Krooninen sairaus

tiivistelmä

Micro (mi) RNA: t ovat tärkeitä sääntelyviranomaiset osallistuvat erilaisia ​​fyysisiä ja patologisia prosesseja, kuten syövän. Mirna-302 perhe on dokumentoitu niillä on keskeinen merkitys syövän synnyssä. Tässä tutkimuksessa selvitimme rooli miRNA-302a eturauhassyövässä (PCA). MiRNA-302a ekspressiota havaittiin 44 PCa kudosten ja 10 normaalissa eturauhasessa kudokset, sekä niiden kliinis merkitsevyys analysoitiin. Solujen lisääntyminen ja solusyklin analyysi tehtiin PCa soluissa, jotka pysyvästi ilmensivät miRNA-302a. Tavoitteena geeni miRNA-302a ja alavirran polku tutkittiin tarkemmin. Verrattuna normaaliin eturauhasen kudosten, miRNA-302a ilmentyminen säädeltiin vähentävästi PCA kudoksissa, ja oli vielä alhaisempi PCA kudoksiin Gleason ≥8. Yli-ilmentymisen miRNA-302a aiheuttamaa G1 /S solukierron pysähtymisen PCA soluissa, ja tukahdutti PCa soluproliferaatiota sekä in vitro että in vivo. Lisäksi miRNA-302a inhiboi

AKT

ilmentymisen suoraan sitoutumalla sen 3 transloitumattoman alueen, jolloin myöhemmin tehtävät muutokset

AKT-GSK3p-sykliini D1

ja

AKT-p27

Kip1

kautta. Nämä tulokset paljastavat miRNA-302a tuumorisuppressorina PCA, mikä viittaa siihen, että miRNA-302a voidaan käyttää mahdollisena kohteena terapeuttisen intervention PCA.

Citation: Zhang GM, Bao CY, Wan FN, Cao DL Qin XJ, Zhang HL et ai. (2015) MicroRNA-302a vaimentaa kasvainsoluproliferaation estämällä

AKT

eturauhassyövässä. PLoS ONE 10 (4): e0124410. doi: 10,1371 /journal.pone.0124410

Academic Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 21 lokakuu 2014; Hyväksytty: 13 maaliskuu 2015; Julkaistu: 29 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (Grant nro NSFC 81202003) (https://www.nsfc.gov.cn /) ja Science Foundation Shanghai Municipal komission terveys- ja perhesuunnittelu (Grant nro 2010145) (https://www.wsjsw.gov.cn/wsj/) ja DPD.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Koska yleisin maligniteetti miesten kehittyneissä maissa [1], eturauhassyöpä (PCA) esitetään niinikään vakaan nousun esiintyvyys Kiinassa yli viime vuosikymmeninä. Mukaan Kiinan Syöpärekisterissä Annual Report (2012) PCA on tullut kuudenneksi yleisin syöpä ja yhdeksäs suurin syy syöpään liittyvien kuolleisuus miehillä, etenkin kaupunkialueilla [2]. Lisäksi jopa 70%: lla potilaista PCA on etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi, jolloin dramaattisesti vähentynyt pysyvyyttä [3]. Täten on välttämätöntä tarvetta tutkia mekanismeja, joilla PCa sukupolvi ja etenemiseen aloitetaan.

Kasvava näyttö osoittaa, että MikroRNA (miRNA), eräänlainen endogeenisen, pienet ei-koodaavaa RNA: ita, osallistua erilaisiin solun prosesseissa. Kautta erityisesti sitovat ja pilkkomalla mRNA: iden tai estämällä niiden käännös [4,5], miRNA toimivat joko onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla [6]. Mirna-302 perhe oli ensimmäinen tunnistettu ihmisen alkion kantasoluja (hESCs) ja ihmisalkion karsinoomasoluja vuonna 2004. Sittemmin useat tutkimukset miRNA-302 perhe on keskitytty sen mahdollisen roolin uudelleen ohjelmointi somaattisten solujen aiheuttama pluripotenttien kantasolujen sekä alkion itseuudistumisen [7]. Useat transkriptiotekijät, joita ilmentyy varhaisen syövän kantasolujen kehittäminen ja ylläpito, kuten

Oct4

,

Sox2

, ja

Nanog

, havaittiin olennaista transkription säätelyyn mirna-302 perhe [8]. Mielenkiintoista on, Fareh et ai. osoittivat, että stabiili ilmentyminen miRNA-302 kykeni indusoimaan menetys

Oct4

,

Sox1

, ja

Nanog

[9]. Rooli miRNA-302 kasvainten synnyssä on keskusteltu viime aikoina, koska ristiriitaisia ​​päätelmiä on tehty eri tutkimusryhmää. Esimerkiksi endogeenisen miRNA-302 ei havaittu kohdunkaulan syöpäsoluja, ja ektooppinen ilmentyminen miRNA-302 esti solujen lisääntymistä ja kasvaimen muodostumisen [10]. Sen sijaan, transfektointi miRNA-302B in koolonkarsinoomasoluissa johti lisääntyneeseen kykyyn pesäkkeiden muodostumista, invaasio, ja muuttoliike in vitro [11]. Tähän mennessä vain harvat tutkimukset on tehty tutkia mahdollisen roolin miRNA-302 PCA.

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että verrattuna normaaliin eturauhasen kudosten PCA kudokset ilmaistu alempi miRNA-302a tasoilla, ja miRNA-302a-ilmentyminen käänteisesti yhteydessä Gleason (GS). Samalla osoitetaan, että yli-ilmentyminen miRNA-302a PCA solut voidaan indusoida solusyklin pysähtymiseen ja estävät solujen lisääntymistä in vitro ja kasvainten muodostumiseen in vivo. Lisäksi tunnistimme

AKT

tavoitteeksi geeni, jonka kautta miRNA-302a kykenee sen estävä rooli PCa.

Materiaalit ja menetelmät

Potilasnäytteet

eturauhassyövän kudosten ja eturauhasen hyvänlaatuisesta kudosta saatiin kudospankille Fudanin yliopiston Shanghai Cancer Center. Kliinis näistä potilaista haettiin Department of Urology tietokantaan. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Institutional Research Review Board Fudanin yliopiston Shanghai Cancer Center ja allekirjoitettu suostumus saatiin kaikilta TET.

Soluviljely

Ihmisen PCa solulinjat, ihmisen alkion munuaisen 293T-solut (HEK293T-) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (RWPE-1) hankittiin Institute of Cell Research Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, People Kiina). LNCaP ja 22Rv1, PC-3, DU145, ja HEK293T-soluja kasvatettiin RPMI 1640-alustassa, F-12K medium, MEM, ja DMEM-elatusainetta, vastaavasti, kaikki oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. RWPE-1-soluja kasvatettiin K-SFM väliaineessa, jota oli täydennetty naudan aivolisäkeuutetta ja ihmisen rekombinanttia epidermaalista kasvutekijää. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

RNA miRNA uuttamalla, ja kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Kokonais-RNA eristettiin viljellyistä soluista ja kasvaimen kudoksiin käyttämällä Trizol reagenssia. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen RevertAid First Strand cDNA-synteesi Kit (Life tekniikkaa, Carlsbad, CA), joka käytettiin sitten reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR), sekä eteen- ja taaksepäin-alukkeita ja virran SYBR Green PCR Master sekoita.

β-aktiini

käytettiin sisäisenä kontrollina

AKT

transkriptipitoisuuksissa. Alukesekvenssit olivat seuraavat:

AKT

-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, käänteinen: GTCCATGGTGTTCCTACCCA; β-aktiini-eteenpäin: ACCGAGCGCGGCTACAG, käänteinen: CTTAATGTCACGCACGATTTCC.

mukaan valmistajan ohjeiden miRNA kudoksista ja soluista eristettiin käyttäen Mirvana miRNA eristyspakkausta (Life tekniikka, Carlsbad, CA), ja ekspressiotasot miRNA-302a havaittiin TaqMan miRNA määritykset (Life tekniikka, Carlsbad, CA) käyttäen U6 pieni ydin- RNA sisäisenä kontrollina.

vector rakentaminen, lentivirus tuotannon ja solujen transfektio

kypsä HSA-miRNA-302a-sekvenssi syntetisoitiin ja tuotu PLKO.3G vektorin tuottamiseksi PLKO.3G-miR-302a. AKT- palauttaminen vektori rakennettiin tuomalla

AKT

CDS, joka monistettiin PC-3 cDNA osaksi pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vektori. Lusiferaasi-3 transloimaton alue (UTR) toimittaja vektori aikaansaatiin rakentamisessa

AKT

3UTR, joka kuljettaa otaksuttu miRNA-302a sitoutumiskohta vektoripoluille MT01. Kaikki rakennettu vektorit varmennettiin sekvensoimalla.

PLKO.3G-miR-302a sekoitetaan psPAX2 ja PMD2-G transfektoitiin HEK293T-soluihin käyttäen Lipofectamine-2000-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan . Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, lentivirus kerättiin ja käytettiin infektoimaan PC-3 ja DU145-soluissa. Seuraavaksi solut lajitellaan virtaussytometrialla (Beckman Coulter, Brea, CA) vakaan solulinjoja ilmentävät konstitutiivisesti miRNA-302a (PC-3-302a ja DU145-302a solut).

Luciferase määritykset

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin käyttäen 50 ui passiivisen lyysipuskuria. Seuraavaksi dual-lusiferaasin määritys suoritettiin ohjeiden valmistajan (Promega, Madison, WI). Suhde tulikärpäsen ja Renillan lusiferaasiaktiivisuudeksi käytetään ilmaisemaan lusiferaasiaktiivisuudet. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Protein sadonkorjuun ja western blot

Yhteensä proteiinit kerättiin käyttäen CelLytic Extraction kit (Roche, Basel, Sveitsi), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita ja kvantitoitiin sitten käyttäen BCA Protein Assay Reagent kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) mukaan valmistajan ohjeiden. Erottamisen jälkeen proteiinit käyttäen natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi, proteiini siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvot ja sitten estettiin 5% maidon rasvatonta. Käyttäen ensisijaisena vasta-aineet ja anti-kani on liitetty piparjuuriperoksidaasiin (1: 5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), kuten toinen vasta-aine, kohteena proteiinit koetettiin ja sitten visualisoidaan käyttäen ECL PlusWestern Blotting System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

β-aktiini

oli käytettäväksi latauskontrollina. Ensisijainen-aineita olivat seuraavat:

AKT

(1: 1000), fosforyloitiin

AKT

(

Pakt

)

(Ser473) B (1: 500 ),

GSK3p

(1: 500),

pGSK3β (Ser9) B (1: 500),

sykliini D1

(1: 1000),

p27

Kip1

(1: 1000),

PI3K

(1: 1000), (Cell Signaling Technology, Boston, MA) ja

β-aktiini

(1: 2000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX).

Solulisääntyminen ja solusyklin määritykset

CCK-8 ja edu analyysit suoritettiin havaitsemiseksi solujen lisääntymistä. Lyhyesti, CCK-8 määritykset suoritettiin seuraavasti: solut ympättiin 96-kuoppalevylle konsentraatiossa 1 x 10

4 solua /kuoppa. Kiinnittymisen jälkeen, soluja viljeltiin tuoreeseen elatusaineeseen sekoitetaan CCK-8 (10: 1) (Dojindo, Shanghai, Kiina) 2 tunnin ajan, ennen kuin absorbanssi mitattiin mikrolevylukijalla aallonpituudella 450 nm. Oppilaitoksille määrityksiä, soluja inkuboitiin EDU liuokseen (1: 5000) 2 tuntia, sitten kerättiin ja värjättiin käyttäen Cell-Light edu Apollo 643 In vitro virtaussytometria Kit (Ribobio, Guangzhou, Kiina), mukaan valmistajan ohjeiden . Sitten solut analysoitiin virtaussytometrialla.

solusyklin analyysi suoritettiin myös käyttäen virtaussytometriaa: lyhyesti, solut kiinnitettiin 75% kylmällä etanolilla yön yli, ja sitten se pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Seuraavaksi propidiumjodidilla (50 ug /ml), joka sisälsi RNaasi-soluihin lisättiin DNA-värjäystä ennen virtaussytometria-analyysi.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

yksittäisiä soluja ympättiin 60 mm: n levyillä pitoisuus 500 solua /kuoppa ja inkuboitiin sitten 5% CO

2 37 ° C: ssa. Kaksikymmentä päivää myöhemmin solut värjättiin 0,5% kristallivioletilla 30 minuutin ajan. Colony numerot kunkin levyn laskettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia.

In vivo kasvainten muodostumiseen

PLKO.3G-Scr-transfektoituja PC-3-soluja (PC-3-Scr-solut) ja PC- 3-302a solua injektoitiin ihonalaisesti joko taka kylkeen saman 4-6 viikkoa vanhoja BALB /c-nude-hiiri, joka ostettiin Shanghai SLAC Laboratory Animals Ltd (Shanghai, Kiina). Kasvainten koot mitattiin mittaharpilla vähintään kolme kertaa viikossa. Hiiret lopetettiin CO

2 päivänä 44. Kasvaimen tilavuus laskettiin ja kasvaimen paino mitattiin eläinten lopettamisen jälkeen. Kasvaimet sitten jaettu kahteen osaan, kukin osa kiinnitettiin 10% formaliinilla tai säilytetään -80 ° C. Eläin kokeet suoritettiin hyväksynnän Animal Studies eettisen komitean Fudanin yliopiston Shanghai Cancer Center.

immunohistokemia

immunohistokemia (IHC) värjäys parafinoidut yksilöitä suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],12]. Lyhyesti, kani anti

AKT

vasta-aine ja anti-hiiri /kani piparjuuriperoksidaasileimattua vasta-aineella (Univ-bio, Shanghai, Kiina) käytettiin ensisijaisena ja toinen vasta-aine, vastaavasti.

Tilastolliset analyysit

ero jatkuvia muuttujia analysoitiin käyttäen Studentin

t

-testin tai varianssianalyysi. Kaksipuolinen

P

-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS versio 20,0 (IBM Corporation, NY).

Tulokset

miRNA-302a ilmentyminen tukahdutetaan PCA kudoksiin ja on pienempi suuremmilla GS

PCa kudokset hankittiin yhteensä 44 mies potilasta, joiden keski-ikä oli 67 vuotta (vaihteluväli, 49-77 vuotta), joilla oli äskettäin diagnosoitu, patologisesti vahvistettu PCa. Niistä 32 potilasta oli saanut eturauhasen ja 12 potilasta oli saanut höyläysleikkaus eturauhasen. Patologisesti vahvisti normaali eturauhaskudoksiin hankittiin 10 miehen virtsarakon syöpä, joka oli saanut radikaalin cystectomy. Kliiniset ja patologisia piirteitä kaikista potilaista on esitetty yksityiskohtaisesti S1 taulukossa.

Olemme havainneet miRNA-302a ilmentymistason 44 PCa kudoksissa ja 10 normaalin eturauhasen kudosten ja totesi, että verrattuna normaaliin eturauhasen kudosten PCA kudokset ilmaistuna pienempi tasot miRNA-302a (kuvio 1A). Lisäksi olemme analysoineet suhdetta miRNA-302a tasoilla ja kliinis-PCA potilailla. Ei ollut merkittävää yhteyttä havaittu miRNA-302a tasoilla ja ikä, eturauhasen antigeeni tasolla tai kliinisessä vaiheessa (S1 taulukko). Kuitenkin verrattaessa miRNA-302a ekspressiotasot erilaisissa PCa kudoksissa paljasti, että ilmentyminen miRNA-302a merkittävästi vähentynyt, kun GS 7 (kuvio 1 B). Yhdessä me olettaa, että downregulation miRNA-302a ilmentyminen voi olla tärkeä rooli PCA etenemiseen.

(A) miRNA-302a ilmentyminen säädeltiin vähentävästi PCA kudoksessa verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta. (B) miRNA-302a ilmentyminen oli matalampi PCA kudoksiin GS 7 verrattuna GS = 7 (C) Alhainen miRNA-302a ilmentyminen on havaittu neljässä ihmisen PCa solulinjoissa verrattuna normaalin eturauhasen epiteelisolujen. (D) Korkeat miRNA-302a ilmentymistä havaittiin PCa-soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti miRNA-302a (*

P

0,05).

yli-ilmentyminen miRNA-302a inhiboi PCa solujen kasvua in vitro ja in vivo

tutkimiseksi funktio miRNA-302a PCA, mittasimme ilmaus miRNA-302a neljässä ihmisen PCa solulinjoissa (LNCaP, 22Rv1, PC-3, ja DU145) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (RWPE-1) kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Kuten on esitetty kuviossa 1C, oli pienempi ilmentyminen miRNA-302a kaikki neljä solulinjoissa verrattuna RWPE-1-soluja. Koska me arveltu, että yli-ilmentyminen miRNA-302a voi estää PCa solujen kasvua, olemme vakaasti yli-ilmentynyt miRNA-302a PC-3 ja DU145 soluja, joka vahvistettiin määrällinen käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioanalyysillä (qRT) -PCR (kuvio 1 D).

CCK-8, edu, ja pesäkkeitä muodostavien määritykset suorittaa tutkia miRNA-302a yliekspressio vaikuttaa PCa soluproliferaatiota in vitro. Kuten kuvassa 2, oli merkitsevästi pienempi (

P

0,05) kasvu PC-3-302a ja DU145-302a solujen kontrolleihin verrattuna. Virtaussytometrinen analyysit osoittivat, että prosenttiosuudet Edu-positiivisten solujen sekä PC-3-302a ja DU145-302a solut olivat pienempiä kuin kontrolleissa. Lisäksi kontrolleihin verrattuna, sekä PC-3-302a ja DU145-302a solujen kehitetty vähemmän pesäkkeitä 20. ja 15. päivinä, vastaavasti. Siksi in vitro kokeet osoittavat, että miRNA-302a kohdistama tukahduttava rooli PCA solujen lisääntymisen.

CCK-8 määritys suoritettiin mittaamiseksi lisääntymistä (A) PC-3 ja (B) DU145 soluja. Tulokset edustavat keskiarvoa ± keskihajonta optinen tiheys (OD) arvo havaittiin 450 nm: ssä kolmesta itsenäisestä kokeesta. Soluproliferaatiota havaittiin (C) PC-3 ja (D) DU145-soluihin käyttäen edu määritystä analysoitiin virtaussytometrialla. (E, F) Pesäkkeenmuodostusta tutkimukset osoittivat vähemmän siirtomaat miRNA-302a yliekspressoivia PCa soluja. (*

P

0,05).

edelleen vahvistaa havaintomme in vivo, PC-3-Scr soluja ja PC-3-302a solut ruiskutetaan vasempaan ja oikea taka kylkeen viisi nude-hiirten, vastaavasti. Tuumoritilavuudet mitattiin mittaharpilla eri ajankohtina siirrostuksen jälkeen, ja kasvaimen painot mitattiin lopettamisen jälkeen. Sekä tilavuus ja massa olivat huomattavasti alhaisempia PC-3-302a kasvaimia kuin PC-3-Scr kasvaimet (

P

0,05; Kuva 3). Yhdessä ilmeinen solujen lisääntymisen inhibitio havaittiin sen jälkeen, kun yli-ilmentymisen miRNA-302a PCA-soluissa.

PC-3-GFP-soluja ja PC-3-302a solut injektoitiin vasemman ja oikean taka kylkeen BALB /c-nude-hiirissä, vastaavasti (A, B). Kasvaimen tilavuus (C) ja massa (D) PC-3-302a ryhmä olivat huomattavasti alhaisemmat kuin PC-3-GFP ryhmä. (*

P

0,05).

yli-ilmentyminen miRNA-302a indusoi solukierron pysähtymisen PCA soluissa

Nyt kasvun estämistä havaittiin PCa soluissa teimme solusyklin analyysi tutkimaan, yli-ilmentymisen miRNA-302a johti solusyklin muutoksiin. Kuten kuviossa 4, osuus solujen G1-vaiheessa on lisääntynyt merkittävästi PC-3-302a soluja, kun taas osuus solujen S-vaiheessa oli huomattavasti pienempi kuin vertailuryhmässä. Vastaavia tuloksia havaittiin DU145-302a soluissa, mikä viittaa siihen, että miRNA-302a tehokkaasti indusoivat G1 /S solukierron pysähtymisen PCA soluissa.

osuus soluja G1-vaiheessa kasvanut merkittävästi PC-3-302a soluissa (A, C) ja DU145-302a solujen (B, D), verrattuna kontrolleihin, kun taas osuus solujen S-vaiheessa oli huomattavasti pienempi kuin kontrollit. (* P 0,05).

miRNA-302a vaimentaa

AKT

ilmentyminen suoraan kohdentamalla sen 3UTR

havaitsemiseksi molekyylitason mekanismeja, joilla miRNA- 302a kykenee sen posttranskriptionaalisella sääntelytehtävät, käytimme bioinformatiikan algoritmeja (https://www.targetscan.org) hankkia mahdollisia kohdegeenien, ja totesi, että 3UTR on

AKT

mRNA satamat konservoituneen sitoutumiskohdan miRNA-302a. Seuraavaksi tutkimme ilmaus

AKT

mRNA ja proteiini tasolla PC-3-302a ja DU145-302a soluja ja valvontaa. Kuten kuvioissa 5A ja 6, verrattuna kontrolleihin,

AKT

ilmaisuja väheni merkittävästi PC-3-302a ja DU145-302a soluja, sekä mRNA ja proteiini tasolla. Lisäksi

AKT

ilmentymistä PC-3-302a kasvainten oli huomattavasti pienempi kuin PC-3-Scr kasvaimet, määritettynä reaaliaikainen PCR ja IHC värjäytymistä (kuvio 5B ja 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että

AKT

ilmentyminen säädeltiin vähentävästi mukaan miRNA-302a PCA.

AKT

-mRNA huomattavan tukahdutettiin (A) PC-3-302a ja DU145 -302a soluja, ja (B) PC-3-302a kasvaimet (viisi itsenäistä kasvaimia ei havaittu). (C) immunohistokemia värjäys osoitti pienempi ilmaus

AKT

PC-3-302a kasvaimia. (D) Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus erityisesti tukahdutettiin villityypin

AKT

-3 transloimaton alue (UTR) transfektoiduista soluista. (E) Kaavamainen esitys lusiferaasireportteri, joka kuljetti villityypin tai mutantti

AKT

-3 ’UTR. (* P 0,05).

Western blot-analyysit osoittivat vaimentua AKT, fosforyloidun AKT (Pakt) ja sykliini D1 tasolla, ja voimistunut GSK3p, pGSK3β ja p27

Kip1 tasoilla miRNA-302a yliekspressoivassa Eturauhassyövän soluja. PI3K tasot ei ollut vaikutusta.

Voit testata, onko miRNA-302a säätelee

AKT

suoraan sitoutumalla sen 3UTR, lusiferaasireport- vektori, joka sisältää ihmisen

AKT

3UTR kantoi villityypin miRNA-302a sitoutuva sekvenssi subkloonattiin. Lusiferaasia kantava vektori mutantti 7-bp alueella, jotka ovat komplementaarisia 5 siemenen alueen miRNA-302a synnytettiin ohjaus toimittaja (kuvio 5E). Kontrolliin verrattuna, suhteellisen lusiferaasiaktiivisuus tukahdutettiin 36% (

P

0,05) villityypin

AKT

3UTR transfektoiduissa soluissa (kuvio 5D). Siksi miRNA-302a estää PCa solujen kautta suoraan kohdistaminen

AKT

.

miRNA-302a aiheuttamaa solukierron muutoksia PCa soluissa estämällä

AKT-GSK3p-sykliini D1

ja

AKT-p27

Kip1

väyliä

edelleen vaikutuksen arvioimiseksi miRNA-302a on

AKT

signalointireitistä, havaitsimme ilmaus alkupään (

PI3K

) ja loppupään (

GSK3p

,

sykliini D1

ja

p27

Kip1

)

AKT

effektorit western blot. Lisäksi tasot fosforyloidun AKT (Pakt) ja pGSK3β tutkittiin. Verrattuna vastaavaan kontrolliin soluja, sekä GSK3p ja pGSK3

β

tasoilla sekä p27

Kip1 tasot, olivat huomattavasti kohonnut, kun taas Pakt ja sykliini D1 olivat huomattavasti vähennetty miRNA-302a transfektoituja PC-3 ja DU145 soluja. Kuitenkin ilmaus

PI3K

ei vaikuttanut miRNA-302a transfektio (Kuva 6). Edelleen vahvistaa nämä havainnot, me palautettu

AKT

ilmaisun lyhytaikaisella transfektiolla olevan

AKT

ilmentämisvektori

AKT

CDS osaksi PC-3-302a ja DU145-302a solujen (nimeltään PC-3-AKT-CDS ja DU145-AKT-CDS vastaavasti). Kuten kuviossa 7, palautumisen jälkeen AKT ilmaisun, sekä GSK3p ja p27

Kip1: n pitoisuus väheni, kun taas sykliini D1 ekspressiota ei pelastettiin sekä PC-3-AKT-CDS ja DU145-AKT-CDS-soluja. Koska kriittinen roolit

AKT-GSK3p-sykliini D1 ja AKT-p27

Kip1

signaalireaktioteissä solusyklin siirtymävaiheessa, tulokset viittaavat siihen, että miRNA-302a saattaa aiheuttaa G1 /S solukierron pysähtymisen PCA soluissa samanaikaisesti estämällä

AKT-GSK3p-sykliini D1

ja

AKT-p27

Kip1

koulutusjakson, samalla poistetaan PCa solu leviämisen.

Western blot-analyysit osoittivat pelastettiin ilmentymä AKT, ja esti ilmaisun GSK3p ja p27

Kip1 tasoa AKT palauttaminen. Kuitenkin sykliini D1 tasot eivät pelastettiin.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miRNA-302a säädeltiin vähentävästi PCA kudoksissa. Lisäksi analyysit paljastivat pienempi ilmentyminen PCA kudoksiin GS ≥8 kuin GS 8. Yli-ilmentymisen miRNA-302a aiheuttamaa G1 /S pidätys PCA soluissa, ja hämmästyttävän tukahdutti PCa soluproliferaatiota in vitro ja in vivo. Lisäksi

AKT

paljastui välittömänä ja toiminnallinen kohdegeeni miRNA-302a.

Kuluneen vuosikymmenen aikana, suurin osa tutkimusta, jossa miRNA-302 on keskittynyt rooliaan hESCs, jotka ovat ominaista itseuudistumisen ja pluripotentti-. Tutkimukset analysoidaan miRNA-302 toiminto karsinogeneesissä ovat rajalliset ja epäjohdonmukaisia. Lin et ai. havaitsi, että miRNA-302 voi estää tuumorigeenisyyteen ja indusoi apoptoosin ihmisen rintasyövän MCF7-solut, alkion teratokarsinooma Tera-2-soluissa, ja maksasyövän HepG2-soluissa [13]. Samoin soluproliferaatiota tukahdutettiin kohdunkaulan syövän Hela ja SiHa soluja, samoin kuin maksasyövän SMMC-7721-solujen, kautta solusyklin säätelyssä [10,14]. Kuitenkin, Zhu et ai. havaittiin käänteinen ilmiö koolonkarsinoomasoluissa: yli-ilmentymisen miRNA-302B johti tehostetun pesäkkeitä muodostavien kyky in vitro [11]. Täydennetty pesäkkeenmuodostus kyky niinikään validoitu syövän kantasoluja pään ja kaulan okasolusyöpä [15]. Ensimmäistä kertaa olemme paljasti tukahdutti miRNA-302a ilmentymistä PCA kudoksissa verrattuna normaaliin eturauhasen kudosten, ja alempi ilmaisun PCa kudoksiin korkeampi GS. Siksi me spekuloida, että miRNA-302a voisi olla tärkeä rooli PCa kehittymistä ja etenemistä.

Tutkimuksessamme estävä vaikutus miRNA-302a soluproliferaatioon havaittiin PCa PC-3 ja DU145 soluja, kautta estää G1-S faasimuutos, jota pidetään keskeisenä tapahtuman aikana solujen lisääntymistä. Yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, [8,10,14] löysimme myös huomattava downregulation

sykliini D1

in miRNA-302a yliekspressoivia PCa soluja. Mielenkiintoista, miRNA-302 ennustetaan kohdistaa paljon solusyklin sääntelyviranomaiset. Esimerkiksi Lin et ai. osoittivat, että miRNA-302 samanaikaisesti tukahdutetaan sekä

sykliini E-CDK2

ja

sykliini D-CDK4 /6

signalointipolkujen [13], ja tämä tavoite esto oli säätelevät useat transkriptiotekijöitä, kuten

Oct4

ja

Sox2

[8]. Kuitenkin Card et al. kertoi, että miRNA-302a edistänyt kasvua S-vaiheessa ja lasku G1 vaiheeseen hESCs, vaikka

sykliini D1

myös tukahdutettiin [8]. On selvää, lisätutkimuksia selvittämiseen tarkka mekanismeja miRNA-302 toimintoa tarvitaan.

havaintojen yliekspressio miRNA-302a PCA soluissa indusoi solujen kasvun esto in vitro ja in vivo viittaavat siihen, että miRNA-302a voisi post transkriptionaalisesti säätelevät keskeinen geeni, joka on osallisena solujen lisääntymisen. Tärkeänä onkogeeni,

AKT

vaikuttaa monenlaisia ​​fysiologisia toimintoja, kuten aineenvaihdunta, lisääntymistä, eloonjääntiä, angiogeneesiä, muuttoliike, ja hyökkäys [16]. Samoin

AKT

todistettiin ajamaan PCa muodostumista in vivo [17]. Tuloksemme osoittavat, että miRNA-302a tukahdutetaan leviämisen ja tuumorigeenisyystesti Eturauhassyövän solujen läpi

AKT-GSK3p-sykliini D1

ja

AKT-p27

Kip1

polku, ja suoraan sitomalla 3UTR on

AKT

. Lisäksi ilmaus

PI3K

, joka on pääasiallinen ylävirtaan efektori

AKT

ja on myös osoittautunut tärkeäksi PCA kehittämiseen, ei vaikuttanut miRNA-302. Sääntelevä rooli miRNA-302

AKT

osoitettiin myös Cai et al: jälkeen miRNA-302S transfektiolla kohdunkaulan syöpäsoluja, ne havaittiin kohonnut ilmentyminen sykliiniriippuvaisen estäjät

p27

Kip1

ja

p21

CIP1

yhdessä vaimentua

AKT

tasoilla. Lisäksi ne osoittivat, että

sykliini D1

on toinen tavoite geeni miRNA-302S, jonka osuus havaintomme että sykliini D1 ilmentyminen ei pelastettiin jälkeen AKT palauttamisen [10]. Siksi tavoitteeksi asetettiin miRNA-302,

AKT

oli erityisesti tukahdutettiin ja herätti muutoksia monissa loppupään signalointi polkuja.

Meidän tulokset antavat myös tiettyjä vihjeitä suhteen miRNA kohdistetun syövän hoitoon. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että tiettyjä miRNA usein yli-ilmentyy tuumoreissa, kun taas useimmat miRNA olivat vaimentua [18,19]. Global miRNA tukahduttaminen havaittiin lisätä syövän syntymistä sekä in vitro ja in vivo malleissa [20], jossa korostetaan protumorigenic vaikutukset seuraavat miRNA menettämisestä toiminnon. Liang et ai. havaittu herkistävää roolin miRNA-302 korvaushoito rintasyöpäsoluissa ionisoivaa säteilyä [21]. Toinen tuore tutkimus kertoo, että viraalisia let-7 miRNA voisi estää kasvaimen kasvua hiiren keuhkoadenokarsinooma malli [22]. Samoin tuloksemme validoitu estävää vaikutusta miRNA-302a korvaaminen PCA soluissa. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että yli-ilmentyminen jopa yksittäinen miRNA syöpäsoluissa voisi antaa huomattavaa terapeuttista hyötyä.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoittaa, että miRNA-302a on keskeinen PCA solujen kasvua säätelemällä G1-S-vaiheessa siirtyminen. MiRNA-302a ilmentyminen tukahdutetaan PCA kudoksiin, ja on vieläkin pienempi PCA kudoksiin korkeampi GS. Lisäksi suoraan sitova sen 3UTR miRNA-302a inhiboi

AKT

ilmaisua, jolloin myöhemmin muutoksiin

AKT-GSK3p-sykliini D1

ja

AKT-p27

Kip1

reittejä. Vaikka on selvää, että miRNA-302a osallistuu PCA lisätutkimuksia tarvitaan selittämään tarkkaa mekanismeista rooliaan PCa etenemistä, ja siten määrittää sen potentiaalista arvoa biomarkkerina ja /tai kohde terapeuttisen intervention.

tukeminen Information

S1 Taulukko. Demografiset ja kliinis ominaisuudet 44: llä eturauhassyöpä (PCA).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0124410.s001

(DOCX) B

Kiitokset

Tekijät Kiitokset toimielinjärjestelmämme jäseniä etenkin Dr. Sheng-Lin Huang tekniseen tukeen.