Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tautikohtaisia ​​biomarkkerit ovat tärkeä väline ajoissa ja tehokasta hallintaa patologisten tilojen, kuten määritellä alttius, diagnoosi, ja seuranta tehokkuuden ehkäiseviä tai terapeuttisia strategioita . Aptameerit, joka käsittää yksijuosteista tai kaksijuosteista DNA: ta tai RNA: ta, voidaan käyttää biomarkkereita sairauden tai biologisten todetaan. Aptameerit voivat sitoutua epitoopit makromolekyyleihin johtuen niiden kolmiulotteisia rakenteita ja, aivan kuten vasta-aineet, aptameerit voidaan kohdistaa tiettyihin epitooppeja niiden molekyylikoon perusteella muodon. Järjestelmällinen Evolution of ligandien eksponentiaalinen rikastus (SELEX) on lähestymistapa valitaan suuren affiniteetin Aptameerien erityisiä makromolekyyliyhdisteiden tavoitteiden joukosta 10

13 oligomeerit käsittävät tyypillinen satunnainen oligomeerin kirjastoissa. Tässä tutkimuksessa käytimme elävien solujen perustuvia SELEX tunnistamaan DNA Aptameerien jotka tunnistavat solun pinnan väliset erot HPV-transformoidut kohdunkaulansyövän syöpäsoluja ja isogeenisistä, joka ei aiheuttanut kasvaimia revertantit solulinjat.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kokosolun SELEX menetelmää sovitettu käytettäväksi tarttuneen solulinjojen (jota kutsutaan Tarttuneesta Cell-SELEX (AC-SELEX)). Tätä lähestymistapaa käyttäen tunnistimme suuri affiniteetti aptameerit (nanomoolialueella K

d) spesifisiä epitooppeja solupinnan kaksi ei tuumorigeeninen, ei tuumorigeeninen revertantteja johdettu ihmisen kohdunkaulan syövän HeLa-solulinjassa, ja osoittaa, menetys näiden epitooppien toisessa ihmisen papilloomavirus transformoitu kohdunkaulan syövän solulinja (SiHa-). Olemme myös suorittaa esitutkintaa aptameeriä epitooppien ja niiden sitovia ominaisuuksia.

Johtopäätökset /merkitys

käyttäminen AC-SELEX olemme luoneet useita Aptameerien, joilla on korkea affiniteetti ja spesifisti ei aiheuttanut kasvaimia revertantit of HPV-transformoituja kohdunkaulan syövän soluja. Nämä aptameerit voidaan käyttää tunnistamaan uusia biomarkkereita, jotka liittyvät syövän synnyn. Paneelit Aptameerien, kuten nämä voivat olla hyödyllisiä ennustettaessa Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja ominaisuuksia syövän koepaloja ja tukea tehokasta hallintaa patologisten tilojen (diagnoosi, ennustettu tulos, ja hoitovaihtoehtoja).

Citation: Graham JC , Zarbl H (2012) käyttö Cell-SELEX tuottaa DNA Aptameerit kuten Molecular Probes HPV-Associated Kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 7 (4): e36103. doi: 10,1371 /journal.pone.0036103

Editor: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Ranska

vastaanotettu 26. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 28 maaliskuu 2012; Julkaistu: 20 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Graham, Zarbl. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tukemana Public Health Services Grant # NIEHS P30ES005022 (HZ), apurahan jotta JCG päässä New Jersey komission Cancer Research, Award #: 09-1962-CCR-EO ja institutionaalinen tuki Robert Wood Johnson Medical School, UMDNJ. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on toiseksi yleisin syöpä naisia ​​kaikkialla maailmassa [1]. Yli 90% kohdunkaulan syövistä johtuvat HPV, ja noin 10800 uutta tapausta HPV liittyviä kohdunkaulan syöpä diagnosoidaan Yhdysvalloissa (US) vuodessa [2]. Yli 100 HPV-tyypit on luokiteltu, kaikkein onkogeenisiä joista HPV16 ja HPV18. HPV-tyyppi 16 (HPV-16) liittyy yli 50% kohdunkaulan syövistä maailmanlaajuisesti [3]. Tuore tutkimus osoitti, että HPV-infektio liittyy myös seksuaalista toimintaa ja on johtava syy, että lisääntyvä suunielun syövän Yhdysvalloissa [4]. Näin ollen, huolimatta siitä, että käytettävissä on ennalta ehkäisevän rokotteen HPV-infektion [5], on edelleen merkittävä tarve kehittää biologisten merkkiaineiden, jotka ovat erityisesti HPV karsinogeneesin eikä vain infektio. Nämä transformaatio erityinen biomarkkereita olisivat käyttökelpoisia tutkimuksia sairauden etenemisen ehkäisy ja /tai hoitovaste. Tässä me kuvaamme kehitystä aptameeristä lähestymistapa tunnistaa biomarkkerit HPV välittämiä solun transformaatio.

käsite Aptameerien syntyi kautta havainto, että makromolekyylit eri perusmolekyylirakenne rakenteita kukin hyväksyä ainutkertainen, kolmen ulotteinen kokoonpano, joista jokainen on ainutlaatuinen affiniteetit sitoutumisesta, ja jotka muodostavat komplekseja muiden molekyylien kanssa [6]. Se on itse asiassa sama tyyppi sekvenssin riippuvaisten rakenteellisia muunnelmia on perusta spesifinen sitoutuminen vasta-aineiden antigeeniin epitooppeja. Viime -20 vuotta, käsite rakenne-pohjainen sitova on hyödynnetty kehittää aptameerin kirjastoja, sarjaa makromolekyylejä satunnaistettu nukleiinihapposekvensseihin (RNA tai DNA). Aptameeriin kirjastoja seulotaan sitten niiden kyky sitoutua valikoivasti tiettyjä molekyylejä tai makromolekyylit käyttämällä SELEX (Systematic Evolution of Ligands by eksponentiaalinen rikastamiseen), jossa yhdistyvät aptameeriin rikastumista iteratiivisen valinta affiniteetilla ja polymeraasiketjureaktio (PCR), löytää suuren affiniteetin , ominaisuus-kaksijuosteista tai yksijuosteista RNA: ta tai DNA: ta [6], [7]. Vaikka aptameerit voi olla affiniteetit, jotka ovat verrattavissa monoklonaalisten vasta-aineiden niillä on useita etuja. Aptameerit voidaan tuottaa

in vitro

ja näin ollen eivät vaadi immunisaation, solufuusio, tai käymisen avulla tuottaa suurempia määriä. Kun nukleiinihapposekvenssi toiminnallisen aptameerin on määritetty, suuria määriä erityisiä oligomeeri voidaan tuottaa kemiallisella tai entsymaattisella synteesillä edullisesti ja korkea hyötysuhde.

uudempi sovellus on solu-SELEX, jossa aptameerit jotka tunnistavat tiettyjä molekyylejä pinnalla solut kehittynyt toistuvasti vahvistusta ja sitoutuminen eläviin soluihin [8]. Tässä lähestymistavassa aptameerejä voidaan käyttää tunnistamaan erilaisia ​​molekyylejä, mukaan lukien nukleiinihappojen, proteiinien lipidien, hiilihydraattien sekä posttranslational muuttaa sellaisia ​​molekyylejä, jotka ovat pinnalla alttiina solujen. On merkittävää, solu-SELEX tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden löytää tuntematon tai tunnistamaton biomarkkerit liittyvät tiettyyn solutyypin, kehitysvaiheessa, altistuminen, infektio, biologista tilaa tai sairautta. Cell-SELEX on onnistuneesti käytetty tarttumattomia soluviljelmien tunnistaa aptameerejä, jotka voivat tunnistaa leukemiasolujen biologisista näytteistä [8], [9]. Tässä tutkimuksessa olemme mukautettu kokosolu-SELEX käytettäväksi adherenteilla solulinjoissa (kohde ja ei-kohde), prosessi, joka me kutsutaan Tarttuneesta Cell-SELEX (AC-SELEX) yksinkertaisuuden vuoksi. Käyttämällä AC-SELEX, me kehittynyt aptameerit voidaan erottaa ihmisen papilloomaviruksen (HPV) transformoiduista HeLa kohdunkaulansyövän solut ei-tuumorigeenisen palautujat HeLa-solujen (HF), jotka säilyttävät funktionaalisen, integroitu HPV-genomin [10], [11]. HF Revertanttien solulinja on aiemmin johdettu meidän laboratoriossamme HeLa-soluista altistettiin yhden mutageeninen annos, ethylmethylsulfonate (EMS), jota seurasi valinta käyttäen kloonien soluista menetti pitkittynyt rodamiini 123 retentioaika ominaisuus useimmissa syöpäsoluissa [12] . Suhteessa vanhempien HeLa-solut, HF solut ovat ei-transformoidun fenotyypin laski kloonaustehokkuuden pehmeässä agarissa ja ovat ei-tuumorigeenisiä kateenkorvattomissa nude-hiirissä [11]. HF × HeLa-solujen hybridisolut syntyy solufuusio osoittivat merkittävää vähenemistä kloonaustehokkuuteen pehmeässä agarissa, mikä viittaa siihen, aktivointi määräävän tuumorisuppressorigeenin HF solujen ja molekyylien analyysi osoitti aktivoituminen p53 tuumorisuppressorigeenin HF-soluissa, mutta ei menetys, uudelleenjärjestely tai ilmentyminen vähenee HPV E6 /E7 onkoproteiineja [10], [11]. Koska HF solut ovat isogeenisiin HeLa-solujen kanssa, erot niiden geeniekspressiomalleja todennäköisesti liittyy menetys kasvaimia fenotyypin, joten tämä on ihanteellinen kennoparin jossa etsiä biomarkkereita HPV välittämiä solun transformaatio.

Kirjoittajat raportoivat löytö yksijuosteisen DNA-aptameerejä, joilla on korkea affiniteetti epitooppeja, jotka on rikastettu pinnalla on kiinnittynyt, ei tuumorigeeninen HF solulinjan suhteen kasvaimia HeLa-solulinjassa. Kyky aptameerien havaita biomarkkerit menetetty aikana HPV välittämiä solun transformaatio validoitu SiHa kohdunkaulakarsinooman solulinjassa. Tulokset Tämän tutkimuksen mukaan Aptameerien voidaan käyttää selvittämään ehdokas biomarkkereita solumuutoksia liittyy ja /tai edistää sukupolven ei-tuumorigeenisiä fenotyypin HPV-tartunnan saaneiden solujen.

Tulokset

Tarttuneesta Cell-SELEX ja tunnistaminen Target-Cell Specific aptameeriin Hakijoiden

mukauttaa koko solusta-SELEX ja kiinnittyneet solut viljelmässä, me utlized esitetyn menettelyn kuviossa 1. Aptameerit oli suunnattu ei aiheuttanut kasvaimia HF solu line käyttämällä isogeenisiin HeLa-solut negatiivisten vastakkaisella valinnalla. Kahdeksantoista syklin positiivinen /negatiivinen valinta havaitsimme molekyylinäytteitä jotka olivat hyvin spesifisiä revertanttien HF solulinja (taulukko 1). Sekvensoimme yksitoista aptameeriin ehdokasta ja näistä neljä valittiin satunnaisesti edelleen DNA-sekvenssianalyysillä ja sitovia tutkimuksia (lihavoitu taulukossa 1). Koska aptameerit voidaan ajatella, joka käsittää ”muoto” kirjastoihin, me luotu mahdollinen sekundaarinen rakenteita kunkin valitun aptameerit ja lasketaan suhteellinen vapaa energiat kunkin ennustetun rakenteita [13] (kuvio 2).

liikkeellelähdön kirjasto 10

15 aptameerejä hyödynnettiin ja kahdeksantoista kierrosta AC-SELEX tehtiin puhdistamaan ja vahvistamaan aptameerien jotka tunnistivat epitooppeja läsnä HF soluissa eivätkä esiinny HeLa-soluissa. Lähtöaineena kirjastoa inkuboitiin ensin kanssa HeLa-solulinjasta ja sitoutumattoman aptameerejä otettiin talteen ja käytetään AC-SELEX menettelyä.

toissijaisia ​​rakenteita kunkin aptameerit tutkittu. rakenne (t), jolla on pienin vapaa energia ( dG) esitetään. Toissijainen rakenne ennusteita määritettiin käyttäen UNAfold ohjelmistoa ja ovat sir_graph ® lähtö [13].

aptameeriin toutumiskohtiin kohdesoluihin

Kun saimme nukleotidisekvenssien meidän kohde-soluspesifisen aptameerit, vastaavat yksijuosteiset DNA-oligonukleotidit syntetisoitiin fluoresoivilla FAM tunnisteita. Leimatun aptameerejä inkuboitiin sitten HF solujen määrittää sijainti solun niiden sitoutumiskohtia (kuvio 3). FAM konjugoitu Aptameerien inkuboitiin myös vanhempien HeLa-solujen tarkistaa ero sitova.

Kuvia HF ja HeLa-solut inkuboidaan fluoresoivasti merkittyjä Aptameerien. Aptameerejä ovat spesifisiä ei-tuumorigeenisen HF solulinjassa. Ne tunnistavat epitooppeja tai HF soluissa ja eivät tunnista niiden sitoutumiskohdat kasvaimia HeLa-solut. Kaikki kuvat ovat 40 × ja ovat soluja 24 tunnin inkubaation jälkeen 2000 nM aptameerejä ja myöhemmät kiinnityksen ja peittämistä peitinlasilla kanssa Aquamount.

konfokaali kuvantaminen ja kuvan muodostamiseen käytetään z-pinot käytettiin määrittämään solujen lokalisaatio aptameerin-epitoopin kompleksit (kuva 4). Sitoutumiskohdat Aptameerien 13, 14, 20, ja 28 näytti sijaitsee solun pinnalla. Aptameeri 14, kuitenkin myös näyttää sitoutuminen perinuclear alueen solussa, joka on yhdenmukainen sitoutumisen aptameerin 14 epitooppeihin solun pinnalla, jota seuraa kuljetus perinuclear alueelle. Vaikka mekanismia, jolla tämä oligomeeri syötetty solu on epäselvä, esi-inkubaatio HF solujen proteinaasien (proteinaasi K tai trypsiiniä 2 tai 10 minuuttia ennen aptameerin sitova) ei vaikuttanut kykyyn solujen sisäistää FAM leimattu aptameerit. Sitä vastoin proteinaasi hoito vähensi merkittävästi kykyä Aptameerien 13, 20 ja 28 sitoutuvat soluihin, mikä viittaa siihen, että ne liittyvät epitooppien solupintaproteiinien.

Kuvia HF solujen FAM leimatun aptameerejä. Aptameerit 13, 20 ja 28 näyttävät sitoo ainoastaan ​​solun pinnoille, kun aptameeriin 14 ollaan myös otetuksi sytoplasmaan. Kaikki kuvat ovat 40 × ja ovat soluja 24 tunnin inkubaation jälkeen 2000 nM aptameerejä ja myöhemmät kiinnityksen ja peittämistä peitinlasilla kanssa Aquamount.

aptameeriin sitoutumisominaisuudet

sitoutumisen määrittämiseksi tasapainoa aptameerejä niiden HF epitooppeja, olemme inkuboitiin HF solujen vähitellen pitoisuuksien FAM merkitty aptameerit ja mitataan fluoresenssi yksittäisten solujen (kuvio 5). Analyysimme, kaikki aptameerit arvioitiin osoitti suuren affiniteetin sitoutumista niiden epitoopit: aptameeriin 13 (K

d = 2,5 ± 0,5 nM); Aptameeriin 14 (K

d = 7,1 ± 0,4 nM); aptameeriin 20 (K

d = 1,6 ± 0,4 nM); ja aptameeriin 28 (K

d = 6,9 ± 0,2 nM).

Fluoresenssi kvantifiointiin FAM-leimatun aptameerien sitoutuneen HF soluihin. Aptameeriin sitovia käyriä (linja ja datapistettä) tuotettiin piirtämisen keskimääräistä fluoresenssi virhepalkkien edustaa keskivirhettä keskiarvon datapisteen (n = 4 datapistettä kohti). Nämä tiedot sovitettiin malliin Y = Bmax * X (Kd + X) (yhtenäinen viiva), joka on muodostettu käyttäen epälineaarista regressioanalyysiä yksi sivusto spesifinen sitoutuminen: aptameeri 13 (K

d = 2,5 ± 0,5 nM); aptameeriin 14 (K

d = 7,1 ± 0,4 nM); aptameeriin 20 (K

d = 1,6 ± 0,4 nM); ja aptameeriin 28 (K

d = 6,9 ± 0,2 nM).

aptameeriin Spesifisyys Non-tuumorigeenisen, HPV-transformoidut Kohdunkaulan syöpä Cell Line

tutkia, onko aptameerit kehittynyt sitoutumisesta ei-tuumorigeenisiä HF ​​solut tunnustaa solun pinnan eroja erityinen ei-tuumorigeenisiä palautujia, tutkimme myös sitoutumista itsenäisen kloonin ei-tuumorigeenisen palautujat HeLa-solujen (HA) ja toiseen HPV-transformoidut kohdunkaulakarsinooman solulinja (SiHa-). Inkubaatioita FAM koodattu aptameerit HA ja SiHa solulinjoissa (kuvio 6) on esitetty, että aptameerit spesifinen ei-transformoitujen HF-solut sitovat myös HA revertanttien klooni, mutta ei sitoudu transformoitujen SiHa-soluissa. Nämä tulokset osoittivat, että Aptameerien kehittynyt vastaan ​​HF revertanttien solut ovat spesifisiä epitooppeja, jotka menetettiin HPV aiheuttamaa muutosta kohdunkaulan soluissa. Tutkimukset käyttäen aptameeri reagenssit affiniteettikromatografiaa ovat käynnissä puhdistaa ja tunnistaa makromolekyylien kätkeminen epitoopit.

Kuvia kuvaa ei-transformoitu revertanttien, HA-solulinjan ja HPV-transformoitu kohdunkaulan syövän solulinja, SiHa-, inkubaation jälkeen FAM leimatun aptameerien. Aptameerejä syntyy kohdistaa ei-transformoidut revertanttien, HF solulinja tunnustavat myös ei-transformoidut revertanttien, HA solulinja. Myös huomata, että nämä aptameerit eivät tunnistavat epitooppeja SiHa kohdunkaulan syövän solulinja, joka on samanlainen tulosten me havaittu HeLa kohdunkaulan syövän solulinja. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​hypoteesia, että nämä Aptameerien tiedostavat epitooppeja, jotka menetetään seurauksena transformaation kohdunkaulan epiteelisoluihin HPV. Kaikki kuvat ovat 40 × ja ovat soluja 24 tunnin inkubaation jälkeen 2000 nM aptameerejä ja myöhemmät kiinnityksen ja peittämistä peitinlasilla kanssa Aquamount.

Keskustelu

Erittäin herkkä ja erityiset biomarkkerit ovat erittäin hyödyllisiä diagnosointiin, hoitoon ja ennusteen syöpätapauksista. Cell-SELEX on

in vitro

menettelystä, jonka Aptameerien voidaan valita niiden kyky sitoa differentiaalisesti soluihin [14], ilman aiempaa tietoa solun muutoksia. Aptameerit voi sitoa suurella affiniteetilla ja spesifisyydellä erilaisia ​​molekyylejä [15], [16], [17] ja tarjoavat ainutlaatuisen vaihtoehdon vasta-aineet ovat paljon suurempia, helposti hajoavaa, kallista ja aikaa vievää kehittämiseen, ja edellyttävät eläinten käyttö [18]. Nukleiinihappopohjaisten-Aptameerien helposti syntetisoida ja voivat läpikäydä käännettävä denaturaatio PCR-monistamiseen. Ne voivat myös tunnistaa pieniä molekyylejä, kuten toksiinit [19], [20], ja molekyylit, jotka eivät ole ei-immunogeenisiä komplekseja [21] ja aptameerejä voidaan helposti modifioida reportterimolekyylejä tai muita molekyylejä, parantaa niiden ominaisuuksia (eli puoliintumisaika) [18 ]. Aptameerit myös toteuttaa ainutlaatuinen sekvenssiriippuvaisia ​​kolmiulotteisia muotoja, joten ne ovat tavallaan, muoto kirjastoja ja ne voivat sitoutua soluun perustuvan sarjoina, rakennetta ja /tai maksu vuorovaikutusten kautta sitovia taskuja, vetysidokset, pinoaminen aromaattisia renkaat, van der Waalsin voimat, tai näiden yhdistelmä. [22] Aptameerit voivat häiritä proteiini-proteiini vuorovaikutusten, kilpailevat ja häiritä sitoutumiskohdat, häiritsevät virus-solu kiinnitys, transkription ja mRNA käännös [23]. Koska niiden pienen koon, aptameerit voi myös olla mahdollisuus käyttää epitooppeja, jotka ovat normaalisti lukittu /piilossa muista antureista /terapeuttisten. Nämä toivotut ominaisuudet, saadaan aptameerit kyky toimia terapeuttisina aineina [21], [24], [25], [26], [27].

Aptameerit jo hyödynnetään syövän biologian ja syövän lääketieteen [28], [29], [30]. Using cell-SELEX, tutkijat ovat tunnistaneet suuren affiniteetin aptameerit jotka lisäävät herkkyyttä haimasyövän ja kemoterapia-[31], toimittaa terapeuttisia osaksi syöpäsoluihin [32] tai tunnistaa syöpäsoluja biologisista näytteistä [8], [9]. SELEX on myös mahdollistanut tutkijat tunnistaa aptameerit, joka kohdistaa muunnos-antigeenejä, kuten HPV-16 E6 ja E7 onkoproteiineja, uutteissa kohdunkaulan syövän soluihin [33], [34]. Tässä osoitamme, että AC-SELEX voidaan myös käyttää tunnistamaan solun pinnan markkereita, jotka ovat muuttuneet aikana HPV-indusoidun solun transformaatio.

kehittyä aptameerejä, jotka erottavat HPV-transformoituja soluja ei-transformoitu kohdunkaulan solujen ilman

ennalta

valikoima epitooppeja tai kohteiden, me sovitettu kokosolu-SELEX käytettäväksi adherentteja solulinjoja (kuvio 1). Tätä lähestymistapaa käyttäen tunnistimme ja riippumattomasti validoitu aptameerejä, joilla on suuri affiniteetti proteiineja tai solujen pinta-antigeenit, jotka ovat ominaisia ​​ja esillä pinnalla ei tuumorigeeninen palautujat HeLa-solut, mutta eivät ole läsnä HPV transformoitu kohdunkaulan karsinooman solulinjoissa (kuvio 3 ). Tärkeää on, kaksi itsenäisesti johdettu revertanttien solulinjoja (HF ja HA) jatkossakin ilmaista HPV E6 ja E7 onkoproteiineja, mutta toisin kuin vanhempien HeLa-solut, HF ja HA solulinjoilla on ei-transformoitu morfologia, yhteystiedot esti kasvu vähensi merkitsevästi kloonaus tehokkuutta pehmeällä agarilla, ja kyvyttömyys muodostaa kasvaimia paljaissa hiirissä [10], [11]. Vuonna yksi näyttö, pystyimme tunnistamaan yksitoista ainutlaatuisia aptameeriin sekvenssit, jotka tunnistavat ja sitoutuvat ligandit läsnä transformoimattomissa revertanttien HF soluja, mutta ei HeLa-solut (taulukko 1). Tutkimustulosten perusteella, aptameerit 13, 20 ja 28 sitoutuvat HF ​​spesifisten solun pinnan epitooppeja, kun aptameerin 14 on sitoutuminen solun pintaan ja joka sisäistetään soluun sytoplasmaan (kuvio 4). Kyky poistaa aptameerin sitoutumisesta solujen esikäsittely proteaasin ehdotti, että kolme neljästä aptameerit testattu tunnistivat epitooppeja solun pinnalla proteiineja. Aptameeriin 14 voinut mennä soluihin riippumaton solun pinnan proteiineihin sitoutumista, tai oli tunnustetaan proteaasiresistentti solun pinnan epitoopin että sisäistänyt aptameeriin monimutkainen. Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että AC-SELEX pystyi kehittymään Aptameerien jotka tunnistavat muutokset solun pinnan makromolekyylit, jotka erottavat kasvaimia ei-tuumorigeeniset HPV-tartunnan saaneiden solujen, mikä viittaa siihen, hyödyllisyys diagnostisina koettimina.

Tutkitaan niiden ennustetekijöiden potentiaali , aptameerit 13, 14, 20 ja 28 testattiin riippumaton HPV-positiivisten kohdunkaulan syövän solulinja, SiHa, ja ylimääräinen, ei-tuumorigeenisiä revertanttien solulinjassa, HA. Merkittävästi, havaitsimme, että Aptameerien tekivät tunnistavat epitooppeja ei-tuumorigeenisiä HA soluissa, mutta ei sitoutunut kasvaimia SiHa soluja (kuvio 6), joka tukee oletusta, että Aptameerien tunnistavat markkereita hävinneitä HPV-välitteinen transformaatio kohdunkaulan epiteelisolujen . Koska HF, HA ja HeLa solulinjat ovat isogeenisiin, odotamme erot geenien ilmentymisen ei liity transformaation minimaaliset, ja siksi, että aptameerit kehittynyt todennäköisesti tunnistavat tärkeitä biomarkkereita ja epitoopit ohjeellinen kohdunkaulan solujen kasvainten muodostumiseen. Nämä tulokset osoittavat, että Aptameerien tuottamat AC-SELEX on kyky ensisijaisesti tunnistaa erittäin tuumorigeenisia kohdunkaulan syövän solulinjoissa verrattuna ei-tuumorigeeniset kohdunkaulan syövän solulinja palautujia.

Yhteenvetona esillä oleva tutkimus osoitti toteutettavuus Adherent Cell-SELEX sekä sen hyödyllisyys paljastamisessa epitooppeja, jotka menetetään seurauksena transformaation kohdunkaulan epiteelisoluihin HPV. Paneelit Aptameerien kuten nämä, kehittynyt vastaan ​​eri kasvainten solulinjat erottaa syövän tyypit ja alatyypit voivat olla hyödyllisiä käyttää suhteuttaa diagnoosin ja ennusteen ja määrittää kemoterapiaa ja taudin alttius (eli geneettisiä eroja).

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

alussa passage ATCC CCL2 klooni HeLa-soluissa sekä SiHa kohdunkaulan karsinooman solulinjassa saatiin American Type Culture Collection. HF: n ja HA-solut saatiin kokeissa, jotka suoritettiin aikaisemmin, jossa valinta transformoimattomina revertanttien saatiin perustuu menetys rodamiini 123 solusta mitokondrioiden [11]. HeLa, HF, HA: n ja SiHa-soluja viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (Gibco), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniliuosta.

SELEX kirjasto ja alukkeet

Yksi- DNA-sekvenssit on 52 satunnaista nukleotidin reunustaa tunnetuilla 18-nt alukekohtia saatiin Integrated DNA Technologies. Alukesekvenssejä olivat 5′-ATACCAGCTTATTCAATT ja 5′-AGA TAG TAA GTG CAA TCT. FAM koodattu alukkeet luotiin 5′-per- ATACCAGCTTATTCAATT ja biotiinin tagged alukkeet luotiin 5′-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT.

SELEX Menettelyt

Ennen alku, alkaa kirjastossa noin 1,6 x 10

15 aptameerien inkuboitiin kuin siirrettävien HeLa-soluissa ja sitten sitoutumattoman aptameerejä otettiin talteen ja valmistettiin ensimmäisen kierroksen AC-SELEX. Ennen jokaisella kierroksella, aptameerit denaturoitiin kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten nopeasti jäähdytettiin jäillä 2 minuutin ajan. Jokaisen kierroksen Inkubaatioiden 3 x 10

5 HF solut huuhdeltiin PBS: llä ja inkuboitiin jäillä kanssa aptameeriin kirjaston sitomispuskuriin (1% BSA PBS: ssä, jossa suolat) varovasti sekoittaen. Sitten solut huuhdeltiin PBS: llä ja aptameerien, joka sitoutui HF solut eluoitiin lisäämällä eluutiopuskuria (100 mM NaCl, 10 mM Tris 7,5, 1 mM EDTA: a ja 1% SDS), ja ottaa talteen käyttämällä Hirt DNA prep menetelmä [35], joka osallistuu fenoliuutto, fenoli-kloroformiuutto, kloroformiuutolla. Olemme myös sisällytetty back-uuttovaihe varmistaa riittävä aptameeriin elpymistä. Genominen DNA poistettiin sitten etanoli ratkaisu. Aptameerit otettiin talteen liuoksesta etanolisaostuksella (3 M NaOAc: sta 100% etanolia) ja sen annettiin laskeutua yön yli -20 ° C: ssa. Saatu näyte sentrifugoitiin ja pelletti huuhdeltiin kahdesti 70% etanolilla ja sen annetaan kuivua. Sitten pelletti rekonstruoitu vuonna sitova puskuriin ja inkuboitiin 10

6 HeLa soluja aptameeriin vastakkaisella valinnalla. Sitten solut huuhdeltiin PBS: llä ja ei-sitovia aptameerit otettiin talteen tästä laimeita vesiliuoksia uudelleen käyttämällä Hirt menetelmällä, kuten back-uuttovaihe, jota seurasi etanolisaostus aptameerit. Saatu aptameerin kirjastot monistettiin sitten PCR: llä, jossa on biotiini-merkitty aluketta ja ei-biotiini-merkittyä aluketta (Integrated DNA Technologies), ja tuloksena kaksijuosteiset aptameerit erotettiin sitten käyttäen streptavidiinilla päällystettyjä helmiä ja sarakkeen sentrifugoimalla erottaa ei-toivotut biotiini-koodattu sekvenssi halutun aptameeriin sekvenssi (katso PCR ja aptameeriin Strand Separation). Tuloksena yksijuosteiset Aptameerien saostettiin sitten ja käytetään seuraavan kierroksen AC-SELEX.

PCR ja aptameeriin Strand Separation

Aptameerit johtuvat vastapäivään valinnan vaihe oli saatettu eluoimispuskurilla (100 mM NaCl, 10 mM Tris 7,5, 1 mM EDTA: a ja 1% SDS) ja monistettiin PCR: llä, jossa biotiini-merkittyjä alukkeita (94 ° C 30 sekuntia, 46 ° C 30 sekuntia, 72 ° C 30 sekuntia) on Eppendorf-AG 22331 thermocycler (Hampuri, Saksa). Edellytykset PCR-monistukseen aptameerin kirjastojen eroaa homogeeninen DNA. PCR optimoitiin noin suorittamalla 18 kierrosta AC-SELEX. Tutkimus satunnainen nukleotidin tämän kaltaiset pituus on osoittanut, että tuote muodostuminen saavuttaa maksimin 18 kierrosta, ja jos enemmän kuin 20 kierrosta PCR suoritetaan, sivutuotteita alkaa muodostua, ja on olemassa riski, täydellinen menetys aptameerin tuotteen [36 ]. Saatu biotiini-merkitty kaksijuosteiset aptameerit sitten keitettiin 5 minuutin ajan, flash jäähdytettiin jäävedessä 3 minuuttia, ja inkuboitiin streptavidiinilla päällystettyjen helmien sarakkeessa sitomispuskuria (20 mM NaPO 4, 150 mM NaCl) ennen kolonniin sentrifugoimalla. Saatu yksijuosteinen aptameerit saostettiin pylväästä virrata kautta etanolisaostus. Aptameeriä Sitten pelletti liuotetaan PBS: ään 1% BSA ja tämä aptameeriin liuosta käytettiin seuraavalla kierroksella AC-SELEX.

aptameeriin Kloonaus

Kun 18 kierrosta AC-SELEX, The tuloksena aptameeriin pool PCR-monistettiin muunneltua alukkeilla. Saatu aptameerin kirjasto ligatoitiin sitten plasmidit ja kloonattiin Escherichia coli käyttäen

TOPO

TA

-koonaustarvikepakkausta

sisältävät pCR®2.1-

TOPO

® (

Invitrogen

, K4500-01). Plasmidit puhdistettiin käyttämällä QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, 27106). Pitoisuudet tuloksena Puhdistettuja plasmideja määritettiin käyttäen Nanodrop TM 1000 Spektrofotometri (Thermo Scientific). PCR seurasi geelielektroforeesi suoritettiin sitten puhdistettu plasmidi näytteiden varmistaa insertin oikeaan pituuteen.

aptameerin Sequencing

kaksijuosteiset aptameerit sekvensoitiin käyttämällä M13-forward- ja reverse-alukkeita tarjotaan TOPO 10 kloonaus kit. Plasmidit sekvensoitiin yliopiston lääketieteen ja hammaslääketieteen New Jersey DNA Core Facility (Piscataway, NJ).

DNA Folding Ennusteet

Toissijainen rakenteet yksijuosteisen DNA Aptameerien ennustettiin käyttämällä UNAfold mfold ohjelmistot (https://mfold.rna.albany.edu). Rakenteet esitteli annetaan lähtönä sir_graph ® kehittämä D. Steward ja M. Zuker [13].

Imaging Cell-Aptameerin Complexes

FAM 5′-merkinnällä Aptameerien syntetisoitiin Integrated DNA Technologies. Soluja viljeltiin kammiossa dioja, kasvatettiin yön yli, huuhdeltiin PBS: llä ja sitten annettiin inkuboitua fluoresoivasti leimattu aptameeri (t) PBS: ssä, jossa oli 1% BSA: ta jään päällä 45 minuuttia. Sitten solut huuhdeltiin PBS: lla ennen kiinnittämistä 4% paraformaldehydillä. Kiinnitetyt solut huuhdeltiin sitten PBS: llä ja nopeasti DNaasi vapaata vettä, ja on asennettu käyttämällä Aquamount (Polysciences, Inc.). Soluun sitoutuneen aptameerit sitten kuvattiin käyttämällä Leica -konfokaalimikroskoopilla.

Fluoresenssi kvantifiointi Analyysi

fluoresenssin aptameerin-solu kompleksit mitattiin käyttämällä Leica Lite-ohjelmisto. Solut kuvattiin käyttäen Leica -konfokaalimikroskoopilla ja yksilöllisesti kvantifioidaan Leica Lite ohjelmistoa. Neljä solut kvantifioitiin per datapiste jälkeen taustan vähentäminen. Keskimääräinen fluoresenssin piirretään kanssa virhepalkkien edustaa keskivirhettä keskiarvon datapisteen. Näennäinen Kd-arvot kullekin aptameeriin määritettiin lineaarisella regressiolla paikan päällä sitova yhtälön mukaisesti: Y = B max * X /(Kd + X) käyttäen GraphPad Prism versio 5.04 Windowsille (GraphPad Software, La Jolla California USA, www. graphpad.com [37].

proteinaasikäsittely Solujen

suunnitelleet AC-SELEX menettely mahdollistaa aptameerin sitovan pinnan proteiinin epitooppeja, jotka voivat olla herkkiä proteinaasit. sen määrittämiseksi, joka aptameerin epitoopit olivat herkkiä proteaasien, käsittelimme kohdesolujen proteaasit vähintään 4 kertaa kullekin proteinaasi ja aptameerin ja määritetään aptameerin sitovia. soluja käsiteltiin 0,05% trypsiiniä ja 0,53 mM EDTA HBSS tai 0,1 mg /ml proteinaasi K: PBS: ssa 37 ° C: ssa 2 ja 10 min. proteinaasi käsitellään kohde- soluja käytettiin sitten fluoresoivasti leimattu aptameerin sitova kuten edellä on kuvattu.

Tiedoksi

kiittää Dr. Denise Galloway varten SiHa kohdunkaulan syövän solulinja, tohtori Paul Thomas ja tohtori Carol Gardner apua varusteineen ja protokollia, ja Christal Lewis hänen apua PCR optimoinnin.