Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Sytokiini aiheuttama tappajasolujen (CIK solut) ovat heterogeeninen osajoukko ex-vivo laajennettu T-lymfosyyttejä, jotka on ominaista, jossa on MHC-rajoittamaton kasvaimeen tappaa toimintaa ja sekoitettu T-NK fenotyyppi. Adoptiovanhemmat CIK solujen siirrossa yksi adoptiovanhemmat immunoterapia edustaa lupaavaa myrkytöntä syöpähoidon. Kuitenkin kliinisissä tutkimuksissa, terapeuttista aktiivisuutta adoptiovanhemmat CIK solujen siirto ei ole yhtä tehokas kuin odotettiin. Mahdollisia selityksiä ovat, että epänormaali verisuonien ja hypoksinen kasvaimen mikroympäris- voisivat haitata soluttautuminen ja tehoa lymfosyyttien. Oletimme, että angiogeneesiä torjuvina hoito voisi parantaa antituumorivaikutuksen CIK solujen normalisoimalla kasvaimen verisuonistoon ja moduloiva hypoksinen kasvain mikroympäristön.

Methods

Yhdistimme ihmisen rekombinantti endostatiini (rh-endostatiinia) ja CIK solujen hoitoon keuhkosyöpä hiiren malleja. Elintensisäinen mikroskopia, dynaaminen varjoainetta magneettikuvaus, immunohistokemia, ja virtaussytometria tutkittaessa käytettiin kasvaimen verisuoniston ja hypoksinen mikroympäristölle sekä immuunisolujen soluttautumista.

Tulokset

Tulokset osoittivat että rh-endostatiini synergized kanssa adoptiovanhemmat CIK solujen siirto estää kasvun keuhkosyöpä. Huomasimme, että RH-endostatiini normalisoitu kasvaimen verisuonistoon ja pienentää hypoksinen alueen kasvaimen mikroympäristössä. Hypoksia merkittävästi inhiboivat, sytotoksisuutta ja migraatio CIK in vitro ja esti ohjautumisen CIK solujen kasvain parenkyymiin ex vivo. Lisäksi olemme havainneet, että käsittely rh-endostatiini lisäsi merkittävästi ohjautumisen CIK solujen ja vähentynyt kertyminen suppressiivinen immuunisolujen kasvainkudoksessa. Lisäksi yhdistelmähoito tuotettu korkeampi kasvaimen infiltraatiota lymfosyyttejä verrattuna muihin hoitoihin.

Päätelmät

tulokset osoittavat, että rh-endostatiini parantaa terapeuttista vaikutusta adoptiiviseen CIK solujen hoito vastaan ​​keuhkosyövän ja paljastaa mekanismit synergistinen antituumorivaikutuksen tehosta, joka tarjoaa uusia perusteita yhdistämiseksi angiogeneesiä torjuvina hoidon immunoterapia hoidossa keuhkosyövän.

Citation: Shi S, Wang R, Chen Y, Song H, Chen L, Huang G (2013) yhdistäminen antiangiogeeniset Hoito Adoptive Cell immunoterapia kiinnostavuus Parempi Kasvaintenvastainen vaikutukset ei-pienisoluinen keuhkosyöpä mallit. PLoS ONE 8 (6): e65757. doi: 10,1371 /journal.pone.0065757

Editor: Juri G. Gelovani, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 joulukuu 2012; Hyväksytty: 29 huhtikuu 2013; Julkaistu: 14 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Shi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat National Natural Science Foundation of China (Grant numero: 81101739) ja China International Medical Foundation (Grant numero: CIMF-F-H001-023). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi johtavista syistä syövän liittyvät kuolemat [1]. Useimmat keuhkosyöpäpotilaita diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa (III tai IV) ja erilaisia ​​hoitoja on syntynyt kuten kemoterapia, sädehoito, tavoite hoito ja immunoterapian. CIK solut ovat heterogeenisiä solupopulaatioita, jotka ovat peräisin ihmisen perifeerisen veren tai hiirillä pernan jälkeen in vitro laajentamisen kanssa interferoni-γ, interleukiini-2 ja anti-CD3-vasta-aineita [2]. CIK soluja välittävät voimakas MHC-vapaan sytotoksisuutta erilaisia ​​kasvainsoluja ja voivat tunnistaa ja tappaa kasvainsoluja ilman edeltävää altistusta tai pohjustus. On olemassa kaksi pääasiallista osapopulaatioiden voidaan erottaa sisällä viljelmän pääosa in vitro laajeni CIK soluja, yksi yhteistyössä ilmentävien CD3 ja CD56-molekyylejä (CD3

+, CD56

+), kun taas toinen esittää CD3

+ CD56

– fenotyyppi. Antituumorivaikutuksen CIK solujen on raportoitu pääasiassa rajoittunut CD3

+, CD56

+ soluihin [3]. Adoptiovanhemmat CIK solujen siirrossa yksi adoptiovanhemmat immunoterapia edustaa lupaavaa myrkytöntä syöpähoidolla hoidettaessa kiinteitä kasvaimia tulenkestävien perinteisiin hoitoihin. Kuitenkin kliinisissä tutkimuksissa, terapeuttista aktiivisuutta CIK solujen siirto ei ole yhtä tehokas kuin odotettu [4]. Tehokas adoptiovanhemmat solu siirto on edessään monia haasteita, kuten systeeminen immuuni suvaitsevaisuutta ja kasvain paikallisen immuuni paeta. Homing immuunisolujen kasvainkohtaan pienenee ja tuumorin vastaista immuuni- toimintoja estää kasvaimen mikroympäristössä ja immunomodulatorisia ominaisuuksia ehkäisevien solupopulaatioiden [5], [6]. Näin ollen on kiireellisesti löytää tehokas hoito parantaa adoptiovanhemmat solun siirron tehokkuuden parantamiseksi kliinistä vaikutusta syöpäpotilailla.

On ehdotettu, että tehokkuus solupohjainen immunoterapioiden voisi vaikuttaa eheys kasvaimen verisuoniston ja immunosuppressiivinen kasvaimen mikroympäris- [7]. Hypoksia on tunnusmerkki epänormaali metabolisen ympäristön kiinteitä kasvaimia. Paitsi olla mukana väheni säteilyherkkyydestä ja kestävyys kemoterapiaa, hypoksia on tullut merkittävä tekijä siedätyshoitoa kasvaimen mikroympäristössä [8], [9], [10]. Useita rivejä näyttö viittasi siihen, angiogeneesiä torjuvina ohimenevästi normalisoitu verisuonien, vähentynyt sisäinen kasvain hypoksia ja lisääntynyt lymfosyyttien tunkeutumisen kasvain, joka tarjosi perustelut yhdistämällä angiogeneesiä torjuvina hoidon omaksutun solun immunoterapia [11], [12]. Angiogeneesiä torjuvina hoidon on raportoitu lisäävän tuumorin vastaista tehokkuutta kemoterapian, sädehoidon ja immunoterapiassa sekä eläinmalleissa ja ihmisen [13], [14], [15], [16]. Endostatiinista on 20 kDa fragmentti tyypin XVIII kollageenin, pystyy vähentämään jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasio endoteelisolujen vuorovaikutuksessa αvβ1, -αvβ3, ja a vp 5 intergrins pinnalla ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) [17]. Vaiheessa I ja II vaiheen kliinisissä kokeissa Amerikassa, endostatiinia osoitti pieniä vailla kasvainten vastainen vaste, vaikka mitään haitallisia sivuvaikutuksia havaittiin. Rh-endostatiinia käytetään esillä olevassa tutkimuksessa on modifioitu muoto endostatiinin ylimääräinen yhdeksän aminohapposekvenssi, joka muodostuu toinen hänen-tag rakenne ja on hyväksytty kliiniseen käyttöön valtion Food and Drug Administration Kiinassa hoidettaessa levinnyttä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä vuonna 2005 [18]. On todistettu, että RH-endostatiini voisi parantaa potilaiden edistymistä elinaika kehittyneissä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) yhdistelmähoitoa kemoterapian satunnaistetuissa tutkimuksissa. Olemme aiemmin osoittaneet, että rh-endostatiini voisi parantaa tuumorin vastaista tehokkuutta paklitakselin hoidossa keuhkosyöpä [19]. Rh-endostatiini on raportoitu parantaa radioresponse ihmisen karsinooman parantamalla hypoksisen kasvaimen mikroympäris- [8], [20]. Kuitenkin viime aikoihin asti, on vain vähän tietoa saatavilla kirjallisuutta antituumorivaikutusta yhdistämisen rh-endostatiini kanssa otto- solun immunoterapian. Teimme tätä tutkimusta, onko rh-endostatiini voisi parantaa antituumorivaikutusta Adoptiivisen CIK solujen siirto ja havainnollistaa mahdollisen mekanismeja, joilla rh-endostatiini julkaisi täyden potentiaalin adoptio soluterapian. Meidän Tulosten mukaan rh-endostatiini voisi parantaa antituumorivaikutukset CIK solujen ja ehdotti, että yhdistelmähoito rh-endostatiinia ja CIK soluja pidettiin erittäin lupaavilta edenneen vaiheen keuhkosyöpäpotilaiden.

Methods

Ethics lausunto

eläinten tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals of Jinling sairaalan. Protokolla hyväksyttiin eläinten eettisen komitean Jinling Hospital (NO. 2010062412). Kaikki Leikkaus suoritettiin pentobarbitaalinatriumilla ja ketamiinianestesiassa ja eläimet lopetettiin yliannostuksen anestesia. Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Ihmisen veri kerättiin ilmoitettiin luovuttajien ja menettely suoritettiin tiukasti mukaisesti hyväksymän menettelyn Ethic komitean Jinling Hospital. Verinäyte avunantajat ovat antaneet kirjallisen tiedon, suostuu osallistumaan tähän tutkimukseen.

Solulinjat

Hiiren Lewisin keuhkokarsinooma soluja, ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolua A549 ja SPC-A1 ostettiin Shanghai Institute of biokemian ja solubiologian (Shanghai, Kiina). HUVEC ostettiin KeyGen Biotech (Nanjing, Kiina). Hiiren Lewisin keuhkokarsinooma soluihin [19] pidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (Invitrogen, USA) täydennetään 100 U /ml penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia. Ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasoluja A549 [8] ja SPC-A1 [21] pidettiin laboratoriossamme ja kasvatettiin RPMI-1640 (Gibaco, USA), jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia . HUVEC-soluja [22] kasvatettiin F12K (Mediatech), jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä, 10% FBS, 0,1 mg /ml hepariinia, 0,03 mg /ml endoteelisolujen kasvun täydennysosa (Sigma Aldrich). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

Animal Models

SPF C57BL /6-hiiriä ja BALB /c-nude-hiiriä (6-8 viikon ikäisiä) hankittiin Academy of Military Medical Science (Peking, Kiina), pidetään Comparative Medicine Department of Jinling sairaalan ja kasvatetaan valvotuissa lämpötila ja kosteus, ja 12 tuntia pimeää, 12-tunnin valo sykli steriilillä ruoan ja vettä halun. Olemme perustettu kolme eläinmalleissa esillä olevassa tutkimuksessa. Kaksi ihmisen keuhkon adenokarsinooman ksenograftimalleja vahvistettiin ihonalainen rokotus A549-solujen ja SPC-A1-solut (1 x 10

6 /ul PBS) vastaavasti oikeaan kylkeen BALB /C nude-hiirissä. Kolmannen kasvain malli, C57BL /6 hiiret altistettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen 1 x 10

6 Lewisin keuhkosyöpä solua 100 ui PBS: ää. Ihonalainen kasvain tilavuudet mitattiin päivittäin paksuus ja kasvainten tilavuudet laskettiin kaavalla: tuumorin tilavuus = 0,52 x pituus x leveys

2.

Generation ja Cellular Fenotyyppikuvaus analyysi CIK solujen

ihmisen CIK soluja tuotettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, verinäytteet suostumuksensa luovuttajilta käsiteltiin käyttäen Ficoll-Hypaque tiheysgradienttisentrifugaatiolla (Beijing Kemialliset reagenssit Company, Kiina) erottamiseksi perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa. Pesun jälkeen keskipitkällä, solut suspendoitiin uudelleen RPMI-1640-väliaineessa (10% FCS, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), tiheydellä 2-4 x 10

6 solua /ml. 1000 U /ml interferoni-γ (Peprotech, USA) lisättiin ensimmäisenä päivänä kulttuurin. 24 tunnin kuluttua, 500 U /ml interleukiini-2 (Peprotech, USA) ja 50 ng /ml anti-CD3-vasta-aineella (eBioscience, USA) lisättiin. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja oli osa-viljeltiin joka 2-3 päivä tuoreella täydellistä elatusainetta 300 U /ml interleukiini-2 (Peprotech, USA) 2 viikkoa. Sukupolven hiiren CIK solujen pernasoluista toimi samanlainen kuin ihmisen CIK soluja. Karakterisoimiseksi fenotyyppejä CIK soluja, viljeltiin 7, 14 ja 21 päivää kerättiin ja värjättiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa seuraavat FITC tai PE-konjugoituja monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t): anti-CD3 ja anti- CD56. Virtaussytometrillä, ilmentymisen pinnan merkkiaineiden, CD3, CD56 tutkittiin ja kirjataan (Fig. S2). Kaikki vasta-aineet on saatu (eBioscience, San Diego, CA) käyttäen vakiomenetelmiä. Kaikkiaan 100000 solua näytettä hankittiin ja analysoitiin FACS-Calibur ja CellQuest ohjelmistojen (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

hoitokäytäntö

BALB /C nude-hiirissä altistettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen 100 pl (1 x 10

7 /ml) A549-soluja. Kun kasvaimen tilavuutta oli noin 100 mm

3, eläimet jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (n = 4-5 per kukin ryhmä) ja hoidot aloitettiin. Päivä, jolloin hoito aloitettiin nimettiin d0. Angiogeneesiä torjuvina hoito Tässä tutkimuksessa oli ihonalaisen 5 mg /kg rh-endostatiini 7 päivää ja adoptiovanhemmat immunoterapiaa koostui kahdesta laskimoon verensiirron CIK solujen d6 ja d9 (2 x 10

7 solua annos yhteensä tilavuus 100 ui). Yksityiskohtaiset ryhmittymät olivat seuraavat (kuviossa. S1): (1) ryhmä NS, käsiteltiin normaalilla suolaliuoksella (NS). (2) ryhmä EN, käsiteltiin rh-endostatiini yksinään. (3) ryhmä CIK, käsiteltiin CIK soluja yksinään. (4) ryhmä EN + CIK, käsiteltiin rh-endostatiini seurasi verensiirron CIK soluja. Kehon paino ja kasvaimen tilavuus kirjattiin päivittäin. Synergia kaksi hoitoja arvioitiin seuraavalla kaavalla: q = E

A + B /[E

A + (1-E

A) E

B] [24].

E

A + B, esto määrä yhdistelmähoitoa.

E

A estoaste rh-endostatiinia antiangiogeenisesti terapia.

E

B, esto nopeus adoptiovanhemmat CIK solujen immunoterapiaa.

q 0,85 tarkoittaa, että kaksi hoitojen antagonismia.

q 1,15 tarkoittaa, että kaksi hoitojen synergiaa.

0.85≤ q ≤1.15 tarkoitetaan kahden hoidot ovat additiivisia.

koe toistettiin neljä ryhmää C57B /6 hiirissä, joissa Lewisin keuhkokarsinooma ja neljä BALB /c-nude-hiirillä, joilla on SPC-A1 keuhkokarsinooma.

viljelyolosuhteet

Hypoxic inkubaatio ehto suoritettiin kosteassa, anaerobiset työpiste inkubaattoriin (Bug Box; ALC International, Cologno Monzese, Milano, Italia). Kaasuseos 1% O

2, 5% CO

2, ja 94% N

2 jatkuvasti injektoitiin virtausnopeudella 25 l /min kohdalla, anaerobiset työpisteeseen yrityshautomo. Jotta normoxic kunnossa, soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka koostuu 20% O

2, 5% CO

2, ja 75% N

2. Kaikki reagenssit myös keskipitkällä ja muovit käytetään hypoksinen hoitoja tasapainotettiin anaerobista kammiossa minimoimiseksi saastuminen ilman kanssa.

karboksifluoreseiinia diasetaatti sukkinimidyyliesteriä (CFSE) Labeling

leimaus CIK solujen CFSE suoritettiin kuten on raportoitu aiemmin [25]. Lyhyesti, ihmisen CIK-solut leimattiin CFSE: llä (Molecular Probes Biotec., Lopullinen konsentraatio 5 umol /l PBS: ssä) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 6 minuutin ajan. Merkintöjä Reaktio pysäytettiin lisäämällä kylmää RPMI-1640, jossa on 10% FCS: ää, ja solut pestiin kaksi kertaa PBS: llä, jossa oli 2% FCS: ää poistamaan ylimäärä CFSE.

Suppression of proliferaatiotestillä

CIK -soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa (10% FCS, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), 96-kuoppalevyillä normoksia tai hypoksia. Anti-CD3-vasta-aine ja interleukiini-2 lisättiin osaksi mediaa, jotta voidaan edistää jako CIK soluja. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, CIK solut laskettiin hemocytometry alla valomikroskoopilla.

In vitro Sytotoksisuusmääritys

cytotoxicities CIK soluja vastaan ​​kohdesoluja normoxic ja hypoksinen olosuhteet analysoitiin CytoTox 96 ®, ei- radioaktiivista Sytotoksisuusmääritys-laktaattidehydrogenaasin vapautumisen määrityksellä (Promega, Madison, WI, USA). Lyhyesti, A549-solut jaettiin kahteen 96-kuoppalevyille 1 x 10

5 solua /kaivo ja inkuboitiin 48 h CIK solujen 20:1, 40:1 efektori-to-kohde (E-to-T ) suhde. Tilavuus 30 ui soluviljelyn supernatantti siirrettiin läpinäkyvä tasapohjaisille 96-kuoppaisille levyille ja sen jälkeen lisäämällä 30 ui substraattia. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia pimeässä huoneen lämpötilassa, reaktio pysäytettiin lisäämällä 30 ui pysäytysliuosta. Sen jälkeen absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä. Maksimaalinen vapautuminen LDH suoritettiin täysin hajottamalla kohdesoluihin. Kohdesoluja tai efektori- ainoastaan ​​soluja käytettiin negatiivisina kontrolleina (spontaani vapautuminen). Tappaminen korko määritettiin seuraavan kaavan mukaan: tappaa korko (%) = [(kokeellinen laskee – efektori ohjaus laskee -kohde spontaani määrä) /(kohde esiinny kovin – kohde spontaani määrä)] x 100.

Transmigration Pitoisuus

Transmigration määritys suoritettiin TranswellTM ™ (Costa, USA) insertit sisältäviä HUVEC kulttuuriin. HUVEC lisättiin ylempään kammioon ja inkuboitiin normoxic tai hypoksinen edellytyksenä 24 h. Yhteensä 1 x 10

6 CIK solua 200 ul: ssa RPMI-1640-väliaineessa lisättiin sitten kun HUVEC-kerroksen A549-soluja viljelysupernatantti lisättiin alempaan kammioon ja inkuboitiin sitten alle normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia, vastaavasti . CIK soluja, jotka vaelsivat alempaan kammioon kerättiin ja laskettiin hemocytometry.

Immunosytokemia

Inkuboidaan hypoksinen tai normoxic viljelyolosuhdetta 48 tuntia, HUVEC kiinnitettiin 70% etanolilla 10 minuutin ajan ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100: ssa 5 min. 5% BSA: ta PBS: ssä käytetään estämään ei-spesifinen sitoutuminen vasta-aineita. Anti-ICAM-1-vasta-aine (Abcam, Cambridge, MA), ja anti-VCAM-1-vasta-aine (Abcam, Cambridge, MA) käytettiin ekspression havaitsemiseksi solujen välisen adheesiomolekyyli-1 (ICAM-1) ja verisuonten endoteelisolun molekyyli-1 (VCAM-1) by HUVEC. Kuvat otettiin käyttäen Olympus BX-60 mikroskooppia 400-kertaisella suurennuksella.

CIK Solut Tartunta endoteelisoluihin in vitro

aliyhtyvät yksikerroksiset HUVEC 6-kuoppalevyillä esi- inkuboitiin hypoksinen tai normoxic Viljelyolosuhteet: ssa 48 tuntia. Sen jälkeen esi-inkubointi, CIK soluja (2 x 10

6 solua /kuoppa) siirrettiin HUVEC viljelmiä ja inkuboitiin 24 tuntia samoissa viljelyolosuhteissa kuin HUVEC. Erillinen solut poistettiin kaksi huolellinen pesua käyttämällä PBS: ää ja loput solut värjättiin kaniinin anti-hiiri-CD3-vasta-aineita (Abcam, Cambridge, MA) havaitsemiseksi CIK soluja. Kuvia kiinnittyneet solut hankittiin käyttäen Olympus BX-60 mikroskooppia 200-kertaisella suurennuksella.

Kasvain Hypoksia Measurement

hypoxyprobe ™ -1 Kit (Natural Pharmacia International, Inc., Burlington, MA, USA, muodostuu 100 mg kiinteää ainetta pimonidatsoli HCI: ää (hypoxyprobe ™ -1) ja 1,0 ml hiiren IgG1 monoklonaalinen vasta-aine (mAb1)) käytettiin edelleen tutkia vaikutusta rh-endostatiinin kasvaimen hypoksia. Tämän perusteella mittaus on, että pimonidatsoli pelkistävästi aktivoituu, kun kudos pO

2 on alle 10 mmHg ja aktivoitu välimuotoja stabiileja kovalenttisia addukteja tioliryhmien proteiineja, peptidejä ja aminohappoja. Nämä adduktit voidaan havaita immunokemiallinen avulla, kun ne yhdistetään vasta-aineen kanssa reagenssin mAb1. Kasvaimen hypoksia havaitsemiseksi, hiiret rasittaa A549 keuhkokarsinooma annettiin 60 mg /kg kehon paino pimonidatsoli HCl: ää (hypoxyprobe ™ -1) intraperitoneaalisesti 4 h ennen kuin se lopetetaan kolme eri ajankohtina (päivinä 3, 6, 9). Kasvaimet leikeltiin ja kiinnitettiin 10% formaliinilla, upotettiin parafiiniin ja värjättiin sitten hiiren IgG

1 vasta-aineella. Kuvia jaksoissa hankittiin käyttäen Olympus BX-60 mikroskooppia 100 x suurennus ja hypoksinen alueet analysoitiin käyttämällä digitaalista kuva-analyysi-ohjelmisto Image J (NIH, Maryland, USA).

In vivo Seuranta CIK Cells

Seitsemän päivää annon jälkeen rh-endostatiinin, A549 kasvain hiiriä verensiirtoa iv CFSE: llä-leimatun CIK soluja (2 x 10

7-soluissa, kokonaistilavuudessa 100 ui). Normaalia suolaliuosta, käytettiin negatiivisena kontrollina (n = 4 eläintä ryhmää kohti). Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun CIK solujen verensiirron, hiiret lopetettiin ja yhden solun suspensiot perna ja kasvainkudoksen valmistettiin kaksi ryhmää. Analyysi prosenttiosuus CFSE-leimatun CIK soluja suoritettiin FACS-Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Kymmenen tuhansia avainnettu tapahtumia kerättiin ja analysoitiin käyttäen CellQuest ohjelmistoa (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

virtaussytometria

Seitsemän päivää käsittelyn jälkeen rh-endostatiinin, kasvain C57BL /6-hiiriä tapettiin. Kasvaimia ja pernat otettiin talteen ja yhden solun suspensiot valmistettiin. Erytrosyytit poistettiin inkuboinnin jälkeen erylysis puskurissa [155 mmol /l NH4CI: a, 10 mmol /L KHCO3, ja 0,1 mmol /l EDTA: a (pH 7,4)] huoneenlämpötilassa 10 min. Soluja värjättiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa seuraavat FITC tai PE-konjugoituja monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t): anti-CD11 ja Gr-1 Myelooisen johdettujen vaimennin soluja (MDSCs), anti-F4 /80 ja MHC /II for kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM). Kaikki vasta-aineet on saatu (eBioscience, San Diego, CA) käyttäen vakiomenetelmiä. Kaikkiaan 100000 solua näytettä hankittiin ja analysoitiin FACS-Calibur ja CellQuest ohjelmistojen (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Elintensisäinen Mikroskopia ja verisuonten läpäisevyyttä Pitoisuus

A549 tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin rh-endostatiini (5 mg /kg, sc) peräkkäisen 7 päivä normaalia suolaliuosta kontrollina. Päivinä 3, 6 ja 9, hiiret nukutettiin antamalla intraperitoneaalisesti pentobarbitaalinatriumia (40 mg /kg) ja ketamiinin (20 mg /kg kehon painoa). Lyhyesti, hiiriä pidettiin lämpimänä käyttäen lämpötyyny koko kirurgisen. Yksi kerros ihon (12 mm) ympärille kasvain poistettiin kirurgisesti luoda havainto ikkuna. Jälkeen lisäämällä steriiliä PBS: ää, ohut steriiliä piilolinssi käytettiin kattamaan leikkausalueen ja visuaalinen pääsy verisuonten verkosto kasvaimen (Fig. S3A). Leikkauksen jälkeen, hiiri oli vahvistettu alle fluoresenssimikroskoopissa ja asianomaiset verisuoniston havaittiin. Sen jälkeen, kun i.v. injektio 20 mg /kg Evans Blue väriainetta (Sigma-Aldrich, USA), jakelun aikana Evansin sinistä kirjattiin noin 10 minuuttia. Ekstravasaatio Evans Blue analysoitiin videon. Tiedot vahvistettiin Evans Blue uuttamalla testin päättymisen jälkeen Elintensisäistä mikroskoopilla tarkastelun.

immunohistokemia

C57BL /6 hiiret altistettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen kanssa Lewisin keuhkokarsinooma soluja. Kun kasvain volyymit olivat noin 100 mm

3, eläimet jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään mukaan hoito-protokollaa, ja hoito aloitettiin päivänä 0. Päivänä 14, kasvaimet kaikista kokeen ryhmät poistettiin ja kasvainten näytteet kiinnitettiin 4% formaliinia ja upotettu parafiiniin Immunohistokemiatutkimukset. Vieressä 3-um: n leikkeitä tehtiin, ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Abcam, Cambridge, MA) käytettiin värjäämään verisuonten endoteelisolujen, kanin anti-hiiri-alfa-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) vasta-aineita (1:200; Abcam, Cambridge, MA) käytettiin tahraa perisyyteissä. Tuumorikudoksista oli kaksinkertainen värjätään anti-CD31-vasta-aineiden ja anti-α-SMA-aineita. Sitten lasit huuhdottiin PBS: ssä ja inkuboitiin toisen vasta-aineet 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Toissijainen vasta-aineet vuohen anti-rotta FITC-konjugoituja vasta-aineita ja vuohen anti-kaniini TRITC vasta-aineita. Sitten lasit huuhdottiin PBS: ssä. Kuvia leikkeet kiinni. Mikrovaskulaarinen tiheys (MVD) arvioitiin, kuten aiemmin on kuvattu kaksi tarkkailijaa itsenäisesti [26]. Lyhyesti, leikkeet seulottiin alemmissa suurennoksilla (100 x) tunnistaa kymmenen alaa, joka sisältää eniten kapillaareja ja pienten venules. Valitulta alueelta, CD31-positiiviset värjätään endoteelisolut (MVD) ja CD31 /α-SMA kaksinkertaisen värjätty alusta laskettiin suurennuksella × 400.

Dynaaminen kontrasti Enhanced magneettikuvauksessa (DCE-MRI)

A549 tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin rh-endostatiini (5 mg /kg, sc) peräkkäisen 7 päivä normaalia suolaliuosta kontrollina. Päivinä 3, 6 ja 9, hiiret nukutettiin ja DCE-MRI suoritettiin. DCE-MRI suoritettiin käyttäen 3 Teslan koko kehon MR-skanneri (Siemens Symphony) yhdessä pieni eläin kela viritykseen ja signaalin vastaanottoon. Morfologiset MR-kuvantaminen suoritettiin käyttäen poikittainen T2-painotettu turbo-spin kaiku sekvenssi (toistoaika, TR 650 ms, kaikuajan, TE 24 ms, näkökenttä, FOV 70 x 70 mm2, leikkeen paksuus 2 mm). T1 kartta kasvaimen jaksossa saatiin 3 Flip kulmat (5 astetta, 15 astetta ja 30 astetta), ja T1-arvot laskettiin käyrän arvio. Kinetics varjoaineen kasvaimissa rekisteröitiin käyttäen T1-painotettu inversio toipumista vilkutusjakso (TR 5 ms, TE 2 ms, viipaleen paksuus 5 mm, FOV 55 x 70 mm2). Käynnistyksen jälkeen DCE-MRI mittaus, 0,1 ml (0,1 mmol /kg) paramagneettinen gadoliniumia dietyleeniglykoli-triamiini penta-etikkahappoa (Gd-DTPA) (Bayer-Schering Pharma) ruiskutettiin manuaalisesti 5 s häntälaskimoon , 70 dynaaminen skannauksia hankittiin yhdestä osiosta. Tiedot analysoitiin käyttäen farmakokineettistä mallia kuin aiemmin raportoitu ja parametrinen kuvia K

trans (tilavuus siirto vakio varjoainetta) tuotettiin farmakokineettinen analyysi DCE-MRI-sarjassa [27].

tilastollinen analyysi

tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskivirhe (SE). Erot neljään ryhmään verrattiin ANOVA, ja LSD haettiin useita keinoja vertailuja. Yhden mittauksen vertailut kahden ryhmän välillä testattiin käyttämällä paritonta t-testejä. Pearsonin korrelaatio analyysiä käytettiin testaamaan korrelaatiota sisäisen kasvaimen hypoksia ja MDSC kertymistä. Arvot p 0,05 otettiin merkittävä. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS ohjelmistoa 16,0 (Chicago, IL, USA).

Tulokset

Morfologia Observation and Cellular fenotyypin CIK solujen

Under mikroskopia, CIK soluista osoitti klusterimaisen kasvua. Massat CIK solujen vähitellen lisääntyi ja tuli suurempia kuluttua 4 päivän inkuboinnin. On olemassa kaksi pääasiallista alapopulaatioista CIK soluja, yksi ilmensivät sekä CD3- ja CD56-molekyylejä (CD3

+, CD56

+) ja toinen esittää CD3

+, CD56

– fenotyyppi. Kun oli inkuboitu 7, 14 ja 21 päivää, fenotyypit CIK soluja havaittiin. Prosenttiosuudet CD3

+, CD56

+ CIK soluja 8,93%, 23,66% ja 17,17% päivänä 7, 14 ja 21, tässä järjestyksessä (kuva. S2).

Yhdistelmä rh-endostatiinin jossa Adoptioisät CIK solujen Siirrä inhiboi merkittävästi kasvu keuhkosyöpä in vivo

Voit selvittää, onko lisääminen rh-endostatiinin on mitään synergiavaikutusta antituumorivaikutuksen tehosta CIK soluja, kolme edustava kasvainmuodoista perustettiin. A549 keuhkokarsinooma malli, huomasimme, että RH-endostatiini hieman rajoitettu kasvaimen kasvua verrattuna NS ohjaus, mutta ei ollut tilastollisesti merkitsevä (929,46 ± 471,70 vs. 1251,8 ± 531,75, p = 0,324). CIK solujen adoptiivinen hoito yksinään ei ollut antituumorivaikutus verrattuna NS ohjaus (1192,1 ± 621,68 vs. 1251,8 ± 531,75, p = 0,852). Päinvastoin, merkitsevä (p 0,05) kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta havaittiin, kun yhdistelmähoidossa verrattuna monoterapiaan tai NS-ohjaus (Fig. 1A). E

A = 1,35, E

B = 1.05, E

AB = 2,08 ja q = 2,71, mikä vahvistaa arvion synergian. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin perustettiin Lewis ja SPC-A1 keuhkokarsinooma malleja. SPC-A1 keuhkosyöpä malli, verrattuna NS ohjaus, rh-endostatiinin (1152,8 ± 181,4 vs. 1284,7 ± 229,2, p = 0,527) ja CIK (1204,1 ± 536,2 vs. 1284,7 ± 229,2, p = 0,698) monoterapiana ei osoittanut mitään merkittävää antituumorivaikutus. Kuitenkin merkittävä antituumorivaikutus saavutettiin yhdistelmähoidossa (p 0,05) (Fig. 1 B). Lewisin keuhkokarsinooma, ei rh-endostatiini (3394,7 ± 668,4 vs. 3866,5 ± 490,62, p = 0,176) eikä CIK solujen hoito (3429,6 ± 579,12 vs. 3866,5 ± 490,62, p = 0,208) yksin näytteille ilmeinen esto kasvaimen kasvuun verrattuna NS ohjaus. Kuitenkin merkittävä synergistinen antituumorivaikutus osoitettiin kun rh-endostatiini lisättiin CIK hoito (2037,0 ± 294,6 vs. 3866,5 ± 490,62, p = 0,000) (Kuva. 1 C). In vivo kokeet toistettiin kaksi kertaa. Ja samanlaisia ​​tuloksia sai kolmessa eri keuhkosyöpä malleja jotka kaikki viittasi siihen, että synerginen antituumorivaikutukset saatiin yhdistämällä RH-endostatiinin antiangiogeenistä hoito ja CIK solujen adoptiivinen hoito.

BALB /C nude-hiiriin ruiskutettiin s.c. A549 keuhkosyöpään solujen ja kun kasvain ylsi 100 mm

3, hiiret jaettiin neljään ryhmään satunnaisesti ja saivat sen pöytäkirjoja käsittelyn mukaisesti skeema. SPC-A1 ja Lewisin keuhkosyöpä -ksenografteja perustettiin ja asetetaan vastaavat hoitoja. A, synergistinen antituumorivaikutuksen osoitettiin kun rh-endostatiini yhdistettiin CIK adoptiivinen hoito tukahduttamaan A549 kasvaimen kasvua (p 0,05). Rh-endostatiinin tai CIK hoito yksinään ei merkittävästi tukahduttaa kasvaimen kasvua. B, rh-endostatiini osoitti huomattavan antituumorivaikutus, kun sitä annetaan yhdessä CIK soluja estämällä SPC-A1 keuhkosyöpä (p 0,05). C, on synergistinen anti-kasvain vaikutus osoitettiin, kun rh-endostatiini yhdistettiin CIK adoptiivinen hoito tukahduttamaan Lewisin keuhkokarsinooma kasvu (p 0,05). Points, keinot kasvaimen tilavuutta hiirtä ryhmää kohti; Bars, SE. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

Rh-endostatiini Vähennykset mikrovaskulaarisia tiheys ja Edistää kasvain Vessel normalisointi

Meidän Edellisessä tutkimuksessa havaitsimme, että mikrovaskulaarinen tiheys väheni ja kollageeni kattavuus kasvoi rh-endostatiinin hiiren Lewisin keuhkokarsinooma, joissa C57BL /6-hiirissä [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa, mikrovaskulaarinen tiheys (MVD) arvioitiin A549 kasvaimen kantavien hiirten. Päivänä 3, 6 ja 9, hiirtä kustakin ryhmästä lopetettiin ja kasvain näytteet valmistettiin immunofluoresenssivärjäyksen.