Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on aggressiivinen maligniteetti, joka on usein diagnosoidaan edistyneellä vaihe huonon ennusteen. Täällä raportoimme kemoterapeuttisen vaikutukset bioaktiivisten proantosyanidiineja rypäleiden siemenet (Gmailin sponsoroimia mainoksia) arvioituna käyttäen

In vitro

ja

In Vivo

malleissa. Hoito ihmisen haimasyövän soluja (MiaPaca-2, PANC-1 ja AsPC-1), jossa Gmailin sponsoroimia mainoksia

In vitro

vähentää solujen elinkelpoisuuden ja lisääntynyt G2 /M-vaiheen pysähtymisen solusyklin johtaa apoptoosin induktioon on annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla. Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoiman apoptoosin haimasyövän soluja liittyi lasku tasot Bcl-2 ja Bcl-XL ja tasojen nousu Bax ja aktivoitu kaspaasi-3. Hoito MiaPaca-2 ja PANC-1-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia myös vähensi tasoja fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) ja fosforylaatio Akt at ser

473. siRNA Knockdown PI3K haiman syöpäsoluja myös vähensi fosforylaatiota Akt. Edelleen, ravinnon anto Gmailin sponsoroimia mainoksia (0,5%, paino /paino), kuten on täydennetty AIN76A kontrolliruokavaliota estivät merkittävästi kasvua MiaPaca-2 haiman tuumoriksenografteja kasvatettu subkutaanisesti kateenkorvattomiin nude-hiiriin, jotka oli liitetty: (

i

) soluproliferaation inhibointi, (

ii

) induktion kasvainsolujen apoptoosin, (

iii

) lisääntyneen ekspression Bax, vähentää ilmentymistä anti-apoptoottisten proteiinien ja kaspaasi-3: positiivisia soluja, ja (

iv

) vähentynyt ilmentyminen PI3K ja p-Akt in -tuumoriksenografti kudoksissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Gmailin sponsoroimia mainoksia voi olla mahdollisesti kemoterapeuttista vaikutusta haiman syöpäsolujen kasvua.

Citation: Prasad R, Vaid M, Katiyar SK (2012) rypäleen proantosyanidiinin Estä haimasyövän Cell Growth

In Vitro

ja

In vivo

kautta induktio Apoptoosi ja kohdistamalla PI3K /Akt Pathway. PLoS ONE 7 (8): e43064. doi: 10,1371 /journal.pone.0043064

Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 17, 2012; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2012; Julkaistu: 08 elokuu 2012

Copyright: © Prasad et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja Veterans Administration Merit Review Award (SKK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä pidetään neljäs johtava syy syövän liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa. Se on aggressiivinen maligniteetti, joka on usein diagnosoidaan edennyt pitkälle huonon ennusteen; yleistä 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [1], [2]. Vain 20% haimasyövän potilaat ovat oikeutettuja kirurginen resektio, joka on edelleen ainoa mahdollinen parantavaa hoitoa [3]. Vaikka yhdistelmä kemoterapiaa ja sädehoitoa voidaan parantaa selviytymistä, useimmat potilaat kuolevat sairauden etenemisen usein liittyy hankittu tai luontainen vastustuskyky kemoterapia [4], [5]. Siksi kehittäminen tehokkaampien hoitavien strategioita, jotka voivat kohdistaa molekyylit liittyvät haiman kasvainten kasvua ja kiertää tai vastustusta apoptoosin saattaa parantaa tuloksia potilailla, jotka kärsivät haimasyöpä.

Myrkytön fytokemikaalit tarjoavat lupaavan vaihtoehtoja kehittää tehokkaita kemoterapeuttisten strategioita eri syöpien riskiä. Joissakin tapauksissa ohjattu epidemiologiset tutkimukset tukevat käsitystä, että kulutus bioaktiivisten ruokavalion fytokemikaalit vähentää haimasyövän [6], [7]. Rypäleiden siemenet proanthocyanidins (Gmailin sponsoroimia mainoksia) ovat bioaktiivisia phytochemicals jotka ovat osoittaneet anti-karsinogeeninen joillakin eläin- kasvainmalleissa [8], https://carcin.oxfordjournals.org/cgi/content/full/24/8/1379 – B10 # B10and näyttävät vähäinen myrkyllisyys laboratorioeläimillä [9], [10]. Gmailin sponsoroimia mainoksia ovat helposti pois rypäleiden siemeniä, ja ovat sekoitus dimeerit, tetrameerit ja oligomeerit monomeerisen katekiinit ja /tai (-) – epikatekiinit [9], [10]. Gmailin sponsoroimia mainoksia on osoitettu olevan anti-inflammatorisia, antioksidantti ja anti-metastaattisen ominaisuuksia sekä

in vitro

ja

in vivo

mallit [8] – [12]. Ne estävät ultravioletti säteily- ja kemialliset karsinogeeni aiheuttama ihon syövän syntymistä hiiren malleissa [9], [13]. Äskettäin olemme osoittaneet, että ravinnon antaminen Gmailin sponsoroimia mainoksia, joilla AIN76A ohjaus ruokavalio aiheutti annoksesta riippuvan kasvun eston ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä tuumoriksenografteja [14]. Gmailin sponsoroimia mainoksia estää invasiivisia potentiaali melanooman sekä pään ja kaulan okasolusyöpä soluissa arvioitiin käyttämällä

in vitro

malleissa [11], [12]. Kuitenkin anti-karsinogeenisuutta Gmailin sponsoroimia mainoksia vastaan ​​haimasyöpä on paljolti hyödyntämättä.

fosfatidyyli 3′-kinaasi (PI3K) /Akt-reitti on perustavanlaatuinen signalointireitin, joka välittää useita solu- prosesseja, myös solujen jakautumista, kasvua , solujen selviytymisen ja liikkuvuus [15]. Lisääntynyt aktivointi ja vapautuminen komponenttien PI3K /Akt-reitin on yhdistetty moniin maligniteettien ja resistenssin kemoterapiaa [16]. Akt on hyvin tunnettu seriini /treoniini-kinaasi. Lisääntynyt Akt-aktiivisuutta on liitetty useita erilaisia ​​syöpiä, joissa se edistää solujen eloonjäämistä kautta vaikutuksia lukuisia alavirran tavoitteita, mukaan lukien inaktivaatio pro-apoptoottisten proteiinien aktivaatio anti-apoptoottisten geenien ja etenemistä solusyklin [17]. Aktivointi Akt on yleinen tapahtuma haimasyövän ja liittyy huono ennustetekijöiden muuttujat ja tulokset [18] – [20]. Eräs tutkimus osoitti, että 59% haiman adenokarsinooman osoitti hyperactivation Akt [18]. Jotkut tutkimukset osoittavat, että esto PI3K /Akt-reitin herkistää haimasyövän solujen apoptoottista vaikutusta kemoterapiaa sekä

in vitro

ja

in vivo

[21] – [23].

Tässä tutkimuksessa, arvioimme kemoterapeuttisen vaikutuksen Gmailin sponsoroimia mainoksia on haimasyövän käyttäen MiaPaca-2, PANC-1 ja AsPC-1 ihmisen haimasyövän solulinjoissa kuin

in vitro

soluviljelymalleissa. Voit tarkistaa

in vitro

data, teimme

in vivo

-tuumoriksenografti tutkimuksia. Tuloksemme osoittavat, että hoito haimasyövän soluja Gmailin sponsoroimia mainoksia johtaa soluproliferaation inhibointi, apoptoosin induktio ja inhibitio PI3K /Akt-reitillä.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

ensisijainen vasta-aineet saatiin seuraavasti: spesifisiä vasta-aineita Bax, Bcl-2, Bcl-xl, pilkottiin kaspaasi-3, PI3K, Akt, p-Akt ja β-aktiini ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA); Sykliini B1, CDC25B, Cdc25c, Ki-67, ja toisen vasta-aineita, jotka on piparjuuriperoksidaasia-konjugoitua, ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). PI3K siRNA pakki hankittiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Anneksiini V-konjugoitu AlexaFluor488 Apoptosis Detection Kit ostettiin Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Proteiini iinianalyysikitissä oli Bio-Rad (Hercules, CA). MTT (3- [4,5-dimetyyli-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi), ja kaikki muut kemikaalit olivat analyyttistä laatua ja ostettiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Gmailin sponsoroimia mainoksia saatiin Kikkoman Corporation (Japani). Kemiallinen koostumus ja vakaus Gmailin sponsoroimia mainoksia on kuvattu aikaisemmin [9], [10].

Solut ja viljelyolosuhteet

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa, AsPC-1, PANC-1 ja MiaPaca -2, saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD), ja viljeltiin, kuten suositellaan yksittäiskerroksina DMEM täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT), 100 ug /ml penisilliiniä ja 100 ug: /ml streptomysiiniä Invitrogen (Carlsbad, CA) kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. Gmailin sponsoroimia mainoksia liuotettiin pieneen määrään dimetyylisulfoksidia (DMSO, 100 ui) ennen lisäämistä median. Enimmäispitoisuus DMSO media ei ylitä 0,1% (v /v). Solut, jotka käsitelty pelkästään DMSO toimi ajoneuvon ohjaus.

Solujen elinkelpoisuus ja solukuoleman määritykset

vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia elinkelpoisuudesta haimakarsinooma solujen määritettiin käyttäen MTT-määritystä kuten aiemmin on kuvattu [24 ]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin kanssa tai ilman Gmailin sponsoroimia mainoksia 24 ja 48 tuntia. Lopussa määrätyn ajan, soluja käsiteltiin 50 ui 5 mg /ml MTT: n ja tuloksena formatsaanikiteet liuotettiin 150 ul: aan DMSO: ta. Värin absorbanssi kirjattiin 540 nm käyttäen Bio-Rad 3350 mikrolevynlukijaa. Vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia solujen elinkelpoisuus laskettiin suhteessa kontrolli- prosentti, joka on mielivaltaisesti arvo 100% elinkelpoisuuden. Gmailin sponsoroimia mainoksia solukuolema määritettiin käyttäen trypaanisinivärin syrjäytymisen määritystä kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin kanssa tai ilman Gmailin sponsoroimia mainoksia 24 ja 48 tuntia. Tämän jälkeen solut otettiin talteen, käsiteltiin 0,25% trypaanisinivärin ja soluja, jotka oli otettu väriaine laskettiin mikroskoopilla hemosytometrillä. Gmailin sponsoroimia mainoksia solukuolema on ilmaistu keskiarvona ± SD prosenttiosuus kuolleet solut kussakin hoitoryhmässä kolmesta kokeiden toisto.

Solusyklianalyysiä

MiaPaca-2 ja PANC-1-soluja käsiteltiin eri pitoisuus Gmailin sponsoroimia mainoksia (0, 20, 40 ja 60 ug /ml) täydellisessä väliaineessa 48 tuntia. Sitten solut kerättiin ja prosessoitiin solusyklin analyysi, kuten aikaisemmin on yksityiskohtaisesti kuvattu [24]. Lyhyesti, 1 x 10

5-solut suspendoitiin uudelleen 50 ul: kylmässä PBS: ssä, johon 450 ui kylmää metanolia lisättiin, ja soluja inkuboitiin sitten 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Sentrifugoinnin jälkeen pelletti inkuboitiin RNaasi A: n (20 ug /ml) 30 min. Soluja inkuboitiin propidiumjodidilla (50 ug /ml) jäissä pimeässä. Solusyklin jakautumisen solujen määritettiin sitten käyttämällä FACS Calibur väline (BD Biosciences, San Jose, CA) varustettu Cell Quest 3.3 ohjelmiston Core Facility UAB Kattava Cancer Center.

Apoptoottista solukuolemaa analyysi virtaussytometrillä

Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoimaa apoptoottista solukuolemaa haiman syöpäsoluissa määritettiin kvantitatiivisesti virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V-konjugoidun Alexa fluor 488 Apoptosis Detection Kit seuraten valmistajan protokollaa, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun solujen käsittely Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia, solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja inkuboitiin anneksiini V Alexa fluor488 (Alexa488) ja propidiumjodidia 10 minuutin ajan pimeässä. Värjätyt solut analysoitiin sitten fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelua käyttäen FACSCalibur välineen (BD Biosciences) ja Cell Quest 3.3 ohjelmistoa.

Western blot-analyysi

hoidon jälkeen haimasyövän soluja tai ilman Gmailin sponsoroimia mainoksia solut otettiin talteen, pestiin kylmällä PBS: llä, ja lyysattiin jääkylmällä lyysipuskurilla täydennetty proteaasi-inhibiittoreita, kuten aikaisemmin on yksityiskohtaisesti kuvattu [24]. Western blot -analyysiä varten proteiinit erotettiin 10% Tris-glysiini-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Sen jälkeen, kun esto ei-spesifisiä sitoutumiskohtia, kaivoa inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Sitten membraania inkuboitiin sopivan piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen ja immunoreaktiivisen proteiinin juovat visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- reagensseja (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Sitten membraania tislattiin ja uudelleenseulottiin anti-β-aktiini-vasta-aine, sen varmistamiseksi, yhtä suuri kuin proteiinin loading geelillä.

Eläimet ja ksenograftimallissa

nainen kateenkorvattomia nude-hiirten 4-5 viikkoa ja ikä hankittiin National Cancer Institute (Bethesda, MD) ja sijoitettu Animal Resource Facility University of Alabama at Birmingham mukaisesti Institutional Animal Care ja Käytä komitean ohjeita. Eläin protokollaa käytetään tässä tutkimuksessa hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja University of Alabama at Birmingham, ja eläin protokolla numero on: 101109267. Hiiret varustettu steriloitu AIN76A ruokavalion ja vesi

mielin määrin

. Määrittää

in vivo

kemoterapeuttisten ravintokuidun tehokkuudesta Gmailin sponsoroimia mainoksia ihmisen haiman -tuumoriksenografti kasvua, eksponentiaalisesti kasvava MiaPaca-2-solut (5 x 10

6 100 ui PBS) injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen kunkin hiiren. Yksi päivä tuumorisolujen inokulaation jälkeen eläimet jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään, jossa on kahdeksan hiirtä ryhmää kohti. Yksi ryhmä hiiriä sai AIN76A ohjaus ruokavalio, kun taas toinen ryhmä hiiret saivat 0,5% Gmailin sponsoroimia mainoksia täydennetty AIN76A kontrolliruokavaliota pelletteinä koko kokeen ajan. Kokeilu lopetettiin klo 11

th viikko kasvainsoluinokulaation jälkeen. Kasvain kasvun ja kehon paino per hiiri viikossa kirjattiin. Tuumorin koko mitattiin käyttäen Vernier ja tilavuudet laskettiin käyttäen hemiellipsoid malli kaavaa: tuumorin tilavuus = ½ (4π /3) (l /2) (w /2) h, jossa l = pituus, w = leveys ja h = korkeus . Perustuen IACUC suuntaviivoja, kasvaimen koko ei saisi lisätä enintään 1,5 cm

2 tai koko penniäkään. Tässä vaiheessa, koe lopetettiin, hiiret tapettiin, kasvaimen kustakin hiirestä leikattiin ja märkäpaino kunkin kasvaimen kussakin ryhmässä kirjataan. Osa kasvaimen käytettiin valmistettaessa kasvaimen lysaatit western blot-analyysi ja muut osa kudosta parafinoidut ja käyttää immunohistokemiallista analyysia varten.

immunohistokemiallinen tunnistus Ki-67-positiivisia, p-Akt -positiivinen ja aktivoitu kaspaasi-3-positiivisten solujen

parafinoidut kasvaimen osat (5 pm paksu) poistettiin parafiini ja rehydratoitiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Seuraavat nesteytystä, antigeeni haku suoritettiin sijoittamalla objektilasit 10 mmol /l natriumsitraattia (pH 6,0) 95 ° C: ssa 20 min, jota seurasi 20 minuutin jäähdytyksen. Sitten leikkeet pestiin PBS: llä ja ei-spesifisiä sitoutumiskohtia blokattiin 1% naudan seerumin albumiinia ja 2% vuohen seerumilla PBS: ssä ennen inkubointia joko anti-Ki-67, anti-p-Akt tai anti-lohkaistaan ​​kaspaasi-3 vasta-aine. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen ja sen jälkeen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua streptavidiinia. Leikkeet inkuboitiin edelleen 2,4-diaminobentsidiinillä alustan ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Ki-67-positiivisia ja halkaistut kaspaasi 3-positiivisten solujen osassa laskettiin ainakin 4-5 eri alojen ja valokuvattiin käyttäen Olympus mikroskooppia (malli BX40F4, Tokio, Japani) varustettu Q-väri 5 Olympus kamera.

TUNEL määritys apoptoottisten solujen

TUNEL Testi suoritettiin käyttäen DeadEnd

TM Kolorimetrinen TUNEL System Kit (Promega Corporation, USA) valmistajan protokollaa. Lyhyesti, sen jälkeen, kun antigeeni haku, kasvaimen osat (5 pm paksu) kiinteään inkuboimalla 4% paraformaldehydillä 4 ° C: ssa. Permeabilisoitujen leikkeitä inkuboitiin terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi rekombinantti (TTKK) entsyymikatalysoitu reaktio, ja nukleotidin seosta 60 minuuttia 37 ° C: ssa pimeässä. Upottamisen jälkeen stop /pesupuskurissa 15 minuuttia huoneenlämmössä, leikkeitä pestiin PBS: llä poistamiseksi rekisteröimätön fluoreseiini-12-dUTP ja ytimet vastavärjättiin hematoksyliinillä. TUNEL-positiivisia soluja tutkittiin ja laskettiin mikroskoopilla. TUNEL-positiivisia soluja ilmaistaan ​​prosentteina koko solujen mikroskooppisen kenttään.

Tilastollinen

tilastollinen merkitys erotusta valvonta- ja hoitoryhmien määritettiin joko Student

t

testi tai yksinkertaisesti yksisuuntaista ANOVA seurasi Tukeyn

post hoc

testi monimuuttujille käyttäen GraphPad Prism versio 4.00 Windowsille, GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA, www. graphpad.com. Kussakin tapauksessa,

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Gmailin sponsoroimia mainoksia estävät elinkelpoisuutta ja aiheuttaa kuoleman haimasyöpäsoluissa

antiproliferatiivinen vaikutukset Gmailin sponsoroimia mainoksia on haimasyövän solulinjoissa, MiaPaca-2, PANC-1 ja AsPC-1, määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Gmailin sponsoroimia mainoksia (0, 10, 20, 40 ja 60 ug /ml) 24 ja 48 tuntia. Annoksesta riippuva väheneminen elinkelpoisuutta MiaPaca-2-solujen havaittiin, että vaihtelivat 2 35% (

P

0,05) 24 tunnin kuluttua, ja 20: sta 60% (

P

0,01) 48 tunnin kuluttua hoidon Gmailin sponsoroimia mainoksia, kuten on esitetty kuviossa 1A. Identtisissä olosuhteissa, samankaltaisia ​​vaikutuksia Gmailin sponsoroimia mainoksia havaittiin hoitoon PANC-1 ja AsPC-1-soluissa (kuvio 1 B ja 1C, vasen paneeli), paitsi että Gmailin sponsoroimia mainoksia aiheuttama väheneminen elinkelpoisuutta AsPC-1-soluja oli vähemmän kuin mitä havaittiin muiden solulinjojen. Olemme myös päättäneet sytotoksista vaikutusta Gmailin sponsoroimia mainoksia on haimasyövän solulinjoissa suhteen solukuoleman käyttäen trypaanisinivärin syrjäytymisen määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa 1A (oikea paneeli), verrattuna ei-Gmailin sponsoroimia mainoksia-käsiteltyjen kontrollisolujen, hoito MiaPaca-2-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia johti merkittävään ja annoksesta riippuva nousu solukuoleman. Hoito 24 tuntia johti 5-28% (

P

0,05) lisäys solukuoleman, kun taas käsittely 48 h johti 9-38% (

P

0,05 -0,001) solukuolemaa. Käyttäen identtisiä olosuhteita, samankaltaisia ​​sytotoksisia vaikutuksia havaittiin hoidettaessa PANC-1 ja AsPC-1-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia (kuvio 1B ja 1C, oikea paneeli).

(A) MiaPaca-2-solut, (B) PANC -1-soluja, ja (C) AsPC-1-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla Gmailin sponsoroimia mainoksia varten osoitetun ajanjaksoja. Vasen paneeli: solujen elinvoimaisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot ilmaistaan ​​prosentteina vertailusta soluja (ei-Gmailin sponsoroimia mainoksia käsitelty) keskiarvona ± SD 8 rinnakkaista. Oikea paneeli: sytotoksinen vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia haiman syöpäsoluissa määritettiin käyttäen trypaanisinivärin syrjäytymisen määritystä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Solukuolemaa tiedot esitetään keskiarvona prosenttia kuolleiden solujen kolmesta kokeesta ± SD

vs.

Kontrolliryhmän (ei Gmailin sponsoroimia mainoksia-käsitelty). Merkittävä ero

vs.

Kontrolliryhmään,

*

P

0,001;

**

P

0,05.

Gmailin sponsoroimia mainoksia aiheuttaa G2-M-faasin solukierron pysähtymisen haiman syöpäsoluissa

Häiriöt normaalin solu- cycle etenemistä ja jako ovat tärkeitä tapahtumia syövän kehittymiseen. Määrittää mahdolliset mekanismit anti-proliferatiiviset vaikutukset Gmailin sponsoroimia mainoksia, solusyklin analyysi tehtiin käyttäen MiaPaca-2 ja PANC-1-solulinjoja käsiteltiin 20, 40 tai 60 ug /ml Gmailin sponsoroimia mainoksia. Kuten kuviossa 2A on esitetty, sen jälkeen, kun hoito MiaPaca-2-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia oli huomattavasti suurempi määrä solujen G2-M-faasin kaikilla käytetyillä pitoisuuksilla: 20 ug /ml: lla (15,5%,

P

0,05), 40 ug /ml: lla (23,9%,

P

0,01) ja 60 ug /ml: lla (29,4%,

P

0,001), verrattuna ei-Gmailin sponsoroimia mainoksia-käsiteltyihin kontrolleihin (5,9%). Tällä 24 tunnin ajan pisteen vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia on G2 /M solukierron pysähtymisen oli merkittävästi pienempi kuin mitä havaittiin käsittelyn jälkeen 48 tuntia. Samanlaisia ​​vaikutuksia Gmailin sponsoroimia mainoksia on G2 /M vaiheessa pidätyksen löydettiin käyttäen PANC-1-solulinjassa (kuvio 2B). Me seuraavaksi määritetään vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia solusyklin säätelyproteiineja mukana G2 /M-vaiheen solusyklin etenemisen. Tulokset Western blotting osoitti, että hoito MiaPaca-2 ja PANC-1-solujen kanssa erilaisina pitoisuuksina Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia aiheutti annoksesta riippuvaa vähenemistä sykliini B1 ilmaisu sekä vähentää ekspressiotasot CDC25B ja Cdc25C proteiineja, jotka säätelevät G2 /M-vaiheen solusyklin (kuvio 2C).

MiaPaca-2 ja PANC-1-soluja käsiteltiin joko vehikkelillä (0,1% DMSO) tai Gmailin sponsoroimia mainoksia (20, 40 ja 60 ug /ml) täydellisessä väliaineessa. 48 tunnin kuluttua hoidon jälkeen solut otettiin talteen ja hajotettiin RNaasi. Solujen DNA värjättiin propidiumjodidilla ja virtaussytometria-analyysi suoritettiin analysoida solusyklin jakautumisen, niin kuin kohdassa Materiaalit ja menetelmät. Edustaja solusyklin histogrammit kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta in MiaPaca-2 (A) ja PANC-1 (B) solujen käsittelyn jälkeen eri annoksilla Gmailin sponsoroimia mainoksia näytetään. (C) vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia on G2 /M vaiheessa solusyklin sääntelyn proteiinien MiaPaca-2 ja PANC-1-soluissa. Soluja käsiteltiin joko vehikkelillä tai Gmailin sponsoroimia mainoksia (20, 40, 60 ug /ml DMSO: ssa) 48 tunnin ajan ja sen jälkeen talteen, solujen lysaatit valmistettiin ja sitten SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot-analyysit eri proteiineja. β-aktiini käytettiin tarkistaa yhtä suuri lastaus näytteitä. Edustavia blots kolmesta yksittäisestä kokeesta esitetään.

Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoida haimasyöpäsoluissa

tutkia väheneminen solujen elinkelpoisuuden ja induktio G2 /M vaiheessa pidätyksen ihmisen haiman syöpäsolujen Gmailin sponsoroimia mainoksia hoidon, jotka liittyvät apoptoosin induktion, The MiaPaca-2 ja PANC-1-soluja käsiteltiin vaihtelevilla Gmailin sponsoroimia mainoksia ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen arvioitiin käyttäen Alexa488 apoptoottinen Detection Kit. Apoptoottista solukuolemaa määritettiin kannalta varhaisen tai myöhäisen vaiheen apoptoottisia soluja, jotka on esitetty vastaavasti oikeassa alakulmassa (LR) ja ylhäällä oikealla (UR) neljänneksessä FACS histogrammien (kuvio 3A). Käsittelemällä MiaPaca-2 ja PANC-1-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia aiheutti merkittävän apoptoosin induktioon molemmissa solulinjoissa. Prosenttiosuudet yhteensä apoptoottisten solujen (UR + LR kvadrantissa) in MiaPaca-2-soluissa sen jälkeen, kun Gmailin sponsoroimia mainoksia olivat seuraavat: 5,2% (apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään), 16,6% (20 ug /ml,

P

0,01), ja 35,8% (60 ug /ml,

P

0,001), joista esitetään yhteenveto paneeli B . Samanlaisia ​​Gmailin sponsoroimia mainoksia-apoptoosin induktio havaittiin, kun PANC-1-soluja käsiteltiin Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia, kuten on esitetty kuviossa 3A ja 3B.

(A) MiaPaca-2 ja PANC-1-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Gmailin sponsoroimia mainoksia (0, 20, 40 ja 60 ug /ml) täydellisessä väliaineessa 48 h, sitten talteen analyysiä varten apoptoottisten solujen FACS-analyysillä käyttämällä anneksiini V-Alexa Fluor488 Apoptosis Vybrant Assay Kit (Alexa488) jälkeen valmistajan protokollaa. Alempi oikea (LR) neljänneksessä FACS histogrammien ilmaisee prosenttiosuuden varhaisen apoptoottisten solujen (Alexa488-värjättyjen solujen) ja oikeassa yläkulmassa (UR) neljänneksessä ilmaisee prosenttiosuuden myöhään apoptoottisten solujen (Alexa488 + propidiumjodidista-värjäytyneiden solujen). (B) kokonaismäärä prosentteina apoptoottisten solujen kussakin hoitoryhmässä 48 tunnin jälkeen on koottu tietoja esitetään keskiarvona ± SD kahdesta kokeesta. Merkittävä ero

vs.

Kontrolliryhmään (ei Gmailin sponsoroimia mainoksia-käsitelty), *

P

0,001; **

P

0,05. (C) Käsittelemällä MiaPaca-2 ja PANC-1-solujen kanssa erilaisina pitoisuuksina Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia johtaa annoksesta riippuvainen väheneminen ekspressiotasot anti-apoptoottiset proteiinit (Bcl-2 ja Bcl-xl) ja samalla kasvattaa ekspression pro-apoptoottisen proteiinin Bax. Gmailin sponsoroimia mainoksia myös lisätä aktivointitason kaspaasi-3-soluissa.

vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia on proteiinien Bcl-2-perheen haiman syöpäsoluissa

jäsenet Bcl-2-perheen proteiinien pelata ratkaiseva rooli apoptoosin säätelyyn toimimalla edistäjinä tai inhibiittorit solukuoleman [26] – [28]. Western blot analyysi paljasti, että hoito MiaPaca-2-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia (20, 40, 60 ug /ml) 48 h johti annoksesta riippuvaa vähenemistä Bcl-2 ja Bcl-xl-proteiinin ilmentymistä (kuvio 3C), kun taas ilmaisu Bax oli selvästi säädelty kasvavien pitoisuuksien kanssa Gmailin sponsoroimia mainoksia (kuvio 3C). Samanlainen vaikutus on Gmailin sponsoroimia mainoksia on proteiinien Bcl-2-perheen havaittiin myös, kun PANC-1-soluja käsiteltiin Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia. Koska halkaistut kaspaasi 3 pidetään tunnusmerkki apoptoosin, myös määritti Gmailin sponsoroimia mainoksia on katkaistun kaspaasi-3: Näiden näytteiden ja vahvisti, että Gmailin sponsoroimia mainoksia lisääntynyt aktivointi tai katkaisun kaspaasi-3 sekä MiaPaca-2 ja PANC -1 soluja (kuvio 3C).

Gmailin sponsoroimia mainoksia estää PI3K /Akt ilmentymistä syöpäsoluissa

Koska PI3K /Akt-signalointireitin on kriittinen rooli syövän solujen selviytymisen ja kehityksen syöpien, me tutki vaikutuksia Gmailin sponsoroimia mainoksia tästä solujen elossapysymisreitin. MiaPaca-2 ja PANC-1-soluja käsiteltiin Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia, solulysaatit valmistettiin ja tasot PI3K ja fosforylaation Akt Ser

473 määritetään Western blot -analyysillä. Tulokset paljastivat, että hoito näiden solulinjojen Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia laski tasot sekä sääntelyn (P85) ja katalyyttinen (p110) alayksiköt PI3K ja vähensi myös fosforylaatiota Akt Ser

473 konsentraatiosta riippuva tavalla (kuvio 4A). Kuten on tunnettua, että Akt-aktiivisuutta säätelee yleensä PI3K, me Lisäksi todennettiin, että Akt säätelevät PI3K haiman syöpäsoluja. Tätä tarkoitusta varten olemme tippuu alas PI3K in MiaPaca-2 ja PANC-1-soluissa käyttäen PI3K siRNA Kit (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) valmistajan protokollaa. Kuten on esitetty kuviossa 4B, Western blot-analyysi osoitti, että siRNA pudotus PI3K johti huomattavasti vähennettyä p-Akt sekä MiaPaca-2 ja PANC-1-soluissa. Kuitenkin vaikutus koko Akt ilmentymistä ei havaittu näissä solulinjoissa on siRNA knockdovvn PI3K. Pudotus PI3K-proteiinien varmistettiin myös käyttämällä western-blottauksella.

(A) Käsittelemällä MiaPaca-2 ja PANC-1-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia vähentää ilmentymisen taso PI3Kp85 (sääntely) ja PI3Kp110 (katalyyttinen), ja fosforylaatio Akt annoksesta riippuvalla tavalla. Hoidon jälkeen 48 tuntia, solut kerättiin, ja solujen lysaatit altistettiin Western blot -analyysillä ekspression määrittämiseksi eri proteiineja. β-aktiini käytetään varmistamaan yhtä suuri kuormitus proteiinin näytteitä. (B) siRNA pudotus PI3K haiman syöpäsoluissa johti vähentäminen p-Akt tasot verrattuna siRNA kontrolliryhmään.

Ravinnon Gmailin sponsoroimia mainoksia kasvun estämiseksi haiman ksenograftien kateenkorvattomissa nude-hiirissä

Koska nämä

in vitro

tutkimukset osoittivat, että hoitoon haimasyövän soluja Gmailin sponsoroimia mainoksia vähentää elinkelpoisuus ja indusoi apoptoosia näissä soluissa, etsimme onko ravinnon anto Gmailin sponsoroimia mainoksia inhiboi

in vivo

kasvaimen kasvua käyttämällä ksenograftin hiirimallissa. Koska terapeuttinen vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia on MiaPaca-2 ja PANC-1 solulinjat identtiset, valitsimme MiaPaca-2 solulinjan näille

in vivo

tutkimuksissa. Aiemmissa tutkimuksissa olemme myös havainneet, että ruokavalion Gmailin sponsoroimia mainoksia annoksella 0,5% indusoi merkittävää kasvua estäviä vaikutuksia kasvainten [9], [29], valitsimme tämä annos Gmailin sponsoroimia mainoksia edelleen

in vivo

tutkimuksessa. Hiirille annettiin AIN76A verrokkiruoalla yksin tai samaa ruokavaliota oli täydennetty Gmailin sponsoroimia mainoksia (0,5%, w /w). Keskimääräinen kehonpainot Gmailin sponsoroimia mainoksia käsiteltyjen ja ei-Gmailin sponsoroimia mainoksia-käsitellyissä hiirissä olivat verrattavissa koko koejakson aikana (tuloksia ei ole esitetty). Vastaavasti hiirillä, jotka saivat Gmailin sponsoroimia mainoksia niiden ruokavalio eivät osoittaneet mitään fyysistä merkkiä toksisuudesta tai epänormaalia käyttäytymistä (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot viittaavat siihen, että anto Gmailin sponsoroimia mainoksia ruokavalion käytetyn pitoisuuden näissä tutkimuksissa ei liity ilmeistä brutto myrkyllisyys.

Weekly mittaus Kasvaimen tilavuuden osoitti, että keskimääräinen kasvaimen kasvu mitattuna kasvaimen kokonaistilavuus /hiiri oli suurempi kuin Gmailin sponsoroimia mainoksia hoidetuissa hiirissä kuin Gmailin sponsoroimia mainoksia hoidetuissa ryhmissä. Kuten kuviossa 5A, hiirillä, jotka saivat Gmailin sponsoroimia mainoksia annoksella 0,5% niiden ruokavalioon, kasvaimen tilavuus päättymisen kokeilu oli 64% (

P

0,005) vähemmän. Koe lopetettiin 11

th viikon kuluttua kasvainsolujen istutuksen. Tällä hetkellä hiiret tapettiin, tuumorit kerättiin ja märkä tuumorin paino /hiiri kussakin hoitoryhmässä on tallennettu. Kuten kuviossa 5A (oikea paneeli), märkä paino kasvaimia oli 68% alempi (

P

0,005) hiirillä annettiin 0,5% Gmailin sponsoroimia mainoksia ruokavaliossa verrattuna kasvaimia ei-Gmailin sponsoroimia mainoksia käsitellyssä hiirissä.

(A) antaminen ravinnon Gmailin sponsoroimia mainoksia (0,5%, w /w) inhiboi kasvua MiaPaca-2-soluja kasvatettiin, kuten ksenograftien kateenkorvattomissa nude-hiirissä. Keskimääräinen kasvaimen tilavuus ± SD /hiiri (mm3) kussakin hoitoryhmässä mitattiin viikoittain. -tuumoriksenografti Kudokset kerättiin päättyessä kokeilun 11 viikon ajan ja märkä tuumorin paino /hiiri kussakin ryhmässä on ilmoitettava grammoina keskiarvona ± SD. Tilastollinen merkitsevyys ero valvonnan ja Gmailin sponsoroimia mainoksia-käsiteltyjen ryhmien analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin

t

testi, n = 8. tilastollista merkittävyyttä

vs

kasvaimia ei-GSPs- käsiteltyihin kontrollihiiriin, *

P

0,005. (B) Immuunihistokemialliset havaitseminen TUNEL-positiivisten solujen -tuumoriksenografti kudoksissa hiirissä Gmailin sponsoroimia mainoksia ruokavaliossa ja hiiret eivät saaneet Gmailin sponsoroimia mainoksia näytetään, ja tuloksena tiedot TUNEL-positiivisia soluja tiivistää. (C) immunohistokemiallinen tunnistus aktivoituu kaspaasi-3-positiivisten solujen -tuumoriksenografti kudoksissa Gmailin sponsoroimia mainoksia-käsiteltyjen ja ei-Gmailin sponsoroimia mainoksia-käsitellyissä hiirissä. Immunohistokemialliset tietojen suhteen positiivisten solujen prosenttiosuuden esitetään keskiarvona ± SD 5-6 kasvain näytteet kustakin ryhmästä. TUNEL-positiivisia tai kaspaasi-3-positiiviset solut laskettiin neljällä viidelle eri aloilla, ja tiedot on esitetty yhteenvetona suhteen positiivisten solujen prosenttiosuutta 5-6 -tuumoriksenografti näytteitä. Edustavia micrographs näytetään. (D) ravinnon Gmailin sponsoroimia mainoksia ilmentymisen inhiboimiseksi anti-apoptoottisten proteiinien ja lisäävät ilmentymistä pro-apoptoottisen proteiinin, Bax, ja tasot aktivoitu kaspaasien-3 -tuumoriksenografti kudoksissa. Kasvaimen lysaatit valmistettiin tuumoriksenografteja kerätään kokeiden päättyessä on kuvattu kuviossa 5A, ja suoritettiin Western blot-analyysi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Edustavia blotit esitetään riippumattomista kokeista vähintään viidestä kasvaimia viidestä eri hiirtä ryhmää kohti identtisillä havaintoja.

Ruokavalion Gmailin sponsoroimia mainoksia parantaa apoptoottista solukuolemaa haiman kasvainsolujen ksenografteissa

onko tuumorin kasvua ravinnon Gmailin sponsoroimia mainoksia on aiheuttanut kuoleman kasvainsolujen Ksenograftikudoksista, arvioimme vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia apoptoottiseen indeksiin kasvainsolujen ksenografti näytteistä käyttäen TUNEL-määritystä.