Krooninen sairaus

tiivistelmä

Biophvsical ja biokemialliset ominaisuudet microenvironment säädellä soluvasteita kuten kasvuun, erilaistumiseen, morfogeneesiä ja muuttoliike normaaleissa ja syöpäsoluissa. Koska kaksiulotteinen (2D) viljelmistä puuttuvat olennaiset ominaisuudet natiivi solu microenvironment, kolmiulotteinen (3D) kulttuureissa on kehitetty paremmin jäljittelee luonnollista soluväliaineen. Tähän mennessä 3D kulttuuri järjestelmät ovat luotti kollageenin ja Matrigel ™ hydrogeelit, jolloin vain rajoitetusti valvoa matriisi jäykkyys, proteolyyttinen hajoaminen, ja ligandin tiheys. Sen sijaan, bioteknisesti hydrogeelien avulla voimme itsenäisesti virittää ja systemaattisesti tutkia vaikutusta näiden parametrien solun kasvuun ja erilaistumiseen. Tässä tutkimuksessa, polyetyleeniglykoli (PEG) hydrogeelit, funktionalisoitu jossa arginiini-glysiini-asparagiinihappo (RGD) motiiveja, yhteinen solu-sidosmotiivia soluväliaineen proteiinien ja matriisin metalloproteinaasi (MMP) pilkkomiskohdat, oli tunnusomaista koskevat niiden jäykkyys, diffusiivisella ominaisuudet ja kyky tukea kasvua androgeeniriippuvaisen LNCaP eturauhasen syöpäsoluja. Olemme havainneet, että mekaaniset ominaisuudet moduloidun kasvun kinetiikka LNCaP PEG hydrogeelin. Klo kulttuuri jaksot 28 päivää, LNCaP tehtiin morphogenic muutoksia, jotka muodostavat kasvain kaltaisia ​​rakenteita 3D kulttuuri, jossa hypoksinen ja apoptoottisten sydämiä. Olemme edelleen verrataan proteiinin ja geeniekspressiotasot välillä 3D- ja 2D kulttuureissa stimuloitaessa synteettisen androgeenin R1881. Mielenkiintoista, kinetiikka R1881 stimuloidaan androgeenireseptorin (AR) tumaansiirtymiseen vaihteli 2D- ja 3D-viljelmistä havaitsema immunofluoresenssivärjäyksellä. Lisäksi microarray tutkimukset osoittivat, että muutokset ekspressiotasot androgeeniresponsiivinen geenien upon R1881 kohtelu erosivat suuresti 2D- ja 3D kulttuureissa. Yhdessä viljelemisen LNCaP soluja viritettävissä PEG hydrogeelit paljastaa eroja soluvasteiden androgeenistimulaation välillä 2D- ja 3D-ympäristöissä. Siksi ehdotamme, että esitetyt 3D-kulttuurin järjestelmä edustaa tehokas työkalu korkea suoritusteho eturauhassyövän huumetestejä että ssä toistetaan kasvain mikroympäristön.

Citation: Sieh S, Taubenberger AV, Rizzi SC, Sadowski M, Lehman ML, Rockstroh A, et al. (2012) fenotyyppinen karakterisointi Eturauhassyöpä LNCaP-soluilla sisällä biotekniikalla mikroympäristön. PLoS ONE 7 (9): e40217. doi: 10,1371 /journal.pone.0040217

Editor: Elizabeth Wilson, University of North Carolina at Chapel Hill, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 marraskuu 2011; Hyväksytty: 6 kesäkuu 2012; Julkaistu: 05 syyskuu 2012

Copyright: © Sieh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Queensland University of Technology käynnistää apurahan tuolin Prof. DW Hutmacher, eturauhassyöpä Foundation of Australia, Australian kanadalainen eturauhassyöpä Research Alliance, Australian Eturauhassyöpä tutkimuskeskuksen-Queensland ja NHMRC avustusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (CAP) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia sairauksia miehillä länsimaissa. 5 vuoden eloonjäämisaste miesten diagnosoitu paikallinen CaP lähestyy 100%; katsoo, ennuste huononee nopeasti, kun CaP eteneminen kehittynyt ja etäpesäkkeitä [1] – [2]. Huolimatta edistysaskel havaitsemismenetelmiä ja hoitoja, CAP edelleen merkittävä syy syövän kuoleman miehillä. Siksi on tärkeää saada parempi käsitys etenemistä lokalisoitu edistyneisiin CaP käyttämällä sopivia fysiologisia järjestelmiä. Kuten monet muut syöpäsolut, cap soluja on tutkittu laajasti kaksiulotteinen (2D) kulttuureissa, kautta kulkee suuri perustiedot syövän biologian on saatu. Kuitenkin kotimainen kudokset, solut on upotettu soluväliaineen (ECM), joka tarjoaa paitsi arkkitehtoninen tukea, mutta myös kemiallisen ja mekaanisen vihjeitä soluihin [3] – [4]. Viime aikoina, on tärkeää, että mekaaniset ominaisuudet kasvaimen mikroympäris- on yhä kasvavassa määrin. Yleisesti, syöpäkudoksen ja sen strooman ovat jäykempiä kuin ei pahanlaatuisia kudoksia epätavallisen kertymistä ja remodeling ECM stroomassa [5] – [7].

In vitro

tutkimukset ja harvat

in vivo

tutkimukset ovat osoittaneet, että jäykkyys ympäröivään matriisi voi lisätä syöpäsolujen kasvua, moduloida solun signalointi ja helpottaa solujen invaasiota [8] – [11]. Kun otetaan huomioon tärkeä rooli matriisin jäykkyys, keinotekoinen geometrinen rajoitteita ja suuri jäykkyys asetetut solujen 2D kudosviljelymuoviin voivat vaikuttaa kasvaimen kasvua, adheesio, solu polaarisuus, morfologia, muuttoliike ja proteolyysi mekanismien [12] – [15].

viime vuosina useat tutkimukset ovat osoittaneet, että opiskelu kasvaimia 3D paremmin toistetaan

in vivo

kasvuominaisuudet ja vastustuskykyä kemoterapia-aineiden kuin 2D lähestymistapa [16] – [18]. Yleisimmin käytetty 3D-matriisiin mallit ovat eläinperäisiä liuotetaan tyvikalvon uute, Matrigel ™ [17], [19] – [20], ja rotan hännän tyypin I kollageeni matriisit [21] – [24]. Vaikka nämä luonnosta peräisin matriiseilla on ECM kaltaisia ​​biologisia ominaisuuksia, niiden ominaispiirteet rajoittavat joustavuutta säätämällä matriisin jäykkyys ilman samanaikaisesti vaikuttamatta muihin matriisi ominaisuudet, kuten proteolyyttisiä hajoavuus ja ligandin tiheys. Lisäksi Matrigel ™ näyttää erä-erien vaihtelut, mikä pienentää toistettavuus kokeiden ja tietojen vertailukelpoisuuden sarjaa eri laboratorioissa. Yksinkertaistaa muuten monimutkaisia ​​solun vuorovaikutuksia useista osista, jotka esiintyvät luonnostaan ​​johdettu matriiseihin, on kasvava kiinnostus käyttää matriisien suunniteltu erityisiä biologisia ja biokemiallisia ominaisuuksia luonnon ECM [25] – [28]. Nämä Biomimeettinen matriisit mahdollistavat entistä järjestelmällistä tutkimusta vaikutuksista tiettyjä osia tai ominaisuuksia kasvain microenvironment syöpäsoluihin. Siksi uusien lähestymistapojen biomateriaalien tiede on keskitytty kehittämään synteettisten matriisien kuten hyaluronon johdettua tai Alginaattimatriiseja kasvatukseen syöpäsoluja [25] – [28]. Toinen esimerkki on PEG-hydrogeelit, jotka ovat inerttejä itsensä kannalta laukaista solun signalointipolkujen, mutta voidaan varustaa biokemialliset (esimerkiksi proteolyyttisen hajoamisen sivustoja) ja biologisia toimintoja (esim RGD motiivia valvotusti) [29]. Edullisesti, jäykkyys tällaisten hydrogeelien voidaan tarkasti viritetty, riippumatta niiden proteolyyttisen herkkyyden ja solujen ligandin tiheys.

Aiemmin olemme ja muut ovat käyttäneet MMP-herkkä PEG-hydrogeelit, jossa RGD-motiivien on yhdistetty yhdellä on määritelty tiheys [13], [30] – [32]. RGD motiivia tarjoavat sitoutumiskohdat solujen kautta integriinien, ja MMP pilkontasekvenssejä sallivat solujen hajottamiseksi matriisiin, joka luo tilaa solujen lisääntymisen ja muuttoliike. Tätä varten, perusteellinen fenotyyppinen karakterisointi CaP viljeltyjen solujen tässä Biomimeettinen ECM ei ole raportoitu. Tässä tutkimuksessa pyrittiin luomaan ja vahvistamaan 3D kulttuuri järjestelmä LNCaP, joka mahdollistaa mallinnuksen alkuvaiheessa suonettoman kasvainten muodostumista. Tehdä tämän, tutkimme vaikutus hydrogeelin jäykkyys solun kasvuun. Sen jälkeen tutkimme morfologia, geenien ilmentyminen ja proteiinisynteesiä LNCaP kasvatettu 3D hydrogeelien verrattuna perinteisiin 2D kulttuureissa. Käytimme myös tässä 3D kulttuuri järjestelmän vaikutusten tutkimiseen synteettisen androgeenin, R1881, on AR signalointi verrattuna 2D viljelmiä [33] – [34].

Tulokset antavat oivalluksia rooli microenvironment moduloimaan solu- ja molekyylitason käyttäytymistä syöpäsoluja. Lisäksi me paljastaa eroja soluvasteiden androgeenien 2D- ja 3D kulttuureissa. Tämä malli on ponnahduslauta kehittämiseen 3D viljelysysteemejä jäljitellä

in vivo

kasvain microenvironment, mahdollistaa luomisen tehokkaita työkaluja ymmärtää paremmin CaP biologia, erityisesti vastauksena androgeenien.

tulokset

Mekaaniset ja diffuuseissa ominaisuudet Biomimeettinen hydrogeelit ovat riippuvaisia ​​PEG sisällöstä

Voit jäljitellä alkuvaiheessa CaP kasvainten muodostumista 3D, ryhdyimme kulttuuriin LNCaP soluja biomimeettistä PEG hydrogeelejä. PEG esiasteet konjugoitu MMP katkaisukohdat ja RGD motiivia sisällytettiin hydrogeeliverkoston antaa olennaisia ​​Biomimeettinen piirteitä luonnollisen ECM (kuvio 1A). Koska mekaaniset ominaisuudet hydrogeelin tiedetään vaikuttavan kasvuun, morfologiaan ja invasiivisen fenotyypin syöpäsolujen [5], [10], [35], ensin, jonka tarkoituksena on optimoida hydrogeelin jäykkyys soluviljelyyn. Cell-free PEG-hydrogeelien vaihtelevia jäykkyys valmistettiin säätämällä PEG: n määrä on 1,5, 2, 2,5% (w /v). Jäykkyys hydrogeelin määritettiin löyhän puristuskokeet käyttäen microtester (kuvio 1 B, vasemmalla) ja atomivoimamikroskoopilla (AFM) sisennyksen mittaukset (kuvio 1C, vasemmalla), jotka muunnetaan jännitys-venymä-käyrä (kuvio 1 B, keskellä) .

(A) kaavio esittää valmistamiseksi biomimeettistä hydrogeelien. LNCaP-solut sekoitettiin PEG esiasteita, jotka sisältävät MMP-pilkkomiskohdat ja RGD-peptidit ennen FXIII-katalysoidun polymeroinnin. (B) Global jäykkyyttä solutonta hydrogeelit, joilla on erilaiset PEG: n määrä (w /v) mitattiin käyttäen microtester. Edustava jännitys-venymä käyrä kirjatut 2% PEG geeliä. The (elastinen) Youngin moduuli, E, laskettiin suoran kulmakerroin asennettu jännitys-venymä käyrä klo 9-12% rasituksella (keskellä). Sirontakuvaajan osoittaa Youngin moduli mitataan eri PEG-hydrogeelejä (oikealla). Mediaanit on merkitty punaisella palkit. (C) Paikallinen jäykkyyttä solutonta hydrogeelit, joilla on erilaiset PEG: n määrä (w /v) mitattiin käyttäen atomivoimamikroskoopilla (AFM). Pyramidin muotoinen AFM uloke käytettiin suorittamaan sisennys mittauksiin. Edustava voima versus tip-näyte-erotus käyrän alla näkyy AFM kaavamainen. Punainen viiva sovi avulla arvioidaan lähestymistapa käyrän Hertzian sisennys malli. Youngin moduli on mitattu 2% PEG hydrogeeliä normaalisti jakautunut alueella 4 kPa (keskellä). Sirontakuvaajaan näyttää mediaani Youngin moduli mitattiin eri hydrogeelien (oikealla). Punainen palkit edustavat mediaanit. Sekä microtester ja AFM painuman mittaukset saada samanlaisia ​​Youngin moduli ja osoittaa lineaarista kasvua jäykkyys PEG sisältöä. (D) Rasiakuvaajat osoittavat diffuusiokertoimien, D mitataan elintarvike- väriaine E133 (794 Da) ja FITC-BSA (66 kDa) soluttomissa hydrogeelien eri PEG sisältöä. Arvot K E133 ovat kertaluokkaa suurempi kuin FITC-BSA. Vähintään kolme näytettä mitattiin kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Vaikka microtestor koettimina maailmanlaajuinen elastiset ominaisuudet PEG-hydrogeelien, AFM sisennys mittaukset saadaan tietoa paikallisten jäykkyyden jakautuminen (kuvio 1C). Molemmat menetelmät paljasti lineaarisesti kasvu kimmoisuusmoduulien kanssa lisääminen PEG sisällön ja osoitti samanlaisia ​​kimmoisuusmoduulien, vaihdellen noin 0,8 kilopascalin (kPa) 10 kPa 1,5% ja 2,5% PEG hydrogeelejä, vastaavasti (kuvio 1 B ja 1 C, oikealla) . AFM mittaukset paljastivat homogeenisen jakautumisen paikallisen Youngin moduuli E yli testattiin hydrogeelit (kuvio 1C, keskellä). Kun 2,0% hydrogeelit testattiin käyttämällä microtester ennen ja jälkeen yli 4 viikkoa kulttuurin, emme ei havaittu huomattavia muutoksia koko matriisissa jäykkyys (2,5-4,2 kPa), joka oli yhdenmukainen vaihtelun testattu 2% hydrogeelit ( Kuva S1). Kuten aikaisemmin ilmoitettiin 3D soluviljelmissä sisällä samanlaisia ​​matriiseja [5], [10], [35], tämä osoittaa, että nämä Biomimeettinen PEG-hydrogeelin vain paikallisesti hajottaa sulautettujen solut, kun taas yleinen jäykkyys ei vaikuta yli analysoitu kasvun aikana.

muutokset PEG sisällön odotetaan muuttavan huokoskoko PEG-hydrogeelien [36], jotka voivat vaikuttaa siirron pienten molekyylien, kuten synteettisen androgeenin R1881, ja myös kasvutekijöiden läsnä väliaine kokeissa. Arvioida levittämistä R1881, mittasimme diffuusiokerroin D, ruoan väriaine E133 (792 Da), joka on suurempi molekyylipaino kuin R1881 (284 Da). Huomasimme, että mediaaniarvot diffuusion, laskivat PEG sisältöä (kuvio 1 D) 2,99 ± 0,06 x 10

-6 cm

2 /s 1,5% PEG hydrogeelien 1,9 ± 0,13 x 10

– 6 cm

2 /s 2,5% PEG hydrogeelejä. Testata, jos välttämätöntä kasvutekijät, kuten fibroblastien kasvutekijä, endoteelikasvutekijä ja verihiutaleiden kasvutekijä (20-50 kilodaltonin, kDa) voi myös tunkeutua hydrogeelin, tutkimme diffuusio Fluoreseiini-isotiosyanaatti-konjugoitujen naudan seerumin albumiinia (FITC -BSA) (66 kDa), joka on suurempi molekyylipaino kuin nämä kasvutekijät. Diffuusiokerroin FITC-BSA: ta pienempi kuin E133 ja väheni lisäämällä PEG: n määrä (kuvio 1 D). D-arvot 1,5-2,5% PEG hydrogeelejä (1,5-3,0 x 10

-7 cm

2 /s) ovat samassa suuruusluokkaa (6 x 10

-7 cm

2 /s) raportoi Ramanujan

et al.

(2002) ja Erikson

et al.

(2008) mitataan diffuusio BSA pehmeämmän kollageenigeeleissä [37] – [38]. Kun PEG-hydrogeelit inkuboitiin FITC-BSA: ssa 24 tunnin ajan, havaitsimme yleistynyt, FITC-BSA: ta (kuvio S2). Näistä havainnoista voidaan päätellä, että vaikka siirto R1881 ja kasvutekijöitä voidaan hidastunut geelejä suuremmilla PEG sisältöä, huokoskoko kaikkien geelien on riittävän suuri tarjota sulautettujen solujen liukoisen tekijät kasvualustasta.

leviämisen LNCaP solujen Biomimeettinen hydrogeelejä vaikuttavat PEG sisällön ja jäykkyys hydrogeelien

Seuraavaksi arvioida vaikutuksia matriisin jäykkyyden soluproliferaatioon, me viljellä LNCaP 1,5, 2,0 ja 2,5% hydrogeelejä yli 28 päivää (kuvio 2A, yläpaneeli, oikealla). Yksikerrosviljelmiä (kahdentumisaikoina, Td = 27 h) kasvoi eksponentiaalisesti asti 5. päivänä ja alkoi tasaantua sen jälkeen (kuvio 2A, yläpaneeli, vasemmalla). Päinvastoin, solut lisääntyivät hitaammin 1,5% (Td = 54 tuntia) ja 2% (Td = 58,5 tuntia) PEG hydrogeelien. Räjähdysmäinen kasvu tapahtui vuosina päivä 7 ja 14 3D kulttuureissa (kuvio 2A, yläpaneeli, oikealla). LNCaP yleistyminen jatkui ainakin jopa 28 päivää 2,0% hydrogeelit, kun taas suurin solujen määrä saavutettiin 14 päivän kuluttua on 1,5% hydrogeelit. Korkeampi kasvuvauhti pehmeämmän 1,5% hydrogeelin verrattuna 2,0%: hydrogeeli voi johtua alemmasta stressiä kohdistama soluista ympäröivään pehmeämpi hydrogeeli [39] – [40]. Sigmoidal kasvukäyrä vietämme on verrattavissa havaittu kasvua LNCaP ksenograftien todisteet hitaasti kasvaa alkuvaiheessa, räjähdysmäinen kasvu välivaiheessa ja hidastaa kasvun myöhemmässä vaiheessa [41] – [46]. Toisaalta, ei kasvua havaittu 2,5% hydrogeelien vahvistanut live-dead värjäytymistä (kuvio 2A, alapaneeli) mikä osoitti pääasiassa Elinkyvytön solujen 2,5% hydrogeelin päivänä 24. Helotaustanäkymä kuvaa osoitti, että solut pystyivät muodostamaan pesäkkeitä on 1,5 ja 2,0%, mutta ei 2,5% hydrogeelien.

(A) kasvukäyrät LNCaP yli 7 päivää 2D viljelmät (vasemmalla) ja 28 päivää 3D kulttuureissa ( oikea) normaalissa kasvualustojen mitataan DNA: n kokonaismäärä (keskiarvo ± SE). 2D kulttuureissa solut lisääntyvät paljon nopeammin tavoittavin konfluenttisuuden 7 päivän kuluessa (yläpaneeli, vasemmalla). Kasvu profiili solujen riippuu mekaanisiin ominaisuuksiin bioengineered PEG matriisien, jossa kasvu on korkein 1,5% sen jälkeen soluja kasvatettiin 2% hydrogeelit (yläpaneeli, oikealla). Ei soluproliferaatiota havaitaan jäykempi hydrogeelit (2,5%). Live kuollut tutkimus suoritettiin käyttäen fluoreseiinidiasetaattia-propidiumjodidivärjäys päivänä 24. LNCaP kasvatettu eri PEG pitoisuus (alempi kuva). Live-dead värjäytymistä paljastaa, että useimmat solut ovat elinkelpoisia (vihreä) sekä 1,5 ja 2,0% hydrogeelit mutta ei elinkelpoinen (punainen) 2,5% hydrogeelit. Kuvat otettiin CLSM (10 ×, 0,4 NA). Kirkas kuvia myös vahvistaa, että solut 2,5% hydrogeelit eivät muodostaneet pesäkkeitä kuin havaittiin 1,5% ja 2,0% hydrogeelit päivänä 28 (B) (yläpaneeli) Edustava CLSM 3D ennusteet LNCaP pesäkkeiden leimattu falloidiinia (aktiini, punainen ) /DAPI (ytimet, sininen) päivästä 7 päivään 28 (20 ×, 1,0 NA). Pesäkkeet ovat pyöristetty päivänä 7 ja päivänä 14, mutta tulevat epäsäännöllisiksi aggregaattien päivästä 21 lähtien. Rasiakuvaajien pesäkkeitä koko ja muoto tekijä analysoidaan kuudesta CLSM kuvia (alapaneeli) osoittavat merkittävää kasvua sferoidiviljelmiä koon ja lasku muotokerroin (p 0,001) 28. päivänä suhteessa päivä 7 viljelmät havaitaan. (C) edustaja histologia osa päivä 28 kulttuurien paljastaa muodostumista invasiivisen ”sormien” (nuoli) tunkeutuu ympäröivään hydrogeeli (vasemmalla). H Lisäksi AR-signalointireitin on tärkeä rooli kasvainten kehittymistä, ja se on tärkeä koko etenemistä [56] – [57]. Tästä syystä, androgeeniriippuvaisessa LNCaP-soluja käytetään laajasti 2D kulttuureissa tutkimiseen androgeenireseptorin (AR) signalointia, joka aktivoituu androgeenien ja analogit, kuten R1881. Jotta laajentaa meidän tietoa LNCaP vastaus R1881 2D kulttuuri perustuu kokeisiin, tutkimme vaikutuksia R1881 YMP merkki ilmaisun 3D kulttuureissa (kuva 4). Immunofluoresenssivärjäyksellä paljasti translokaatiota AR solun tumaan sekä 2D ja 3D kulttuureissa kuluttua 7 h 1 nM R1881 käsittely (kuvio 4A). Se on vakiintunut 2D kulttuuri, joka kerran AR sitoutuu R1881, se kuljetetaan tumaan, jossa se aloittaa transkription kohdegeenien, kuten eturauhasen antigeenin /Kallikrein 3 (PSA) [58]. Meidän alustava tutkimus osoitti, että AR kohdegeenien, kuten PSA, indusoitui korkeammilla pitkänkään R1881 hoidon jälkeen (36 h) sekä 2D- että 3D-viljelmät (kuvio S5a). Siksi valitsimme tätä tutkimusta varten 48 tuntia R1881 hoitoa molemmissa kulttuureissa. Mielenkiintoista, vaikka 2D- ja 3D kulttuureissa vastasivat 48 h R1881 hoitoa, mistä on osoituksena kasvu mRNA ja proteiini tasoilla PSA, lokalisoinnin AR solun tumassa havaittiin jonkin verran 3D kulttuureissa verrattuna 2D kulttuureissa. Kumpikaan ei kuitenkaan lokalisointi eikä intensiteetti luminaaliselle epiteelin markkeri, sytokeratiinivasta 8 (CK8) vaikuttivat R1881 hoito 2D- tai 3D kulttuureissa.

(A) immunofluoresenssivärjäyksiä LNCaP-solujen kuluttua 7 h hoidon R1881 näytä co -localization AR ja solun tuman sekä 2D (päivä 6) ja 3D (päivä 28) viljelmät (yläpaneeli). Vastaavat AR lokalisointi molemmissa kulttuureissa on esitetty harmaasävykuvat (alapaneeli). (B) Solu fenotyypit 2D (päivä 6, vasen paneeli) ja 3D (päivä 28, oikea paneeli) viljelmiä kasvatettiin androgeeni tyhjennetty kasvualusta tai R1881 täydennetty median (48 h) verrattiin immunofluoresenssivärjäyksiä. Proteiinit kohteita ovat vihreällä, aktiini punaisella ja tumassa sinisellä. 2D kulttuureissa, AR tumassa ja PSA sytoplasmassa upon R1881 stimulaatiota. Ilman hoitoa, AR pysyy sytoplasmassa ja PSA: ta ei havaita. Luminaaliselle epiteelin merkki, CK8 havaitaan molemmissa kulttuureissa riippumatta hoidon edellytys. 2D kulttuureissa, CK8 selvästi värjää kuitusäi- kun 3D, CK8 on lokalisoitu solun reunassa. 3D kulttuureissa, extranuclear AR lokalisointi havaitaan sekä ei käsitelty ja R1881 käsitelty monisoluisten aggregaatteja. PSA tuotetaan myös runsaana R1881 käsitelty 3D kulttuureissa, mutta vain hyvin alhaisella tasolla, kun ei hoideta. Suurennettu alueilla kunkin erityisen värjäytymisen ja kulttuuri ehto (valkoiset laatikot) on esitetty alla vastaavissa kuvissa. CLSM kuvat otettiin 60 x suurennus (1,4 NA) A ja 40-kertaisella suurennuksella (1,25 NA) B. Mittaviivat: (A) 30 pm, (B) 75 pm ja 25 pm (suurennettu alueet).

vaikutuksen tutkimiseksi R1881 tasoilla proteiinien, keskityimme ilmaisua AR, PSA ja CK8 suorittamalla Western blot-analyysi. Kun R1881 hoito, PSA ja CK8 määrät lisääntyivät 2D- ja 3D kulttuureissa verrattuna ei käsitelty etanolin valvontaa vaikka korkeus CK8 proteiinin R1881 ei ollut havaittavissa immunofluoresenssivärjäyksen 2D- ja 3D-viljelmiä, jotka voivat johtua puute herkkyys (käytettävän vasta-aineen) (kuvio 5A, B). Mielenkiintoista on, että käsitelty 2D kulttuureissa AR proteiinin tasot olivat koholla verrattuna ei-käsiteltyihin kontrolleihin, osoittaa vakauttaminen sitoutuneen ligandin AR ja /tai lisääntyminen AR tuotannossa [59] – [60]. Sitä vastoin merkittäviä muutoksia ei havaittu 3D kulttuureissa. Yhdessä tämä viittaa ero säätely AR proteiinin ilmentymisen 2D- ja 3D kulttuureissa vastauksena R1881. Vaikutus R1881 on mRNA-tasojen 2D- ja 3D-viljelmistä tutkittiin edelleen kvantitatiivisen Real Time-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR). Mukaisesti lisääntynyt proteiinin tasot, PSA: n ja CK8 mRNA-tasot lisääntyivät molemmissa kulttuureissa (kuvio 5C). Samanlainen western blot-analyysi, AR mRNA taso ei merkittävästi vaikuttanut R1881 käsittely 3D kulttuureissa mutta ei käynyt ilmi laskussa, kun hoito oli pidentynyt (kuvio S5B). Kasvusta huolimatta AR ilmaisun 2D kulttuureissa verrattuna 3D kulttuureissa, PSA ilmentyminen oli samankaltainen kulttuureissa, kuten kuvassa 5C. Kiehtovan, non käsitelty kulttuurien PSA mRNA taso oli huomattavasti korkeampi 3D suhteessa 2D kulttuureissa. AR ja PSA-mRNA-tasot LNCaP tuumoriksenografteja koskemattomista Non lihavilla diabeetikko /Severe Combined ImmunoDefficiency (NOD /SCID) hiiriä (Kuva S5c) olivat verrattavissa R1881 kannustanut 3D kulttuureissa, mutta ei 2D kulttuureissa. Siten meidän havainnot osoittavat, että 3D-viljelmät paremmin

in vivo

kasvaimissa.

(A) Edustava Western blot paljastaa tehostettuun kaikkien tutkittujen proteiinien 2D kulttuureissa hoidetuilla R1881 verrattuna ei käsitelty (etanoli kontrollit), kun taas 3D kulttuureissa, vain PSA ja CK8 ovat merkittävästi koholla. (B) signaalin suhde proteiinien suhteen a-tubuliinin Western-blotit R1881 käsiteltyjen ja etanolin kontrolliryhmiin (-R1881) esitetään keskiarvona ± SE. Proteiini kvantitatiivinen tukevat muutokset esitetään immunobloteista yllä. (C) qRT-PCR edustaa ilmaus LNCaP solumarkkerien (keskiarvo ± SE), jossa PSA ja CK8 ovat säädelty mRNA-tasolla käsittelemällä sekä 2D- että 3D-viljelmiä verrattuna muun kuin käsitelty 2D- tai 3D-ryhmiä. AR on vain koholla 2D kulttuureissa. Merkitsevä ero (p 0,05) välillä käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen näytteiden sisällä vastaavia ryhmiä (2D- tai 3D-viljelmät) on merkitty (*) ja samankaltaisten hoidossa eri ryhmien on merkitty (Δ). Triplikaattinäytteet analysoitiin vähintään kolmen erillisen kokeen.

androgeeni vasteen LNCaP 3D kulttuureissa on muuttunut verrattuna 2D viljelmät alle R1881 riistää kunnossa

Kun otetaan huomioon edellä erot PSA ja AR ilmaisun ja AR lokalisointi 2D- ja 3D LNCaP soluviljelmissä, suoritimme mikrosiruanalyysi arvioitaessa kokonaisvaltaisesti transkription eroja 2D- ja 3D LNCaP soluviljelmissä alle androgeenireseptorin riistää ja R1881 käsiteltiin olosuhteissa, keskittyen androgeenireseptorin reagoivien geenien. Löysimme ero sääntelyä 4157 (1896 ylös, 2261 alas) ja 3306 (1304 ylös 2002 alas) androgen-reagoiva geenien R1881 saaneilla 2D- ja 3D LNCaP soluviljelmässä, vastaavasti. R1881-käsitelty 2D (2D + R1881) ja 3D (3D + R1881) viljelmät jakoi 2862 yleisesti säännelty androgen reagoiva geenien (1165 ylä- ja 1697 alas geenien) verrattuna vastaavaan etanolin säätimet (kuvio 6A). Mielenkiintoista, kertainen muutos ilmentymistason 898 (31%) näistä geeneistä vähenivät huomattavasti 3D + R1881 verrattuna 2D + R1881. Tämä oli erityisen selvää jopa geenien, kuten on esitetty sirontakuvaajiin (Fig. 6A), mikä viittaa androgeeni vaste ilman androgeenien kun LNCaP soluja kasvatettiin 3D kulttuuriin. Vertailu 3D ja 2D etanolia valvonta (3D + EtOHvs2D + EtOH) paljasti, että 1469 androgen-reagoiva geenit ilmentyvät differentiaalisesti (kuvio 6B). Tämä viittaa vahvasti siihen, että vähentynyt kertainen muutos androgen geenien vastauksena R1881 3D kulttuurin suhteen 2D + R1881 aiheutti voimakkaan muutos peruslinjan ilmentymistason androgeenireseptorin säädeltyjen geenien (Fig. 6B).