Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monet erilaisesti metyloituja geenit on tunnistettu eturauhassyöpä (PCA), ensisijaisesti käyttäen kandidaattigeenifragmenttikloonien perustuvissa määrityksissä. Viime aikoina useita maailmanlaajuisia DNA: n metylaatio profiileja ei ole raportoitu PCA kuitenkin kukin näistä on heikkouksia kannalta kyky havainnoida globaalin DNA metylaatio muutoksia PCA. Oletamme, että on vielä tunnistamattomia poikkeava DNA: n metylaation PCA, joka voidaan tunnistaa käyttämällä Tarkempaa koemenetelmiä. Käytimme äskettäin kehitetty Illumina HumanMethylation450 BeadChip PCA (

n

= 19) ja viereisen normaaleissa kudoksissa (

n

= 4) ja yhdistetään nämä kanssa geenien ilmentyminen tietojen tunnistaa uusia DNA: n metylaatio, jotka saattavat on toiminnallinen seurauksia PCA kehittymistä ja etenemistä. Olemme myös vahvistaneet metylointituloksia itsenäisessä tietokokonaisuutta. Kaksi poikkeava DNA: n metylaatio geenit validoitu joukossa ylimääräinen 56 PCa näytteitä ja 55 viereisten normaaleissa kudoksissa. Yhteensä 28735 CpG sivustoilta osoittivat merkittäviä eroja DNA: n metylaatio (FDR säädettiin

P

0,05), jotka on määritelty keskimääräinen metylaatio ero on vähintään 20% välillä PCa ja normaalin näytteitä. Lisäksi yhteensä 122 geeneistä oli enemmän kuin yksi differentiaalisesti metyloitu CpG sivusto niiden promoottorialueella ja geeniekspressiomalli joka oli käänteinen suuntaan muutos DNA: n metylaatio (esim. Vähentynyt ilmaisutapoja lisääntynyt metylaatio, ja päinvastoin). Poikkeava DNA: n metylaatio on kaksi geeniä,

AOX1

ja

SPON2,

vahvistettiin kautta bisulfaatti sekvensointi, ja suurin osa kunkin CpG-sivustoja, joilla havaitaan merkittäviä eroja kasvaimen näytteiden ja normaaleissa kudoksissa.

AOX1

promoottorialue osoitti hypermetylaation vuonna 92,6% 54 testattiin PCa näytteitä vastakohtana vain kolme 53 testattu normaaleissa kudoksissa. Tässä tutkimuksessa käytettiin uuden BeadChip yhdistettynä geenien ilmentyminen tietojen PCA tunnistaa uusia differentiaalisesti metyloitu CpG sivustot sijaitsevat geenit. Hiljattain tunnistettiin eri tavalla metyloitu geenejä voidaan käyttää biomarkkereita PCa diagnoosin.

Citation: Kim JW, Kim S-T, Turner AR, Young T, Smith S, Liu W, et ai. (2012) Identification of New Differentially Metyloidut Geenit jotka Mahdolliset Toiminnallinen Seuraukset eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (10): e48455. doi: 10,1371 /journal.pone.0048455

Editor: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 26 syyskuu 2012; Julkaistu: 31 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health myöntää CA106523, CA95052, ja CA105055 (jotta JX); CA135008 (WL ja WBI); CA133066 (WL ja JWK) ja Department of Defense avustuksen PC051264 (ja JX). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA: n metylaatio on kovalenttinen lisäys metyyliryhmä on 5-asemassa hiilen sytosiiniemäs, ja tämä epigeneettisiä muutos on lähes yksinomaan löytyy sytosiinin guaniini-dinukleotidien (CpG) on eriytetty ihmisen soluissa [1]. CpG sivustot esiintyy lähinnä toistuvat sekvenssit tai CpG-saarekkeiden (CGI), jotka ovat CpG-rikkaita alueita, jotka löytyvät koko ihmisen genomin. Normaaleissa ihmisen aivokudos, alle 3% ja CGI sijaitsee promoottorialueita todettiin olevan metyloituja, toisin jopa 34% CGI sijaitsee geeninsisäinen alueilla metyloitiin [2]. Kuitenkin CGI metylaation promoottorialueille on hyvin dokumentoitu monissa tutkimuksissa johtuen yhdessä geenin hiljentäminen [3] – [5].

Aberrant DNA: n metylaatio välillä syöpänäytteissä ja normaaleissa kudoksissa on laajalti havaittu eri syövissä, mukaan lukien PCa [6] – [9]. Yli 67 erilaisesti metyloituja geenit tunnistettiin PCA, perustuvat pääasiassa geenispesifiseen määritysmenetelmissä [10]. Viimeaikainen kehitys state-of-the-art tekniikoita, kuten sirutekniikalla ja seuraavan sukupolven sekvensointi ovat aloitti uuden epigenomic aikakauden DNA: n metylaatio tutkimuksissa [11] – [14]. Useita tutkimuksia on raportoitu poikkeavan kuviot genominlaajuisten DNA-metylaation PCa kudosnäytteistä, käyttäen Agilent-CpG-saarekkeen mikrosiruja, Illumina HumanMethylation27 (HM27) BeadChips tai seuraavan sukupolven sekvensointi menetelmillä [15] – [20]. Neljä paperit ovat raportoineet DNA: n metylaatio profiileja HM27 BeadChip [17] – [20]. Kobayashi et ai. raportoitiin yli 8000 differentiaalisesti metyloitu CpG sivustoja (DMC) PCA näytteissä verrattuna viereisen normaaleissa kudoksissa käyttämällä suhteellisen suuri määrä näytteitä [18]. Mahapatra et ai. identifioitiin ja varmennettiin monia poikkeavasti metyloitua geenejä, joita voidaan käyttää diagnostisina tai prognostisia biomarkkereita [20]. Tämä HM27 BeadChip menetelmä tarjoaa DNA: n metylaatio tietoja yhden nukleotidin resoluutio yli 27000 CpG sivustoja. Kuitenkin tämä HM27 foorumi kattaa vain 0,1% kaikista CpG sivustojen ihmisen perimän ja kaikki testit CpG sivustot sijaitsevat promoottorialueille.

MethylPlex-seuraavan sukupolven sekvensoinnin (M-NGS) yhdistyy entsymaattinen rikastamista metyloitua CpG-saarekkeiden kanssa seuraavan sukupolven sekvensointi tekniikka [16]. Tätä menetelmää käytettiin Kim et al. tunnistamiseksi 2481 syöpäspesifisessä differentiaalisesti hypermetyloitunut alueille promoottorialueille vertaamalla PCa näytteitä, viereisten normaaleissa kudoksissa, ja taudista vapaan eturauhaskudoksiin. Kuitenkin, kun käytetään tätä menetelmää, Kim et al. ei ilmoittanut mitään tuloksia hypometyloidut alueisiin PCA. Lisäksi koko differentiaalisesti hypermetyloitunut alueiden raportoitu Kim et al. oli suhteellisen suuri (3000 emäsparia). Käyttämällä tätä menetelmää, se voi vaikeaa tunnistaa ydin metyloiduksi alueita, jotka ovat kriittisiä geenin ilmentymisen säätelemiseksi; sen vuoksi muuta määritystä varten tarvitaan tarkka arvio DNA: n metylaatio yksittäisiin CpG sivustoja [21]. Heikkouksista huolimatta kustakin tekniikkaa, nämä genominlaajuisten DNA: n metylaatio tutkimukset ovat osoittaneet, että on olemassa paljon tunnistamattomia erilaisesti metyloitua CpG sivustoja (tai alueet, riippuen määrityksen tekniikkaa), ja nämä tunnistamattomat DMC voi olla merkittäviä arvoa uusi lääke tavoitteita ja diagnostisia tai prognostisia biomarkkereita.

Illumina HumanMethylation450 (HM450) on äskettäin kehitetty BeadChip alustan, jonka avulla voidaan testata yli 480000 yksittäisiä CpG sivustoja ihmisen genomin [22], [23]. Tämä kattavuus vastaa noin 1,7% kaikista CpG sivustojen ihmisen perimässä, ja on valtava kasvu päässä edeltäjä HM27 BeadChip (0,1% kaikista CpG sivustoja). Korkea korrelaatio HM450 data ja koko genomin bisulfiitti sekvensointi tiedot osoittavat, että tämä uusi BeadChip voi tarjota luotettavia DNA: n metylaatio tietojen epigenomic profilointiin tutkimuksissa [23].

Teimme esitutkimuksessa tämän uuden HM450 BeadChip arvioida Eturauhassyövän näytteitä ja viereisten normaaleissa kudoksissa. Joukko geenien vapautettu poikkeava DNA: n metylaation PCA tunnistettiin ja yhdistettiin sitten riippumattomien geenien ilmentyminen tietoja. Sitten keskityttiin kahteen poikkeava DNA: n metylaatio geenejä (

AOX1

ja

SPON2

), vahvistuksen analyyseistä ylimääräisiä PCa ja viereisten normaalin eturauhasen kudoksia.

Materiaalit ja menetelmät

tutkimus aiheet

Kaikki kudokset näytteistä tässä tutkimuksessa saatiin eturauhassyövän potilailla, joille tehdään eturauhasen hoitoon kliinisesti paikallinen tauti Karolinska Institute, Ruotsi (

n

= 23) ja Johns Hopkins Hospital (JHH;

n

= 111). Kaikki eturauhasessa käytetty tässä tutkimuksessa kerättiin sen jälkeen kun sopiva koehenkilöillä hyväksynnät saatiin ja kirjallinen dokumentointi suostumus annettiin. Kaikki tutkimuksessa protokollat ​​hyväksyttiin Karolinska Institute tai Johns Hopkins Hospital tai Wake Forest University School of Medicine Institutional Review Board. Aihe näytteet valittiin perustuu kykyyn saada genomista DNA riittävän määrän ja puhtauden ( 70% syöpäsoluja syövän yksilöitä, ei havaittavaa syöpäsoluja normaalille näytettä) mukaan macrodissection täsmäävän viereisen ei-pahanlaatuinen (jäljempänä normaalit ) ja syöpä on laajoja eturauhasessa määritettynä histologinen arviointi hematoksyliinillä ja eosiini värjätään jääleikkeillä eturauhasen yksilöitä. Genominen DNA eristettiin leikattu jäädytetty kudoksista kuten aiemmin on kuvattu [24].

DNA Metylointi Pitoisuus

Genominlaajuiset DNA: n metylaatio profilointi suoritettiin käyttäen HM450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA) . Genomiset DNA: t muutettiin käyttämällä EZ-DNA metylaatio Kit (Zymo Research, Orange, CA) seuraavat suositusten Illumina. Illumina Infinium määritys suoritettiin myös mukaan valmistajan protokollan.

DNA-näytteet muutettava valmistauduttaessa sekvensointi kuten aiemmin on kuvattu [25]. Bisulfiitti sekvenssointialukkeiden suunnitellut metyyli Primer Express -ohjelmiston (Applied Biosystems, Foster City, CA) monistamiseen vetysulfiitilla muunnetun DNA (taulukko S1). Hot Start polymeraasiketjureaktio (PCR) (Qiagen, Valencia, CA) suoritettiin käyttäen seuraavaa Sykliohjelma: 95 ° C: ssa 15 minuuttia; 94 ° C 30 sekuntia, 56 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 30 sekuntia, 50 sykliä; ja lopullinen vaihe 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Monistetut PCR-tuotteet jatkokloonattiin käyttämällä TOPO TA-kloonausvektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Transformaation jälkeen

Escherichia coli

, me satunnaisesti valittu noin 10- 20 yksittäisiä

E. coli

pesäkettä jokaisesta näytteestä arvioidaan. Plasmidi-DNA suoraan monistettiin (Templiphi -monistustarvikesarjaa, GE Healthcare, Piscataway, NJ) ja sitten sekvensoitiin käyttämällä BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) ja M13-forward-aluketta.

Jokaisessa bisulfiitti sekventointialuketta setti arvioitiin käyttäen käyttövalmista kontrolli-DNA asetetaan, jotka olivat seoksia vaihtelevia määriä (0, 20, 50, 80 ja 100% metylaatio) kaksi valvonnan DNA: iden;

M.SssI

käsiteltyä DNA: ta metyloitu DNA: ta (Millipore, Billerica, MA) ja koko genomista monistetaan DNA metyloitumaton DNA [26], [27].

bisulfiitti-sekvenssin tietoja verrattiin kanssa UCSC genomin referenssijaksoa voidakseen arvioida metylaatiostatuksen kunkin CpG-sivuston avulla BiQ Analyzer ohjelmisto [28]. Kloonit vähintään 95% bisulfiittikonversion korko sisällytettiin myöhemmissä analyyseissä. Jokainen CpG sivuston sekvensointialustamme aineisto numeroitu 5 ’3’ -suunnassa. CpG sivustoja 2 ja 34

AOX1

promoottorialue jätettiin pois lisäanalyysiä takia usein puuttuu yhden nukleotidin pitkissä tymiini homopolymeerisen ulottuu noin jokainen näistä CpG sivustoja.

Julkaistu Metylointi ja Expression data

Raaka DNA: n metylaation tietoja PCa käyttämällä HM27 ladattiin Gene Expression Omnibus, julkinen tietovarasto [18]. Nämä metylaatio data luotiin käyttäen 86 viereisten normaalissa eturauhasessa kudoksiin ja 92 ensisijaista PCa näytteitä. Geenien ilmentyminen tietoja PCA joka perustui Affymetrix eksoni 1.0 ST Array ladattiin tietojen portaalin kotisivuilta (https://cbio.mskcc.org/cancergenomics/prostate/data/) [29]. Nämä ekspressiotietojen luotiin käyttäen 29 viereisten normaaleissa kudoksissa, 131 ensisijaista PCa näytteitä ja 19 metastaattisen PCa näytteitä. Normalisoitu log

2 transformoitu geeni-tason (koko transkriptio signaalin intensiteettiä) tietoja käytettiin tilastolliseen analyysiin.

Tilastollinen analyysi

Raaka HM450 tiedot saatiin käyttämällä GenomeStudio ohjelmistoa (Illumina) skannauksen jälkeen BeadChips. Väritasapainon säätö, yksinkertainen skaalaus normalisointi, ja valvomaton hierarkkinen klusterointi analyysi tehtiin käyttäen Bioconductor

lumi

paketti [30]. Β (metylaatio) laskettiin perustuen ehdotti yhtälö Du et al. [31]. Β arvo on jatkuva muuttuja välillä 0 ja 1, jossa β arvot lähestyy 1 (tai 0), mikä osoittaa täydellistä metylaatio (tai ei metylaatio, vastaavasti) kussakin CpG päällä. CpG sivustoja, jotka oli tunnistus

P

arvo on suurempi kuin 0,05, jätettiin pois.

Association välissä fenotyypin tai kliinis parametri ja DNA: n metylaatio kussakin CpG testattiin erikseen sisällä HM450 tiedot. Nämä tilastolliset testit suoritettiin yleisen lineaarisen mallin avulla PROC GENMOD SAS ohjelmiston (SAS Institute Inc., Cary, NC) [32]. Beta-jakauma β arvojen johtui kanssa binomimallia logit linkki ja asteikolla muuttuja arvioida Pearson jäännöksiä. Me määrittää, onko kukin yksittäinen CpG oli tilastollisesti merkitsevä perustuu virheelliseen löytö määrä (FDR) korjaamiseksi mahdollisia vääriä positiivisia useista testeistä (α = 0,05). Myös myöhemmin laskettiin keskimääräinen metylaatio (β arvo) CpG sivuston kussakin ryhmässä ja valittujen CpG sivustoja, jotka oli suurempi tai yhtä suuri kuin 0,2 tarkoittaa metylaation ero kahden vertailuryhmään [27], [33]. Siksi differentiaalisesti metyloitu CpG (DMC) määriteltiin CpG sivusto, joka oli FDR säätää

P

arvo 0,05 päässä yleistetty lineaarinen malli testi ja keskimääräinen metylaation ero kahden vertailuryhmät suurempi tai yhtä suuri kuin 0,2 (kuvio 1). HM27 tiedot myös käsitellään käyttäen samaa menettelyä.

Käytimme Fisherin testiä testata assosiaatioita DMC ja genomin eri puolilla genomin. Tilastollinen testi geenin ilmentyminen suoritettiin Wilcoxonin Rank Sum testin SAS-ohjelmiston. Me määrittää, onko kukin yksittäinen geeni oli tilastollisesti merkitsevä perustuu FDR säädettiin

P

arvo (α = 0,05).

Tulokset

tunnistaminen Differentially Metyloidut CpG Sites PCA

Olemme suorittaneet genominlaajuisten DNA metylaatio profilointi käyttäen Illumina HM450 BeadChip. Arvioimme neljä pariksi kasvain näytteet ja viereisten normaaleissa kudoksissa, plus 15 ylimääräistä pariton kasvainnäytteestä että alun perin kerätty Ruotsin aiheista (taulukko S2A). Normalisoinnin jälkeen, kaikki 23 kudosnäytteet näytti hyvin samankaltainen signaali intensiteettijakaumien, kun taas valvomaton hierarkkinen ryhmittely koko DNA metylaatio datasarja osoitti kaksi pääryhmään olivat kukin koostuu fenotyypin; kasvain tai normaali (kuva S1). Tämä selvä ero PCa ja normaalin näytteet osoittivat eri DNA metylaatiokuvion kahden fenotyyppien.

Tunnistaa poikkeava DMC eturauhassyövässä, suoritimme tilastollinen analyysi ja kavennetaan valintaa CpG sivustoja perustuu DNA metylaatio eroja ( Kuvio 1). Kaikkiaan 28735 CpG sivustoja osoittivat tilastollisesti merkitsevä FDR säätää

P

0,05 ja vähintään 0,2 tarkoittaa metylaation eroa PCa ja normaalin näytteet (taulukko S3). Näihin 28735 DMC mukana 20187 hypermetyloitunut CpG sivustoja (hyper-DMC) ja 8548 hypometyloidut CpG sivustoja (hypo-DMC) kasvaimissa verrattuna normaaleihin kudoksiin. Mielenkiintoista, 69,5% hyper-DMC (14038 CpG sivustot) sijaitsivat CGI, CGI rannoilla tai CGI hyllyjä, mutta vain 37,0% hypo- DMC havaittiin näillä alueilla (Fisher tarkka kaksisuuntainen

p

10

-44, taulukko 1A). Lisäksi jakelu tunnistettu hyper- ja hypo-DMC kasvaimissa oli tilastollisesti toisistaan ​​geenialueen luokkien valmistajan toimittamat (Fisher tarkka kaksisuuntainen

p

= 2,0 × 10

-44; Taulukko 1B ) [23]. Hyper-DMC oli useammin tunnistettiin proksimaalisessa promoottorialueille (mukaan lukien transkription aloituskohdasta [TSS] 1500, TSS200, 5’untranslated alue [UTR] and1st eksoni) kuin hypo-DMC, mutta hypo-DMC oli enemmän usein ei-promoottori alueet (mukaan lukien geenin rungon ja 3’UTR).

yhteensä 19570 DMC sijaitsee aiheuttavilta alueilla, vastasi 7031 ainutlaatuisia geenejä. Yhteensä 32 pois 67 geenien aiemmin raportoitu PCA on promoottori hypermetylaation todettiin listalta (taulukko S4) [10]. Tämä luku ylittää yhteisiä geenejä M-NGS menetelmällä (20 yleinen geenejä), joka on hieman yllättävä, koska M-NGS tarjoaa paremman käytännön kattavuus genomista CpG (29,6%) sivustoja verrattuna HM450 BeadChip (1,7%) [ ,,,0],16].

Vertasimme tuloksia julkaistaan ​​aineistoja. Niistä 28735 DMC, yhteensä 1175 CpG sivustot olivat läsnä HM27 BeadChips, joita käytettiin aiemman PCa tutkimuksessa [18]. Tilastollinen analyysi osoitti, että 1157 (98,5%) ulos 1175 CpG sivustoja ilmi varsin erilaisia ​​DNA: n metylaation välinen kasvain ja normaali näytteet (FDR säätää

P

0,05) ja kaikki nämä 1157 CpG sivustoja oli sama suunta metylaatio muutos kaksi tiedostoa (928 hyper-DMC ja 229 hypo-DMC, taulukko S3).

DMC Associations kanssa vapautettiin Gene Expression PCA

Saat poikkeava DNA: n metylaatio, joka voi aiheuttaa geenin ilmentymisen muutoksen PCA kartoitettiin geenien ilmentyminen tietoja muista listan DMC geenejä. Voit lisätä todennäköisyyttä tunnistaa tosi positiivisia, me vain testattu geenejä, jotka täyttivät kolme kriteeriä. Ensimmäinen, enemmän kuin yksi DMC havaittiin proksimaalisen promoottorin alueilla (TSS1500, TSS200, 5′-UTR ja 1. eksonin) geenin; Toinen, vähintään kolme neljäsosaa näiden useiden DMC geenissä promoottorialue oli sama suunta metylaatiomuutokset (hyper tai hypometylaatio PCA); kolmas, vähintään yksi DMC geenissä promoottorialue oli vähintään 0,4 tarkoittaa metylaation välinen ero syövän ja normaalin fenotyyppejä. Näiden kriteerien perusteella, yhteensä 276 geenit valittiin 9643 DMC jotka sijaitsivat proksimaalisesti geenin promoottori alueille ja käytettävissä 269 sovitetun geenien ilmentyminen tietoja testattiin [29]. Kaikkiaan 122 geenien osoittivat merkittäviä eroja geenien ilmentyminen välillä kasvain ja normaali näytteet (FDR säätää

P

0,05 ja käänteinen korrelaatio DNA: n metylaation ja ilmaisun muutoksia, taulukot 2 ja S5). Tämä setti sisältyy seitsemän tunnettua metylaatio geenejä PCA, esimerkiksi

GSTP1, CAV1, ja WR

. Yhteensä 65 pois 122 geenien vahvistettu olevan ero metylaatio HM27 data [18]. Nämä 65 vahvistivat geenien HM27 tiedot osoittivat samaan suuntaan metylaatiomuutokset kanssa HM450 tietoja. Lisäksi 55 pois 122 geenien on todettu cDMRs seuraavan sukupolven sekvensointi metylaatio data (M-NGS) [16].

Vahvistus AOX1 Järjestäjä hypermetylaation in Additional PCa Näytteitä

Yksi joukko 122 poikkeavasti metyloitua geenejä,

AOX1

, joka koodaa aldehydioksidaasi 1 ja sijaitsee kromosomissa 2q33.1, oli kaikkein merkittävästi alassäädetty geeni PCA näytteistä, jotka perustuvat HM450 tietoihin . Muutokset DNA: n metylaation ja geenin ilmentyminen

AOX1

välillä PCa ja normaaleissa kudoksissa olivat hyvin samankaltaisia ​​

GSTP1

(taulukko 2). Yhteensä 13 pois 19 testattu CpG sivustoja

AOX1

geeni tunnistettiin hyper-DMC (valikoima FDR säätää

P

: 7.4 x 10

-8~0.01 ja valikoima keskimääräisen metylaation ero: 0.20~0.52) ja 11 näistä 13 DMC sijaitsivat proksimaalisessa promoottorialueille (taulukko 2 ja kuvio S2A).

Kaksi CpG sivustoja

AOX1

promoottorialue lisäksi vahvistettiin hyper-DMC itsenäisissä HM27 datajoukon (taulukko S3 ja kuvio S2A) [18]. Mahapatra et ai. myös tunnistaneet tämän geenin differentiaalisesti metyloitua geeni käyttäen samaa HM27 alustaa [20]. Kim et ai. tunnistettu differentiaalisesti metyloitu alueella

AOX1

joka limittyy meidän 13 hyper-DMC sivustot käyttämällä M-NGS menetelmä PCA näytteissä [16]. Kim et ai. suoritettiin myös bisulfiitti sekvensointi

AOX1

promoottori kahdessa eturauhasen solulinjoissa, joissa vahvistettiin todisteita ero metylaation

AOX1

. Kuitenkin metylaatiostatuksen PCA kudosnäytteistä yhden nukleotidin resoluutio ei ole vielä suoritettu.

Siksi käytimme bisulfiitin sekvensointi vahvistamaan meidän löydös

AOX1

geeni keskuudessa ylimääräisiä PCa ja normaalissa eturauhasessa kudosnäytteet (taulukko S2B). Amplifioimme

AOX1

promoottorialueen, joka sisälsi 5 hyper-DMC ja limittyvät CpG saari, sitten sekvensoidaan jälkeen bakteeri- muunnoksen (kuvio S2A). Tiedot sarjasta ohjaus DNA: iden osoitti luotettavia tuloksia tästä bisulfiitti Sekvenointialuke setti (kuvio S2B). Niistä yhteensä 107 kudosnäytteitä JHH lukien 54 PCa näytteet ja 53 normaaleissa kudoksissa (51 pareittain), havaitsimme

AOX1

geenin promoottori voidaan voimakkaasti hypermetyloitunut PCa näytteissä verrattuna normaaleissa kudoksissa kaikissa reitin 34 testattu CpG sivustoja (keskiarvo metylaatio kaikissa 34 CpG sivustot: PCa

vs

. normaali = 0,73

vs

. 0,07, kuva 2A ja taulukossa S6); nämä erot olivat tilastollisesti merkitseviä (FDR säätää

P

8,8 x 10

-11). Me piirretään keskiarvo metylaatio kaikkien 34 CpG sivustoja kussakin kasvaimen näytteen ja vastaaviin normaaleihin näytteet (

n

= 51, kuva S2C). Tämä juoni osoitti lähes kaikki kasvain näytteissä oli suurempi kuin keskimääräinen metylaatio arvo 0,3

AOX1

promoottori, kun taas pariksi viereisen normaalia kudosta oli suhteellisesti pienempi metylaatio (alle keskiarvo metylaatio arvo 0,3). Tutkittuaan näitä tietoja, me mielivaltaisesti asettaa raja-tasolle 0,3 osoittamiseksi

AOX1

promoottori metylaatio erottaa kasvain normaalista kudoksesta (kuvio 2B). Herkkyys DNA metylaatio

AOX1

promoottori havaitsemiseksi Eturauhassyövän oli 92,6% (50 ulos 54 testattu PCa näytettä) ja 94,3% positiivista ennustus arvon. Emme pystyneet laskemaan spesifisyyttä tässä lisääntymään väestön koska näytteet ovat viereisten normaaleissa kudoksissa Eturauhassyövän potilaista. Kuitenkin 50 ulos 53 (94,3%) näistä normaali näytteet osoittivat negatiiviset tulokset

AOX1

promoottorin metylaation.

. Keskimääräinen metylaatio 34 testattiin CpG sivustoja kussakin fenotyyppiin. Virhe palkit osoittavat 95%: n luottamusväli kunkin CpG-sivuston. B. jakelu

AOX1

promoottori metylaatio kussakin fenotyyppiin. Jokainen ympyrä tai neliö edustaa keskimääräistä metylaatio 34 testattiin CpG sivustoja kussakin testattu kudosnäytteestä.

Vahvistus SPON2 Järjestäjä hypometylaatio in Additional PCa Näytteitä

SPON2

, joka koodaa spondin 2 ja sijaitsee kromosomissa 4p16.3, oli toiseksi säädelty geeni keskuudessa joukko 122 merkittävästi vapautettiin geenejä PCA, joka perustuu HM450 tietoihin. Yhteensä viisi CpG sivustoja

SPON2

promoottori tunnistettiin hypo-DMC (valikoima FDR säätää

P

: 2,1 × 10

-14~8.0 × 10

-8 ja valikoima keskimääräinen metylaation ero: -0.20~-0.50) ja nämä viisi DMC myös sijaitsee LOC100130872 promoottorialue (taulukko 2).

vahvisti myös metylaatio

SPON2

promoottorialueen, joka sisältää viisi hypo-DMC ja sijaitsee CpG-saarekkeen rannalla, käyttäen samaa bisulfiitti sekvensointi edellä kuvatulla menetelmällä (kuvio S3A). Tiedot sarjasta ohjaus DNA: iden osoitti luotettavia tuloksia tästä bisulfiitti Sekvenointialuke setti (kuvio S3B). Kaikkiaan 109 JHH kudosnäytteiden lukien 54 PCa näytteet ja 55 normaalien kudosten (54 pareittain) testattiin

SPON2

promoottori metylaatio. Tuloksena bisulfiitin sekvensointi osoitti hypometylaatio

SPON2

geenin promoottori PCA näytteissä verrattuna normaaleista kudoksista, ja nämä erot olivat tilastollisesti merkitseviä 25 ulos 27 testattu CpG sivustoja (keskimääräinen metylaatio ero PCa näytteiden ja normaaleissa kudoksissa : -0,1 ~ -0,27, kuvassa 3 ja taulukossa S7). Kuitenkin metylointi arvot Tästä 25 CpG sivustoja osoittivat enemmän vaihtelua kuin mitä me havaittiin

AOX1

promoottori (kuvio 2A). Kaikkiaan 55 normaaleissa kudoksissa osoitti keskimääräinen DNA metylaatio välillä 0,46 ja 0,81 vuonna 25 CpG sivustoja, mutta PCa näytteet (

n

= 54) osoitti keskimääräinen DNA metylaatio välillä 0,30 ja 0,63. DNA: n metylaatio on

SPON2

promoottori ei osoittanut mitään yhteyttä kliinis muuttujat, kuten ikä aikaan leikkauksen, Gleason pisteet, ja TNM PCA näytteitä ja normaaleissa kudoksissa (tuloksia ei ole esitetty).

jokainen ympyrän tai neliön edustaa keskimääräistä metylaatio 27 testattiin CpG sivustoja kussakin fenotyyppiin. Virhe palkit osoittavat 95%: n luottamusväli kunkin CpG sivuston.

DMC Associated kanssa kliinis Properties

Tunnistaa CpG sivustoja liittyy kliinis ominaisuudet, vertasimme metylaatio tiedot Eturauhassyövän näytteiden Gleason pisteet tai tilan biokemiallisten toistumisen (BCR). Ensin PCa näytteet jaettiin Gleason (alempi Gleason 6 ja 3 + 4 vs. korkeampi Gleason 4 + 3, 9, 10). Kaikkiaan 245 CpG sivustoja tunnistettiin Gleason pisteet liittyvien DMC (FDR säätää

P

0,05), mutta vain 40 CpG sivustoja osoitti yli 0,2 tarkoittaa metylaation eroa korkeamman ja alemman Gleason PCa (taulukko S8) . Geenien ilmentyminen data 22 geenien oli Gleason pisteet liittyvien DMC in aiheuttavaa alueilla testattiin yhdessä Gleason PCA näytteissä. Näistä 22 testattujen geenien vain

PPARGC1A

osoitti merkittäviä eroja geenin ilmentymisen välillä kasvainten alemman Gleason vs. korkeampi Gleason PCa (FDR säätää

P

= 0.022). Lisäksi metylaatio

PPARGC1A

(cg12691631) oli kääntäen korreloi geenien ilmentyminen (kuvio S4).

Vertailut BCR (biokemiallisten uusiutuminen; määritellään havaitseminen koko PSA yli 0,2 ng /ml leikkauksen jälkeen) ja ei-BCR määrittelivät vain kaksi CpG sivustoja DMC (cg11385353 in

AGXT

ja cg14218447 käytettäessä geenien välinen alue) käyttäen FDR säätää

P

0,05 ja yli 0,2 keskiarvon metylaatio ero kahden ryhmän välillä. Nämä kaksi CpG sivustoja osoittivat merkittävää eroa oikaistu hoidon tietoja. Kuitenkin geenin ilmentymisen

AGXT

ei osoittanut mitään eroa BCR ja ei-BCR ensisijaisen PCa (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

Testasimme DNA: n metylaation yli 480000 CpG sivustot käyttämällä HumanMethylation450 BeadChip PCA näytteitä ja normaaleissa kudoksissa. Olemme onnistuneesti tunnistettu 28735 erilaisesti metyloituja CpG sivustoja PCA. Monet tunnistetut DMC olivat riippumattomia Toistoja aikaisempien havaintojen ero DNA: n metylaation PCA [16], [18]. Ensimmäisessä, 98,5% (1,157 joukosta 1,175) yhteisten CpG sivustoja, jotka olivat läsnä meidän DMC luetteloon ja HM27 BeadChip havaittiin huomattavia metylaatioerojen edellisessä tietojoukon [18]. Toisessa, yhteensä 1014 pois 2481 (40,9%) syöpää erityisiä metyloituja alueita, jotka tunnistettiin käyttämällä M-NGS menetelmä PCA, päällekkäin meidän DMC [16]. Kun otetaan huomioon valtavat erot käytännön CpG kattavuutta näistä menetelmistä (M-NGS

vs

. HM450:29.6%

vs

. 1,7%), viskositeettiluku osuus 40,9% voi olla pidetään erittäin korkea.

jakautuminen DMC että HM450 osoitti samanlaista mallia jakeluun DMC on koolonisyöpäsolulinja [22]. Sandoval et ai. havainnut, että useimmat hypermetyloitunut CpG sivustot sijaitsivat CGI, CGI rannalla, ja CGI hylly alueilla, kun taas yli puolet hypermetyloitunut CpG sivustot olivat tunnistettavissa proksimaalisilta promoottorialueille. Tuloksemme oli yhdenmukainen että havainto, joka osoittaa, että 69,5% hyper-DMC sijaitsivat CGI, CGI rannalla, ja CGI hylly alueilla, kun taas 52,4% hyper-DMC oli tunnistettavissa proksimaalisilta promoottorialueille.

ovat huomanneet, että yhteensä 6907 CpG sivustoja määritettiin, että HM450 BeadChip sattuvat sijaita yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) loci. Kaikkiaan 336 CpG sivustojen joukossa 28735 DMC että olemme määritelleet myös sijaitsee SNP loci taulukon S3. Siksi erityistä huomiota tulee tulkita havaitut yhdistysten näillä 336 DMC.

Päätimme rajoitamme analyysin proksimaaliseen promoottorialue, koska tämä alue on hyvin ominaista sen vaikutuksia DNA: n metylaatio on geenien. Tämä lähestymistapa on myös antanut meille mahdollisuuden arvioida assosiaatioita geenien ilmentyminen muuttuu perustuu riippumattoman PCa tietokokonaisuutta, joka perustuu oletukseen, että käänteinen korrelaatioita promoottorin metylaation ja geenin ilmentyminen voi uskottavasti osoittaa toiminnallinen tulos erilaisesti metyloitua tunnistettujen geenien PCA. Tämä lähestymistapa havaintojen mukaan yhteensä 122 geenejä, mukaan lukien seitsemän tunnettua DNA metylaatio geenejä PCA. Positiivisena vahvistus lähestymistapamme,

GSTP1

, joka on perusteellisimmin tutkittu hypermetyloitunut geeni PCA havaittiin hypermetyloitunut tarkastelussa (taulukko 2). Yhteensä 7 ulos 15 CpG sivustoja HM450 BeadChip tunnistettiin hyper-DMC (valikoima keskimääräinen metylaation ero: 0,27 ~ 0,48)

GSTP1

geeni (taulukko S3). Lähetti-RNA on

GSTP1

geeni on aiemmin osoitettu olevan merkitsevästi säädellä vähentävästi ensisijainen PCa, ja etäpesäkkeitä näyttää edelleen alassäätöä [29].

aldehydioksidaasi 1 (

AOX1

) geeni on mukana erilaisissa metaboliareitit myös huumeiden aineenvaihduntaa ja sukupolvi reaktiivisia happiradikaaleja [34] – [36]. Alennettu AOX1 proteiinin ilmentymistä krooninen haimatulehdus ja poissaolon AOX1 proteiinin ilmentymistä haimasyövän on raportoitu [34]. Lisäksi vähentynyt AOX1 proteiinin ilmentymistä havaittiin maksasolukarsinoomassa ja tämä vapautuminen AOX1-ilmentyminen liittyy kasvaimen vaiheesta ja metastasoituneen asema [37]. Poikkeava DNA hypermetylaatiota

AOX1

promoottorialue äskettäin raportoitu paksusuolensyöpä ja PCa [16], [18], [20], [38], [39]. Osana näitä ennen julkaistut tiedot, meidän data tukee lisäksi roolia poikkeavalle DNA metylaatio

AOX1

promoottori Eturauhassyövän kasvaimia, mutta tarjoaa myös laajin kattavuus DMC tässä geenissä tasalla.

havaitut erot DNA metylaatio

AOX1

promottorista PCa näytteiden ja normaaleissa kudoksissa olivat merkittäviä. Tämä promoottori alue osoitti hyvin johdonmukainen metylaatiokuvion 34 CpG sivustoja ulottuu 400 emäsparia kussakin fenotyyppiin. Tämä genominen sijainti voi hakea arvioinnin kautta muita testejä, kuten pyrosekvensointi tai metylaatiospesifistä PCR.

Suurin Eturauhassyövän kasvain (92,6%; herkkyys) havaittiin olevan positiivisia DNA: n metylaatio, ja keskiarvo metyloinnin leikkaus off 0,3 ja 94,3% normaalista kudoksissa negatiivinen DNA metylaatio samalla cut-off. Tämä herkkyys

AOX1

metylaatio oli samanlainen muiden tunnettujen metyloituja geenejä, mukaan lukien

GSTP1

ja

WR

jotka testattiin käyttämällä pyrosekvensointi menetelmiä [40]. Tämä korkea herkkyys

AOX1

promoottorin metylaation ja valtavia eroja DNA: n metylaatio välillä PCa näytteiden ja normaaleissa kudoksissa ehdottaa mahdollisia hyödyllisyys tämän geenin biomarkkerina PCA diagnoosia.