Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat luokka yksijuosteisia, ei-koodaavat RNA: t noin 22 nukleotidin pituus. Lisääntyvä todistusaineisto syytöksiä miRNA voi toimia onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla. Tässä osoitimme, että miR-107 oli suunnattu suoraan MCL1 ja aktivoida ATR /Chk1 polku estävän jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invasiivisuus kohdunkaulan syöpäsoluja. Lisäksi olemme havainneet, että MCL1 oli usein säädelty vahvistavasti kohdunkaulan syöpä, ja knockdovvn MCL1 merkittävästi esti syövän solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota, kun taas ektooppinen ilmentyminen MCL1 merkittävästi parantaa näitä ominaisuuksia. Palauttaminen MCL1 ilmaisun voi vaikutusten lieventämiseksi miR-107 syöpäsoluja. Yhdessä miR-107 on uusi säätelijä MCL1, ja molemmat miR-107 ja MCL1 merkittäviä rooleja patogeneesissä kohdunkaulan syövän. Siksi olemme tunnistaneet mekanismi ATR /Chk1 kulkureitti jotka lisäävät miR-107 johtaa vähenemiseen MCL1. Vastaavasti meidän tulokset osoittivat, että miR-107 vaikuttaa ATR /Chk1 signalointi ja geenien ilmentyminen, ja sekaantunut miR-107 terapeuttisena kohteena ihmisen kohdunkaulan syövän. Olemme myös osoittaneet, että taksoli vaimennettu muuttoliike ja hyökkäyksen kohdunkaulan syöpäsolujen aktivoimalla miR-107, jossa miR-107 on tärkeä rooli säätelyssä ilmaus MCL1. Selvittäminen tämä löysi MCL1 oli suoraan säätelee miR-107 parantaa huomattavasti meidän mekanismien ymmärtämistä vastaavan kohdunkaulan syöpää ja antaa uusia varsi kehittämiseksi syöpähoitoihin.

Citation: Zhou C, Li G Zhou J, Han N, Liu Z, Yin J (2014) miR-107 Aktivoi ATR /Chk1 Pathway ja Suppress kohdunkaulan syövän tunkeutuminen Targeting MCL1. PLoS ONE 9 (11): e111860. doi: 10,1371 /journal.pone.0111860

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 08 lokakuu 2014; Julkaistu: 11 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä työ rahoittaneet National High Technology Researchin ja kehittämisohjelma Kiina (863 ohjelmaa) (2010AA023002) ja National 12th Five-Year tieteellinen ja tekninen tuki ohjelma Kiina (2012BAI02B02). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Aberrant MikroRNA (miRNA) lauseke on piirre ihmisen pahanlaatuisen. Erityisiä miRNA on todettu edistäjinä tai suppressorit metastasointiin [1], [2]. Kohdunkaulan syöpä on myös äskettäin osoitettu liittyvän epänormaaliin miRNA ilmaisun profiilin, mikä viittaa siihen, että miRNA voisi vaikuttaa syövän kehitystä [3]. Kohdunkaulan syöpä vaikuttaa merkittävästi naisten terveyttä kaikkialla maailmassa ja on nykyään toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus naisilla seuraavissa rintasyöpä. Noin 500000 kohdunkaulan syöpä diagnosoidaan vuosittain, lähes 45% johtaa kuolemaan [4], [5]. Kohdunkaulan syöpä on monimutkainen sairaus, johon liittyy epänormaali ilmentyminen useiden onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille. Vaikka keskittymällä tunnettuja geenejä on tuottanut merkittävää uutta tietoa, aiemmin tuntemattomia Ei-koodaavat RNA: t, kuten miRNA, voi myös tarjota oivalluksia biologia kohdunkaulasyövän.

Useat miRNA on tunnistettu säätelemään kasvainmetastaasit. Niistä miR-107, joka kuuluu miR-103/107 perhe, koska niillä on sama siemen sekvenssit, pystyy aiheuttamaan epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon rintarauhasen epiteelisolujen, mikä edistää invasiivinen ja metastaattinen käyttäytymistä syöpien [6] – [8]. Myeloidisolun leukemia-1 (MCL1) on anti-apoptoottinen jäsen Bcl-2-proteiinin perheen, ja sen ekspressio on havaittu syntyvän solujen eri vaiheissa kasvun ja erilaistumisen [9]. Koska sen anti-apoptoottisia ominaisuuksia, MCL1 on mahdollinen proto-onkogeeni. Lisäksi, lisääntynyt ilmentyminen on MCL1 havaitaan laaja kasvaimia, mukaan lukien hepatosellulaarinen karsinooma, rintasyöpä, jne [10] – [13]. Kasvava näyttö viittaa siihen, että MCL1 ilmaisu arvot liittyvät huonompi kliinisiä tuloksia eri syöpätyyppeihin. Vaikka miR-107 pidetään avainasemassa määritettäessä kasvain ominaisuuksia, sääntely MCL1 ilmentymisen kohdunkaulasyövän edelleen suurelta osin tuntemattomia. Tämä sai meidät analysoimaan edelleen merkitystä MCL1 kohdunkaulan syövän.

Tässä tutkimuksessa tutkimme roolia miR-107, joka on miRNA liittyy kohdunkaulan syövän ja sen vuorovaikutusta vaimennin MCL1. Siksi me määräytyy qRT-PCR joka MCL1 yliekspressoitui kohdunkaulan syövän suhteessa viereisiin normaaleissa kudoksissa, ja MCL1 tunnistettiin välittömänä kohteena miR-107. Knockdovvn MCL1 tukahdutti kasvun ja invasiivisuus ihmisen kohdunkaulansyövän HeLa ja SiHa soluja. Tuloksemme osoittivat, että MCL1 voi toimia onkogeeni ja on välittäjänä miR-107 kohdunkaulan syövän. Saatavuudesta huolimatta eri hoitomuotoja, kuten leikkaus, kemoterapia, ja sädehoito, 5 vuoden pysyvyys on edelleen heikko. Siksi on ehdottoman välttämätöntä tutkia huumausaineiden pystyy estämään ja Kohdunkaulansyövässä. Taxol on havaittu olevan tuumorin vastaista vaikutusta ihmisen keuhkoadenokarsinooma A549, ihmisen maksasyövän solulinja Bel-7402, ihmisen rinta- adenokarsinoomasolulinja MCF-7 ja hiiren Lewis keuhkokarsinoomasolulinja

jne

[14] – [16]. Näin ollen tässä tutkimuksessa, taksolin tehtiin selvittää, taksoli ollut vaikutuksia proliferaatioon, erilaistumiseen ja apoptoosiin kohdunkaulan syövän solujen, ja tutkimaan mahdollisia mekanismi transkriptiotasolla.

kokeelliset menetelmät

Eettinen linjaus ja aiheet

Kirjallinen suostumukset saatiin kaikissa aineissa. Koemenettely tarkistettiin ja hyväksynyt eettinen komitea Harbin Medical University (HMU-EY-10168) ja suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

Plasmidin Hakemisto Rakentaminen

Pri-miR-107 monistettiin käyttäen alukkeita ja kloonattiin restriktiokohtien pcDNA3. Saatu rakenne pcDNA3 /pri-miR-107 vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla. Syntetisoitu ASO-miR-107 oli estäjänä miR-107. 3′-UTR-fragmentti MCL1-geenin, joka sisältää ennustetun miR-107 sitoutumiskohdan monistettiin PCR: llä käyttäen alukkeita. PCR-tuotteet kloonattiin pcDNA3 /EGFP-plasmidi. Saatu vektori nimettiin pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR. Lisäksi mutantti-fragmentti MCL1 3′-UTR sisälsi mutatoidun miR-107 sitoutumiskohta monistettiin käyttäen PCR kohdennettua mutageneesiä ja kloonattiin pcDNA3 /EGFP-plasmidi välillä samoihin kohtiin. Kaikki lisäykset vahvistettiin sekvensoimalla. Rakentaa SIR-MCL1 vektori, 70 emäsparin kaksisnauhaiselle fragmentti saatiin kautta hehkutus reaktion avulla kaksi erillistä osaa. PcDNA3 vektoria käytettiin tuottamaan MCL1 yliekspressio plasmidi. Täyspitkän ihmisen MCL1 cDNA monistettiin käyttäen PCR: llä cDNA-kloonin, vektori, ja sitten kloonattiin restriktiokohtien käyttäen alukkeita.

Cell Culture

HeLa- ja SiHa-solulinjat saatiin Cancer Research Center Harbin Medical University (Harbin, Kiina). Hela-soluja pidettiin RPMI1640 (GIBCO) ja SiHa-soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, näitä soluja oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, HyClone, Logan, UT), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä kosteutetussa ilmakehässä 95% ilmaa ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

ihmisestä otettujen kudosnäytteiden

Kaksikymmentä kuusi paria kliinisistä näytteistä, mukaan lukien 26 ihmisen kohdunkaulansyövän kudososat potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpä ja vastaavat viereisen normaaleissa kudoksissa, saatiin ensimmäisen Affiliated sairaala, Harbin Medical University. Histologinen kaikki koepaloja olivat okasolusyöpä ja vaiheita syövän olivat III. Diagnoosit nämä näytteet varmistettiin patologia.

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi

kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin havaitsemaan suhteellisen transkriptio tasoja miR-107. Lyhyesti, 3 ug pienten RNA uutettiin ja eristettiin solujen tai kudoksen näytteiden käänteisfaasi-cDNA: ksi, jonka varsi-silmukka-käänteistranskriptaasi-aluketta käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI). cDNA käytettiin myöhemmin monistamiseen miR-107 ja endogeeninen kontrolli, U6 snRNA kautta PCR. MCL1 käänteistranskriptio (RT) pohjamaali ja qPCR alukkeet syntetisoitiin Sangon Biotech., Inc. (Shanghai, Kiina). PCR-syklit olivat seuraavat: 94 ° C 3 min, jota seurasi 40 sykliä 90 ° C 30 s, 55 ° C: ssa 30 s, ja 74 ° C: ssa 30 s. Määrällisesti MCL1 ilmentymisen, 4 ug RNA: ta soluista tai kudoksesta näytteiden käänteisfaasi-cDNA: ksi käyttämällä M-MLV-käänteistranskriptaasia. PCR-syklit olivat seuraavat: 94 ° C 3 min, jota seurasi 40 sykliä 96 ° C 30 s, 56 ° C: ssa 30 s, ja 70 ° C: ssa 30 s. SYBR green RCR suoritettiin kolminkertaisena käyttämällä Bio-Rad Chromo 4 System Real-Time RCR ilmaisin (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Suhteellisen geeni-ilmentymisen tasot laskettiin. Kaikki alukkeet ostettiin ABI.

Western-blottaus

Western blottaus suoritettiin sen määrittämiseksi MCL1 proteiinin ilmentymisen. Kaikki proteiinit erotettiin 10% SDS-denaturoitua polyakryyliamidigeelissä ja siirrettiin sitten PVDF-kalvolle. Membraaneja inkuboitiin estopuskurilla 80 min ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin sitten vasta-aine MCL1 tai glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) kanssa yön yli 5 ° C: ssa. Membraanit pestiin ja niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (AuGCT, Inc. (Peking, Kiina)). Proteiinin ilmentyminen arvioitiin parannettu kemiluminesenssin ja altistuminen kemiluminesenssi elokuva. Lab Works Image Acquisition ja Analysis Software (UVP) käytettiin kvantifioimaan kaistaintensiteettejä.

fluoresoiva Reporter Assay

HeLa- ja SiHa solut kotransfektoitiin pri-miR-107 tai ASO-miR -107 on 48-kuoppalevylle ja sen jälkeen pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR toimittaja vektori tai pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR-mutantti. Erillinen RFP ekspressiovektori, pDsRed2-N1 (Clontech, Mountain View, CA) käytettiin normalisointia. Solut hajotettiin 72 tuntia myöhemmin, ja proteiinit kerättiin. Seuraavat vektorit transfektoitiin soluihin: sellaisia, jotka sisälsivät EGFP-reportterivektoria yksinään, pcDNA3 /primiR-107, tai joissa on ASO-miR-107. PcDNA3 /EGFP, pcDNA3 tai ASO-NC käytettiin kontrollivektoreihin. Intensiteetit EGFP ja RFP fluoresenssi havaittiin F-4500 fluoresenssispektrofotometriä (Hitachi, Tokio, Japani).

transfektioanalyysissä

HeLa-soluja (1 x 10

5 solua kohti kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille viljelymaljoille ja kasvatettiin yön yli. Sitten solut transfektoitiin miR-107-ekspressiovektoriin (pri-miR-20a, 4 ug kutakin) vai miR-107-antisense-oligonukleotidit (ASO-miR-107). Sillä SiHa-solut, 1 x 10

6 solua kuoppaa kohti ympättiin 6-kuoppaisille viljelylevyille. 5 ug pri-miR-107 tai 500 umoolia ASO-miR-107 transfektoitiin. Plasmidi pcDNA3 ja ei-suhteelliset sekvenssi (ASO-NC) käytettiin negatiivisena kontrollina. Transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Väliaine korvattiin uusilla viljelyväliaineessa 5 h transfektion jälkeen. 24 h transfektion jälkeen soluja käytettiin solujen elinkelpoisuuden solujen pesäkkeiden muodostumista ja in vitro muuttoliike ja invaasion määrityksissä.

solujen elinkelpoisuuden arviointi ja lisääntymiskyvyn

Määritä solujen elinkelpoisuuden ja proliferatiivista kapasiteettia solut tutkittiin käyttäen MTT: n ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset kuten aiemmin on kuvattu [17]. Solut ympättiin 96-kuoppalevyille joko 1 x 10

5 solua /kuoppa (HeLa-solut) tai 1,5 x 10

5 solua /kuoppa (SiHa-solut) ja testattu käyttäen MTT-määritystä eri ajankohtina. Sillä pesäkemuodostusta, määrä elinkykyisten solujen pesäkkeiden määritettiin sen jälkeen, kun 10 päivää (HeLa-solut, SiHa-solut) istutuksen jälkeen 200 solua /kuoppa kolmena rinnakkaisena 12-kuoppaisilla levyillä. Solut värjättiin kristallivioletilla. Pesäkkeenmuodostusta kvantifioitiin käyttäen pesäkemuodostusta numeron.

Cell Migration ja Invasion Analyysit

TranswellTM migraatiokokeessa, 1 x 10

5 HeLa-soluista tai 1,3 x 10

5 SiHa-solut 200 ui: aan RPMI 1640 ilman FBS ympättiin yläosaan kunkin Transwell kammion (huokoskoko 8 pm; Corning), jotka sisältävät ei-päällystetty kalvo. Sillä invaasiomääritys, 1 x 10

5 HeLa-soluista tai 1,3 x 10

5 SiHa Solut sijoitettiin ylempään kammioon kunkin insertin päällystettiin 50 ui 2 mg /ml matrigeeliä kasvutekijää, ja 500 ui RPMI 1640, jossa 20% FBS: ää, lisättiin alemman osan kammiosta. Inkuboimisen jälkeen useita tunteja, kammiot purettiin, ja kalvot värjättiin 2% kristalliviolettiliuoksella 15 minuutin ajan ja asetettiin lasilevylle. Sitten solut, jotka olivat vaeltaneet kalvon läpi laskettiin viidessä satunnaisesti näkökentän valomikroskoopilla. Kaikki määritykset suoritettiin kolme riippumatonta kertaa kolmena kappaleena.

immunohistokemia

Immunofluoresenssi määritys suoritettiin menetelmien mukaisesti, jotka on kuvattu aikaisemmin [18]. Kohdat esikäsiteltiin mikroaaltosäteilyllä, tukossa, ja niitä inkuboitiin käyttäen polyklonaalista kanin anti-humaani MCL1 (Saier Biotechnology). Värjäyksen intensiteetti arvioitiin mitattiin, kuten aiemmin on kuvattu [18].

Cell Cycle määritys

Solut maljattiin ja transfektoitiin pcDNA3-miR-107 tai pcDNA3-NC päivänä 0, sitten ne siirrostettiin on päivä 1, ja korjattujen päivänä 2. Näytteet värjäsimme, ja mitataan virtaussytometrialla mukaan raportoitu protokollien.

Flow Aytometry Analysis

Apoptoosi arvioitiin mittaamalla kalvon uudelleenjako fosfatidyyliseriinin kanssa anneksiini V-propidiumjodidi apoptoosin havaitsemiseen kit (Sigma, USA). Lisäksi propidiumjodidilla värjättyjen LoVo Solut analysoitiin EPICS ELITE ESP-virtaussytometrillä (Beckman Coulter, USA).

Taxol Säätelee Expression of MCL1 jonka Up-Regulating miR-107

soluproliferaatiota suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu muutoksin. Migraatiokokeessa soluja (2 x 10

5 solua /kuoppa) käsiteltiin taksolin (0, 25, 50, ja 100 uM) 48 tunnin ajan, sitten ne trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen seerumia ja 5 x 10

4 solut saatettiin ylempään kammioon hyvin sisäosa 8 um huokoskoko polykarbonaattikalvosuodatinta (Millipore). DMEM, joka sisälsi 20% naudan sikiön seerumia pantiin alempaan kammioon. Sillä invaasiomääritys, kokeellinen ovat samanlaiset kuin migraatiokokeessa kuten edellä on kuvattu, paitsi että sekä insertti päällystettiin 10 ul: n kanssa Matrigeliä (5 mg /ml; BD Biosciences, Bedford, MA). Kun oli inkuboitu 24 ja 48 tuntia 37 ° C: ssa siirtymisen tai invaasiomääritys, vastaavasti. Real-Time PCR tehtiin ja nähdä kuvattu menetelmät lisätietoja. Tämä koe suoritettiin kahdesti itsenäisesti.

miRNA Target Prediction ja Tilastollinen analyysi

miRNA kohdesivustot ennustettiin käyttämällä ohjelmistoa RNA22 verkossa (https://cm.jefferson.edu/rna22v1.0/), TargetScan integroitu gNET algoritmeja. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolmena kappaleena. Tilastollinen merkittävyys arvioitiin käyttäen Student t-testiä. P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

miR-107 Suoraan tavoitteet MCL1

Ensinnäkin käytetään integroidun laskennallisen algoritmeja gNET menetelmällä TargetScan (ks. S1 File S1) tunnistamaan geeni-miRNA paria huomattavasti säännelty kohdunkaulan syöpä. Käytimme tätä algoritmia ohjelmia ennustaa miR-107 sitova suoraan 3′-UTR MCL1. Seuraavaksi vaikutus miR-107 MCL1 ilmentyminen oli vahvistanut miR-107 voitto ja tappio toimintoja. Sekä HeLa ja SiHa solujen qRT-PCR suoritettiin validoimiseksi miR-107 over-ekspressiokonstruktin tai miR-107 ASO, pcDNA3 tai ASO-NC olevan verrokkeihin nähden (Kuva. 1

). HeLa-solut kotransfektoitiin kanssa pcDNA3 /EGFP-MCL1 3′-UTR raportti vektorin ja pri-miR-107 tai ASO-miR-107. Kuten on esitetty kuviossa. 1

B

intensiteetti EGFP fluoresenssi pri-miR-107 ryhmä väheni merkittävästi, kun taas että ASO-miR-107 ryhmä kasvoi merkittävästi 48 tunnin kuluttua transfektion. Määrittää funktio miR-107 sitoutumiskohdan, rakensimme lisäksi EGFP-reportteri vektoriin, joka sisälsi MCL1 3′-UTR, jossa on mutantti miR-107 sitoutumiskohdan. Tämän seurauksena ei ole yli-ilmentyminen tai estäminen miR-107 oli mitään vaikutusta intensiteetti EGFP fluoresenssin transfektoiduissa soluissa 3′-UTR-mutantin vektorin (Fig. 1

C

). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että miR-107 sitoutuu suoraan 3′-UTR MCL1 tukahduttaa geenin ilmentymistä. Lisäksi olemme selvitettävä, miR-107 estää myös endogeenisen MCL1 ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla, olemme analysoineet vaikutuksia miR-107 endogeenisen MCL1 mRNA ja proteiini tasot käyttäen qRT-PCR-analyysi ja Western blottauksella, vastaavasti. HeLa-soluissa, yli-ilmentyminen miR-107 johti noin 70%: n lasku MCL1 mRNA-tasojen (Fig. 1

D

) ja noin 50%: n lasku proteiinin ilmentymisen (Fig. 1

E

). Lisäksi MCL1 mRNA: ta ja proteiinia nousivat noin 3- ja 2-kertaiseksi, HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu ASO-miR-107. Havaitsimme samanlaisia ​​tuloksia SiHa solulinjassa (kuvio. 1,

D

ja

E

). Nämä tulokset osoittivat, että miR-107 säätelee negatiivisesti endogeenisen MCL1 proteiinin ilmentymisen kautta mRNA: n hajoamisen ja translaation tukahduttamisen.

, ilmentymistason miR-107 HeLa ja SiHa solujen muuttunut merkittävästi transfektion jälkeen joko pri-miR -107 tai ASO-miR-107 ilmentämiskonstruktiot määritettynä qRT-PCR: llä käyttäen U6 snRNA normalisointia. B, intensiteetti EGFP fluoresenssin HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu pri-miR-107 aleni 48 tunnin kuluttua ja lisää seuraavat transfektion ASO-miR-107. C, pri-miR-107 ja ASO-miR-107 ei ollut mitään vaikutusta intensiteetti EGFP fluoresenssin transfektoiduissa soluissa 3′-UTR: n mutantti-vektoriin. MRNA (D) tai proteiini (E) tasot MCL1 HeLa ja SiHa solujen vähentynyt tai lisääntynyt verrattuna kontrolliryhmään, kun pri-miR-107 yliekspressoitui tai tukossa, vastaavasti (*,

p

0,005).

miR-107 Estää Migration ja Invasion

Me tehdään MTT, pesäkkeiden muodostumista, solujen vaeltamiseen, ja invasiivisuus määrityksiä käyttäen HeLa- ja SiHa-soluja transfektoitiin joko pri-miR-107 tai ASO-miR-107 plasmideja vaikutusten määrittämiseksi miR-107 ilmaisun

in vitro

. MTT ja pesäkkeiden muodostumista analyysit osoittivat tilastollisesti merkittävä väheneminen solujen elinkelpoisuutta ja leviämisen PRI-miR-107-transfektoiduissa soluissa verrattuna kontrolliryhmään, kun taas ASO-miR-107 ilmeisesti lisännyt näitä ominaisuuksia HeLa-soluissa (kuvio. 2

A, B

ja Fig. S2A File S1). TranswellTM määritykseen ilman Matrigeliä (Fig. 2

C

ja

Fig. S2B File S1) osoittivat, että miR-107 yliekspressio vähensi muuttoliikettä HeLa-soluissa 60%, ja transfektointi ASO-miR -107 muuttoliikkeen kiihtymiseen noin kaksinkertaiseksi verrattuna kontrolliin soluja. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-107 johti merkittävään vähenemiseen invasiivisia potentiaalin HeLa-solujen verrokkiin verrattuna soluihin TranswellTM määrityksessä matrigeelin, ja transfektoitujen solujen ASO-miR-107 oli merkittävästi lisätä niiden invasiivisia potentiaali (Fig. 2

D

ja Fig. S2C File S1). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kanssa SiHa solulinjan (kuva 2,

–

D

). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-107 estää solujen lisääntymisen, migraation ja invasiivisuus HeLa ja SiHa solujen

in vitro

.

Kohdunkaulan syövän solut transfektoitiin joko pri-miR-107 tai ASO- miR-107. Solujen elinkyky määritettiin 24, 48, ja 72 h ymppäyksen jälkeen 96-kuoppaisilla levyillä käyttäen MTT-määritystä.

, histogrammi näyttää tiedot ajanhetkellä 48 tuntia. Kaikki kolme datapistettä osoittivat merkittävää eroa.

B

kohdunkaulan syövän solut transfektoitiin pri-miR-107 tai ASO-miR-107 ja sitten ympätään 12-kuoppalevyille. Sillä pesäkemuodostusta, solut värjättiin 2% kristalliviolettiliuoksella, ja edustava kuva näytetään.

C

ja

D

, muuttoliike ja invaasio analyysit suoritettiin HeLa ja SiHa-solut transfektoitiin joko pri-miR-107 tai ASO-miR-107. Kuvat ovat ja satunnaisesti valitut kentät näytetään. Knockdovvn MCL1 hillitsee, muuttoliike, ja invasiivisuus kohdunkaulan syöpäsoluja.

E

, MCL1 proteiini taso mitattiin Western blottauksella 48 h transfektion jälkeen Sir-MCL1 HeLa- ja SiHa soluja. GAPDH käytettiin lastaus /siirto ohjaus (

Ctrl

) ja normalisointia arvoja.

F

ja

G

vaikutukset MCL1 Knockdown solujen elinkelpoisuuden (

F

) määritettiin käyttäen MTT-määritystä, ja soluproliferaatiota määritettiin käyttäen pesäkemuodostusta (

G

).

H

ja

I

, muutoksia solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus aiheuttama Sir-MCL1 määritettiin muuttoliike ja invaasion määrityksissä. (*, P 0,05; **, p 0,005).

knockdovvn MCL1 Estää leviämisen, Migration, ja Invasion

Funktio MCL1 HeLa ja SiHa soluissa oli tutkittiin käyttäen RNA-interferenssi. HeLa- ja SiHa-solut transfektoitiin siRNA: lla kohdistaminen MCL1. Western blotting käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi siRNA on MCL1 proteiinin esto. Kuten on esitetty kuviossa. 2

E

, SIR-MCL1 aiheutti tilastollisesti merkittävä väheneminen MCL1 proteiinin tasot, jopa noin 60% HeLa-soluissa ja 50% SiHa soluissa. Esto MCL1 ilmentymisen pienentynyt elinkelpoisuuden (Fig. 2

F

) ja pesäkkeen muodostumista (Fig. 2

G

) kohdunkaulan syövän solujen verrattuna kontrollisoluihin. Lisäksi knockdovvn MCL1 ilmaisun johti merkittävään alenemisella solumigraation (Fig. 2

H

) ja invaasiota (Fig. 2

I

). Nämä havainnot osoittivat vaikutusta MCL1 Knockdown soluproliferaatioon, muuttoliike, ja invaasio, jotka ovat sopusoinnussa vaikutusta miR-107 yliekspressio sekä HeLa ja SiHa soluja.

Palauttaminen MCL1 ehkäisee Effects of miR-107 Expression

Varmista, että vaikutukset miR-107 on solujen lisääntymisen, migraation ja invasiivisuus HeLa ja SiHa solut välittyvät MCL1 rakensimme pcDNA3 /MCL1 sisältävä vektori MCL1 ORF ilman 3′- UTR välttää vaikutuksen miRNA. Transfektio HeLa ja SiHa soluja tällä MCL1 ORF ilmentymisrakenteen päinvastaiseksi kielteiset vaikutukset miR-107 MCL1 proteiinipitoisuuden (Fig. 3

). Estyminen soluproliferaation (kuvio. 3

B

), pesäkemuodostusta (Fig. 3

C

ja Fig. S3A File S1), maahanmuutto (kuva 3

D

ja Fig. S3B File S1), ja invasiivisuus (Fig. 3

E

ja Fig. S3C File S1) aiheuttama pri-miR-107 kumottiin soluissa yhteistyössä transfektoitu pcDNA3 /MCL1 vektori. Yli-ilmentyminen MCL1 torjua vaikutuksen miR-107 solujen lisääntymisen, migraation ja invasiivisuus HeLa ja SiHa soluja.

(A) B solut kotransfektoitiin pcDNA3 /MCL1 vektori, joka ei sisällä 3′-UTR MCL1, kanssa tai ilman pri-miR-107-vektoriin. (

B

–

D) B, 48 h transfektion jälkeen MCL1 proteiinin taso mitattiin Western-blottauksella. MTT-määritystä (

B

), pesäkemuodostusta (

C

), siirtokuoppaan määritykset ilman matrigeelin (

D

), tai TranswellTM testeissä, joissa matrigeelin (

E

) käytettiin arvioimaan solujen elinkelpoisuuden, kasvupotentiaalia, ja mahdollisuudet solujen vaeltaminen ja invaasio, vastaavasti. (

F

) ATR ja ATM mRNA-tasot olivat seurattiin qRT-PC R ilmoitettuina ajankohtina pistettä, kun miR-107transfection. GADPH käytettiin normalisointia. Tiedot edustavat keskiarvoja ± keskivirhe (SE) kolmesta itsenäisestä kokeesta. (

G

) Western blot -määritys osoitti, että kun miR-107 yliekspressio, ATR oli voimistunut, sitten fosforylaatiota Chk1 nostettiin, mutta fosforylaatiota Chk2 ollut eroa. (H, I ja J) Cell cycle jakelu arvioitiin transfektoitujen solujen negatiivisena kontrollina, miR-107 tai MCL1 propidiumjodidilla värjäys ja virtaussytometria 24 h transfektion jälkeen.

N

ja

O

suhteellinen ilmentyminen miR-107 (

K

) ja MCL1 (

L

) on 15 paria, kuten kohdunkaulan syöpä kudoksiin ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin, määritettiin käyttäen qRT-PCR.

M

, ilmaus MCL1 kohdunkaulan syövän kudoksen ja normaalin kudosten immunohistokemiallinen (

n

= 12).

N

, kaavamainen edustaa miR-107-välitteinen säätely MCL1 ilmaisun aikana syövän etenemisen. Malli muunnettuja ATR /Chk1 reitin, jossa miR-107 ja MCL1 ovat mukana. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SE kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittävyys määritettiin Studentin t-testi: * p 0,05, ** p 0,005.

miR-107 Aktivoi ATR /Chk1 Pathway

Jos haluat tarkistaa, onko miR-107 voi aktivoida DNA-vaurioita polkuja, me seurataan mRNA taso ATR ja ATM (Fig. 3

F

). Gain pri-miR-107 massiivisesti aiheuttama ilmaus ATR muttei ATM mRNA tasolla. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin proteiinin taso (kuva 3

G

). Verrattuna kontrolli, ATR proteiini lisääntyi, kun primiR-107 yliekspressoitui. Olemme myös seurattiin aktivointia Chk1 ja Chk2, alavirran geenin ATR ja ATM. Kuten on esitetty kuviossa. 3

G

, Chk1 dramaattisesti fosforyloitiin jälkeen pri-miR-107 yliekspressio kuitenkaan ei ollut merkittävää muutosta fosforylaatiota Chk2. Koska aktivointi Chk1 yleensä johtaa G1 pidätys, testasimme solusyklin profiilin kanssa virtaussytometrialla (Fig. 3

H

,

I

ja

J

). Vastaavasti solut S-vaiheessa vähennettiin yhdessä miR-107 yliekspressio vaikkei ollut mitään merkittävää muutosta G2 /M vaiheessa. Kaikki nämä tiedot viittaavat siihen, että lisääntynyt miR-107 indusoi G1 pidätyksen aktivoimalla ATR /Chk1 reitin.

Expression of miR-107 ja MCL1 kohdunkaulan syövän ja Normaali kudokset

ekspression havaitsemiseksi miR -107 ihmisen kohdunkaulan syövän kudoksissa qRT-PCR-määritys suoritettiin viisitoista pariksi näytteitä kohdunkaulan syövän ja viereisten normaaleissa kudoksissa. miR-107 ilmentyi alhaisemmalla tasolla (Fig. 3

K

), kun taas MCL1 ilmentyi merkittävästi korkeammalla tasolla kasvainkudoksessa verrattuna vastaavaan normaalit kudokset (Fig. 3

L

). Tässä asetelmassa, käytimme immunohistokemiallista määritystä edelleen havaita MCL1 ilmentymistaso ihmisen kohdunkaulansyövän kudosten ja viereisten normaaleissa kudoksissa. Kuten on esitetty kuviossa. 3

M

Ilmaisulla tasot MCL1 olivat merkittävästi korkeammat kuin viereisen normaaleissa kudoksissa, mikä tukee edelleen, että miR-107 säätelee negatiivisesti MCL1. Työryhmä malli miR-107-MCL1 vuorovaikutuksen aikana syövän etenemisen oli kuvassa. 3

N

. Tämä löytö tarjoaa tietoa siitä, miten MCL1 ilmentymistä säädellään, ja ehdottaa terapeuttisia kohteita pelastamiseen funktio MCL1 proteiinin yleisimmin liitetty ihmisen kohdunkaulan syöpä.

Taxol vaimentaa Migration ja invaasiota kohdunkaulan syövän

tässä tutkimuksessa tutkimme sytotoksisuuden taksolin käsittelemällä kohdunkaulan syövän solujen eri pitoisuuksilla taksolin 24 tai 48 tuntia. Tulokset MTT-määritystä osoitti, että taksoli ei ollut merkittävästi toksinen HeLa- ja SiHa (Fig. 4

) soluihin pitoisuudet jopa 100 uM 24 48h. Tämä konsentraatioalueella ollen soveltaa kaikissa myöhemmissä kokeissa. Kasvainsolujen irrottamiseksi viereisistä soluista julkaisemalla niiden välisissä liitoksissa aikana etäpesäke, ja solunulkoinen-matriisi hajoaa proteolyyttisesti jotta muuttoliikettä ja hyökkäyksen syöpäsoluja. Vaikutuksen tutkimiseksi taksolin on pahanlaatuisuuden kohdunkaulan syövän solujen, migraation ja invaasion kyvyt HeLa ja SiHa soluja oli päättänyt. Vuonna solun migraatiokokeessa, HeLa-solut käsiteltiin 50 ja 100 uM taksoli osoitti merkittävää vähenemistä liikkuvuudessa, vastaavasti, ja samanlainen tulos on havaittu myös SiHa solujen esto (Fig. 4

B

). Vuonna solun invaasiomääritys, taksolin osoitettiin vähentävän soluinvaasiota pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. 50 uM, invaasio väheni 46,12% ja 61.24%, ja 100 uM, invaasio väheni 50.04% ja 80,11% HeLa ja SiHa soluja, tässä järjestyksessä (Kuva. 4

C

). Nämä tulokset osoittivat, että taksolin estivät merkittävästi muuttoliikkeen ja hyökkäys kohdunkaulan syövän solujen ei-myrkyllisiä pitoisuuksia.

(

) kemiallinen rakenne taksolin. (

B

) HeLa-soluja ja SiHa-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla taksolin 24 ja 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. Juoni esittelee suhteellinen solujen elävyys verrattuna hoitamattomiin (0 uM) soluihin. HeLa- ja SiHa-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla taksolin 48 tuntia. Myöhemmin muuttavien (

C

) ja invasiivisia (

D

) solujen kykyä kunkin hoidon jälkeen määritettiin, kuten on kuvattu aineisto ja menetelmät. Pohja tontit olivat suhteellisen solujen määrä vertaamalla hoitamattomilla (0 uM) soluihin. Soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla taksolin 48 tuntia. (

E

) vakioitu väliaine kustakin käsittelystä kerättiin, ja MCL1 aktiivisuus määritettiin kaseiinitsymografialla. (

F

) Solulysaattia käytettiin määrittämään proteiinin tasot MCL1 Western-blottauksella. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (

G

) Apoptoosin määritys osoitti, että taksolin tukahdutetaan solujen apoptoosin ja G1 pidätykseen. (

H

) suhteellista ilmentymistä miR-107, (

I

) työmallin taksolin säätelee ilmentymistä MCL1 by alaspäin säätäminen miR-107. Bars osoittavat arvon keskiarvona ± S.E. kolmesta itsenäisestä kokeesta. *, P 0,05; **, P 0,005, verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

Taxol Estää ilmentäminen MCL1

tutkia mahdollisuutta oleva anti-metastaattinen vaikutus taksolin, ilmentymisen MCL1 kohdunkaulan syövän soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla taksolin tutkittiin. Kuten on esitetty kaseinolyyttisellä aktiivisuuden määrityksessä, MCL1 aktiivisuus väheni annoksesta riippuvaisella tavalla hoidon jälkeen taksolin. Kvantifiointi analyysi osoitti, että MCL1 aktiivisuus laski 20,2%, 60,1%, ja 85,4%: HeLa-soluissa, ja 40,5%, 70,8%, ja 84,2% SiHa- soluihin, kun soluja käsiteltiin 25, 50 ja 100 uM taksolin, vastaavasti (Fig. 4

D

). Western blot -analyysi suoritettiin tutkimaan proteiinin ilmentymistä MCL1 kohdunkaulan syövän soluissa. Verrattuna kontrolliryhmään kummassakin kohdunkaulan syövän riviä testattu, taksoli esti proteiinin ilmentymistä MCL1 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4

E

). Kuten on esitetty kuviossa. Kuva. Kuva. Kuva.