Krooninen sairaus

tiivistelmä

Forkhead laatikko M1 (FOXM1) onkogeeninen transkriptiotekijä on houkutteleva terapeuttinen kohde taistelussa syöpää vastaan, koska se on yli-ilmentynyt useimmissa ihmisen kasvaimista. Äskettäin, käyttämällä solun perustuva määritys systeemi tunnistaa tiatsoli antibiootti Siomycin A estäjä FOXM1 transkriptionaalisen aktiivisuuden. Tässä me raportoimme, että rakenteeltaan samanlaisia ​​tiatsoli antibiootti, tiostreptonille estää myös transkriptionaalista aktiivisuutta FOXM1. Lisäksi olemme havainneet, että nämä thiopeptides ei inhiboinut transkriptionaalista aktiivisuutta muiden jäsenten Forkhead perheen tai joitakin ei-liittyviä transkriptiotekijöiden. Lisäkokeet osoittivat, että tiatsoli antibiootit estävät myös FOXM1 ilmentymistä, mutta ei ekspressiota muiden jäsenten Forkhead laatikon perheen. Lisäksi olemme havainneet, että tiatsoli antibiootit tehokkaasti esti kasvun ja indusoi voimakkaita apoptoosin ihmisen syöpäsolulinjoissa eri alkuperää. Tiopeptidiä indusoiman apoptoosin korreloi tukahduttaminen FOXM1 ilmaisun, samalla kun yli-ilmentyminen FOXM1 osittain suojattu syöpäsolujen tiatsoli antibiootti-välitteistä solukuolemaa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Siomycin A ja tiostreptonia voi kohdistaa FOXM1 indusoimaan apoptoosin syöpäsoluissa ja FOXM1-inhibiittorit /tiatsoli antibiootteja voitaisiin mahdollisesti kehitetään uusia syöpälääkkeitä ihmisen neoplasia.

Citation: Bhat UG, Halasi M, Gartel AL (2009) tiatsoli Antibiootit Target FOXM1 ja indusoida apoptoosia ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 4 (5): e5592. doi: 10,1371 /journal.pone.0005592

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2009; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2009; Julkaistu: 18 toukokuu 2009

Copyright: © 2009 Bhat et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH avustuksia 1RO1CA1294414-01A1 ja 1R21CA134615-01, ja IDPH Ticket Cure Research Grant ja ALG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Forkhead laatikko M1 (FOXM1) [1], transkriptiotekijä on Forkhead perheen [2] on yksi tärkeimmistä positiivisia sääntelyviranomaisten solusyklin. Sekä ilmaisun ja transkriptionaalista aktiivisuutta FOXM1 liittyy proliferatiivinen tila solujen [1]. Se ilmentyy kaikissa alkion kudoksissa ja jakautuviin soluihin epiteelin ja mesenkymaalista alkuperää [3], [4]. FOXM1 on rooli kehityksessä hermoston [5], ja se on tarpeen hepatoblast erilaistumisen kohti sapen epiteelisolujen suvusta [6] ja alkion kehitykseen keuhkojen verisuoniston [7]. FOXM1 ilmentyminen indusoituu myös aikana keuhkojen ja maksan kudosten uudistumista ja korjausta. Transkriptionaalista aktiivisuutta FOXM1 riippuu onkogeenisten Ras-MAPK ja Sonic Hedgehog polkuja [8], [9]. FOXM1 transkriptionaalisesti ylössäätelee kohdegeenien osallistuvat solusyklin etenemisen ja se on ratkaiseva G1 /S ja G2 /M siirtyminen, ja myös suorituksen mitoosi ohjelmaan, koska FOXM1 vaje solujen ei edetä pidemmälle prophase vaihetta mitoosin [10] .

Vaikka FOXM1 on yksi yli-ilmennetty geenien ihmisen kiinteiden kasvainten (tarkistetaan [11], [12]), sen ilmentyminen on kytketty pois päältä lopullisesti erilaistuneita, ei-jakautuvat solut [1]. FOXM1 yliekspressoituu maksasolukarsinoomat [13], haiman karsinoomat [14], rintasyöpiä [15], [16], ei-pienisoluisen keuhkosyövän [17], anaplastinen astrosytoomiin ja glioblastoomiin [18], tyvisolusyöpien [9] ja intrahepaattinen cholangiocarcinomas [19]. Koska toiminto FOXM1 estyy useita tuumorisuppressorien, kuten p19-ARF, pRb, p16 ja p53, ja aktivoidaan useita onkogeeninen signalointireittien, FOXM1 voidaan luokitella proto-onkogeeni. Inhibitio FOXM1 ilmaisun pienet häiritsevät RNA: t [20], [21] tai peptidi sisältää aminohappoja 24-46 of p19

ARF [22], [23] vähensi ankkurista riippumaton solujen kasvua in vitro ja viivästynyt maksakasvain kasvua hiirissä. Samoin, tukahduttaminen FOXM1 haiman syöpäsoluissa RNA-interferenssi johti inhibition metastasoituneeseen mahdollisten [24]. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että FOXM1 on välttämätön syöpäsolu elinkelpoisuuden ja sen estäminen voi estää syövän kehittymiseen, mikä viittaa siihen, että kohdentaminen FOXM1 pienten molekyylien voisi edustaa uutta strategiaa kehittää uusia syöpälääkkeitä [25], [26], [27] , [28].

Aiemmin käyttäen solu-pohjainen seulonta kehittämä laboratoriossamme olemme tunnistaneet tiopeptidin, Siomycin A (NSC-285116), kuten voimakas estäjä FOXM1 [25]. Lisäksi osoitimme, että Siomycin A ja toinen samanlainen tiatsoli antibiootti, tiostreptonille, joka on jo hyväksynyt FDA eläinten käyttöä, estävät FOXM1 ja apoptoosin melanoomasoluissa [26], [29]. Täällä, osoitimme, että tiatsoli antibiootit, Siomycin A ja tiostreptonille estävät FOXM1 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja ilme. Olemme myös löytäneet suoraa korrelaatiota tukahduttaminen FOXM1 ilmentymisen ja apoptoosin induktio, joita thiopeptides eri ihmisen syöpäsolujen linjat. Lisäksi loimme että FOXM1 voisi suojata solukuolemaa aiheuttama tiatsoli antibiootteja, mikä viittaa siihen, että nämä lääkkeet saattavat osittain aikaansaavat syövän vastaista aktiivisuutta kautta tukahduttaminen FOXM1.

Tulokset

Äskettäin saimme näyttöä siitä, että toinen tiatsoli antibiootti, tiostreptonille, joka rakenteellisesti eroaa Siomycin A vain 2 tähteet (Fig. 1A) jolla on anti-cancer [30] ja anti-FOXM1 ominaisuudet [29] samanlainen Siomycin A. vaikutusten arvioimiseksi tiostreptonia on FOXM1 transkriptionaalinen aktiivisuus, ja myös tutkia, miten tiatsoli antibiootit vaikuttavat transkriptionaalista aktiivisuutta muiden jäsenten Forkhead perheen, olemme kehittäneet C3-Luc2.3-FoxO1 solulinjassa. C3-Luc2.3-FoxO1 solut ovat johdannainen U2OS luusarkoomasoluissa kanssa doksisykliinin-indusoituva FOXM1-GFP-fuusioproteiini, [25], joka on tamoksifeeni indusoitavissa konstitutiivisesti aktiivinen FoxO1 (AAA) -er fuusioproteiinia ja FOXM1 /FoxO1 riippuvainen tulikärpäsen lusiferaasi. Tässä järjestelmässä, pystyimme indusoivat selektiivisesti joko FOXM1 transkriptionaalista aktiivisuutta lisäämällä doksisykliini tai FoxO1 transkriptionaalista aktiivisuutta lisäämällä tamoksifeenin. Ensinnäkin testata, kuinka tiostreptonia vaikuttaa FOXM1 transkriptionaalista aktiivisuutta verrattuna Siomycin A, soluja käsiteltiin yhdistelmällä doksisykliini ja tiatsoli antibiootteja ja 16 tuntia myöhemmin lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Huomasimme, että tukahduttaminen FOXM1 transkription aktiivisuuden tiostreptonille on verrattavissa Siomycin A (Fig. 1 B), mikä osoittaa, että molemmat tiatsoli antibiootit estävät FOXM1 transkription aktiivisuutta. Seuraavaksi onko tiatsoli antibiootit estävät transkriptionaalista aktiivisuutta muiden Forkhead perheenjäsenten kuten FoxO1 [31], käsittelimme C3-Luc2.3-FoxO1 solulinja yhdistelmä tamoksifeeni ja thiopeptides. Olemme havainneet, että lisäämällä tamoksifeenin johti induktion FoxO1 riippuvainen lusiferaasiaktiivisuuden, mutta hoidon tiatsoli antibiootteja ei pienentää tätä arvoa (Fig. 1 B). Koska kaikki jäsenet Forkhead perheen osuus konservoitunut Forkhead /siivekäs-helix DNA: ta sitovan domeenin, joka on vastuussa sitoutumisesta konsensuksen sivustoja, meidän tiedot viittaavat siihen, että thiopeptides eivät suuntaa tällä alalla ja ne voivat säädellä negatiivisesti vain FOXM1, mutta ei muita Forkhead perheenjäsenet.

(A) kemiallinen rakenne tiatsoli antibiootti, tiostreptonille, joka poikkeaa Siomycin A vain kaksi tähdettä (tiostreptonia-R1-R2: isoleusiini-alaniini; Siomycin- R1-R2: valine- dehydroalaniinia). (B) Luciferase määritykset käsittelyn jälkeen C3-Luc2.3-FoxO1 solulinja yhdistelmä joko 1 ug /ml doksisykliiniä (Doksi) tai 300 nM tamoksifeeni (Tam) ja 3 uM Siomycin A (SiO) tai tiostreptonia ( Tio), vastaavasti paljasti, että tiostreptonia on myös negatiivinen säätelijä FOXM1 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja tiatsoli antibiootit estävät FOXM1 transkriptionaalinen aktiivisuus joukossa Forkhead perheenjäseniä. (C) tiatsoli antibiootit vaimentua FOXM1-proteiinin tasot, mutta ei FoxA1, FoxO1 ja FoxO3a tasot havaittiin immunoblottauksella. (D) HCT116-p53RE-Luc-solulinja, joka ekspressoi stabiilisti tulikärpäsen lusiferaasi valvonnassa useita p53-vaste-elementtejä on käsitelty mitattu pitoisuus on Siomycin A tai tiostreptonia. Yön yli tapahtuneen käsittelyn lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. (E) SW480 paksusuolen syövän solulinja transfektoitiin väliaikaisesti Tcf /Lef riippuvainen TOPFlash ja ohjaus- FOPFlash rakentaa. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 3 uM Siomycin A tai tiostreptonia. Seuraavana päivänä lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. (F) A549 keuhkosyövän soluja transfektoitiin ohimenevästi GLI-riippuvaisen GLIBS-Luc, ohjaus miniTK toimittaja konstruktit ja GLI ekspressioplasmidin. Soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden thiopeptides 24 tuntia transfektion jälkeen ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin seuraavana päivänä. Bars in B, D-F edustavat keskiarvoja rinnakkaisessa kokeessa +/- SD.

Aiemmissa raporteissa huomasimme yllättäen, että Siomycin paitsi vaimentua FOXM1 transkriptioaktiviteettia, mutta se myös alensi mRNA ja proteiini tasoilla FOXM1 [25], [29]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että tiostreptonia myös downregulates FOXM1-proteiinin tasoja samassa määrin Siomycin A (Fig. 1 C). Lisäksi olemme havainneet, että tiatsoli antibiootit eivät vähennä proteiinin tasoja muiden jäsenten Forkhead perheen kuten FoxA1, FoxO1 ja FoxO3a (Fig. 1 C), mikä tukee ajatusta, että tiatsoli antibiootti Siomycin A ja tiostreptonia ovat spesifisiä inhibiittoreita FOXM1. Tutkimaan edelleen mahdollisia spesifisyys antibioottien FOXM1-riippuvaisen transkription testasimme kuinka Siomycin A ja tiostreptonille vaikuttavat transkriptionaalista aktiivisuutta muiden transkriptiotekijöiden kuten p53, Tcf /Lef ja GLI. Tätä varten HCT116-p53RE-Luc-solulinja (villityypin p53 ja useita p53-vaste-elementtejä ylävirtaan lusiferaasigeenin), SW480 paksusuolen syövän solulinja (ohimenevästi transfektoitu Tcf /Lef riippuvainen TOPFlash rakentamiseksi [32] ; lahja tri Randall Moon) ja A549 keuhkosyövän soluja (ohimenevästi transfektoitu GLI-riippuvaisen GLIBS-Luc reportterikonstruktista ja GLI ekspressioplasmidin; lahjana Dr. David Robbins) käsiteltiin Siomycin A tai tiostreptonille ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin 16 tuntia käsittelyn jälkeen. Huomasimme, että hoito antibiooteilla ei vähentänyt p53, Tcf /Lef tai GLI- riippuvaista transkriptiota (Kuva. 1 D-F). Kuitenkin myös muita kokeet osoittivat, että tiatsoli antibiootit vaikuttavat myös NF-kB-aktiivisuutta, mutta ei ole aktiivisuutta muissa tutkittu transkriptiotekijöiden (tuloksia ei ole esitetty).

arvioimiseksi syövän vastainen potentiaali tiatsoli antibioottien analysoitiin niiden vaikutukset ihmisten syöpäsolulinjoissa eri alkuperää jotka oli kohonnut ilmentymistaso FOXM1. Ensin tutkitaan, onko sisäinen tai ulkoinen apoptoottista reitin on mukana tiopeptidin: n indusoiman apoptoosin. Käsittelimme kaspaasin 8 puutteellisia ja rekonstruoitu NB7 neuroblastoomasolu- radoilla antibioottien 24 tuntia (Fig. 2A). Olemme havainneet, että kaspaasi-8 puutteellisia NB7 soluja, joita ei suoriteta ulkoisen apoptoosin olivat lähes yhtä herkkä thiopeptides kuin rekonstruoitu NB7 solujen aktiivisen kaspaasin 8, viittaa siihen, että tiopeptidin indusoiman apoptoosin on lähinnä luontainen apoptoottisen reitin.

(A) hoito kaspaasin 8 puutteellisia ja rekonstruoitu NB7 neuroblastoomasolu- linjojen kanssa tiatsolia antibiooteilla paljasti, että tiopeptidin indusoiman apoptoosin on lähinnä luontainen apoptoottisen reitin. (B) Leukemia syövän solulinjat CEM [IC

50 /uM: Sio-0,73 (0,08); Tio-1,47 (0,1)], HL60 [IC

50 /uM: Sio-0,68 (0,06); Tio-1,78 (0,4)], ja U937 [IC

50 /uM: Sio-0,53 (0,1); Tio-0,73 (0,3)], ja maksasyöpä solulinjoissa Hep-3B [IC

50 /uM: Sio-3,6 (1,3); Tio-2,3 (0,8)], Huh7 [IC

50 /uM: Sio-2,3 (0,5); Tio-1,8 (0,2)], ja SK-Hep [IC

50 /uM: Sio-3,7 (0,4); Tio-6,0 (1,4)], osoittivat herkkyyttä heikoissa mikromoolitasoa että tiatsolia antibiootteja määritettynä kasvun inhibitiomenetelmissä. (C-D) Siomycin A ja tiostreptonille estävät FOXM1 ilmaisun ja aiheuttaa voimakkaita apoptoosin leukemia ja maksan syöpäsoluja.

arvioida määrällisesti herkkyys eri ihmisen syöpäsolujen linjat tiatsolin antibiootteja Siomycin A ja tiostreptonille suoritimme kasvun inhibitioanalyyseissä eri leukemia (CEM, HL60, U937) ja maksan (Hep-3B, Huh7, SK-Hep) syöpäsoluja. Nämä syöpäsolulinjoissa käsiteltiin eri pitoisuuksilla antibioottien 48 tuntia ja laajuuden kasvun esto määritettiin laskemalla elävien solujen lukumäärä (Fig. 2B). Kaikki solulinjat näytetään IC

50s alhaisen mikromolaarisella alueella, mikä viittaa siihen, että nämä ihmisen syöpäsoluja ovat melko herkkiä thiopeptides. Lisäksi arvioimme apoptoottista vastaus Siomycin A ja tiostreptonille näissä ihmisen syöpäsoluja immunoblottauksella varten lohkaistaan ​​kaspaasi-3. Olemme havainneet, että sekä Siomycin A tiostreptonia tukahduttaa FOXM1-proteiinin ilmentymisen, ja indusoi apoptoosia näissä leukemia ja maksan syöpäsoluja (Fig. 2C, D). Nämä tulokset edelleen tukevat päätelmää, että tiatsoli antibiootteja paitsi antagonisoivat transaktivaatio kykyä FOXM1, mutta ne myös estävät sen ilmentymisen takia FOXM1 positiivista palautetta silmukka [33]. Lisäksi havaitsimme suoran korrelaation FOXM1 tukahduttaminen ja kaspaasi-3 pilkkominen (tunnusmerkki apoptoosin) käsittelyn jälkeen näitä yhdisteitä. Läheinen yhteys FOXM1 tukahduttaminen ja apoptoosin induktio viittaa siihen, että thiopeptides niillä voi olla proapoptoottiset toimintaa ainakin osittain läpi estämällä FOXM1 ihmisen syöpäsoluja.

tutkimiseksi mahdollista roolia FOXM1 in tiopeptidin välittämän apoptoosin, käsittelimme U2OS luusarkoomasoluissa 10 uM Siomycin A ja korjattu solut eri aikapisteissä (Fig. 3A). Löysimme huomattavaa laskua FOXM1 proteiinin ilmentymisen jo 18 tunnin, joka korreloi ulkonäkö vankka pilkkoa kaspaasi-3 bändejä. Havaitsimme myös korrelaatio vahvempi downregulation FOXM1 ja voimakkaampi apoptoosia 24 tunnin kuluttua hoidon tiostreptonille läsnäollessa tunnettu translaation estäjä sykloheksamidin (Chx) verrattuna yksittäisiin käsittely lääkkeillä, jälleen osoittaa, että tukahduttaminen FOXM1 voidaan vaatia ja tiopeptidin indusoiman apoptoosin (Fig. 3B). Tutkimaan edelleen rooli FOXM1 in tiopeptidin välittämän apoptoosin käytimme C3 solulinjassa [25]. FOXM1 indusoitiin lisäämällä doksisykliini ja seuraavana päivänä solut käsiteltiin tiostreptonia ja syklohek- 24 tunnin ajan (Fig. 3C). Havaitsimme, että endogeenistä FOXM1 väheni ajasta riippuvalla tavalla käsittelyn jälkeen, kun taas tasojen eksogeenisen FOXM1 ei ollut vaikutusta (kuvio. 3C). Olemme myös havainneet, että yli-ilmentyminen FOXM1 suojattu indusoimaa solukuolemaa tiostreptonia havaittuna immunoblot on katkaistun kaspaasi-3 (Fig. 3C). Nämä tulokset tukevat käsitystä, että downregulation FOXM1 voi myötävaikuttaa tiopeptidin: n indusoiman apoptoosin. Samoin olemme havainneet, että C3-solut yli-ilmentävät FOXM1 olivat resistenttejä hoidon Siomycin A analysoitiin immunoblottauksella varten pilkotaan kaspaasi-3 (Fig. 3d). Lisäkokeissa paljasti, että yli-ilmentyminen FOXM1 suojaa myös Siomycin A-indusoitua apoptoosia in läsnä ollessa syklohek- (Fig. 3E). Yhdessä kaikki nämä tiedot viittaavat siihen, että downregulation FOXM1 mukaan Siomycin A ja tiostreptonille voidaan tarvita tiopeptidin aiheuttama apoptoosin.

(A) immunoblottianalyysi käsittelyn jälkeen Siomycin paljasti läheinen korrelaatio downregulation FOXM1 ja apoptoosin induktio. (B) hoidon jälkeen tiostreptonille, tiopeptidin aiheuttama apoptoosin ja esto FOXM1 proteiinin ilmentymisen ovat näkyvämpiä läsnäollessa sykloheksamidin (Chx) kuten on kuvattu immunoblottauksella varten FOXM1 ja pilkotaan kaspaasi-3. (C): n ekspressio endogeenisen FOXM1 väheni aikaa riippuvalla tavalla, kun läsnä on tiostreptonia ja Chx, kun taas tasojen eksogeenisen FOXM1 ei ollut vaikutusta. Yliekspressio FOXM1 suojattu indusoimaa solukuolemaa tiostreptonia havaittuna immunoblot on katkaistun kaspaasi-3. (D) FOXM1 yli-ilmentävät solut olivat resistenttejä hoidon määrän kasvaessa Siomycin A analysoitiin immunoblottauksella on katkaistun kaspaasi-3. (E) immunoblot-analyysi paljasti, että yli-ilmentyminen FOXM1 myös suojattu Siomycin A-indusoitua apoptoosia läsnä ollessa Chx.

Keskustelu

Aikaisemmin on raportoitu, että tiatsoli antibioottien Siomycin [ ,,,0],25] ja tiostreptonille [29] estävät FOXM1 ja indusoi apoptoosin ihmisen syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että tiatsoli antibiootit estävät FOXM1 transkriptioaktiviteettia, ne myös downregulate FOXM1 ilmaisun ja aiheuttaa solukuoleman neuroblastooma, leukemia ja maksan syöpäsoluja. On tunnettua, että tiatsoli antibiootit harjoittavat antibakteerista aktiivisuutta estämällä bakteerin käännös kanssa tapahtuvan vuorovaikutuksen välityksellä 23S ribosomaalisen RNA: n, mutta ne eivät estä eukaryoottisten proteiinien synteesiä [34]. Tarkkaa mekanismia inhibition FOXM1 transkriptionaalisen aktiivisuuden on vielä selvittämättä, mutta se ei liity niiden kyky estää proteiinisynteesiä. Mielenkiintoista on, olemme myös havainneet, että tiatsoli antibiootteja tukahduttaa paitsi transkriptionaalista aktiivisuutta, mutta myös ilmaus FOXM1: (Fig. 1, 2), viittaa siihen, että FOXM1 voi positiivisesti säädellä omaa transkription [33].

Tässä olemme havainneet, että tiatsoli antibiootti indusoiman apoptoosin syöpäsoluissa eri alkuperää korreloi downregulation FOXM1: (Fig. 2, 3). Thiopeptides esti solun kasvua vastaavia IC

50 ja solukuolema vertailukelpoisia pitoisuudet niinkin erilaisissa solutyypeissä kuten neuroblastooma, leukemia ja hepatooma (Fig. 2). Koska meillä on jo todettu, että Siomycin A ja tiostreptonia kohde FOXM1, estävät solujen kasvua ja indusoivat apoptoosia melanoomasoluissa [29], nämä tiedot vahvistavat edelleen, että tiatsoli antibiootit voivat vaikuttaa monenlaisia ​​ihmisen syöpäsoluja. Lisäksi olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen FOXM1 voisi suojata syöpäsoluja vastaan ​​tiopeptidiä-välitteistä apoptoosia (Fig. 3C, D, E). Koska tiatsoli antibiootit tukahduttaa ilmentyminen ja aktiivisuus FOXM1 ja samalla FOXM1 yli-ilmentymisen suojaa syöpäsoluja Siomycin A ja tiostreptonia myrkyllisyys, FOXM1 voi olla voimassa kohde tiatsoli antibioottien indusoiman apoptoosin. Äskettäin Kwok et. al. osoittivat, että tiostreptonille tukahduttaa FOXM1 ilmaisun ja indusoi apoptoosia rintasyövän soluissa [35]. Nämä tulokset tukevat edelleen tämänhetkiseen tulokset ja havainnot aiempien julkaisujen että tiatsoli antibiootit, Siomycin [25], ja tiostreptonille [29] apoptoosin ja tukahduttaa FOXM1 ilmentymistä ihmisen syöpäsoluja. Tämä ryhmä ei linkittää tukahduttaminen FOXM1 ilmentymisen eston sen transkription aktiivisuuden tiostreptonille [35]. Lisäksi ne väittävät, että ainoastaan ​​konstitutiivisesti aktiivinen, mutta ei villityypin FOXM1, saattavat estää tiostreptonille lisääntymistä estävä aktiivisuus [35]. Lisäkokeita tarvitaan näiden erimielisyyksien ratkaisemiseksi.

Yhteenvetona osoitimme, että tiatsoli antibiootit Siomycin A ja tiostreptonille ovat voimakkaita estäjiä FOXM1 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja ilme. Lisäksi ne aiheuttavat ohjelmoidun solukuoleman ihmisen syöpäsoluissa erilaisia ​​alkuperää. Aste apoptoosin indusoiman thiopeptides korreloi tukahduttaminen FOXM1, kun taas yli-ilmentyminen villin tyypin FOXM1 osittain suojattu syöpäsolujen tiopeptidiä: n indusoiman apoptoosin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio FOXM1, jonka Siomycin A ja tiostreptonia jossain määrin vastaa solukuoleman aiheuttama tiatsoli antibiootteja. Kokeet on kuvattu tässä käsikirjoitus tukevat aiemmissa raporteissa [25], [26], [27], [29], että FOXM1 on sopiva kohde syöpälääkkeiden ja että tiatsolia antibiootit voivat edustaa lupaavaa vaihtoehtoja nykyisin käytetään syöpähoitoihin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, media ja kemialliset yhdisteet

U2OS luusarkoomasoluissa; C3 soluihin [22], joka on U2OS klooni C3 solulinjan doksisykliini-indusoituva FOXM1-GFP-fuusioproteiini; U2OS johdettu C3-Luc2.3-FoxO1 osteosarkooma, jotka ilmentävät stabiilisti doksisykliini-indusoituva FOXM1-GFP [25] mukaan tamoksifeeni-indusoituva FoxO1 (AAA) -er fuusioproteiinia ja tulikärpäsen lusiferaasi valvonnassa useita FOXM1 /FoxO1 reagoivat elementit; HCT116-p53RE-Luc paksusuolen, jotka ilmentävät stabiilisti tulikärpäsen lusiferaasi valvonnassa promoottorin, jossa on useita p53-vaste-elementtejä (p53RE); A549 keuhko ja Huh7, Hep3B ja SK-Hep maksasyövän solulinjoja kasvatettiin DMEM-alustassa (Invitrogen). SW480 paksusuolen, kaspaasi-8 puutteellisia ja rekonstruoitu NB7 neuroblastooma (antelias lahja tri Jill M. Lahti, St. Jude Lasten Research Hospital, Memphis), CEM, HL60 ja U937 leukemia syövän solulinjoja kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen) . Kaikissa tapauksissa media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (GIBCO), ja solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Tiatsoli antibiootteja Siomycin A (NCI) ja tiostreptonia (Sigma) liuotettiin DMSO: hon (dimetyylisulfoksidi), tamoksifeeni (Sigma) etanolissa, doksisykliini (Clontech) PBS: ssä ja syklohek- (Sigma) DMSO: ssa.

konstruktiot ja transfektiot

Super8xTOPFlash ja ohjaus Super8xFOPFlash toimittaja plasmidit olivat antelias lahja tri Randall T Moon (University of Washington, Seattle, WA). SRαGLI1 ekspressioplasmidin ja GLI-BS-Luc, miniTK reportterirakenteet oli ystävällinen lahja Dr. David J. Robbins (Dartmouth Medical School, Hanover, NH). Ohimenevä transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ohjeiden mukaan valmistajan.

immunoblottianalyysi

Syöpäsolut eri alkuperää käsiteltävä ilmoitetulla kerättiin ja lyysattiin käyttäen IP-puskuria ( 20 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF: ää, 10 mM Na4P2O7, 1 mM natrium- othrovanadate, 0,2 mM PMSF: ää, johon oli lisätty proteaasi-inhibiittorin tabletti (Roche Applied Sciences)) . Proteiinipitoisuus määritettiin Bio-Rad Protein Assay-reagenssia (BIO-RAD). Eristetyt proteiinit erotettiin 8% tai 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore). Immunoblottaus suoritettiin kuvatulla tavalla 34, 35 kanssa spesifisten vasta-aineiden FOXM1 (lahja Dr. Costa laboratoriosta), FoxA1 (lahja Dr. Costa laboratoriosta), FoxO1 (Cell Signaling), FoxO3a (Upstate), pilkotaan caspase- 3 (Soluviestintä) ja β-aktiini (Sigma).

Lusiferaasimäärityksiä

C3-Luc2.3-FoxO1 soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin yli yön yhdistelmä joko 1 ug /ml doksisykliiniä tai 300 nM tamoksifeeni ja 3 uM Siomycin A tai tiostreptonia. Myös HCT116-p53RE-Luc solulinjaa kasvatettiin 6-kuoppalevyille ja käsiteltiin 3 uM Siomycin A tai tiostreptonille 16 tuntia. Lisäksi SW480 paksusuolen syövän solulinja kasvatettiin 6-kuoppalevyillä transfektoitiin kanssa TOPFlash ja FOPFlash rakentaa. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 3 uM Siomycin A tai tiostreptonia. Seuraavana päivänä tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus mitattiin käyttäen Luciferase Assay System (Promega). Proteiinipitoisuus mitattiin Bio-Rad Protein Assay-reagenssia (Bio-Rad) käytettiin normalisointi. A549 keuhkosyövän soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä ohimenevästi kotransfektoitiin joko GLI-riippuvaisen GLIBS-Luc tai ohjaus miniTK reportterirakenteet, GLI ekspressioplasmidin ja PRL-nolla (Promega), joka ilmaisee Renilla lusiferaasi. Soluja käsiteltiin 3 uM Siomycin A tai tiostreptonia 24 tuntia transfektion jälkeen ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden seuraavana päivänä.

Tiedoksi

Tämä käsikirjoitus on omistettu tohtori Robert H. Costa. Haluamme kiittää tohtori Randall Moon (University of Washington, Seattle) varten TOPFlash ja FOPFlash plasmidit, tohtori David Robbins (Dartmouth Medical School, Hannover) tarjoamiseksi GLI efektori ja toimittaja plasmideja. Haluamme myös kiittää tohtori Jill M. Lahti (St. Jude Lasten Research Hospital, Memphis) ja kaspaasin 8 puutteellisia ja rekonstruoitu NB7 neuroblastoomasolu- linjat. Kiitämme tohtori Angela Tyner (University of Illinois at Chicago, Chicago) ja tohtori Senthil Radhakrishnan (Caltech, Pasadena) lukemiseksi käsikirjoituksen ja heidän arvokkaasta kommentteja. Kiitämme myös tohtori Nissim Hay (University of Illinois at Chicago, Chicago) tarjoamiseksi FoxO1 ja FoxO3a vasta, ja hänen käyttökelpoisia ehdotuksia.