Krooninen sairaus

tiivistelmä

Proteiinikinaasit tärkeitä rooleja kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. Paljon estäjät ovat tehneet markkinoille ja lupaavia kliinisiä hyötyjä. Kirjoittajat raportoivat löytö uusi pienimolekyylisiä, hyvin siedetty, oraalisesti vaikuttava estäjät, R1498, majorly kohteena sekä angiogeenisten ja mitoosi väyliä hoitoon maksasolusyövän (HCC) ja mahasyövän (GC). Sarja biokemiallisten ja soluihin perustuvissa määrityksissä osoitti, että tavoite kinaasi klusterin R1498 mukana Aurora-kinaasien ja VEGFR2 et al. R1498 esti kohtalaisesti

in vitro

kasvun estäminen paneelissa kasvainsolujen kanssa IC 50 mikromoolin alue.

in vivo

antituumoriteholla of R1498 arvioitiin paneeli GC ja HCC vierassiirrännäiset rinnakkain verrattuna toiseen multikinaasi estäjä sorafenibi. R1498 osoittautui teholtaan ja toksisuusprofiili yli sorafenibi kaikissa testimallien kanssa 80% kasvaimen kasvun esto ja kasvaimen regressio joissakin xenogratfts. Terapeuttinen potentiaali R1498 tuli esille myös sen tehokkuudesta kolmen ihmisen GC primaarikasvaimen johdettu ksenograftimalleja 10-30% kasvaimen regressionopeuden. R1498 osoitettiin aktiivisesti estävän Aurora aktiviteetti

in vivo

, ja vähentää verisuonten muodostumista kasvaimissa. Lisäksi R1498 esitti hyvää

in vivo

altistumisen ja terapeuttinen ikkuna farmakokineettisen ja annosalueen löytämiseksi tutkimuksissa. Opinnäytetyöt todisteet osoittavat, että R1498 on voimakas, hyvin siedetty, oraalisesti vaikuttava multitarget estäjä ainutlaatuisen antiangiogeeninen ja antiproliferatiivinen profiilin, ja antaa vahvan luottamuksen jatkokehitykseen HCC ja GC terapia.

Citation: Zhang C, Wu X, Zhang M, Zhu L, Zhao R, Xu K, et al. (2013) pieni molekyyli R1498 niin hyvin siedetty ja oraalisesti aktiivinen kinaasiestäjän maksasyövän ja mahasyövän Treatment kautta Targeting Angiogeneesi ja Mitosis Pathways. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10,1371 /journal.pone.0065264

Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, France

vastaanotettu: 22 helmikuu 2013; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2013 Julkaistu: 05 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoittajien ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat ovat työntekijöitä tai entisten työntekijöiden Roche R 98%) syntetisoitiin Roche R D Center (Kiina). Entsymaattista määrityksiä ja

in vitro

soluun perustuvissa määrityksissä, R1498 liuotettiin DMSO: 0,01 mol /l kantaliuosta. Sillä Eläinkokeissa R1498 liuotettiin 1% Klucel EF /0,1% polysorbaatti 80 /0,09% metyyliparabeeni /0,01% propyyliparabeeni vettä, valmistettiin viikoittain. Sorafenibi syntetisoitiin Roche R 1:200 TBS /T) 4 ° C: ssa yön yli, sitten inkuboitiin 100 ul DAKO Kuvitella + /HRP, kani /hiiri jälkeen pestiin huolellisesti TBS. Sata mikrolitraa substraattia-kromogeenista liuosta (DAB) levitettiin objektilaseille ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Objektilasit huuhdeltiin varovasti vesijohtovedellä 15 min. Vastavärinä ja dehydraatio suoritettiin XL ST5010 huoneenlämpötilassa. Lopuksi objektilasit peitettiin Per- mountilla kiinnitysväliaine (Fisher Scientific, Miami, FL).

annosalueen löytämiseksi ja Toksikologisen tutkimuksen

annosalueen löytämiseksi ja toksikokineettisessä tutkimus tehtiin rotilla ja Beagle koirat perustuu

in vitro

metaboliittien tunnistaminen. Wistar rottia (uros: 3, nainen 3 kussakin ryhmässä, Vital River, Peking, Kiina) pidettiin paastolla yön yli, ja sitten sai testiartikkeleita kuin 0, 6,25, 50 ja 100 mg /kg kaksi kertaa päivässä per letkulla suun kautta varten 14 -päivä jatkuva hoito. Liikkuvuus havainto levitettiin päivittäin pohjalta löytää mahdollisimman suvaitsevainen annosta eläimille. Eläimiä uhrattiin D14, ja seuraavat toksikologian havainto tehtiin myös painon muutokset, kliininen havainto, ruumiinavaus, hematologian kemia ja histopatologia. Päivänä 1 ja päivänä 14, otettiin verinäytteitä kautta kaulasuoni punktio kaikista eläimistä (jos elossa, käyttämällä EDTA-K2 putket). Näytteet sekoitettiin kevyesti ja asetettiin murskattua märän jään saakka sentrifugoimalla, joka suoritettiin välittömästi. Näytteitä sentrifugoitiin noin 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa 2700 rpm. Saatu plasma erotettiin, siirrettiin ainutlaatuisesti merkitty selkeä polypropeenituubeihin jäädytetään välittömästi yli kiinteää hiilidioksidia (hiilihappojäätä), kunnes siirtyi noin -80 ° C: ssa. Kunkin eläimen verta seuraavat ajankohtina: noin 5 min, 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 8 ja 24 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta on tiettynä päivänä. Lääkkeen pitoisuudet plasmassa määritettiin LC-MS /MS: llä. Farmakokineettinen analyysi suoritettiin käyttäen WinNonlin ohjelmistoa (versio 5.2, Pharsight Corporation, CA, USA), ja farmakokineettiset parametrit laskettiin käyttäen Non-compartmental mallin menetelmää.

Beagle koiria (noin 8-10 kuukautta, alkaen Beijing Marshall Biotekniikka Co Ltd, Peking, Kiina) tehtiin tutkimus edellä kuvattua protokollaa. Jokaisella ryhmällä on yksi uros ja naaras koira, annokset testiaineen olivat: 0, 1, 7,5 ja 15 mg /kg, vastaavasti. Käyttö ja hoito koe-eläimen hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea, Roche R 0,05.

Tulokset

1. Luonnehdinta R1498 kuin multikinaasi-inhibiittori

Pyrazolobenzodiazepine analoginen R1498, jossa on tukirakenne, joka perustuu fuusion bentsodiatsepiinia ja pyratsolirenkaan (kuvio 1A), on aiemmin tunnistettu olevan heikko sykliiniriippuvainen kinaasi 2 (CDK2) inhibiittori [19]. Tämä molekyyli osoitti luonne multikinaasi-inhibiittori, kun olemme analysoineet estäjä kirjasto. Kinaasin estäminen profiilia R1498 (1 uM) karakterisoitiin KINOMEScan® ATP pitoisuus noin Km kunkin kinaasin. Esto määrä R1498 on yli 80% vastaan ​​39 kinaasien ulos 402 kinaasien, mukaan lukien 359 villityypin kinaasien ja 43 kinaasin mutantit (kuvio S1). Dissosiaatiovakiot (Kd) 39 osuma kinaasien määritettiin sitten, ja kinaasien kanssa Kd 0,2 uM oli kuviossa 1B on esitetty. Suurin osa mahdollisista osumia kuuluvat tyrosiinikinaasi (TK) perheen ja AGC perhe. Lisäksi, Z-Lyte määritys suoritettiin edelleen määrittämiseksi kinaasin inhibition aktiivisuus R1498. Tulokset osoittivat, että IC50 on R1498 olivat 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 nM VEGFR2: n, Aurora-kinaasi A ja B, vastaavasti (kuvio 1C). Sitten meidän tutkimus keskittyi anti-angiogeenisten ja anti-mitoottisten reittejä aikuinen vaikuttaa R1498.

(A) kemiallinen rakenne R1498; (B) R1498 alistettiin KINOMEScan® ja voimakkaimpia osumia Kd 0,2pM näkyvät; määritys suoritettiin kolmena kappaleena, ja tiedot esitettiin keskiarvo ± keskihajonta; (C) R1498 testattiin Z-Lyte kinaasimääritykset, kuten VEGFR2, Aurora A ja B, annos-vaste-käyrä on esitetty ja sitä IC 50-arvot kolmesta itsenäisestä kokeet ilmoitettu. (D)

in vitro

anti-kasvaimen kasvua aktiivisuus R498 analysoitiin 16. solulinjojen HCC, GC ja NPC. Tiedot kolmena rinnakkaismäärityksenä riippumattomien määritykset esitetään keskiarvona ± keskihajonta.

Paneeli 16 syöpäsolun linjat, mukaan lukien maksasyöpä, mahasyöpä ja nenänielun sinoomasolulinjoja, käytettiin määrittämään

vuonna vitro

anti-leviämisen kyky R1498. Useimmat solulinjat perustettiin Aasian syöpiä, kuten Aasian vallalla syövät ovat keskitymme. Maksasyöpä ja mahasyöpä solulinja paneelissa olivat herkempiä R1498 kohtelun kuin nenänielun syövän solulinjat. Yleinen keskimääräinen IC50 oli 7,81, 7,55 ja 30,07 uM, joka vastaa epatocellular syöpä, mahasyöpä, ja nenänielun sinoomasolulinjoja, vastaavasti. Herkkyys johdetut solulinjat Aasian väestöstä (BEL-7402, QGY-7701 ja QGY-7703) oli verrattavissa herkkyys Hep3B joka oli peräisin valkoihoinen (kuvio 1 D).

2. R1498 Estää Aurora-kinaasien ja indusoi solukierron pysähtymisen

Aurorakinaasi esto R1498 tehtiin näkyväksi immunofluoresenssilla mahasyövässä solulinjassa SGC-7901. Suora fosforylaatiokohdat fosfo-Aurora-kinaasi A (T288) ja fosfo-histoni H3 (S10) käytettiin osoittamaan kinaasiaktiivisuutta Aurora A ja B, vastaavasti [20], [21]. Fosfo-Ser /Thr-Pro Mitoottista proteiinin monoklonaalinen # 2 (MPM2) käytettiin mitoottisen merkki (punainen) merkitsemistä mitoosi-soluja. Aurorakinaasi A (T288) fosforylaatio tapahtuu sentrosomimäärän mitoosi soluissa (vihreä). Kun soluja käsiteltiin 5 uM MR1498 24 tuntia, Aurora T288 vihreä pesäkkeitä mitoosi soluissa heikkeni tai kadonnut (kuvio 2A, ylempi paneeli), mikä osoittaa, että aktiivisuus Aurorakinaasi on käytetty pienempää upon R1498 hoitoa. Fosforylaatio histoni H3 (S10) on pääasiassa lokalisoitu sentromeerien mitoosi soluissa. Sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin R1498, fosfo-histoni H3 (S10) väheni jyrkästi (vihreä). Tämä havainto viittasi siihen, että aktiivisuus Aurorakinaasi B laski myös alas kun R1498 hoitoa. Nämä tulokset immunofluoresenssilla vahvistettiin Western blot. Kuten kuvassa 2B, fosforylaatiota fosfo-Aurorakinaasi A (T288) ja fosfo-histoni H3 (S10) laski pitoisuudesta riippuvalla tavalla akuutissa hoitoa R1498.

(A) SGC-7901 mahasyöpä soluja käsiteltiin 5 uM R1498: ssa 24 tuntia, sitten kiinnittää ja värjätä fosfo-Aurora A (T288) (vihreä), MPM2 (punainen) ja DNA (sininen). MPM2 käytettiin paikantamaan mitoottisiin soluja. Kirkkaan vihreä pesäkkeitä sitä osoittaa valkoisen nuolen päät osoitti korkeaa fosfo-Aurora A (T288) in sentromeeriantigeenin (ylempi paneeli). R1498 käsitelty SGC-7901 mahasyövän soluja kuten edellä värjättiin fosfo-histoni H3 (H10) (vihreä), MPM2 (punainen) ja DNA (sininen) (alempi paneeli). Edustavia kuvia 2 itsenäistä määrityksistä esitetään. (B) R1498 käsiteltiin SGC-7901-soluissa, kuten edellä tehtiin DNA-analyysi virtaussytometrialla kautta propidiumjodidivärjäys. Histogrammeja analysoitiin edelleen Modfit 3,0 solusyklin jakeluun. Solujen DNA-pitoisuus on yli 4 N ( 4N) tarkoitetaan aneuploidia- aiheuttama endoduplication. Edustavia histogrammit 3 itsenäisestä määrityksistä esitetään. (C) SGC-7901 synkronoitu nokodatsoli (300 nM) 12 tuntia käsiteltiin erilaisilla pitoisuus R1498, sitten lyysattiin ja suoritettiin Western blot vastaavilla vasta-aineilla. (D)

In vitro

tubuliinin polymerisaatiota määritys suoritettiin R1498 ja doketakselin, ja OD340 mitattiin ja kirjataan kulunut aika tavalla. Edustaja histogrammit 2 itsenäistä määrityksistä on esitetty.

Aurora-kinaasien inhibition A ja B tuottaa eri fenotyyppisiä muutoksia solusyklin. Suppressio Aurora aiheuttama solusyklin G2-vaiheen pysähtymisen [22], kun taas estoa Aurorakinaasi B raportoitu aiheuttavan polyploidia soluissa johtuen endoduplication ilman sytokineesiin [15]. Sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin 10 uM R1498, sekä SGC-7901 (mahalaukun syöpä solu) ja BEL-7402 (hepatosellulaarinen karsinooma solu) osoitti, G2 /M-vaiheen pysähtymisen ja kertymistä polyploideja soluja. Sillä BEL-7402, solut jakelusta G2 /M vaiheita kasvoi 25,6%: sta 57,0% puolestaan ​​solut 4 N DNA sisältöä nousi 6,7%: sta 17,6%. SGC-7901 oli herkempi, jossa G2 /M väestö kasvoi 25,2%: sta 75,5%, ja Polyploidisten solujen kasvoi 3,1%: sta 21,6% (kuvio 2C). Mikrotubulusproteiinit stabilointiaine (esimerkiksi taksoli) ja destabilizer (esimerkiksi kolkisiini) aiheuttaa G2 /M vaiheessa pidätyksen samoin. Ymmärtää onko R1498 on mikrotubulusten kohdennettu reagenssi,

in vitro

tubuliinin polymerisaatiota määritys suoritettiin. Tiedot osoittivat, että R1498 ole vakiintunut eikä epävakaiksi mikrotubulusten polymeroitumisen myös kovilla R1498 pitoisuus (40 uM)

in vitro

(kuvio 2D), mikä viittaa siihen, että solusyklin G2 /M pidätys ei johtunut mikrotubulusten solun tukiranka häiriö. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että R1498 esti Aurora-kinaasien A ja B-soluissa ja tuotti fenotyyppiset muutoksia soluissa.

3. R1498 antagonisoi Angiogeneesi kehitykseen ihmisen endoteelisoluja

Angiogeneesiä alustetaan eritystä angiogeenisen kasvutekijän kasvainsoluja, ja sitten endoteelisolujen lisääntyvät, siirtää ja muodostaa astian putkien vasteita VEGF stimulaatiota. Puuttua spesifisyys R1498 antagonisoimaan endoteelisolujen kasvua stimuloivat VEGF, ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) altistettiin kahdelle eri ärsykkeiden, VEGF: n ja FBS, alle hoitoon R1498: ssa 72 tuntia. Alle viljelyolosuhteet sisältävän VEGF tai FBS, HUVEC osoitti eri vaste R1498. IC50 oli 89 ja 2064 nM VEGF ja FBS, vastaavasti; Näiden ehdotti, että R1498 antagonisoi HUVEC kasvua ohjaavat VEGF tehokkaampia kuin FBS (kuvio 3A). HUVEC-putken muodostumiseen määrityksessä, kun 8 tuntia altistuksen R1498, HUVEC muodostuu vähemmän ehjän putken silmää kuin DMSO käsiteltyjen ryhmien (kuvio 3B). R1498 ei vaikuttanut HUVEC proliferaatiota tämän hoidon edellytys (tuloksia ei ole esitetty).

(A) HUVEC viljeltiin 10% FBS: ää, tai 0,5% FBS: ää VEGF-165 käsiteltiin erilaisilla R1498 72 tuntia, ja sitten analysoitiin leviämisen päätepisteen. Käyrät sovitettiin Graphpad Prism5.0. Kolme riippumatonta määritykset tehtiin kolmena rinnakkaismäärityksenä ja IC50 ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta; (B) HUVEC kasvatettu Matrigel ™ hoidettiin 3 uM R1498 tai vastaava DMSO: ssa 8 tuntia. Edustavia kuvia 2 itsenäistä määrityksistä esitetään.

4. R1498 estää Growth of Human Cancer ksenoqraftit

farmakokinetiikkaa yhden annoksen R1498 useita lajeja määritettiin. Puoliintumisaika aika (T1 /2) ja oraalinen hyötyosuus (Oral BA%) suosii tehotutkimuksen nude mouse (taulukko S1), jossa on kaksi kertaa päivässä suun kautta letkulla aikataulu. Paneeli ksenograftien lukien Aasian mahasyövän, maksasyöpä ja nenänielun syöpä käytettiin vertailun välillä R1498 ja toisen multikinaasi estäjä sorafenibi (kuvio 4, taulukko S2). Sorafenibi on hyväksytty ensilinjan hoito maksasyöpä [2], ja on kliinisessä tutkimuksessa kombinatorisista hoidon edennyt mahasyöpä [23]. Rinnakkainen vertailu koostui kasvaimen kasvun eston, regressio ja painon muutokset eläinten kanssa annostelun 25 mg /kg kaksi kertaa päivässä per suun. Kaikilla testatuilla ksenografteissa, R1498 osoitti parempia tuumorin kasvun esto (TGI%) yli sorafenibin. Sillä maksasyöpä, TGI% of R1498 on 10-19% enemmän kuin TGI% sorafenibia, mahasyövän, 2-12% yli TGI% sorafenibin. Regression nopeus kasvaimen sisällytettiin myös toisena terapeuttinen päätepiste. Vuonna maksasyöpä paneeli, kasvaimen regressio havaittiin BEL-7402 malli, 8/10 (80%) eläimillä oli heikentämiseen R1498 ryhmässä, kun taas 1/10 (10%) eläin oli heikentämiseen sorafenibin ryhmässä (kuvio 4, BEL-7402) . Mahasyövän paneeli, MGC-803 ja SGC-7901 ksenografteissa oli sama regressionopeuden vastauksena testiartikkeleita: 5/10 (50%) ja R1498, ja 2/10 (20%) ja sorafenibin (kuvio 4, SGC -7901; ja taulukko S2). Perustuu tehomuuttujina kaikista 7 testattu mallia, R1498 on parempi tehokkuus kuin sorafenibia samoissa hoitoaikataulun. Lisäksi R1498 osoitti hyvää tehokkuutta yhtä nenänielun -ksenograftia, TGI% ja R1498 (90%, 25 mg /kg, kaksi kertaa päivässä, per oraalisella letkuruokinnalla) oli ylivoimainen standardin hoito- syklofosfamidia (60%, 10 päivän välein, intraperitoneaalinen injektio) (kuvio 4, CNE-2). Kehon painon muutokset, jotka kirjattiin kaikissa malleissa myrkyllisyyden vertailu osoitti, että nude-hiiret osoittivat siedettävä R1498 aikana koko hoidon BEL-7402, SGC-7901 ja CNE-2 mallia, vaikka painonnousun laski hieman 10 päivän kuluttua käsittely (kuvio 4, taulukko S2).