Krooninen sairaus

tiivistelmä

Poistetut maksasyöpää yhden (Dlc1) tuumorisuppressorigeeniä koodaa RhoGTPase aktivoiva proteiini (RhoGAP). Dlc1 geeni on useita transkription isoformeja ja olemme aiemmin perustaneet Hiirikanta sisältää geenin ansa (GT) lisäys, jossa nimenomaan vähentää ilmaus 6,1 kb isoformia (isoformin 2). Tämä geeni loukkuun alleeli, homotsygoottinen johtaa alkion kuolleisuutta ja heterotsygoottinen geeni loukkuun hiirillä eivät osoita lisääntynyttä esiintymistä syöpiä, mikä viittaa siihen, että yhteistyö onkogeeniset muutoksia voidaan tarvita muutosta. Tässä työssä olemme tutkineet

in vivo

yhteistyötä kasvaimia synnyttävän K-Ras2 ja Dlc1 geenien tuumorigeneesiä. Olemme huomanneet kasvu invasiivisia kateenkorvan syövissä, mukaan lukien sekä tymoomissa ja lymfoomat, mikä merkittävästi lyhentää eliniän hiirillä heterotsygoottinen gt Dlc1 alleeli indusoituva LSL-K-Ras2

G12D alleeli verrattuna LSL-K- Ras2

G12D vain hiirillä. Heterotsygoottinen hiiret osoittivat suurta etäpesäke keuhkoissa. Olemme löytäneet kasvaimen erityisiä selektiivisiä hypermetylaatiota Dlc1 isoformia 2-promoottorin ja pelkistämällä vastaava proteiinin ilmentymistä kateenkorvan lymfooma (TL) ja kateenkorvan epiteelin karsinooman (TEC) on johdettu kateenkorvan kasvaimia. Dlc1 puutteellinen kateenkorvan lymfoomåsolulinjojen ilmeni kohonneita trans-endoteelisolujen migraatiota. TEC solulinjoja myös näytteillä lisääntynyt stressi kuitu muodostumista ja Rho toimintaa. Johdanto kolmesta Dlc1 isoformia koodattu GFP näihin soluihin johti eri morfologisia muutoksia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys ilmentymisen vain isomuodon 2 voi olla riittävä kehittämiseen kateenkorvan kasvaimia ja etäpesäkkeitä.

Citation: Sabbir MG, Prieditis H, Ravinsky E, Mowat MRA (2012) The Role of Dlc1 isoformiseosten 2 K-Ras2

G12D aiheuttama Kateenkorvan Cancer. PLoS ONE 7 (7): e40302. doi: 10,1371 /journal.pone.0040302

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 08 joulukuu 2011; Hyväksytty: 7 kesäkuu 2012; Julkaistu: 05 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Sabbir et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin avustuksilla Cancer Research Society Inc. (https://www.src-crs.ca/en-CA) ja CancerCare Manitoba Foundation Inc. (https://www.cancercarefdn.mb.ca). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

poistetut in maksasyövän 1 (Dlc1) tuumorisuppressorigeeniä koodaa Rho GTPaasia aktivoiva proteiini (RhoGAP), joka lisää luontaista hydrolyysi GTP sitoutuneen Rho tehottomaksi BKT sitoutuneeseen muotoon Rho. Dlc1-geeni on havaittu usein poistettu tai alas säätelee promoottori hypermetylaation rinta-, keuhko-, maksa-, paksusuoli- ja eturauhastuumorit [1] – [6]. Tuoreessa tutkimuksessa käyttämällä esittäviä oligonukleotidia mikrosiruanalyysi on osoittanut heterotsygoottinen poistamisen Dlc1 lokuksen -50% maksan, rinta- ja keuhkojen kasvaimet ja 70% paksusuolen syövistä [7].

In vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että transfektio Dlc1 geeni voi estää solujen kasvua [5], [7], poistaa

in vivo

kasvaimen muodostumiseen [2], ja indusoida apoptoosia. Äskettäin kokeita käyttäen

ex vivo

knockdovvn Dlc1 p53 null ja Myc aiheuttama maksan progenitorisolujen ovat osoittaneet vähentänyt selviytymisen injektion jälkeen hiiriin [7].

Dlc1 geeni on ainakin kolme suurta transkription isoformit ilmaisi vaikutuksen alaisena kolme vaihtoehtoista promoottorien hiiressä [8]. Olemme aiemmin perustaneet Hiirikanta sisältää geenin ansa lisäys, jossa nimenomaan vähentää ilmaus 6,1 kb transkription isoformia (isoformin 2) of Dlc1, luoden hypomorph [8]. Homotsygoottinen Dlc-1-geenin loukkuun hiirillä osoittavat alkion tappava fenotyyppi [8], joka phenocopies Dlc1 eksonin 5 hiiressä on Durkin et al. [6]. Heterotsygoottinen Knockout ja geeni loukkuun hiiret ovat elinkelpoisia ja ei ole mitään kasvua spontaanien kasvainten [6], [8]. Tämä osoittaa, että ylimääräinen onkogeeniset tapahtumien lisäksi Dlc1 poistetaan tarvitaan muutos.

On osoitettu, että tietyissä tilanteissa aktivaatio Ras-signalointireitin pidätetty solusyklin indusoivan vanhenemista sijaan, että solujen lisääntymistä [9] – [12 ] kautta induktion p21

waf1 [13], [14]. On myös osoitettu, että Ras aktivoitujen solujen, yksi vaatimus Rho signalointi on tukahduttaminen p21

waf1 [15]. Jälleen Ras muuttaneet fibroblasteissa, sen kärsimä ERK-MAP kinaasisignaloinnin suosii valikoima korkeita aktiivisen Rho-GTP mahdollistaa alas-sääntelemiseksi korkea p21

waf1 [16]. Sen vuoksi on oletettu, että aktivointi Rho-reitin kautta menetys Dlc1 RhoGAP lauseke täydentää Ras-onkogeenin solun transformaatiossa

in vivo

. Se on myös ei tiedetä, mikä Dlc1 isoformi on kriittinen kasvaimen suppression. Tässä tutkimuksessa me raportoimme yleisyys metastaattisen kateenkorvan syövän heterotsygoottisessa Dlc1 isoformia 2-geenin loukkuun hiiriä onkogeenisessä K-Ras2

G12D alleeli. Olemme myös löytää selektiivinen hypermetylaatiota Dlc1 isoformia 2 promoottori näissä kasvaimissa.

Tulokset

yleisyys kateenkorvan Syöpä Dlc1

paino /gtLSL-K-Ras2

p- /G12D infektoidut hiiret AdCMV-cRE

Voit testata, onko Dlc1 tappio olisi yhteistyössä K-Ras2 geenin muunnos, olemme hyödyntäneet LSL-K-Ras2

G12D transgeeninen hiiri [17]. Aktivoi kasvaimia synnyttävän K-Ras2

G12D alleeli, Dlc1

paino /gt; K-Ras2

paino /G12D (KD) ja Dlc1

p /p; K-Ras2

paino /G12D (K

+) hiiriin injektoitiin Cre ilmentävien AdCMV-Cre adenovirus häntälaskimoon. Suurin osa hiiristä kehittyi ensisijainen kateenkorvan kasvaimia 6-9 kuukautta, jossa 52,6% (10/19) ja K

+ hiirillä versus 69,5% (16/23) ja KD-hiiriä, joilla on kasvaimia (kuvio 1A B , Pöytä 1). Hiiret olivat yleensä lopetettujen vakavia hengitys ongelmia johtuen puristuksen rintaonteloon kasvava kateenkorvan kasvaimet (kuvio 1C). Kun Nekroskopiassa, jotkut näistä hiirillä osoittivat myös neoplastisten leesioiden muissa elimissä, mukaan lukien munuainen, maksa, keuhko, kiveksen ja munasarja, mutta suurin osa hiiret osoittivat kateenkorvan kasvaimia (kuvio 1A, taulukko 1). Suurin osa keuhko- kasvainten oli metastaattinen kateenkorvan lymfooman soluissa alkuperää (kuvio 2E, taulukko 2). Määrittämään kokonaiselossaoloaika, Kaplan-Meier analyysi AdCMV-Cre injektoidaan hiiriin suoritettiin. Tämä paljastui huomattavasti alhaisempi eloonjääminen heterotsygoottisessa KD geeni loukkuun hiirillä verrattuna K

+ hiiret (P-arvo = 0,0077, kuvio 3A).

(A) Taajuus eri primaarikasvaimen tyyppejä. (B) Suhteellinen tiheys erityyppisten ensisijaisen kateenkorvan syöpien (C) Kuva laajentuneen kateenkorva (nuoli) hiiren ja leikellään kateenkorva lymfooma.

Ymmärtääksemme luonne kateenkorvan syöpien, suoritimme immunohistokemiaan käyttäen T-solun markkerina CD3 ja kateenkorvan epiteelisolujen spesifisiä markkereita, sytokeratiini 5 (CK5) ja sytokeratiini 8 (CK8 /Troma) [18]. Normaalissa nuoret hiiret (6 viikkoa vanha) T-imusolujen keksittiin jakautunut tasaisesti sekä aivokuori ja ydin alueilla kateenkorvassa, kun taas medullaarinen epiteelisolut olivat voimakkaasti CK5 ja aivokuoren epiteelisolut olivat voimakkaasti CK8 positiivisia (kuvio 2A). Kuitenkin aikuisen hiiren T-lymfosyytit olivat pääasiassa siirtynyt Keski-ydin-alueen ja aivokuoren epiteelisolut olivat voimakkaasti CK8 positiivisia yksittäisiä laastareita CK5 positiivisten solujen (kuvio 2B). Käyttämällä näitä markkereita olemme löytäneet huomattavasti suurempi määrä kateenkorvan lymfoomat 80% (8/10) K

+ hiirillä versus 68,7% (11/16) on KD hiirissä (kuvio 1 B 2D, taulukko 3) . Pienempi osa (20% (2/10)) olivat pääasiassa kateenkorvan epiteelin karsinooman (tymoomissa) K

+ hiirillä versus 31,2% (5/16) heterotsygoottisessa KD hiiret (kuvio 1 B 2C), sillä per histologinen luokitus Bernatz et al. [19]. Taajuus tymoomissa välillä K + ja KD hiirillä ei ollut tilastollisesti merkittävä. Olemme löytäneet vain yhden kasvaimen KD hiiren, joka oli sekoitettu thymoma tyyppi, joka voi olla sekä T-solulymfooma ja kateenkorvakasvain.

Normaali hiiri kateenkorva on 6 viikkoa (A) ja 18 viikkoa (B) osoittaa ekspressiota T-solujen markkeri (CD3) ja eri sytokeratiinimerkkiaineita erityisiä kateenkorvan medullaarinen epiteelisoluihin (CK5) ja aivokuoren epiteelisolut (CK8). Immunohistokemia osoittaa kateenkorvan epiteelin karsinooman (C), T-solulymfooma (D) ja keuhkojen etäpesäkkeiden T-solulymfooma (F).

Ensisijainen kateenkorvassa kasvaimia Usein metastasized Lung

immunohistokemia paljasti myös, että suurin osa kateenkorvan lymfooma kasvainten etäpesäkkeitä useita pesäkkeitä keuhkoissa. Suurin osa keuhkojen etäpesäkkeiden olivat T-solulymfooma alkuperää (kuvio 2E, taulukko 2). Kvantifiointi keuhkojen etäpesäkeleesioita kunkin kohortin osoittaa huomattavasti korkeampi taajuus etäpesäkkeiden KD hiirissä verrattuna K

+ hiirillä (kuvio 3B).

(A) Kumulatiivinen selviytymisen heterotsygoottisten LSL-K-Ras2

G12D; Dlc1

paino /gt ja LSL-K-Ras2

G12D; Dlc1

p /p hiirissä Cre ilmennä adenoviruksen injektio häntälaskimoon. Elinaika määriteltiin injektion jälkeen kuolemaan tai lopettamisesta johtuen saavuttaa inhimillinen päätepisteenä. Kaikkiaan 15 LSL-K-Ras2

G12D; Dlc1

paino /paino ja 18 LSL-K-Ras2

G12D; Dlc1

paino /gt-hiiriä käytettiin selviytymisen tutkimuksessa. Sensuroitu tiedot olivat hiiriä, jotka kuolivat tuntemattomista syistä ilman havaittavaa kasvainta tai leukemia. (B) Frequency metastaattisen keuhkokasvaimia. Neliön muotoiset harmaat pisteet ilmaisevat etäpesäkeleesioita johdettu hiiristä, jotka olivat lähteenä T lymfoomåsolulinjojen 1 ja 2. P-arvo = 0,0257 (jota U-testi).

Ensisijainen T-solu lymfooma ja tymoomasolulinjan Lines ovat puutteellisia Isoformi 2 Dlc1 proteiini ja kohonneen RhoA Activity

Me perustettiin 4 kateenkorvan lymfooman (TL) ja 3 kateenkorvan epiteelikarsinooman (TEC) solulinjoissa (kuvio 4A) päässä ensisijainen kasvaimia ekspression tutkimiseksi Dlc1 proteiinia. Nämä kasvaimet olivat joko CD3 + T-solujen tai CK 5 tai CK 8 positiivisia epiteelisolujen (kuvio 2C 0,05, * * P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). E. Dlc1 proteiinin ilmentyminen 5 azaC käsitelty TL ja TEC solulinjoissa.

Meidän Edellisessä tutkimuksessa olemme raportoineet, että on olemassa kaksi eri molekyylipainon isoformia Dlc1 proteiinin eri hiiren kudoksissa ja hiiri alkion fibroblasteja (MEF), joka oletettavasti peräisin isoformeja 2 ja 3 mRNA: ita tai translaation jälkeisiä modifikaatioita [8]. Säännöllinen 123 KDa Dlc1 proteiinia (isoformin 2) ilmennetään alhaisella tasolla aikuisen kateenkorva. Ottaa huomioon, että 127 kDa rajat reagoida ilmennetään korkeammalla tasolla kateenkorva verrattuna maksan Länsi blotteja (kuvio 4D /i). Mielenkiintoista, tymooma ja lymfoomåsolulinjojen osoitti pienempi ilmentyminen 123 kDa: n proteiinin kaista ja vastaavan isoformia 2: n mRNA verrattuna normaaliin kateenkorvassa (kuvio 4C 3 ja TEC 1 2 riviä oli vähäisempää verrattuna linjat K + hiirillä (kuvio 4D). Lisäksi siellä oli merkittävä nousu 127 kDa proteiini bändi kasvaimissa verrattuna kateenkorva (kuvio 4D). Edellisessä tutkimuksessa sekä esillä olevassa tutkimuksessa, olemme huomanneet, että proteiinin ilmentymisen taso 127 kDa: n proteiinin kasvaa läsnä alenemisesta 123 kDa proteiini, joka on erityisen ilmeistä homotsygoottinen geenin loukkuun hiiren alkion fibroblastisoluja ( Kuva 4D). Suurin osa lymfooman ja TEC soluissa osoitti myös lisääntynyt ilmentyminen 127 kDa proteiinia (kuvio 4D).

Voit selvittää, ylimääräiset suurimolekyylipainoinen bändejä fosforyloidaan muotoja Dlc1 proteiinin solun lysaatit käsiteltiin alkaalisella fosfataasilla. Jatkuva läsnäolo 127 kDa jälkeen fosfataasikäsittely osoittaa, että se ei ole fosforyloituu säännöllisiä 123 kDa Dlc1 proteiinia (kuvio 4C /i 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). (B) mittaus aktiivisen RhoGTP solulinjoissa. (I) RhoGTP kaatamaan määritys osoittaa konstitutiivista ja LPA indusoi tasoja aktiivista RhoGTP in T-solulymfooma ja kateenkorvaepiteelikäsittelyn sinoomasolulinjoja. (Ii) graafinen esitys RhoGTP kokonaismäärään Rho proteiinisuhde skannaamalla suhteellinen voimakkuus proteiinin bändejä ei-käsiteltyjen ja LPA aiheutettiin TEC, TL, MEF solulinjat. Keinot ja keskivirhettä määritettiin neljästä itsenäisestä kokeesta. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 ja **** P 0,0001 Studentin t-testillä ja kaksisuuntainen ANOVA testi.

Kaikki thymoma ja lymfoomåsolulinjojen osoittivat eriasteista aktivoitua RhoA, kun käsiteltiin lysofosfatidihappo (LPA) (kuvio 5B /i-ii). LPA induktion aktiivista RhoA oli merkitsevästi korkeampi kahden lymfooma (TL-1 -2) ja kaksi TEC riviä (TEC-1 -2), joka myös osoitti alimman Dlc 1 isoformia 2 tasossa, verrattuna vastaavaan villityypin solulinjat (kuvio 5B /i-ii). Tämä oli samankaltainen homotsygoottisia Dlc1

gt /gt soluja, mikä osoittaa, että nämä linjat voivat inaktivoineen villityypin Dlc1 alleelin.

kasvaimet aktivoinut K-Ras2 G12D mutaatio

Voit selvittää, että kasvaimet johtuivat aktivoinnin K-Ras2

G12D alleeli, poimimamme RNA ensisijaisesta kasvaimia ja kasvainsolulinjoja, ja sitten suoritetaan pyrosekvensointi perustuu mutaation analyysi K-Ras2

G12D mutaatio (kuvio 6). Kaikki primaaristen kasvainten osoitti ekspressoitumista mutantti K- Ras2 alleelin (kuvio 6F). Ilmaisulla mutanttialleelin oli alle 50% primäärikasvaimissa, kuten kävi ilmi, että pyrogram, mikä johtuu oletettavasti normaalien solujen infiltraatiota (kuvio 6D olemme kuitenkin löytäneet mikrosatelliittimerkkien koon muuttaminen varten D8Mit293 markkeri yksi kasvain sekä vastaava solulinja DNA (kuvio 8C). Olemme myös havainneet heterotsygoottinen menetys D8Mit174 markkerin metastaattisen keuhkovaurioita (kuvio 8C).

(A) kaaviomainen esitys suhteellisen aseman eri microsattelite markkereita käytetään heterotsygoottisuuden menetys analyysi. (B) edustaja autoradiogrammikokoelma osoittavat alleelien ominaisia ​​eri mikrosatelliittimarkkerin. Nuoli osoittaa LOH yhden alleelin ja Tähti osoittaa mikrosatelliitti koko muutos (MA) yhden alleelin, N-Normal, T-Kasvaimen (C) alleelityypitys asema kromosomissa 8qA4 merkkiaineiden kateenkorvan kasvaimet ja TEC ja TL solulinjoissa sekä vastaavan ensisijaisen ja etäpesäkkeitä; RH – säilyttäminen homotsygootista. Kasvaimet 1-7 ovat ensisijainen kateenkorvan kasvaimet vastaavat TL ja TEC solulinjoissa. Osaluokkaan a ja b alla Kasvainten 1-7 edustaa DNA saatiin kahdesta itsenäisestä keuhkojen etäpesäkeleesioita vastaavan primaarikasvaimen vastaavasti.

Jotta selvittää metylaatio Dlc1 promoottori oli vastuussa pieneni ilmaus Dlc1 mRNA ja proteiini, käsittelimme kasvain solulinjojen DNA demetyloivan agentti 5′-atsasytidiini (5 azaC) ja sitten tutkittiin ilmaus Dlc1 mRNA ja proteiini. Mielenkiintoista on, että hoito 5 azaC lisääntynyt ilmentyminen Dlc1 isoformin 2 verrattuna kontrolliin kasvainsolulinjoja (kuvio 4C /iii 0,0001) (kuva 9). Keskikoko kasvainsolujen (8-12 x 10

3 um

2) oli myös merkitsevästi suurempi kuin niiden normaali vastine (6-8 x 10

3 um

2) (p-arvo = 0,016). Lisäksi kasvaimen solut osoittivat, ventraalisempi rasitukseen liittyviä säikeitä [20], kun taas tavanomaisissa kateenkorvaepiteelisoluilla korostaa kuidut pääosin järjestetty poikittainen kaaria [21] (kuvio 9 A-C). Olemme myös havainneet, stressi kuidut järjestetty kolmion mesh kuten verkkojen kattavia tuman klo selkä solun pinnan thymoma soluissa (kuvio 9C).

(A) Normaali kateenkorvan epiteelisolujen osoittaa stressisäikeiden muodostumista muodossa rengasmainen poikittainen kaari. (B) kateenkorvassa epiteelikarsinoomasolulinja (Z pino-1) osoittaa laaja ventral stressisäikeiden muodostumisen ja yhä useammin paikallisessa tarttumisessa, (C) samassa tuumorisolun esittää erilaisia ​​rakenteellisia järjestäminen vinkuliini ja aktiini Z pino -7 selkäpuolen solun pinnalla. (D) Western blot, joka osoittaa ohimenevän ilmentymisen Dlc1 isoformia 2 3 proteiinit koodattu C terminaaliin GFP TEC solulinjassa. Kateenkorvan epiteelikarsinooman transfektoitujen solujen (E) pEGFP C1 vektori, (F) Dlc1 isoformin 2 GFP rakentaa; (G) Dlc1 isoformin 3 GFP-rakenne. (H) Bar kaavio edustaa suhteellista solujen määrän, jotka ovat osoittaneet neuriittien kuten laajennuksia ilmaistuna prosentteina koko GFP transgeenin ekspressoivat solut.

stressi kuidut poistettiin kun TEC transfektoitiin GFP tagged täyspitkä Dlc1 isoformin 2 (kuvio 9E-G). Ekspression GFP-Dlc1 fuusioproteiinit myös todennetaan Western blot käyttäen anti GFP-vasta-ainetta (kuvio 9D). GFP-Dlc1 isoformi 2-fuusioproteiini havaittiin lokalisoitu paikallisiin tarttumisiin (kuvio 9F). Olemme myös huomanneet, että kasvainsolut todettiin runsasta muodostumista ”neuriittien kuten” sytoplasminen laajennus tai filipodial rakenteita yhdessä tuhoaminen stressisäikeiden kokoonpanon kun transfektoitu GFP tagged Dlc1 isoformin 3 (kuvio 9 H). Kaikki Dlc1 transfektoidut solut kuolivat 3-4 päivää transfektion jälkeen.

Voit määrittää, onko T-lymfoomasoluille alhaisemmat Dlc1 tasot osoittivat lisääntynyttä ekstravasaatio ja muuttoliike, joka on transendothalial migraatiokokeessa suoritettiin (kuva 10). Hyökkäyksen nopeus T lymfooma solujen havaittiin merkitsevästi suurempi lymfooman solulinjassa 1 ja 2 verrattuna normaalin ääreisveren (PBL) peräisin T-solulinja (p-arvo = 0,0007 ja 0,021 vastaavasti, kuvio 10C). Kuitenkin loput 2 lymfoomåsolulinjojen, jossa suhteellisesti korkeampi Dlc1 ilmaisua, eivät osoittaneet merkittäviä eroja invaasio (p-arvo = 0,068). Kaikki lymfoomåsolulinjojen osoittivat myös merkitsevästi korkeampi etureunan pseudopodal rakenne verrattuna normaaliin PBL-T-solujen (P-arvo 0,04) (kuvio 10D). Lisääntynyt etureuna pseudopod muodostumiseen ja migraatiota in lymfooman solulinjassa 1 ja 2 Hyväksytty lisääntynyt etäpesäke vastaava hiirissä kohortti (kuva 3).

(A) Esitetään kaksi TL soluja, jotka olivat tunkeutuneet välinen endoteelisolujen solut. TL solut värjättiin T-solu-reseptorin marker spesifisen anti-CD3-vasta-aineita ja endoteelisolujen värjättiin DAPI ja TRITC-falloidiinia. Päälliseinämä esitetään edustavat Z pino kuvat lisäerän (yläpuolella endoteelisolujen) ja nuoli osoittaa pseudopod muodostumiseen (B) migraatiota määrityksessä T lymfoomasolut. Kolmiulotteinen rekonstruktiot näyttää kaksi TL soluja, jotka olivat tunkeutuneet Konfluenttien endoteelin yksikerroksista. Z pinottu otettuja kuvia 0,5 pm välein on käytetty jälleenrakentamiseen 3D-kuva. (C) prosenttiosuus trans-endoteelisolujen liikkui T-lymfoomåsolulinjojen. Keskiarvo ja keskivirhe on esitetty 5 kokeita (D) Prosenttiosuus soluja, jotka osoittivat etureuna pseudopod rakenne alla bEND.3 soluja. Keskiarvo ja keskivirhettä on esitetty 4 kokeita, joissa on yli 200 solua analysoitiin koetta kohti. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 ja **** P 0,0001 Studentin t-testillä).

Keskustelu

Dlc1 geeni kuten muutkin tuumorisuppressorigeeneille, esimerkiksi TP53, APC ja BRCA1, käyttää vaihtoehtoisia promoottoreita, jolloin saadaan vähintään kolme täyspitkää isoformien hiirissä [22] – [25]. On yhä enemmän todisteita selektiivisen vaihtoehtoisten promoottorien, joka säätelee ero transkriptiota, voi olla osallisena taudin alkamisen ja etenemisen syövän [26]. Poikkeavaan käyttöön yhden promoottorin toiseen geeneissä, kuten TGFB3, LEF1 ja CYP19A1, liittyy suoraan syöpäsolujen kasvua (katsaus [26]). Vaihtoehtona promoottoreita käyttämät Dlc1 geeni ovat evoluutiossa konservoituneita ja yleisiä muissa Dlc perheenjäsenet [27], [28]. Dlc1 geeni on kolme merkittävää vaihtoehtoista transkriptit, joita kuvattiin aikaisemmin 7,4, 6,1 ja 6,2 kb: n transkripti, jonka Sabbir et al. [8]. Nämä isomuodot on nimetty Isoformi 1, 2 ja 3 vastaavasti UCSC Genome Browser Mouse heinäkuuta 2007 (NCBI37 /mm9) Asennus. Tätä keskustelua, käytämme UCSC nimikkeistön isoformeja. Aikaisemmin on osoitettu, että kaikki kolme transkription isoformien Dlc1 geenin ilmaistaan ​​vaihtelevasti eri hiiren kudoksissa, mutta yksittäisten rooli tuumorigeneesiä on vielä tuntematon [8]. Ajallisesti ja ilmentyminen ihmisen Dlc1 isoformit vastaa hiiren Dlc1 puuttuu edelleen. Äskettäin Low et al. ovat tunnistaneet uuden Dlc1 isoformi 4 ihmisissä, joka vastaa Dlc1 isoformin 3 hiirellä ja se on löydetty vaiennettu useita karsinooma riviä promoottorin hypermetylaatio [29]. Genetrap hiiri että olemme käyttäneet meidän tutkimus on aiemmin osoitettu ansaan Dlc1 isoformia 2 ja vähentää sen ilme, mutta ei isoformit 1 ja 3 [8]. Isoformivyöhykkeet 3 promoottori osoitti suurta konstitutiivisen metylaation normaalissa kateenkorvassa kudoksessa ja kateenkorvan syöpäsoluja. Molemmat solutyypit vielä osoittivat ilmentymistä isoformin 3 mRNA. Korkea metylaatio Dlc1 promoottorin jatkuessa geenin ilmentyminen on myös raportoitu isoformin 2 koiran lymfooma [30]. Nämä tulokset osoittavat, että metylaatiostatuksen yksinään ei välttämättä riitä ennustamaan ilmentymisen Dlc1 isoformin 3, ainakin kateenkorva ja T-lymfosyytit. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että valitut menetys Dlc1 isomuodon 2: n ilmentymisen voi olla riittävä syövän etenemiseen.

Dlc1 genetrap yksin pysty indusoimaan kasvaimia kuitenkin, läsnä ollessa K-Ras2

G12D mutaatio, se lisää kasvain ja etäpesäke taajuuksilla verrattuna K-Ras2

G12D mutaatio vain hiirillä, mikä osoittaa additiivista vaikutusta. Ehdollinen K-Ras2

G12D hiiren käytettiin tässä tutkimuksessa oli aiemmin raportoitu kehittää adenokarsinooma keuhkojen yhteydessä intranasaalinen toimituksen AdenoCre virus [17]. Toinen siirtogeenisen hiiren mallia, LA1-K-Ras2, jossa K-Ras2

G12D alleeli voidaan aktivoida somaattisen kromosominvälinen rekombinaation tapahtuma, osoitti yleisyys keuhko- kasvainten, mutta myös 30% ilmaantuvuus kateenkorvan lymfooma ja muissa elimissä tyypit [31]. Tutkimuksessamme olemme löytäneet pääasiassa kateenkorvan kasvaimet sekä neoplastisten leesioiden monia muita elimiä käyttäen häntälaskimoon injektion AdenoCre. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että injektoinnin häntälaskimoon AdenoCre enimmäkseen kohdistuu maksaan, pernaan ja munuaisiin ja vähemmässä määrin kateenkorva, sydän ja keuhkokudoksesta [32], [33].

yleinen esiintyvyys neoplastisia vaurioita ja kateenkorvan kasvaimet oli merkitsevästi korkeampi KD hiirillä viittaa siihen, että pyynnin Dlc1 isoformi 2 saattanut antaa etua aloittamisen tuumorigeneesiä. KD hiiret osoittivat myös merkittävästi pienentyneet selviytymistä. Kasvu lymfooma etäpesäkkeitä keuhkoihin KD hiiret voivat olla syy vähentää eloonjäämistä näissä hiirissä.