettu perustuu korkeaan ulosvirtausta kapasiteetin, mikä rikastuttaa solunsalpaajaresistentti solujen sekä ehdokas syövän kantasoluja (CSC). Täällä tutkimme, ihmisen haiman adenokarsinooma (PDAC) sisältää SP, ja onko sen geeniekspressioprofiili liittyy chemoresistance CSC ja ennustetta. Sen jälkeen dispersio yksittäisiksi soluiksi ja inkubaation Hoechstin värillä, analysoimme ihmisen PDAC asemointia yksilöitä käyttämällä virtaussytometria (FACS). Olemme tunnistaneet SP ja valtaväestön (MP) kaikissa ihmisen PDAC resektio näytteitä (n = 52) analysoitiin, mutta havaittiin immuuni (CD45

+) ja endoteelin (CD31

+) solujen tässä jae yhdessä kasvainsolujen . SP ja MP soluja, tai enemmän puhdistettua fraktioiden köyhdytetyn alkaen CD31

+ /CD45

+ soluja (PSP ja PMP), lajiteltiin FACS ja alistetaan koko genomin ilmentymisanalyysiä. Tämä paljasti säätelyä liittyvien geenien hoidon kestävyys ja merkkiaineiden tunnistettu aikaisemmin otaksuttu haiman CSC. PSP geeni allekirjoitukset 32 ​​tai 10 ylä- tai vaimentua geenit kehitettiin ja testattiin syrjivä osaamisen välillä PSP ja PMP eri sarjaa PDAC näytteitä. Ennustavia arvo PSP geenien validoitu suuri itsenäinen sarja PDAC potilaiden (n = 78) käyttäen NCounter analyysi ilmaisun (kasvaimen

versus

ympäröivän haimakudoksesta) ja Coxin regressio taudista vapaan ja yleisen eloonjääminen. Näistä geeneistä, ekspressiotasot

ABCB1

ja

CXCR4

korreloivat huonompi potilaan selviytymistä. Siten tutkimuksemme ensimmäistä kertaa osoittaa, että ihmisen PDAC sisältää SP. Tämä kasvain alapopulaatio voi edustaa arvokkaan terapeuttisen tavoitteen antanut chemoresistance- ja CSC liittyvän geenin ilmentymisen ominaisuudet mahdollisten ennusteen arvioinnissa.

Citation: Van den Broeck A Vankelecom H, Van Delm W, Gremeaux L, Wouters J , Allemeersch J, et al. (2013) Human Haimasyöpä Sisältää Side Population ilmaiseminen Cancer Stem Cell-Associated ja Prognostiset Genes. PLoS ONE 8 (9): e73968. doi: 10,1371 /journal.pone.0073968

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 15, 2013; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2013; Julkaistu: 17 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Van den Broeck et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukee tieteellisen tutkimuksen rahasto Flanders (FWO ASP-08-00379; 3M080177). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka suuria pyrkimyksiä parantaa sen ennustetta, haimasyöpä (haiman adenokarsinooma tai PDAC) on edelleen merkittävä syy syöpään liittyvää kuolleisuutta [1]. Viivästynyt havaitseminen ja hoito kestävyys ovat kriittisiä tekijöitä PDAC hoidon epäonnistumisen. Parempi ymmärrys mekanismeista hoito vastus on siis välttämätöntä. Useissa syöpätyyppien, puoli väestö (SP) on tunnistettu alapopulaation joka rikastuttaa soluja, jotka ovat kemo- ja säteilyresistenteille johtuen läsnäolon monilääke kuljettajat ja kyky korjata DNA-vaurioita ja kestävät apoptoosin [2]. Perustuen niiden ulosvirtausta kapasiteettia, SP solut tunnistetaan flow-metrimittausmenetelmille (FACS) kuin puoli haara ”Hoechst-low” solujen kanssa inkuboinnin jälkeen Hoechst33342 väriaine [3].

Hoito vastus pidetään myös erityisominaispiirteen niin sanottuja syövän kantasolut ”(CSC) [4]. CSC arvellaan hengissä tavanomaisten hoitojen ja siksi vastuussa kasvaimen uusiutumisen. Ehdokas haiman CSC ovat viime aikoina on tunnistettu perustuen solukalvon merkkiaineita. CD24

+ /CD44

+ /epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EPCAM)

+ solujen ja CD133

+ solut osoitettu olevan CSC ominaisuuksia [5], [6]. Kuitenkin vain osittainen päällekkäisyys havaittiin näiden eri haiman CSC populaatiot, mikä osoittaa, että tarvitaan vaihtoehtoisia tunnistamista strategioita. Eri syöpätyyppien, SP on osoitettu rikastua CSC (kaltainen) fenotyyppi ja toiminta [7]. Mitä haimasyöpä, SP aiemmin oli viljellyissä solulinjoissa [8] – [11], ja viime aikoina, ryhmämme havaitsi SP ksenograftikasvaimissa kasvanut ihmisen PDAC näytteistä immuunivajaissa hiirissä [12]. Nämä SP osoitettiin olevan solunsalpaajaresistentti kapasiteettia. Ei kuitenkaan ole osoitettu, onko PDAC suoraan potilaasta, puuttumatta kulttuurin tai laajentumista hiiren vastaanottavaan ympäristöön, sisältää myös SP. Tässä tutkimuksessa raportoimme että PDAC eristetty potilailta satamat SP ja että tämä SP ilmentää geenejä, jotka liittyvät haiman CSC ja chemoresistance sekä potilaan ennustetta.

Materiaalit ja menetelmät

PDAC Näytteet ja SP Analysis

Vuosien 2008 ja 2010, PDAC kirurginen resektio näytteet saatiin 52 potilasta yliopistollisessa sairaalassa Leuven (UZ Leuven, Belgia), kun kirjallinen suostumus. Tutkimuksen hyväksyi UZ /KU Leuven eettisen lautakunnan ennen potilaan rekrytointi, ja sai tutkimusnumero ML3452. Tutkimus rekisteröitiin clinicaltrials.gov numerolla NCT00936104. Resektion jälkeen, kasvaimen lohkot jauhettiin pieniksi paloiksi ja inkuboitiin kollagenaasia tyyppiä IV (1 mg /ml Medium 199; Invitrogen, Grand Island, NY), 2-3 tunnin ajan, kun taas mekaanisesti dispergoitu säännöllisesti 20 minuutin ajankohtina. Lopullinen solususpensio suodatettiin 40 pm nylon mesh (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia), ja solujen lukumäärä ja elinkelpoisuus määritettiin. Elinkelpoisuuden solujen jälkeen saatu dispersio PDAC kudosten oli rutiininomaisesti -50%, ja saanto 400 mm

3 juuri saatu PDAC näytteissä oli noin 3 x 10

6 eläviä soluja.

SP analyysi tehtiin edellä kuvatulla

3. Soluja inkuboitiin Hoechst33342 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgia) 90 minuutin aikana, jonka lopullinen konsentraatio on 5 ug /ml, ja analysoitiin FACS: llä (FACSVantage SE, joissa FACS DIVA ohjelmiston, versio 6.0, BD Biosciences). Laserit käytettiin: lähes UV (375 nm, 10 mW), sininen (488 nm, 13 mW) ja keltavihreä (561 nm, 30 mW). Suodattimia käytettiin: 450/40 Hoechstin blue; 630/22 ja 610 LP Hoechstin punainen; 530/30 ja 520 LP FITC; ja 582/15 PE. Propidiumjodidia (2 ug /ml; Sigma-Aldrich) lisättiin merkitä ei-elinkelpoisten solujen, lukuun ottamatta jäännökset Hoechst-sininen ja Hoechst-punaisen kanavan. Dual-aallonpituus FACS-analyysi tunnisti puolelle haara ”Hoechst-low” solujen SP, edelleen todentaa yhteistyötä lisäämällä verapamiili (100 uM, Sigma-Aldrich), mikä vähentäminen SP koko estämällä väriaine ulosvirtaus monilääke kuljettaja (t). Tärkeimmät väestöstä (MP) on aidatulla koska pääosa ”Hoechst-kirkas” soluja. Lisäkarakterisointia, PDAC solut immunovärjättiin endoteelisolujen markkerin CD31 ja hematopoieettisten /immuunimarkkerina CD45. Inkubaation jälkeen Hoechst, solut liuotettiin värjäyspuskurilla (PBS + 2% FBS), ja fluoreseiini (FITC) -leimattua anti-humaani-CD31 ja fykoerytriini (PE) -leimattua anti-humaani-CD45-vasta-aineita lisättiin käyttäen laimennoksia suosittelemia valmistaja (BD Biosciences). Molemmat isotyypin (BD Biosciences) ja positiiviset kontrollit tehtiin. Muita värjäykset eivät tehneet sillä ne voivat haitata analyysin FACS tuloksen.

Koko genomin Expression analyysi Microarray

25000 SP ja 25000 MP soluja (yhteensä tai köyhdytetty peräisin CD45

+ /CD31

+ solut), lajiteltiin FACS kylmään lyysin liuokseen, jossa RNeasy Micro Kit (Qiagen, Venlo, Alankomaat). Kokonais-RNA uutettiin mukaan valmistajan ohjeiden. RNA-pitoisuus ja puhtaus määritettiin spektrofotometrisesti käyttäen Nanodrop ND-1000-järjestelmä (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) ja RNA: n eheys arvioitiin käyttäen Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Vain näytteiden RNA Integrity Number (RIN) ≥7.5 käytettiin edelleen mikrosiruanalyysi klo VIB Nucleomics Core (www.nucleomics.be). RNA monistettiin NuGEN Pico WTA Kit (Nugen Technologies, Santa Carlos, CA) ja sen jälkeen biotinyloitu. Lopullinen Arna seos puhdistettiin ja hajanainen, ja hybridisoidaan sitten päälle Affymetrix HG U133 Plus 2.0 paneelit (Affymetrix, Santa Clara, CA), mitä seurasi värjäys ja pesemällä GeneChip- fluidistorijärjestelmä asemalle 450 (Affymetrix) mukaan valmistajan menettelyjä. Mittaamaan raaka koetin signaalin intensiteettiä, sirut skannattiin käyttäen GeneChip- skanneri 3000 (Affymetrix) ja analysoitiin affy_1.26.0 paketti (Bioconductor, Seattle, WA).

Tilastollinen ja toiminnallinen analyysi Microarray Data

raaka microarray data normalisoitiin sisällä paneelit ja välillä paneelit jälkeen Robust Multichip keskiarvo (RMA) menettely [13]. MAS 5.0 algoritmia (Microarray Suite käyttöohjeet, versio 5; Affymetrix 2001) käytettiin arvioimaan havaitsemiseen yli taustan. Vuodesta 54616 koetinsarjojen, 10255 olivat alle taustan ja jätetty tarkempaa analyysiä. Principal Component Analysis (PCA) tehtiin kanssa pcurve paketin Bioconductor ja käytetään laskemaan tärkeimmät lähteet vaihtelu näytteiden välillä. Vertaileva analyysi välillä SP ja MP, tietoja pariksi potilasta kohden. Limma paketin Bioconductor käytettiin arvioitaessa kontrastia SP ja MP [14]. Tilastollinen merkitys tämän kontrastin testattiin moderoitu t-testiä (toteutetaan Limma). Merkittävästi ylä- tai vaimentua geenejä määriteltiin geenien ≥2-kertainen muutos (log

2 SP /MP≥1 tai ≤-1), yhdistettynä p 0,001. Klassinen järjestelmiä säätää useita testaus saattaa vähentää tilastollista voimaa microarray tutkimuksia. Tiukat raja-p 0,001 käytettiin vaihtoehtona, pragmaattinen lähestymistapa tasapainottaa väärien positiivisten lukumäärän ja väärien negatiivisten [15]. Geenien ilmentyminen tiedot ovat saatavilla Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) kautta sarja-hakunumero GSE42404. Toiminnalliset polku analyysi kaikki merkittävästi ilmentyvät eri koetinsarjojen tehtiin nerokkuus Pathway Analysis (IPA) ohjelma (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com, Redwood City, CA), rakennettu Ingenuity Knowledge Base, käsin kuratoitu kirjallisuuden tietokanta. Kaikki koetin, joissa on korjattu p-arvo 0,001 ja kansi muutos 2 tai -2 käytettiin hyväksi. Mikäli useita koettimia tarkoitettu samaa geeniä, keskimääräinen log

2-suhde joukon merkintä arvoja tämän geenin otettiin lisäanalyysiä varten. Luotu verkostoja määräsi pistemäärä tarkoittaa merkitystä, arvioi suhteena syötettyjen antureista että kartoitettu polkua jaettuna kokonaismäärä reitin koettimia. Merkityksen biologisten toimintojen ja kanonisen reittejä testattiin Fisherin testiä p-arvo levityksen jälkeen Benjamini-Hochberg menetelmä useiden testaus korjauksen. Väylät pidettiin merkittävinä, kun p 0,05. Muita tunnistamaan biologisia toimintoja (Gene ontologia, GO) ja Kegg (Kioto Encyclopedia of Genes and Genomit) väyliä suoritettiin käyttäen Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID, versio 6.7, http: //www.david.abcc. ncifcrf.org). Tätä analyysiä varten koetin asettaa kanssa korjattu p-arvo 0,001 ja a 2,0-kertainen muutos käytettiin hyväksi. EASE- pisteet, modifioitu Fisherin p-arvo testissä käytettiin säätämään useita testejä.

Kehitetään Gene Signature

ohjattu oppiminen strategiaa sovellettiin microarray data CD45

– /CD31

– SP ja MP väestön (eli puhdistettu SP tai PSP, ja PMP). Luettelo 200 kiinnostavia geenejä muodostui perustuu perusteelliseen kirjallisuuden tutkimus käyttäen seuraavia termejä: ”haimasyöpä”, ”syövän kantasoluja”, ”puoli väestö”, ”kanoninen polkuja”, ”stemness geenejä”, ”epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) ’,’ monilääkeresistenttisyyttä ’,’ onkogeenien ”ja” Polycomb geenejä ”. Esikäsitellyt tiedot rajoittuivat 512 koetinsarjojen (195 geenejä), joka oli geeni symbolia luettelossa 200 kiinnostuksen kohteena olevia geenejä. Kaikkiaan 29 eri luokittelu lähestymistapoja käytettiin, edustavat eri yhdistelmiä 5 luokittelu mallien, 3 tilaa ominaisuuksien hallintaan ja 3 ranking menetelmiä [16]. Arvio näistä lähestymistavoista tehtiin käyttäen leave-one-out-ristivalidointi (LOOCV) luoda toimivan vastaanottimen (ROC) käyrä [17]. Yksiulotteista ominaisuus valintamenetelmien osoittautui olevan mitään lisäarvoa, koska optimaalinen lähestymistapaa korkein ala ROC-käyrän (AUC) ja alin tasapainoinen virheprosentti (BER) koostui tukivektoriluokitin ennakolta ominaisuus ranking tai valinnan (tietoja ei esitetä ). Edelleen vähentää geeni allekirjoitusta, käytimme PINTA strategiaa geenin ehdokas tärkeysjärjestykseen [18]. Tarkastelemalla ero ilmaus naapurustossa geenin genomin laajuinen proteiini-proteiini vuorovaikutus verkko, PINTA strategia tehokkaasti suorittaa monimuuttuja ominaisuuksien hallintaan kautta sisällyttämällä etukäteen tietoa molekyylibiologian. Ryhmä 32 geenejä siirrettiin merkittäväksi, ja koetin, joissa on korkein ekspressiotaso valittiin. Lopuksi PINTA allekirjoitus edelleen kaventunut niille 10 geenejä, joilla on suurimmat kertaluokkamuutos (ylös tai alas).

ennustearvo 32-geenin ja alennettu 10-geeni allekirjoitusta validoitu LOOCV eri SP

versus

MP aineistoja.

NCounter Analysis

Vuosien 2006 ja 2010 kudosnäytteet kerättiin, kun tietoon perustuvan suostumuksen potilailta, joille tehtiin haiman resektio varten PDAC. Näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa RNAlater (Qiagen). Primaarikasvaimen 143 potilasta ja ympäröivien ei-kasvaimen haiman (kontrolli) kudoksen 14 potilasta, kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNeasy Mini Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vain näytteiden RNA eheyden numero (RIN) on 7.0 käytettiin lisäanalyysiä, eli 78 PDAC näytettä (mies /nainen suhde: 41/37; ikä: 32-80 v mediaani 64 v) ja 6 kontrollisilkkipaperia (mies /nainen suhde: 4/2; ikä: 51-66 v mediaani oli 63 vuotta). Kasvainten ominaisuuksiin ja prognostiset piirteet (joissa seurannan heinäkuuhun 2011) on 78 potilaille annetaan (katso taulukko S1). Käyttäen NCounter järjestelmän (Nanostring Technologies, Seattle, WA), ekspressiotasot edellä määritelty allekirjoitus geenejä määrällisesti haimakasvaimesta

vs.

ympäröivän kudoksen (VIB Nucleomics Core) [19].

ABCB1 immunohistokemia PDAC Kaarileikkaus näytteet

ekspression analysoimiseksi ABCB1 proteiinin immunohistokemiallisesti, 5 um: n leikkeet valmistettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu PDAC näytteet 11 potilasta, joiden PSP ja PMP RNA käytettiin microarray-analyysi. Sen jälkeen deparaffinization ja nesteytys dioja, tavoite haku tehtiin EnVision FLEX Target Retrieval Solution (Dako, Glostrup, Tanska) 20 min aikana. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin käyttämällä EnVision Peroxidase-Blocking Reagent (Dako) 5 min. Leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (anti-ihmisen ABCB1 päässä Monosan, Uden, Alankomaat) suositellulla laimennuksen (1/20) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen levyt prosessoitiin käyttäen EnVision Dual Link (Dako). Monimutkainen visualisoitiin DAB (3,3′-diaminobentsidiini, Dako), jonka jälkeen hematoksyliinillä (Dako) counterstaining. Kuvat on otettu Leica DC 300 kamera Leica DMLB mikroskoopilla.

Tilastollinen analyysi

SAS Statistical Software (versio 9.1; SAS Institute, Cary, NC) käytettiin kaikkiin tilastolliset analyysit. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tautivapaa elinaika (DFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS) laskettiin käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmällä (taulukko S1). Testataan ennusteen arvioinnissa geenien, yhden muuttujan analyysi DFS ja OS suoritettiin käyttäen Coxin regressiota ja ilman rajoitettua kuutiometriä splinit (RCS), jonka jälkeen monimuuttujamenetelmin OS käyttäen Coxin regressiota. Valittu malli käytettiin analyysiin riippumattomia muuttujia jo korreloi elinaika (ECLNI, sukupuoli, pM ja pT; katso taulukko S1).

Tulokset

Human Haimasyöpä Sisältää Side Population

Human PDAC resektio näytteet analysoitiin läsnäolon puolella väestöstä (SP). Kaikissa tutkituissa näytteissä (n = 52), joka on SP tunnistettiin edustaa 0,2 21,5% (mediaani: 1,8%) koko PDAC solut (Fig. 1A).

A) Dot juoni dual aallonpituus FACS-analyysi tuoretta ihmisen PDAC solujen inkubaation jälkeen Hoechst33342 kuvaten hännän ”Hoechst-low” solujen (SP), suhteessa suurempi pääosa ”Hoechst-kirkas” soluja, kantaväestön (MP) (

jäljellä paneeli

). Edustava esimerkki esitetään ja SP osuus ilmoitettu. PI

pos (kuolleet) solut jätettiin pois analyysin Hoechst33342, CD45 ja CD31 merkintöjä. Boxplot (

upotus

) yhteenveto SP mittasuhteet 52 PDAC analysoitujen näytteiden. Verapamiili estää Hoechst ulosvirtausta, mikä vähentää SP koon ja vahvisti SP fenotyyppi (

oikea paneeli

). B) FACS dot juoni PDAC SP, immunovärjättiin CD45 ja CD31. Edustava esimerkki esitetään. Numerot osoittavat osuudet CD45

+, CD31

+ ja CD45

– /CD31

– solujen SP. C) Principal Component Analysis (PCA) sekä koko genomin ekspressioprofiileja saadut CD45

– /CD31

– SP (PSP,

punainen

) ja CD45

– /CD31

– MP (PMP,

sininen

) (n = 11). D) immunohistokemiallinen värjäys ABCB1 vuonna PDAC resektio näytteistä (n = 11). Edustava esimerkki (4% SP FACS-analyysi) on esitetty. Alkuperäinen suurennus: x200 (

jäljellä

) ja x400 (

oikea

).

SP ja ”valtaväestön ’(MP) soluja (ks. 1A gating) lajiteltiin FACS ja alistetaan koko genomin ilmentymisen profilointi (n = 10 PDAC). Kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) paljasti SP geenien ja reitit, jotka liittyvät immunologisiin prosesseihin, kuten ”auttaja-T-solun erilaistumisen”, ”välinen tiedonsiirto synnynnäisen ja adaptiivisen immuunijärjestelmän solut” ja ”dendritic cell kypsymisen” (tuloksia ei ole esitetty). Immuuni-tyypin solujen sekä endoteelisolujen tiedetään samanaikaisesti erottaa vaihtelevissa määrin SP kudosten ja kasvaimia. Näin ollen, olemme analysoineet ihmisen PDAC SP virtaussytometrialla ilmentämiseen immuunijärjestelmän /hematopoieettiset merkki CD45 ja endoteelisolujen markkerin CD31. Noin 60% SP solut ovat CD45

+ (mediaani: 61,4%, vaihteluväli: 19,5-75,4%; n = 18), kun taas vain pieni määrä SP solut ovat CD31

+ (mediaani: 0,7%, alue: 0,2-2,1%; n = 15) (Fig. 1 B). CD45

+ ja CD31

+ soluja havaittiin myös MP samalla tasolla (mediaani 63,7% ja 1,6%, ja alue: 41,1-75,4% ja 0,1-6,7%, tässä järjestyksessä). Myöhempinä analyysejä, SP ja MP depletoitiin CD45

+ ja CD31

+ solut.

puhdistetun PDAC SP Näyttää Expression of CSC liittyvien geenien

lajiteltu CD45

– /CD31

– SP ja CD45

– /CD31

– MP-solujen (edelleen kutsutaan puhdistettua SP tai PSP, ja puhdistettu MP tai PMP, vastaavasti) 11 PDAC näytteistä ja suoritetaan uudelleen koko genomin ilmentymisen profilointi. Principal Component Analysis (PCA), osoittaa, että hopsia klusteriin ja erottaa siitä PMPs (Fig. 1 C).

1861 koetinsarjojen, jotka ilmentyvät differentiaalisesti (≥2-kertainen, p 0,001), 993 ovat voimistussäädellään PSP ja 868 ovat vaimentua (ks GEO, hakunumero GSE42404). Usealle transporter

ABCB1

(

MDR1

,

P-glykoproteiini

) on erittäin yliaktiivista PSP

verrattuna

PMP (fold: 5,3, p 0,5), mutta mikrosiru signaali oli yleensä alhainen, ei yli taustan puolessa näytteistä. Mielenkiintoista, aiemmin kuvattu haiman CSC markkereita (kuten

CD44, CD133

ja

CXCR4

) yliekspressoituvat merkittävästi PSP (taulukko S2). Lisäksi muut (syöpä) ’stemness ”geenejä (kuten

LGR4, SOX9, KLF5

ja

MET

) myös yläreguloituja PSP.

Kaikista ilmentyvät eri koetinsarjojen, 1690 voitaisiin kuvata geenien kekseliäisyyttä Knowledge Base ja alistettiin IPA (taulukko S3). Verkkojen eniten voimistunut PSP ovat ”Amino acid aineenvaihduntaan” (joka sisältää

HNF4A

tai ”hnf4a”, fold: 2,7, p 0,001), ”Cell-soluun signaloinnin ’( joka sisältää

TJP2

tai ”tiiviin liitoksen proteiini 2 ’, fold: 2,4, p 0,001) ja” Cellular muodostumista ja kasvua ”(joka sisältää

EPHA2

tai” Efriini reseptorin A2′, taita : 2,1, p 0,001 ja

EPHA4

, fold: 2,6, p 0,001).

Biologiset toimintoja rikastunut PSP

verrattuna

PMP käsittää ”Cellular liikettä ’,’ Cell-soluun signaloinnin ja vuorovaikutuksen ”,” Cellular kasvun ja leviämisen ”,” Alkion kehitys ”,” kasvain morfologia ”ja” Cancer ”(taulukko S3). Erotella pSP- ja PMP-liittyvä biologisia toimintoja yksityiskohtaisemmin, DAVID analyysiä sovellettiin. Clusters liittyvät ”Cell-soluliitos” (Enrichment Pisteet tai ES: 6,8), proteiinikinaasin aktiivisuutta ”(ES: 3,4),” Development ”(ES: 3,0),” Mitogeenillä aktivoitu (MAP) kinaasiaktiivisuutta ”(ES: 1,8), Integriini signalointi ”(ES: 1,6) ja” asetus apoptoosin ”(ES: 1,4) rikastuvat PSP.

Canonical polkuja, jotka perustuvat eri tavalla ilmaistuna geenejä, analysoitiin myös käyttämällä IPA. Useita 46 kanonisen polkuja saavuttanut merkittävän SP rikastamiseen katkaisu p 0,05, mukaan lukien ”Ihmisen kantasolujen pluripotenttisuus”, ”tiiviin liitoksen signalointi”, ”NF-KB signalointi”, ”Wnt /β-kateniinin signalointi”, ”integriini signalointi” ja ”Efriini signalointi” (taulukko S3). Lisäksi yksityiskohtainen analyysi käyttäen DAVID (Kegg väyliä) osoitti ylössäätely ”ErB signalointireitin” (mukaan lukien

ErbB3

, fold: 2,1, p 0,001) PSP.

Gene Allekirjoitukset että Discriminate PDAC PSP PMP

Käyttämällä ohjattua oppimista strategiaa sovelletaan koko genomin ilmentyminen tietoja 11 CD45

– /CD31

– PSP ja PMP pareittain edellä analysoitu, kehitimme sarja 512 koetinsarjojen (195 geenejä) mahdollisina ”PSP geeni allekirjoitus”. Tarkkuuden erotella PSP ja PMP käyttämällä tätä allekirjoitusta 95% koulutukseen kohortissa, kun arvioidaan LOOCV (katso materiaalit ja menetelmät).

Käyttämällä PINTA (katso materiaalit ja menetelmät), tämä suuri PSP geenin allekirjoitus aleni 32 geenejä, joista 19 on voimistunut ja 13 vaimentua (taulukko S4). Validointi tämä pienentää PSP geeni allekirjoitus alkuperäisessä aineisto (n = 11 PDAC näytettä) osoitti 91% luokitustarkkuudesta PSP ja PMP, verrattavissa ennustamiseen käyttäen 195-geenin allekirjoitus. Sisällä 32-geenin allekirjoitus, geenien upregulated PSP ovat aiemmin ehdottanut haiman CSC markkereita (

CXCR4

,

CD133

) tai mahdollisuus vaikuttaa monilääkeresistenssin (

ABCB1

) ja reitteihin tärkeitä kasvainten synnyssä ja syövän etenemistä (katso taulukko S4).

Lopuksi vielä kaventunut geeni allekirjoituksen niille 10 geenien suurimman taittaa ylös- tai alisäätely (taulukko S4, lihavoitu). Tarkkuus Tämän tiivistyneen geenin allekirjoituksen erottaa PSP PMP (90%) on verrattavissa erottelukykyä 32-geeniperimä.

Koska lopullinen testi erotteleva arvo 32- ja 10- geeni allekirjoitukset, haimme molemmissa ylimääräinen riippumaton sarja 10 SP /MP paria käyttäen LOOCV. Molemmat geeni allekirjoitukset esitti erotteleva tarkkuus välillä SP ja MP 85%.

Prognostic arvo ABCB1 ja CXCR4

Sen tutkimiseksi, geenit PSP (32- ja 10-) geeni allekirjoitukset ovat ennusteen arvioinnissa, ekspressiotasoja ensin määritettiin riippumattoman sarjassa potilaiden (n = 78, taulukko S1) kasvaimen

versus

ympäröivään kudokseen käyttämällä NCounter analyysiä (katso materiaalit ja menetelmät) ja sen jälkeen niille yhden muuttujan analyysin mahdollisten korrelaatio prognoosi /selviytymistä. Ensin allekirjoitus geenien yli-ilmentynyt PSP liittyvät ennusteeseen kun taas mitään korrelaatiota löydettiin allekirjoitus geenien vaimentua PSP (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi säätelyä

ABCB1

ja

CXCR4

merkittävästi korreloi huonompi ennuste, eli alhaisimman OS ja DFS (taulukko S5). Monimuuttujamenetelmin Sitten suoritettiin geenien p 0,1 yhden muuttujan analyysiin, (

ABCB1

,

ADAM10

,

CDH1

,

CXCR4

,

ESRP1

,

MMP1

,

RAB25

,

ST14

), nimeävät

ABCB1

itsenäisenä ennustaja huono OS (taulukko S5) .

keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet SP ihmisen haimasyövän. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti, jossa kuvataan läsnäolon SP PDAC analysoitiin potilailta. Kuten muissa kudoksissa ja Tuumorien PDAC SP sisältää osa CD31

+ endoteelisolujen ja CD45

+ immuunisolujen [20]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme keskittyneet ei-endoteeli-, ei-immuuni SP (PSP) ja tutkitaan sen geeniekspressioprofiili. PSP lähinnä edustaa kasvaimen epiteelisolujen antanut suuren ilmaus

CDH1

,

EPCAM, TJP1

ja

TJP2

[21]. Tässä PDAC PSP löysimme säätelyä usealle kuljettimen

ABCB1

, joka voi olla vastuussa chemoresistance näiden solujen. Immunovärjäys varmisti ABCB1 in PDAC, pääasiassa sijaitsee apikaalisella pinnalla kasvainsolujen, joissa vaikuttavan lääkeaineen kuljetus voi tapahtua. Ylössäätely apoptoosin säätelevää tekijää (

Bcl2L11,

taittaa: 2,9, p 0,001;

EPHA2

, katso tulokset) on PDAC PSP voi edelleen tukea sen solunsalpaajaresistentti luonnetta. Olemme äskettäin osoittaneet, että SP on erittäin vastustuskykyinen gemsitabiinia hiirimallissa, jossa PDAC kasvatettiin kuten ksenografteja [12]. Resistanssi SP gemsitabiinin on myös raportoitu haimasyövän solulinjoissa

in vitro

[8], [9], [11]. Yhdessä SP näyttää edustaa solunsalpaajaresistentti alapopulaatio haiman kasvain, ja se voi siten olla yksi syyllisiä hoidon epäonnistumisen ja syövän uusiutumiseen.

useiden syöpätyyppien, SP rikastetaan ehdokas CSC [7], [22]. Huomasimme, että markkereita äskettäin tunnistettu otaksuttu CSC populaatioissa ihmisen haimasyövän, ovat upregulated että PDAC PSP. Lisäksi olemme havainneet joidenkin muiden ”syöpä stemness” markkereita (esim

LGR4, SOX9, KLF5, MET

) sekä haiman alkionkehityksen liittyvät tekijät, jotka voidaan aloittaa uudelleen CSC (esim

HNF4A

) [5], [6], [23] – [26]. Lisäksi

in silico

toiminnallinen analyysi ekspressiotietojen korostetaan esiintyminen polkuja alkion kehityksen ja alkion kantasolujen pluripotenttisuus että PDAC SP, mikä edelleen tukee sen ”stemness”. Myös haimasyövän solulinjoissa, SP ilmestyi rikastunut CSC [9] – [11]. On kuitenkin selvää, että enemmän todisteita tarvitaan lopullisesti osoittaa CSC fenotyyppi PSP, kuten tuumorigeenisia aktiviteetti

in vitro

(pallo muodostuminen) ja

in vivo

(kasvaimen kasvua immuunivajaisiin hiirillä ).

PDAC PSP voi edustaa mielenkiintoinen terapeuttinen kohde antanut chemoresistance- ja CSC liittyvää luonnetta. PSP-solut ilmentävät korkeita

CXCR4,

joka aktivoituessa, voi stimuloida soluja siirtää tai tehdään ”epiteelin-mesenkymaalitransitioon” (EMT), prosessi ajo syövän etenemistä ja maligniteetti. Haimasyövän solulinjoissa, SP voidaan todella aktivoida kohti EMT hoidetuilla TGFli [21]. Vuonna PDAC PSP, havaitsimme säätelyä

Smad3

, tiedetään välittävän TGF signalointi. Lisäksi kiinnostavaa,

CXCL12

, ligandi CXCR4, ilmentyy suuresti ympäröivän haiman kudos PDAC kasvain (tuloksia ei ole esitetty) ja ne voivat houkutella soluja ulos kasvaimen invaasion tai edelleen levittämistä. Analogisesti, CXCR4 ilmentyminen on havaittu luonnehtia alapopulaatio on CD133

+ haiman CSC, jotka näyttävät olevan näet vastuussa varten etäpesäke kasvaimen [6], [27].

lisääntymisen merkkejä

EPHA2

ja

EPHA4

PSP on linjassa tärkeä rooli Efriini signalointireitin sisään PDAC synnyssä. Expression of EPHA2 vuonna PDAC on liittynyt lisääntynyt invasiivisen ja metastaattisen kyvyn ja huono selviytyminen [28]. Knockdovvn EPHA4 ilmaisun pienenee PDAC solujen elinkelpoisuus [29]. Lisäksi olemme havainneet, että ErB signalointireitille ylössäädellään PSP (Kegg analyysi), mukaan lukien korkeampi ilmaus

ErbB3

. ErbB3-reseptori on ratkaiseva rooli haiman kehitykseen sekä haiman kasvainten synnyssä. Yliekspressio

ErbB3

korreloi kehittynyt PDAC vaiheessa ja pieneni selviytymistä, ja viime aikoina, sen roolin voimakas välittäjänä PI3K signalointi on korostettu [30], [31]. Lisäksi aktivointi ErbB3 voi olla välttämätöntä, että vastus yhden aineen EGFR inhibition. Erityisesti estävä ErbB3 aktiivisuutta (esim MM-121) vaikuttaa lupaavalta

in vitro,

ja voi siten myös olla kliinistä potentiaalia [31]. Sekä Efriini ja ErB signalointireitteihin voi esittää mahdollisia terapeuttisia kohteita PDAC. On syytä huomata, että tutkimuksemme ei ole tutkinut ennustetekijöiden arvo

EPHA2

ja

ErbB3

koska nämä geenit eivät sisältyneet PSP allekirjoituksia arvioitava selviytymistä.

kehittyneet PSP geeni allekirjoitukset luottavasti erottelemaan PSP PMP. Osa voimistunut geenit liittyvät CSC /”syöpä stemness” kuten

CXCR4, CD133, EPCAM

ja

SOX9

[5], [6], [24], kun taas toiset ovat liittyy apoptoosiin (

FASLG, TJP2, DUSP4

), MAPK-reitin (

MAP2K4, DUSP4

), ja chemoresistance (

MMP1

, joka on

ETS1

kohdegeenin) [32], [33]. Lisäksi allekirjoitus sisältää geenit liittyvät lisääntyneeseen liikkuvuuteen ja invaasio (

ADAM10, RAB25, DUSP4, CXCR4

). Lisäksi joitakin näistä geeneistä voi edustaa lupaavia kohteita.

Lopuksi arvioitiin prognostisia merkityksellinen sisältämien geenien PSP allekirjoituksia.

CXCR4

ja

ABCB1

negatiivisesti liittyvät selviytymisen jälkeen parantava resektio, joka esiintyy myös muissa raporteissa [34], [35].