Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

bisfosfonaatti, tsoledronihappo (ZOL), voi estää osteoklastien mikä alentaa osteoklastogeneesiä ja osteoklastiaktiivisuutta luuhun. Tässä käytimme sekoitettu osteolyytti- /osteoblastic hiirimallissa luun etäpesäkkeitä eturauhassyövän, RM1 (BM), määrittää, miten estämällä osteolyysiä kanssa ZOL vaikuttaa kykyyn näiden solujen luoda etäpesäkkeitä luussa, eheys kasvain kantavien luiden ja selviytymisen kasvaimen kantavien hiirten.

Methods

malli sisältää sydämensisäisellä injektiona valtimoiden levittämistä RM1 (BM) soluja C57BL /6-hiirissä. ZOL hoito annettiin subkutaanisesti injektiot päivinä 0, 4, 8 ja 12, 20 ja 100 ug /kg annoksia. Bone eheys arvioitiin mikro-tietokonetomografia ja histologia kanssa verrattuna hoitamattomiin hiiriin. Osteoklastien ja osteoblastien aktiivisuus määritettiin mittaamalla seerumin tartraatti-resistentti hapan fosfataasi 5b (TRAP-5b) ja osteokalsiini, vastaavasti. Hiiret tapettiin määrätyin perustein ja eloonjäänti arvioitiin käyttämällä Kaplan Meier tontteja.

Havainnot

Micro-CT ja histologinen analyysi osoitti, että hiirten käsittely ZOL päivästä intrakardiaa- injektion RM1 (BM) soluja esti tuumorin indusoimaa luun hajoamista, ylläpitää luun tilavuuteen ja vähentää kalkkiutumista kasvainten aiheuttaman endokondraaliseen osteoid materiaalia. ZOL käsittely johti myös vähentynyt seerumin osteocalcin ja TRAP 5b tasolle. Lisäksi käsitellyillä hiirillä osoittivat lisääntynyttä selviytymistä verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin. Kuitenkin ZOL käsittely ei estänyt solujen kykyä lähettää metastaaseja luun kuin määrä luu-etäpesäkkeitä oli samankaltainen sekä käsiteltyjen ja käsittelemättömien hiirten.

Johtopäätökset

ZOL kohtelun merkittävää hyötyä ylläpitämiseksi eheys kasvain kantavien luiden ja lisäsi eloonjäämistä kasvain kantavien hiirten, vaikka se ei estä perustamista luu-etäpesäkkeitä tässä mallissa. Vuodesta mekanistinen mielestä nämä havainnot vahvistavat, että kasvaimen aiheuttama luun hajoamiseen ei vaatimus Näiden sekä luukasvaimet.

Citation: Hung TT, Chan J, Russell PJ, Virta CA (2011) tsoledronihappo Preserves Bone Structure ja Lisäykset Survival, mutta ei rajoita Kasvainten esiintyvyys on Eturauhassyöpä luumetastaasi Model. PLoS ONE 6 (5): e19389. doi: 10,1371 /journal.pone.0019389

Toimittaja: Wafik S. El-Deiry, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 helmikuu 2011; Hyväksytty: 28 maaliskuu 2011; Julkaistu: toukokuu 16, 2011

Copyright: © 2011 Hung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat halutessaan ilmoittaa, että tämä työ oli rahoittaa osaksi tutkimus avustusta Novartis Australia. Novartis tarjosi myös tsoledronihapon tälle tutkimukselle. TH oli osittain tukee Eturauhassyöpä säätiön Australia. CAP oli osittain rahoittama Sydney Foundation of Medical Research ja on mies National Imaging Facility, Australia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Hanke rahoitettiin osittain tutkimus avustusta Novartis Australia. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Jotkut primaarisyöpien on suuri taipumus metastaaseja luuhun mutta syitä tähän ovat edelleen epäselviä, vaikka on yleisesti hyväksyttyä, että kasvu useimmat syövät luun riippuu tekijöistä läsnä luun mikro-ympäristössä. Syöpäsolut voivat indusoida proliferaatiota ja aktivaatiota luun solujen kautta vapauttamaan kasvutekijöiden ja tämä aktiivisuuden lisääntyminen aiheuttaa edelleen stimulaation syöpäsolujen mitä on kutsutaan ”noidankehä” [1]. Bone osallistuminen on yleinen eturauhas- ja rintasyöpiä ja myeloomasolujen, ja vaikka rintasyöpä ja myelooma luu-etäpesäkkeet ovat pääasiassa osteolyyttisiä, joihin liittyy lisääntyneitä osteoklastien toiminta johtaa luun eroosioon, eturauhassyövän luumetastaasin tapaukset ovat heterogeeninen, johon sisältyy sekä luun lyyttisiä ja aloitamme vaikutuksia [ ,,,0],2]. Vuonna osteolyyttisiä vaurioita, syöpäsolut voivat tuottaa sytokiineja, jotka edistävät osteoklastien suoraan [3], [4] ja epäsuorasti stimuloimalla luuydinperuskudos- solujen edistää osteoklastigeneesin [5]. Samoin kasvaimen solut voivat tuottaa sytokiineja, jotka edistävät osteoblastien aktiivisuus ja indusoivat luun kasvua [6] ja osteoblastien voi aiheuttaa syövän kehittymisen ja etenemisen [7], [8], [9]. Vuorovaikutusta kasvainsolujen ja luun solujen sanelevat luun metastaattisen fenotyypin.

Tsoledronihappo (ZOL) ja muut bisfosfonaatit (BP) estävät etäpesäkkeiden ja luun kasvua asuvien kasvaimia estämällä osteoklastien toimintaa. Siten ZOL estää luun tuhoisia vaikutuksia kasvaimen ja tuloksena esto luun myös hidastaa noidankehä, mikä pienentää luun kasvaimen koon ja, joissakin tapauksissa, määrä luuleesioita eri eläinmalleissa osteolyyttisiä luusyöpä [10]. Kuitenkin on ollut ristiriitaisia ​​raportteja vaikutuksista ZOL on osteoblastisissa luukasvaimet. Vaikka ZOL hoito ei estä sisäiseen luun kasvun osteoblastien solulinjan LAPC-9 [11], kasvua sisäisen sääriluun LuCaP 23,1 solujen estyy ZOL [12]. Myöhempi tutkimus ehdotti, että kasvain välittämä osteolyysiä ei tarvita osteoblastisissa etäpesäkkeiden [11].

Täällä käytämme sekoitettu osteolyytti- /osteoblastic syngeneeisissä hiirimallissa eturauhassyövän etäpesäkkeiden luun, Rm1 luun metastaattinen (BM) malli [13] ja arvioida ZOL kohtelu

perustaminen

luun etäpesäkkeitä, eheys kasvain luut ja yleistä eloonjäämistä hiirillä.

RM1 (BM) soluja injektoidaan vasempaan kammioon sydämen tulos useita luumetastaaseja muutamia pehmytkudoksiin kasvaimia. Osoitamme, että esto osteolyysiä kanssa ZOL käsittely ei vaikuta esiintyvyys luinen kasvaimia. Kuitenkin, ZOL hoito ei lisätä hiirten eloonjääntiin tavalla, joka on annoksesta riippuvainen. Tärkeintä on, ZOL hoito vähensi myös lyyttinen vaikutukset RM1 (BM) kasvaimia luun arvioimana histologia ja mikro-tietokonetomografiaa (mikro-CT) analyysi, ja näyttää estävän kalkkeutumista kasvainten aiheuttaman rustonsisäisen luun, mutta ei osteoid muodostus. Emme onko ZOL vaikuttaa koko tai kasvukinetiikkaan kasvaimia. Kokeissa esitetään tässä käytetään sisäistä sydämen injektio, joka ei aiheuta luun vaurioita suoraan ja tuloksena etäispesäkkeitä Näissä kokeissa ovat todennäköisesti liittyy suhteellisen vähän soluja. Täten perustetaan etäpesäkkeiden yksittäisistä soluista tai pieniä klustereita solujen ehto todennäköisemmin heijastaa luonnon metastaattisen tapahtumia, ei välttämättä vaadi alkuperäistä lyyttisiä olosuhteissa.

Tulokset

RM1 (BM ) luun etäpesäke malli, ZOL hoito oli merkittävä vaikutus hiirten eloonjääntiin verrattuna hoitamattomiin hiiriin (kuvio 1). Kaiken kaikkiaan oli suuntaus elonjäämisetua lisääntynyt annoksella (p = 0,012). Survival of hiiret 100 ug /kg annos oli merkittävästi erilainen kuin ajoneuvon käsitellyssä ryhmässä (p = 0,031), kun taas 20 ug /kg annos ei saavutettu tilastollisesti merkittävä ero kontrolliryhmän kanssa otoskokoja käyttää näissä kokeissa (p = 0,108). Keskimääräinen elinaika varten ajoneuvo-, 20 ug /kg ZOL- ja 100 ug /kg ZOL käsitellyissä hiirissä oli 14,5, 18,5 ja 20 vuorokauden kuluttua vastaavasti.

(A) Kaplan-Meier selviytymisen kuvaaja hiirillä sisäinen valtimon injektion RM1 (BM) soluja, mitä seuraa käsittely 100 ug /kg tai 20 ug /kg tsoledronihapon annostelua tai pelkkää vehikkeliä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Log-rank testi trendi osoittaa suuntaus elonjäämisetua annoksen kasvaessa (p = 0,012), ja merkittävä ero selviytymisen välillä hiirillä 100 ug /kg vs ajoneuvon kontrolliryhmää (p = 0,031, Kaplan-Meier seurasi Breslow’in pareittain vertailu SPSS 17.0).

Osteocalcin pinnat olivat alhaisemmat kasvaimia omaavilla hiirillä, vaikka ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä ja hoito näiden hiirten 20 (p 0,01) tai 100 ug /kg (p 0,01) on ZOL edelleen pienentää seerumin osteokalsiinin verrattuna normaaleihin kontrolleihin (kuvio 2A). Seerumin TRAP-5b tasot kasvain, käsittelemätön hiiret olivat samanlaisia ​​kuin valvontaa. Kuitenkin, käsittely 20 tai 100 ug /kg ZOL alensi seerumin TRAP-5b on pienempi kuin 40% kontrollihiirissä ja niille annettiin RM1 (BM) soluja vain (p 0,001, kuvio 2B).

(A) tasot osteoblastien merkki, osteokalsiini vähenivät seerumissa tsoledronihapon käsiteltyjen hiirten. (B

) B tartraatti-resistentti hapan fosfataasi 5b, indikaattori osteoklastien toimintaa, myös vähensi hoitoon. Pisteitä kaaviossa edustaa seerumitasot Yksittäisten hiirien kun palkit osoittavat asento keinot kussakin ryhmässä. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA-analyysi, jota seuraa Tukeyn kokeen. *** P 0,001.

Läsnäolo tuumorileesioissa hiirissä arvioitiin kahdella tavalla, fluoresenssikuvantamisella vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) ilmentymistä tuumorisoluissa seuraa vahvistuksen histologia kuvatulla [ ,,,0],13]. Rm1 (BM) solulinja oli herkkä zol hoito

in vitro

(tuloksia ei esitetty), mutta hoito oli vähän vaikutusta esiintyvyys pehmytkudoksen tai luun kasvaimia tässä mallissa. ZOL hoito ei vähentää luun vaurioiden tai määrä kasvaimeen etäpesäkkeiden pehmeän kudoksen RM1 (BM) injektoitiin hiiriin (kuvio 3A-C). Emme arvioida vaikutusta ZOL kohtelu olevien kasvainten kasvua.

(A) kokonaismäärä etäpesäkkeitä, (B) luu-etäpesäkkeitä, tai (C) pehmytkudoksen etäpesäkkeet arvioituna yksi- tavalla ANOVA. Jokainen piste edustaa lukumäärää etäpesäkkeitä yksittäisen hiiren, palkit osoittavat mediaani ryhmässä.

Uudelleenkoottu kolmiulotteisia kuvia luut mikro-CT ja edustava H ja E värjättyä histologisia osat näkyvät kuviossa 4 ja 5 vastaavasti. Leikkeet värjättiin myös tetrachrome tahra [14] erottaa uuden luun kehittämiseen perustettu /calcified luu (kuva 6). Hiiret metastasoitunutta luuleesioita pitkien luiden osoitti merkittäviä luun hajoamiseen, erityisesti lähellä epifyysilevyjen levy, jossa vähenemiseen trabekulaarisen luun (kuva 4B) verrattuna normaaleihin kontrolleihin (kuvio 4A). Lyyttinen vaikutus kasvaimen pelkistetään 20 ug /kg ZOL hoitoryhmässä (kuvio 4C), ja ehkä enemmän niin hiirillä, joille annettiin 100 ug /kg ZOL (kuvio 4D). Mikro-CT tulokset vahvistavat histologiset tulokset (kuva 5 ja 6), joka osoittaa normaalia trabekkeliluuta rakenne käsittelemätön kontrolli hiiret (kuvio 5A, 5B ja 6A), mutta merkkejä sekä lyyttisiä ja aloitamme vaikutuksia käsittelemättömän kasvain luut (kuvio 5C, 5D ja 6B). ZOL hoito 20 ug /kg säilynyt trabekkeliluuhun rakenne kasvain luista (kuvio 5E, 5F ja 6C) ja 100 ug /kg: n annos lisäsi trabekulaarisen luun (kuvio 5G, 5H ja 6D). Kasvu kasvaimen aiheuttama endokondraalinen trabekulaarisen luun muodostumista on erityisen ilmeistä ZOL käsitellyissä hiirissä (kuvio 5E ja 5G) johtuen samanaikaisesta eston kasvaimen aiheuttamaa tuhoutumisen. Kuitenkin epätäydellinen mineralisaatio trabekkeliluuta osteoidi lähellä epifyysilevyjen levy on ilmeistä ZOL-kasvaimen luista (kuvio 6C ja 6D).

MicroCT skannaa hiiren reisiluu ja sääriluu; Normaali ohjaus (A), RM1 (BM) kasvain (B), RM1 (BM) kasvain käsiteltiin 20 ug /kg ZOL hoito (C), RM1 (BM) kasvain käsiteltiin 100 ug /kg ZOL hoito (D).

H B) ja RM1 (BM) kasvain luista (C-H); Tyypillisiä esimerkkejä luut käsittelemättömän hiirillä (A-D) ja hiirissä, joita hoidettiin 20 ug /kg ZOL (E F) tai 100 ug /kg ZOL (G H) on esitetty. T = kasvain, Arrow = Trabekulaariluun.

Tetrachrome tahra erilaistumiseen mineraalistuneen ja unmineralised luun 120x suurennuksella Normal (A), tai RM1 (BM) kasvain luista (B-D). (A B) Käsittelemättömät, (C) 20 ug /kg ZOL (D) 100 ug /kg ZOL. T = kasvain, Arrow = Trabekulaariluun.

kvantitatiivinen analyysi mikro-CT tiedot osoittavat, ettei merkittävää muutosta pinta luut normaaleissa, kasvain tai käsitelty luista (kuva 7A). Ensisijainen vaikutus kasvain on väheneminen luun tilavuus (p 0,01, kuvio 7B), ja sen seurauksena lisäys luun pinta-ala: luun tilavuuden suhde kasvaimen luista (p 0,001, kuvio 7C), kun taas ZOL hoidot johtavat lisääntyneeseen luun tilavuuteen (p 0,001, kuvio 7B) ja väheneminen luun-ala: luu-tilavuuden suhde (p 0,001, kuva 7C) kasvaimen kantavien luiden.

ei ollut merkittävää muutosta luun pinta-ala (a), läsnäolo indusoi kasvaimen tai hoidon tsoledronihapolla. Kuitenkin luun tilavuus väheni dramaattisesti in RM1 (BM), joka sisältää luut ja käsittely ZOL esti tämän menetyksen annoksesta riippuvalla tavalla (B), mikä vähentää pinta-ala /tilavuus-suhde (lisääntynyt luun tiheys) verrattuna normaaliin tai kasvaimen vie- ras luut (C). Tulokset perustuvat mittauksiin saatu TT, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Tukeyn kokeen, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

Keskustelu

Kun pistetään sisäinen sydämen reitti, RM1 (BM) solulinja indusoi useiden luustometastaaseja suhteellisen vähän (ja suhteellisen pieniä) pehmytkudoksen kasvaimet [13]. Huomattavaa on se havainto, että tuloksena luumetastaaseja eivät näytä suosivat erityisesti luustokohtien jossa nopea luun tapahtuu, mikä osoittaa, että nopea luun ei tarvita perustamiseen etäpesäkkeitä. Lisäksi tuloksena luustometastaaseja, ovat sekoitettu osteolyyttinen ja osteoblastic merkkien ole fenotyyppiin vallitseva [13]. Olemme todenneet, että sisäinen sydämen injektion RM1 (BM) soluja on erinomainen malli arvioimiseksi jos ZOL voi estää perustaminen kasvainten etäpesäkkeiden, jotka eivät olleet riippuvaisia ​​lyyttinen kasvu, joka on, noidankehä. Olemme arvioitiin myös kyky ZOL hoidon inhiboida kasvainten aiheuttamaa osteolyysiä ja luun muodostuminen ruston ja määritetään vaikutus hoidon yleiseen eloonjäämiseen hiirillä.

Kuten muut typpeä sisältävät BP, ZOL indusoi apoptoosia osteoklastien estämällä entsyymien mevalonaatin reitin ja estää isoprenylation pienten GTP-proteiinien kuten Ras ja Rho [15], [16].

In vivo

, BPs sitoutuvat suurella affiniteetilla luuhun hydroksi-appatite ja siten ovat erottautuvat aktiivisella osteoklastien suurina pitoisuuksina, mikä johtaa osteoklastien apoptoosin. Vaikka useita muita mekanismeja, mukaan lukien suora tappaminen syöpäsolujen, angiogeneesin inhibition ja aktivaation γδT soluihin [17], [18] on osoitettu ZOL, sen vaikutus osteoklastien edelleen tärkein mekanismi, jonka ZOL estää luun syöpä nykyisen hoito-ohjelmat. Hyöty potilaalle on mahdollisesti kaksijakoinen: ZOL estää osteoklastien lyysiksellä aiheuttama kasvain ja siten keskeyttää noidankehä ja myöhemmin edistäminen kasvaimen kasvua. Tämä pätee varmasti osteolyyttisiä kasvaimia, mutta vaikutukset ZOL kohtelu kasvaimia, jotka eivät ole riippuvaisia ​​luun hajoamiseen ovat huonosti tunnettuja.

kasvainten kantavien hiirten kanssa ZOL lisäsi elinaikaa hiirillä tutkimuksessamme ( Kuvio 1). Tällä 100 ug /kg annos, on tilastollisesti merkittävä kasvu elinaika verrattuna ajoneuvon käsitellyistä hiiristä ja lisääntymässä hengissä 20 ug /kg käsitellyillä hiirillä. Samanlaisia ​​tuloksia on raportoitu muiden syngeenisen syövän mallit [7], [8], [9]. Kuitenkin osteolyytti- malleissa multippelimyelooma [10] ja rintasyövän [8], vähentää merkittävästi perustamalla luun etäpesäkeleesioita havaittiin, mutta tämä ei ole totta meidän (kuva 3). Olemme osoittaneet aiemmin [13], että RM1 (BM) soluja metastaaseja useimpiin luustokohtien ja siten etäpesäke näiden solujen luinen sivustoja näyttää olevan riippumaton luun vaihtuvuus. Siten emme ole yllättyneitä, että esto luun hajoamiselle ZOL hoidon ei ole osoitettu olevan vaikutusta perustamisesta kasvaimia luun. Nämä havainnot viittaavat siihen, että predilection Rm1 (BM) soluja luu on riippuvainen muista tekijöistä, mahdollisesti lisääntynyt ohjautumista luinen sivustoja tai riippuvainen tekijöistä riippumattomia luun tuhoutumisen. Vaikka tämä on sekoitettu osteolyytti- /osteoblastic malli, tulokset ovat toisin kuin Corey [12], mutta samanlaisia ​​tuloksia saavutettu osteoblastisolujen linja, LAPC-9 [11].

Olemme arvioineet pitoisuudet kahden luun markkereita, osteokalsiinin (erittämä osteoblastit) ja TRAP-5b: (valmistaja osteoklastien) seerumin kokeellisen hiirillä. ZOL hoito pienentää seerumin molempien markkereita (kuva 2) osoittaa, että ZOL on estänyt molempien osteoklastien ja osteoblastien aktiivisuus systeemitasolla. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä aikaisempien raporttien on vähentynyt osteokalsiinin syöpäpotilaista [19] ja TRAP 5b laskua hiirillä [20] hoidon jälkeen ZOL. Havainto, että sekä osteoblastien ja osteoklastien aktiivisuutta on alentunut viittaa siihen, että havaittu lisäys luun määrä ja pinta-ala, jossa ZOL hoitoon (kuvio 7) on seurausta siitä, että osteoklastien toimintaa, sen sijaan lisääntynyt osteoblastien aktiivisuutta. Kuitenkin pidämme erityisen kiinnostavaa, että osteokalsiinin tasot seerumissa laski ZOL kasvaimen kantavien hiirten hoitaja havainnon kanssa lisääntynyt ruston osteoidin muodostumista näissä hiirissä (kuvio 5 F ja H). Tärkeää on, että uusi osteoid materiaalia havaittu ZOL käsitellyissä hiirissä näyttää suurelta osin un-calcified (kuvio 6C ja 6D), erityisesti suurilla annoksilla (kuvio 6D), silloin, kun hiiret tapettiin mikä viittaa irrottaminen on osteoid kehityksen ja kalkkeutumista vaiheet luun muodostumista. Merkityksellistä on se havainto, että osteocalcin-hiirillä ovat lisääntyneet luun muodostumista [21]. Väheneminen trabekulaarisen luun kalkkeutumista kanssa kasvoi ZOL annos on uusi havainto ja näyttää olevan ristiriidassa laaja aikaisempiin tutkimuksiin vaikutuksista bisfosfonaattien luuhun. Olemme kuitenkin osoittavat myös, että ZOL hoito kasvaimen omaavien hiirten lisää luun volyymi hiiren jalkojen luut (kuvio 7B), joka tukee aiempia havaintoja. Vastaavissa prekliinisissä tutkimuksissa käyttäen C4-2 [21] ja LuCaP 23,1 [22] ksenograftimalleissa, ZOL hoito myös osoitettu lisäävän yleistä luun tilavuus. Siten vähentynyt mineralisaatio äskettäin muodostuneen trabekulaarisen luun havaittiin tässä on sopusoinnussa yleisen säilyttäminen nykyisten mineralisoituneen luun kasvaimen kantavien hiirten. Nämä vaikutukset ZOL ylläpitämisessä luun eheyttä liittyy lisääntynyt eloonjääminen ZOL käsitellyissä hiirissä.

vaikutukset ZOL luun rakenne voi tai ei voi suoraan vaikuttaa syövän etenemisen, mutta ennaltaehkäisy epänormaali luun mallinnus kasvaimen ratsastetaan luu voi olla avain zol vähentää luuston liittyvät komplikaatiot ja pidentää aikaa luustoon liittyvät tapahtuman esiintyminen potilailla, joilla on luun etäpesäkkeitä eturauhassyövän [23], [24]. Lisäksi ZOL hoito on merkittäviä vaikutuksia käsittelevät kivun väheneminen klinikalla. BP parantaa luusto potilailla, joiden merkittävä vähentäminen liittyvän kivun [25], [26], [27], joka on katsottu johtuvan uudelleen kalkkeutumista luun, joka on johtanut vähenemiseen kipulääke käyttö. Merkityksellistä on se havainto, multippelia myeloomaa (an osteolyytti- tauti) potilailla, vähentynyt osteokalsiini tasot, kuten on raportoitu tässä, liittyi vähenemiseen luustoon liittyviä tapahtumia [28]. Hoito tsoledronihappo on tehokas hoito sekoitettu osteoblastic /lyyttinen kasvaimet, koska se lisää selviytymistä käsitellyistä hiiristä. Hoito estää luun hajoamiseen ja vähentää osteoklastien aktiivisuutta odotetusti. ZOL hoito vähensi myös seerumin osteokalsiini, mutta ei estää kasvaimen indusoiman ruston osteoid muodostuminen, vaikka se inhiboivat osittain myöhemmin kalkkiutuminen tämän osteoidimateriaalin annoksesta riippuvalla tavalla. ZOL ei harventaa etäpesäkkeiden osoittaa, että vaikka RM1 (BM) kasvaimia indusoivat luun hajoamiseen, perustaminen kasvaimia ei ole riippuvainen lyyttisiä kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

The University of New South Wales animal Care ja eettinen komitea hyväksyi eläinten säilytys-, kasvatus-, ja kaikki koetoimenpiteet tehtävä eläimillä ennen kokeita (Project sovellus hyväksymisnumero: 05 /120B). Hiiriä seurattiin tarkasti (päivittäin) ja tapettiin ennalta määrättyjen kriteerien mukaan (tappio 20% kehon painosta, merkittävä heikkeneminen kunnossa, tai osittainen halvaantuminen) hyväksymä eläimen eettisen.

Soluviljely

RM1 solut saatiin Dr. T Thompson, Baylor College, ja RM1 (BM) kehitettiin sarja siirrostamalla of RM1

in vivo

[13]. Molemmat solulinjat kasvatettiin standardiolosuhteissa (37 ° C: ssa 5% CO

2 yrityshautomo) DMEM (Invitrogen, Melbourne, Australia), jossa 10% FBS (Invitrogen) ja L-glutamiinia (Invitrogen).

sijaismarkkereiden Bone etäpesäke seerumissa

Sera kasvain-solu-injektiona saaneiden hiirien ja normaalien kontrollihiirten kerättiin ruumiinavauksen sydänpunktiolla arvioitiin läsnäolo korvike luun aineenvaihduntaa. Riittämätön seerumi oli saatavissa jonkin verran hiirien arvioimiseksi sijaismarkkereiden. Osteokalsiini pitoisuus arvioitiin käyttämällä osteokalsiinin entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tartraatti-resistentti hapan fosfataasi (TRAP) 5b pitoisuus määritettiin Hiirenloukku määrityksen (Suomen Bioanalytikka Oy, Turku, Suomi) kielletty pakkauksessa. Seerumin proteiinin tasot määritettiin vertaamalla standardikäyrään valmistettu standardien varustettu määrityksiä.

Eläimet

5-6 viikkoa vanhoja C57BL /6-hiiret saatiin Animal Resource Centre (Adelaide , Australia). Ne oli pidetty, ja ylläpidettiin Biological Resources Centre, Little Bay, NSW. Päivänä 0 kokeen, hiiriin injektoitiin joko 3 x 10

4 RM1 (BM) soluja suolaliuosta tai yksin suolaliuoksella (100 ui) vasempaan kammioon sydämen. Hiiriä käsiteltiin päivinä 0, 4, 8 ja 12 pistoksena ihon alle joko 20 ug /kg tai 100 ug /kg tsoledronihapon (Novartis Pharmaceuticals, Australia) tai suolaliuosta (ajoneuvo). Kumulatiivinen annos 20 ug /kg vastaa noin kerta-annos 4 mg potilailla. Hiiriä seurattiin tarkasti ja tapettiin ennalta määrättyjen kriteerien mukaan (tappio 20% kehon painosta, merkittävä heikkeneminen kunnossa, tai osittainen halvaantuminen) hyväksymä eläimen eettisen. Kasvainten määrä kunkin hiiren arvioitiin GFP fluoresenssin (kuten aiemmin on kuvattu [13]) ruumiinavauksessa seuraa histologia. Läsnäolo vain rintakehä kasvain on osoitus siitä, että IC injektio ei onnistunut, ja siksi sellaiset hiiret jätettiin näihin arviointeihin.

Histologia

Hiiri ruhot kiinnitettiin 10% formaliinia fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), 48 h, sitten kalkki 10% EDTA: 10-14 päivä. Kalkittomat etualalle ja takajalat parafiiniin jälkeen kudoksen käsittely (kuivuminen, etäisyydet ja kyllästys). Osaa (5 um) leikattiin kustakin lohkosta ja värjätään Harrisin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H & E). Analyysiä mineralisaation luun, osien (8 um) leikattiin ja värjättiin tetrachrome tahra mukaan aiemmin julkaistujen menetelmien [14] pienin muutoksin: Tällä Ponceau red liuos korvattiin Briebrich Scarlet /Acid Fuchsin ratkaisu. Leikkeet tutkittiin kanssa Aperio Scanscope XT (CA, USA) ja otetut kuvat Imagescope Viewer (Aperio, CA, USA).

Micro-CT skannaus ja analyysi

Kun formaliini Kiinnittämisen takajalat valittu mikro-CT skannaus ennen käsittelyä varten histologiaa. Kasvaimen laakeri raajat tunnistettiin ennen ilmentämällä GFP

in vivo

. Kasvaimen kantavien hiirten sai 20 ug /kg: n annoksena, sekä oikea että vasen takajalat viisi hiirtä oli skannattu. Muiden hoitoryhmien, vain yksi jalka oli skannattu kustakin hiirestä. Kaikkien analysoitujen luut olivat peräisin eläimistä, jotka lopetettiin päivän välillä 15 ja 21 sen jälkeen, kun solujen injektion. Skannaus ja jälleenrakentaminen suoritettiin käyttäen Skyscan 1072 mikro-CT-järjestelmän ja siihen liittyvän ohjelmiston (Skyscan, Antwerpen, Belgia). Säilyttäen mallin näkökenttä aikana kuva hankinta, näyte kierretty 180 ° pystyakselin ympäri. Kuvat valotettiin 5,9 sekuntia ja ennusteet kirjattiin kussakin rotaatio vaiheessa, jokainen 0,9 °, 80 keV ja 100 mA. Poikkipinta kuvia (DICOM-muodossa) muodostettiin ennakoituun CT-kuvia käyttäen Nrecon (Skyscan, Belgia). Luun pinta-ala ja tilavuus laskettiin DICOM kuvia käyttämällä valmistajan ohjelmiston (CT-Analyzer, Skyscan, Belgia). Alueella jalkojen ympärillä polvinivelen kärjestä kolmannen sarvennoisessa reisiluun ja kaksijakoisuus ja sääriluu ja pohjeluu valittiin tämän analyysin yhdenmukaisuuden varmistamiseksi. Jälleenrakennus 3D-mallin ja kuvan visualisointi suoritettiin käyttäen ANT ohjelmistoa (Skyscan, Belgia).

Tilastollinen

Yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn postitse suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism versio 4.00 MacIntosh, GraphPad Software (San Diego, USA). Survival arvioitiin Kaplan-Meier seurasi Breslowin pareittain vertailu SPSS 17.0.