Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet yli-ilmentyminen musiinituoton 1 (MUC1) eri epiteelin karsinoomien ja sen rooli kasvainten synnyssä. Nämä musiineilla esittää uusi kohdentaminen mahdollisuus nanohiukkasten välittämän photothermal syövän hoitomuotoja johtuen niiden ainutlaatuisen antennin kaltainen solunulkoisen laajennus. Tässä tutkimuksessa MUC1-vasta-aineita ja albumiini immobilisoitiin pinnalle kultaa nanorods käyttämällä ”Aluke” on polydopamine (PD), jonka molekyylipaino jäljittelee katekoli ja amiini-rikas simpukan adheesioproteiinit. PD muodostaa liima alustan laskeuman albumiinin ja MUC1-vasta-aineita, saavuttaa pinta, joka on vakaa, bioinert ja biofunctional. Kahden fotonin luminesenssi konfokaali ja darkfield hajonta kuvantaminen paljasti kohdistaminen MUC1-BSA-PD-NR on MUC1

+ MCF-7 rintasyöpä ja SCC-15 levyepiteelikarsinooma solujen linjat. Käsitellyt solut altistettiin laser käsittää lähi-infrapuna-AuNR pitkittäinen pintaplasmoniresonanssilla ja arvioitiin photothermal ablaatiota. MUC1-BSA-PD-NR väheni huomattavasti solujen elinkelpoisuutta photoirradiated MCF-7-solulinjoissa vs. MUC1- MDA-MB-231-rintasyöpäsoluissa (p 0,005). Agents esillä sytotoksisuutta ilman photothermal hoidon. Facile luonne päällystysmenetelmä yhdistettynä kohdentaminen ja fotoablaation tehoa, ovat houkuttelevia piirteitä näistä ehdokas syövän nanotherapeutics.

Citation: Zelasko-Leon DC, Fuentes CM, Messersmith PB (2015) MUC1-Kohdennettu Cancer Cell Photothermal ablaatio käyttäminen Bioinspired Gold nanorods. PLoS ONE 10 (7): e0128756. doi: 10,1371 /journal.pone.0128756

Editor: Bing Xu, Brandeis University, Yhdysvallat |

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2015 Hyväksytty: 01 toukokuu 2015; Julkaistu: 06 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Zelasko-Leon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Imaging työ tehtiin Northwestern University Center for Advanced molekyylikuvantamisen (CAMI), anteliaasti tukemana NCI CCSG P30 CA060553 myönnetty Robert H. Lurie Kattava Cancer Center. Osa tämän tutkimuksen suoritettiin Keck-II ja EPIC ytimet Northwestern University Atomic ja nanomittakaavan karakterisointi Experimental (NUANCE) keskus. NUANCE Center tukee MRSEC ohjelman (NSF DMR-1121262) on Material Research Center, International Institute for Nanoteknologia (IIN), Keck Foundation, ja valtion Illinoisin. Lisämateriaalia luonnehdinta kokeet carrieed ulos tuella Northwestern University High Throughput laboratorio (HTAL) ja Keck biofysiikan Facility. Tätä työtä tukee lisäksi Northwestern University virtaussytometria Facility ja Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). DCZL tukivat National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-0824162, https://www.fastlane.nsf.gov/grfp) ja Malkin Scholar Award Robert H. Lurie Kattava Cancer Center (RHLCC) Northwestern University (https://cancer.northwestern.edu/research/research_programs/funding/). CMF tukivat McCormick Summer Research Award (https://www.mccormick.northwestern.edu/students/undergraduate/research-opportunities/). Lisätukea saatiin NIH apurahoja R01 EB005772 ja R37 DE014193 (PBM, https://report.nih.gov/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Au nanorods (AuNRs) ovat erittäin houkuttelevia konstruktioita tuumorin hoitoon johtuen niiden synteesin helppous, viritettävän lähi-infrapuna (NIR) paikallinen pintaplasmoniresonanssi (LSPR), ja suuri, functionalizable pinta-alat [1, 2 ]. LSPR parantaa optisia ominaisuuksia, jotka aiheuttavat korkean absorbanssi, sironta, ja kahden fotonin luminesenssi ilmiöitä, jotka voidaan hyödyntää photothermal syövän hoitoon ja diagnostisen kuvantamisen [1, 2, 3]. Potilaat, joilla on huono kasvain marginaaleja tai mikroskooppisia sairaus voi olla huono ehdolla invasiivisia kirurgisia toimenpiteitä ja hyötyvät parannettu multimodaalinen lähestymistavoista [1]. Ei-invasiivisen tunkeutuminen NIR energiaa AuNR saaneista kudosten sallii lokalisoitu hypertermia jolloin kasvain ablaatio. Lisäetuna, tämä lämmitys voidaan parantaa kudosperfuusio, lisäämällä myöhemmin nanohiukkasten lastaus ja tehoa adjuvanttihoitoa tai säteilyä [4, 5].

Ensisijainen haaste AuNR perustuvia hoitoja liittyy muuttamalla tai korvaamalla alustava CTAB kaksikerroksiset pintakäsittelyyn, joka on sekä bioinert ja biofunctional [6]. Erilaisia ​​passivointi strategiat on kehitetty tämän ongelman voittamiseksi. Nämä strategiat ovat modifikaatio amfifiilinen synteettiset polymeerit, kuten poly (etyleeniglykoli) -thiols (PEG-SH) [7], lipidien [8], sähköstaattiset kerrokset polyanionisten ja polykationisia polymeerejä, [9], ja viimeksi, proteiinit [10, 11]. Havaittu kehitys proteiinin korona seuraavat nanohiukkasten kontakti seerumin sisältävistä biologisista media on tukenut kiinnostusta albumiinin mahdollisena nanohiukkasten passivointi agentti [11].

Transmembraaniset musiineilla runsaasti glykosyloituja proliini, treoniini, ja seriini verkkotunnuksia span epiteelin solukalvon ja saattavat estää toimintoa ektodomeenit jotka työntyvät yli 100 nm solun pinnasta [12]. Autoproteolyysin tuottaa C-terminaalista (MUC1-C) ja N-terminaalista (MUC1-N) alayksiköistä, joista jälkimmäinen on ankkuroitu solun pinnalle stabiilin, mutta ei-kovalenttinen kompleksi MUC1-C. Vaikka musiinit ovat tyypillisesti ilmaistiin apikaalisella pinnalla solujen suojaamiseksi ympäristön toksiinit, krooninen stressi indusoi menetys solun polariteetti, joka johtaa vuorovaikutusta musiinien kanssa basolateraaliseen pinnan molekyylejä, kuten reseptorityrosiinikinaasien, liipaisu loppupään proliferaation aktivaatiota ja eloonjäämisen geenien . MUC1 ylössäädellään vastauksena inflammatoristen sytokiinien aikana tulehduksen ja infektio, mikä johtaa napaisuus ja vahvistamalla suojaustoiminta limakalvon.

Vaikka ohimenevä MUC1 aktiivisuus toimintoja vähentää tulehdusta, pitkäaikainen yliekspressio edistää aggressiivinen fenotyyppejä ihmisen syövissä. MUC1-N sisältää voimakkaasti glycoslyated tandem 20 aminohappoa, ja se on poikkeuksellisesti underglycosylated epiteelisolujen karsinoomat, paljastaen tähteet sekaantunut immuunitutkimusohjelmasta syövän [13]. MUC1-N kykenee estämään pinnan vuorovaikutusta ja voivat läpikäydä myös solusta erityksen kalvo, joka sallii reseptorin kaltainen aktivointi MUC1-C eri kasvaimen signalointireittien [12]. Merkitys MUC1 merkityksellisenä terapeuttinen tavoite on korostettu sen epätyypilliset ilmentyminen 64% karsinoomien diagnosoidaan vuosittain, ja yli 90% rintakarsinoomissa riippumatta hormoni tai kasvutekijän reseptorin asema [14].

toiminta ja hyväksikäyttö MUC1 kuin kasvaimen antigeeni on edelleen selvittämättä [15] . Huolimatta sen antenni kaltainen fyysinen ilmentymä, että periaatteessa soveltuu hyvin terapeuttiseen kohdentamista musiini-ilmentävien kasvainten [12, 16], MUC1 on alittanut kohdennettuja syövän hoidossa [17, 18, 19, 20]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että MUC1 yliekspressio välittömästi tukevaa

in vivo

muutosta maitorauhasen ja sen poikkeava ekspressio transformoiduissa soluissa voi aiheuttaa steerinen esto tai aktivoitumista solun pinnan reseptoreihin, joka toimii liikkeellepanevana voimana hyökkäys [21] ja kemoterapian resistenssin [22, 23]. Kliinisesti havaitseminen kiertävän seerumin musiinituoton tasoilla on FDA-hyväksytty ennustetekijä hoidettaessa rintasyövän [12] ja vaiheen III kliinisissä kokeissa MUC1 perustuu immunoterapioiden ovat käynnissä [24].

Tässä osoitamme polydopamine-välitteisen (PD) konjugaatio kultaa nanorods (AuNRs) naudan seerumin albumiinia (BSA) ja musiinin 1 monoklonaalisia vasta-aineita (anti-MUC1), ja passivointi ja kohdistuksen, vastaavasti (kuvio 1). Tärkeimmistä tavoitteista tätä työtä oli tunnistaa optimaaliset olosuhteet nanohiukkasten functionalization ja osoittaa toteutettavuus photothermal ablaatio MUC1 positiiviset syöpäsolut kautta biofunctionalized AuNRs. Tulokset osoittavat, optimaaliset olosuhteet pintamodifiointiasteeseen AuNRs BSA: n kanssa sekä MUC1 ainetta ja fysiologisia vakautta. Onnistunut kohdentaminen ja fotoablaation MUC1 positiivisia syöpäsolujen viittaa Näiden rakenteiden voivat olla käyttökelpoisia syövän vastaisen terapeuttisia tulevaisuudessa.

MUC1-vasta-aineita toimivat uusina kohdentaminen konstruktien soveltamista plasmonic photothermal hoidon (A). Kosketus MUC1 tavoittelemiseen underglycosylated N- ja C-terminaaliset domeenit eri epiteelin karsinoomien Laajennamme syöpään kohdistamisen ohjelmistoon mahdollisuuksia synergistisiä terapeuttisia vaikutuksia (B, muokattu [12]).

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Dopamine hydrokloridi, setyylitrimetyyliammoniumbromidi (CTAB, 99%), natrium- tetrakloroauraatti (III) dihydraattia (NaAuCl

4 · 2H

2O, 99%), natriumboorihydridiä (NaBH

4, 98%), askorbiinihappoa, glysiini, ja hopeanitraattia (AgNO

3, 99%) oli käytetty AuNR synteesiä. PH-arvo glysiiniliuosta (0,2 M), pH säädettiin arvoon 8,0 2 M natriumhydroksidilla ennen käyttöä. Kaikki reagenssit saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), ellei toisin mainita. AlexaFluor 633 vuohen anti-hiiri-immunoglobuliini (IgG) ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Anti-MUC1-N (VU4H5), anti-MUC1-N-PE (VU4H5 PE), hiiren anti-MUC1-C (H-6), vuohen anti-hiiri-HRP-IgG, vuohen anti-kani-HRP: tä IgG: tä, ja kanin anti-BSA (B-140) ensisijaisen vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vuohen anti-hiiri-IgG ja vuohen anti-kani-lgG-vasta-aineita konjugoituna PE ja /tai HRP ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ultrapuhdasta, deionisoitua vettä (18.2MΩ · cm) käytettiin valmistaa kaikki vesiliuoksia. SCC15, MCF-7 ja MDA-MB-231 syöpäsolulinjoja olivat antelias lahjoja laboratorioista tohtori David Crowe, University of Illinois-Chicago ja tohtori Dean Ho Northwestern University.

Methods

synteesi kultaa NR.

synteesi CTAB-päällystetyn AuNRs (CTAB-NR) on vakiintunut kirjallisuudessa ja suoritettiin hieman muunneltu menetelmä hyödyntää Huang ja työtoverit [2] . Kaikki reagenssit hankittiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO), ellei toisin mainita. 0,2 M CTAB vesiliuosta (5,0 ml), kuumennettiin 30 ° C: seen ja sekoitettiin 0,5 mM NaAuCl

4 (5,0 ml). Jääkylmää 0,01 M NaBH

4 (0,6 ml) lisättiin tähän seokseen ja sonikoitiin 5 minuuttia, kunnes keltainen ruskea siemen kehitetty ratkaisu. Seuraavaksi 50,0 ml 0,2 M CTAB sekoitettiin varovasti 50,0 ml: lla 1,0 mM NaAuCl

4 ja 0,1 ml 0,1 M hopeanitraatin

3 muodostamiseksi kasvua ratkaisu. Askorbiinihappoa (78,8 mM, 0,7 ml) lisättiin kasvatusliuosta lievä pelkistimenä, minkä jälkeen lisättiin 120 ui siementen liuos. 45 minuutin jälkeen, 100 ml tätä AuNR liuosta sekoitettiin 100 ml: lla 0,2 M glysiiniä (pH 8,0). Tämän liuoksen annettiin reagoida yön yli ilman sekoitusta ympäristön lämpötilassa.

Biofunctionalization kultaa NR.

synteesiä BSA-PD-NR, 1 ml: n erillä CTAB-NR sentrifugoitiin 10360

xg

10 min, jolloin muodostuu sakkaa. Supernatantti heitettiin pois ja pelletti dispergoitiin 1,0 ml: aan 10 mM Bicine-puskuria (pH 8,5), jota oli täydennetty 0,1 mg /ml dopamiini-hydrokloridi. Polydopamine pinnoite on kehitetty sonikoimalla 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. 1,0 ml liuosta, jossa oli 20 mg /ml BSA: ta PBS-liuoksessa (Ca

2+ ja Mg

2+ free) lisättiin tämän PD-NR seokseen ja annettiin reagoida vielä 30 minuuttia ultraäänen avulla. Yön yli reaktio varovasti sekoittaen, näytteitä sentrifugoitiin, dispergoitiin veteen tai PBS: llä ja säilytettiin huoneenlämpötilassa ennen jatkokäyttöä. Vasta-taivutukset, 0,25-5,0 ug vasta-aine oli joko reagoimaan suoraan CTAB- tai PD-NR ennen BSA lisäksi tai sekoitetut BSA tai puskuriliuoksia ennen lisäämistä.

Vasta sitova ja kvantifiointiin.

Entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) B: vuohen anti-hiiri-IgG päällystetty 96-kuoppaisille ELISA-mikrotiitterilevyt (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), huuhdeltiin PBS: llä + 0,05% Tween-20 (PBST). Hiiren anti-MUC1-N /C-vasta-aineen standardeista ja AuNR supernatantti sisältäviä näytteitä tuntemattomat suureet MUC1-N tai -C (100 ul /kuoppa) ladattiin ja annettiin kaapata 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa sekoittaen varovasti. Levyt pestiin 3X 200 ui PBST. Toissijainen vuohen anti-hiiri-IgG-HRP: tä (Santa Cruz Biotechnology, 100 ui /kuoppa, 1: 6000-laimennos) inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa sekoittaen. Levy pestiin 3 x PBST: llä ja 1 mg /ml 2,2′-atsino-bis (3-etyylibentstiatsoliini-6-rikkihappo) (ABTS) liuos valmistettiin 50 mM sitruunahappoa ja 100 mM dinatriumfosfaatti . Välittömästi ennen käyttöä, ABTS liuos sekoitettiin 10 ui 30% H

2O

2 ja lisättiin kuoppiin (100 ui). ABTS väri kehitys perustuu läsnäolosta HRP-leimatun sekundaarisen vasta-aine mitattiin 405 nm: ssä 15 minuutin ajan Synergy H4 Hybrid Monitila Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT). Määrä AuNR sitoutuneen MUC1-N ja MUC1-C-vasta-aineita määritettiin vähentämällä pitoisuudet havaittiin näytteessä supernatanteissa tunnetuista kuormitusolosuhteissa valmistuksen aikana. Pitoisuudet laskettiin point-to-point lineaarista regressiota standardikäyriin.

Optinen spektroskopia.

UV-Vis-NIR spektrofotometrisesti

: UV-Vis-NIR-spektrit vaihtelevasti modifioitu AuNRs kirjattiin Hitachi U-2010 spektrofotometrillä (Hitachin City, Japani). Pitkittäinen LSPR piikkien paikat määritettiin ja käytettiin indikaattorina pinnan muunnos ja yhdistäminen.

Sirkulaaridikroismispektrejä

: Sirkulaaridikroismispektrejä (CD) -spektrit tallennettiin J-815 CD Spektrofotometri (Jasco, Easton, MD) äärimmäisenä-UV-alueella (190-300 nm, 1 nm resoluutio) 1 mm väyläpituutta kvartsikyveteissä ympäristön lämpötilassa. AuNR pellettejä (30 ui) laimennettiin 900 ui ultrapuhdasta vettä kaikissa mittauksissa. BSA: ta (0,25 mg /ml) toimi proteiinin viitteenä, kun ultrapuhdasta vettä käytettiin tausta vähennyslasku. Tilallinen järjestely ja selkäranka konformaatio proteiinin amidien synnyttää ominaisuus CD-spektrit sekundäärirakenteita. Minimit ovat aallonpituudella 222 ja 208 nm: ssä johtuvat α-kierteisen proteiinin amidit ja polaroitu valo suuntaan α-heliksejä, vastaavasti [25]. Vaikka menetelmiä, joilla lasketaan% kierteisyys ovat laajalti saatavilla [26], ne vaativat proteiinikonsentraatioilla, joita ei voida täsmällisesti määrittää kokeissa takia Katekoliamiini häiriöiden [27]. Näin ollen, määrittää, missä määrin sekundäärisen rakenteen säilyttämisen BSA, The α-kierteisen taipumus [26], (1) voidaan käyttää karkean mutta kätevä arvio α-kierteisen sisältöä, jossa

θ

edustaa raaka elliptisyyttä millidegrees 208 ja 222 nm, vastaavasti. Väliset suhteet 0,80 ja 0,95 edustavat yksiketjuinen α-heliksejä ja kasvaa yhä α-kierteisen sisältö [26].

Soluviljely.

MCF-7 rintasyövän soluja kasvatettiin runsaasti glukoosia DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% FBS: ää (Invitrogen), 1% gentamisiinisulfaattia (Invitrogen), ja 10 ug /ml ihmisen rekombinantti-insuliinia (Santa Cruz Biotechnology). MDA-MB-231-soluja viljeltiin RPMI 1640 (Invitrogen), jossa oli 10% FBS: ää ja 1% gentamisiinisulfaattia. SCC15 suun okasolusyöpä kasvatettiin runsaasti glukoosia DMEM 10% FBS: ää ja 1% gentamisiinisulfaattia. Kaikkia solulinjoja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa yrityshautomon 5% CO

2.

Cell kuvantaminen.

fluoresenssi ja kaksi-fotoni luminesenssi (TPL) konfokaali kuvantamisen keskeyttämistä solujen (1×10

5) 0,2 ml: ssa väliainetta ympättiin kuhunkin 8 kuoppiin Lab-Tek chambered peitelevyllä dia (Nunc, Rochester, NY). Solut kasvatettiin konfluenssiin ja inkuboitiin tuoreella väliaineella, joka sisälsi AuNRs (viisitoista). Soluja inkuboitiin AuNRs 24 tuntia, huuhdottiin kahdesti PBS: llä, ja kuvaamisen livenä TPL päästöjä tuoretta väliainetta. Konfokaaliset kuvat hankittiin käänteismerkkisinä Axio Observer. Z1 mikroskooppi varustettu 20X objektiivin linssin ja kuumennetaan vaiheessa (37 ° C) asetettiin 5% CO

2 inkubaation (Zeiss, Oberkochen, Saksa). Sillä TPL kuvantaminen, AuNRs olivat innoissaan Mai Tai Fs (FS) Ti: Sapphire laser (Mai Tai, Spectra-Physics, Santa Clara, CA), jonka syke on 130 fs ja toistotaajuus 80 MHz. TPL-virityksen aallonpituus sopeutettiin LSPR piikin AuNR näytteen (780 nm). Sisäinen spektrin ilmaisin säätää päästöjen välillä 500-615 nm havainnut TPL alkaen AuNRs. 543 nm HeNe laseria käytettiin brightfield kuvantaminen. In darkfield (DF) sironta kokeissa soluja ympättiin (1×10

4 solua /kuoppa) 16 Kaivokammio dioja (Lab-Tek, Nunc), kasvatettiin täysiksi ja käsiteltiin 3,75 pM AuNRs väliaineessa 1 tunnin ajan. Yksittäiset kuopat huuhdeltiin 3 kertaa PBS: llä. Kaivot ja kammio tiivisteet poistettiin varovasti ja objektilasi peitetään välittömästi kuvantaminen 40X suurennus pystyssä Leica DM2500 (Wetzlar, Saksa) darkfield mikroskoopilla. Kuvat otettiin vakionopeudella altistus (f-stop 1/15) kautta EOS Rebel T2i kameran.

elektronimikroskopialla.

elektronimikroskopialla (EM) verkot (Ted Pella) kuormitettiin pelletoitiin AuNRs (5 ui, 1 nM), vastavärjättiin phosphotungstinic happoa, ja kuivattiin yön yli ympäristön olosuhteissa. Ristikot oli kuvattu kanssa Hitachi HD-2300 Ultra High Resolution alan päästöjä skannaus siirto elektronimikroskoopilla (FE-STEM) (Hitachi City, Japani) läpäisyn EM (TEM) ja toissijainen elektroni (SE) välillä.

ζ-Potential analyysi.

Modified ja muunneltua AuNRs (15 pM) ruiskutettiin standardi taitettu hiussuonten solujen ζ-potentiaalin mittausta. Mittaukset suoritettiin Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Worcestershire, Iso-Britannia) ympäristön lämpötilassa ja laskettu keskiarvona seitsemän skannaa.

Photothermal hoidon MUC1-modifioitu AuNRs.

MCF- 7, MDA-MB-231, ja SCC15 (5,0 x 10

5) syövän soluja viljeltiin 12 hyvin TCP levyille ja kasvatettiin konfluenssiin yli 2-3 päivää. Kuopat pestiin PBS: llä ja käsiteltiin 0-3 pM anti-MUC1-N, anti-MUC1-C, tai BSA-vasta-modifioitu AuNRs laimennettuna soluviljelyalustoissa. Sen jälkeen 1 h inkubointi 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, kuopat huuhdeltiin 3X PBS: llä poistamaan sitoutumaton AuNRs ja merkitty kaksi painopisteet vastaavia yhtymäkohta tasoilla. Yksi kutakin näistä kohdista on alttiina SuperK Versa laajakaista laserlähteen (NKT Photonics, 480-850 nm, 1 mm spot) 3,5 min tehotiheys 0,18 W /nm on plasmon keskellä aallonpituus (780 nm). Jälkeen 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut huuhdeltiin PBS: llä ja värjättiin kalseiini AM (2 uM) ja propidiumjodidia (4 uM) elävien /kuolleiden kuvantaminen. Fluoresenssimikroskopian suoritettiin Leica DMIRB mikroskoopilla (Wetzlar, Saksa), joka oli varustettu 250 W: n Hg kaarilamppu ja QIClick kamera (QImaging, Surrey, BC Kanada). Kiinnostavat säteilytys ja ei-säteilytys saatiin jää kuhunkin hyvin vertailun. Kuvat prosessoitiin GNU-kuvankäsittelyohjelma (GIMP, v. 2.8.0). ImageJ käytettiin muuntamaan Live /Dead kuvat mustaan ​​(taustalla) ja valkoinen (solut) kynnysarvo maskit. Alueella prosenttiosuus tausta pikseliä (pinta-ala-%

+ NIR) tai ilman laseraltistumisen (Area%

-NIR) laskettiin

Mittaa

toimintoa ImageJ. Seuraava yhtälöä käytettiin määrittämään hoidon tehokkuuden: (2) Tulokset normalisoitiin käsittelemättömiin kuoppiin ± NIR altistumista. Kokeet toistettiin SCC15 suun ja MDA-MB-231 rintasyövän solulinjoissa.

Tilastollinen analyysi.

Studentin t-testiä käytettiin analysoimaan prosenttiin vasta-kuormataan ELISA. Kaksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jossa Bonferroni jälkeinen testejä käytettiin määrittämään, onko keskimääräisen% elinkelpoisia alueita joukossa MUC1

+ ja MUC1

– solulinjat olivat merkittäviä suhteen annostelu ja hoidon ehdot. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun

P

arvo oli 0,05 (n = 3-6). Kaikki analyysit suoritettiin GraphPad Prism versio 5.0a Mac (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Tulokset ja keskustelu

Albumiini pintana passivointisovelluksiin aine

vähäinen epäspesifinen likaantuminen pintojen on usein toivottava tavoite biolääketieteellisen tutkimuksen ja lääketieteellisen laitteen suunnittelu [28, 29], jolle oksastus biomolekyylien ja synteettisten polymeerien pintaan on ehdotettu ratkaisuksi [30, 31]. Aste ja luonne epäspesifisen proteiinin adsorptiota pinnalle riippuu monista tekijöistä, mukaan lukien proteiini koostumus (koko, keskittyminen, lataus, ja sisäistä vakautta), ympäristön olosuhteissa (pH, lämpötila, ja ionivahvuus), ja pinnan ominaisuudet (morfologia, lataa , ja vapaa energia) [32]. Käyttö adsorboituneiden BSA lähestymistapana pinnan passivointi on pitkään ollut kiehtova strategia biolääketieteen tutkijoille. Yksi varhaisimmista käyttötapoja tämän strategian oli havainnon Packham ja muille, että verihiutaleet vastustavat adsorptio albumiiniin-pinnoitettu lasi putket [33]. Passivointi albumiiniin ehdotettiin Plasmafereesin piirejä, valtimoiden proteeseja sekä muiden veren yhteyttä laitteisiin, jotka estävät trombogeneesin, mutta tämä lähestymistapa osoitti rajoitettu tehoa alhaisen pinnan kattavuutta tai siirtyminen physisorbed albumiinin proteiinien suuremmilla sidosaffmiteetti [34].

Myöhemmin yritettiin cross-link adsorboitiin albumiinit glutaraldehydillä tai gammasäteilyllä hoidot; kuitenkin, tuloksena tappio proteiinia joustavuus rajoittaa sen kykyä edistää steerisen vastenmielisyys [35]. Koska nämä ensimmäiset havainnot, albumiini on käytetty muuttaa rautaoksidi [36], polystyreeniä [37], Ag ja Au [38, 39], kvanttipiste [40], ja liposomaalinen nanohiukkaset [41]. Tutkimukset ovat paitsi osoittaneet, että BSA-konjugoiduilla nanohiukkasten vähentää aggregaatin muodostumista, mutta ne ovat myös paljastaneet parantaminen kvanttisaannossa, joka on merkitystä photothermal sovelluksia tarkastellaan tässä tutkimuksessa [42].

Polydopamine funktionalisoimiseksi nanohiukkasten jossa biomolekyylien

tässä tutkimuksessa kuvaamme simpukan liima proteiini innoittamana strategia ankkurointia BSA ja vasta pintaan kullan nanorods. Meri- simpukka n siveetön likaantumista orgaanisten ja epäorgaanisten pintojen syyksi mukaan Waite ja muut epätavallinen proteiineja löytyy terminaalin liima plakkien sen byssal kierteet [43, 44]. Erityisesti korkea katekoli sisältävän aminohapon 3-4-dihydroksifenyylialaniinia (DOPA) ja amiinipitoisia lysiiniaminohappoa esiintyy byssal laattoja, ja tämä havainto on vaikuttanut suunnitteluun monipuolinen molekyylitason liimat, ankkurit synteettiset polymeerit, ja yleiset strategiat pinnoitteita [44, 45].

motivoi korkea katekolamiini pitoisuus simpukan liima proteiinien, dopamiinin tunnistettiin yksinkertainen rakenteellinen jäljittelee simpukan jalka proteiinia 5 (MFP-5) ja osoittanut spontaanisti tallettaa ohut melaniinia kuten elokuvia lähes millä tahansa irtomateriaalin pinta [46]. Polydopamine (PD) kalvot muodostetaan kautta spontaani polymeroimalla dopamiinin molekyylien lievästi emäksinen vesipitoisissa olosuhteissa, jotka jäljittelevät meriympäristöä. Vaikka mekanismi muodostumista ja lopullinen kokoonpano PD on vielä tutkittavana [47, 48, 49, 50, 51, 52], olosuhteissa normaalisti käytetään muodostamaan PD pinnoitteiden dopamiinin hapetetaan, jolloin saadaan dopamiini-kinoni, joka jälkeen molekyylin sisäinen uudelleenjärjestely , lisähapetus ja molekyylien väliset kytkentä, saadaan eumelanin kaltainen heterogeeninen polymeeri [44]. On todennäköistä, että erilaisia ​​rakenteellisia alayksiköiden ja liimaus tyypit tavataan PD elokuvan sekä klo PD-alustan ja PD-proteiini rajapintoja, mukaan lukien kovalenttisten sidosten, sähköstaattinen ja voimakas ei-kovalenttinen vuorovaikutukset kuten varauksensiirtoa, vetysidoksen, ja π-pinoaminen. Liima ja reaktiivinen luonne polydopamine ohutkalvojen on hyödynnetty kätevä alustan tai ”aluke”, jonka päälle voidaan kerrostaa lisäksi toissijainen pinnoitteiden kautta erilaisia ​​mahdollisia mekanismeja, mukaan lukien kovalenttinen sidos, jossa orgaanisten tioli, amiini, ja histidiinitähteitä [53]. Tämän kaksivaiheisen lähestymistavan erilaisia ​​toiminnallisia sovelluksia polydopamine on kehitetty biolääketieteen sovelluksiin [54], kuten varttaminen PEG-tiolit tukahduttaa biologisen likaantumisen [46, 55] tai tietyn edistäminen soluadheesion pinnat [ ,,,0],46].

valmistaminen ja karakterisointi BSA muutettu AuNRs

muuttaminen AuNRs PD suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [56, 57], jolloin saatiin AuNRs ympäröi ohut PD pinnoite. Läsnäolo PD varmistettiin UV-vis punasiirtymä (kuvio A S1 File). PD-NR havaittiin aggregoitua puskurissa, mutta uudelleendispergointia vuonna BSA-liuosta ja eristämistä sentrifugoimalla johtivat stabiileja dispersioita BSA-PD-NR. Käyttäen ratkaisu AuNR LSPR intensiteetti ja huippu shift (kuvio B S1 File) analysoitiin UV-Vis-NIR spektrofotometriassa mittana NR vakautta, seulonta eri BSA pitoisuuksien (0-30 mg /ml) käytetään kahdessa -portainen pinnoite menetelmä johti tunnistamiseen optimaalisen protokolla koostuu 0,1 mg /ml dopamiinin PD pinnoite CTAB-NR seuraa tasaantuminen vuonna ≥10 mg /ml BSA. Näissä optimiolosuhteissa yhdistämisestä BSA-PD-NR oli seitsemän kertaa vähemmän kuin PD-NR (kuvio B S1 File). Kaikki seuraavat kokeet suoritettiin PD-NR modifioitua 20 mg /ml BSA, jotta varmistetaan täysi passivointi PD alakerroksen, jotka muutoin edistettävä AuNR aggregaatiota. AuNRs (20 x 60 nm), on modifioitu PD ja BSA: ta (20 mg /ml) oli kuvattu kautta TEM seuraavat counterstaining kanssa fosfovolframihappoa säätää kontrastia orgaanisen BSA kerros. Kerros mittaus- ~ 15 nm paksuus tehtiin näkyväksi hyvin erotetut BSA-PD-NR SE-tilassa (kuvio 2A). Vaimeneminen XPS Au4f signaalin kultaa pinta havaittu altistettaessa dopamiinin ja BSA on sopusoinnussa laskeuman PD pinnoitteen seuraa oksastamalla BSA (Kuva C S1 File).

(A) elektronimikroskopialla BSA-PD-NR toisen elektroni tilassa. Asteikko bar = 600 nm; Inset = 50 nm; (B) Sirkulaaridikroismispektrejä modifioidun vs. modifioimattoman kultaa NR. BSA-modifioitu NR muutettiin 10 tai 20 mg /ml BSA: ta, kuten on osoitettu. Pitoisuus BSA kontrolli oli 0,25 mg /ml. Proteiinien denaturointi osaksi β arkin muodostus on merkitty PD-käsiteltyjen NR muunnettu optimaalista BSA. Muussa tapauksessa BSA sekundaarinen rakenne on säilynyt, koska määrällisesti vastaavilla α-kierteisen taipumuksesta jokainen muutos.

AuNRs arvioitiin edelleen kautta UV-Vis-NIR-spektroskopian analysoida muutoksiin pituussuunnassa LSPR huippukohta (Kuva B S1 File). BSA-DP-NR osoitti plasmonin punasiirtymä 10 nm muutosten vuoksi paikalliseen dielektriseen johtuviin pinnasta adsorptio tapahtumia. Tämä muutos LSPR aallonpituus maksimi, Δλ

max, vastaa adsorboituneen paksuus

d

15 nm perustuen yhtälöön [57, 58], (3) Jos

m

on suurin taitekerroin vasteen nanohiukkasten, Δ

n

on taitekerroin aiheuttaman muutoksen adsorboivat laji, ja

l

d

on hajoaminen pituus sähkömagneettisen kentän. Tämä laskettu paksuus on samaa mieltä meidän TEM havainnot (kuvio 2A). Lisäksi ζ-potentiaalin mittausta kirjattiin seurata AuNR biofunctionalization ja raportoidaan taulukossa 1. vaiheittainen muutos ζ-potentiaalin PD ja BSA muutos huipentui negatiivisesti varautunut BSA pinnoite.

BSA sitoutuminen PD-NR todennäköisimmin kautta tapahtui ei-kovalenttisen mekanismien yllä kuvatulla tavalla tai kovalenttisella kytkennän mihin tahansa 60 käytettävissä oleva pinta-lysiinitähteiden [38]. Rinnakkaisissa kokeissa suoritettiin käsittelemättömien CTAB-NR dispergoidaan 10 mg /ml BSA: ta ei ole, jolloin saadaan stabiili suspensio, joka osoittaa, että on tärkeää PD parantaa BSA passivointi. Vaikka suurempia pitoisuuksia BSA havaittiin vakauttaa CTAB-AuNRs puuttuessa PD kuten laskeuttamalla kokeiden aikana (kuvio B S1 File) ja ELISA: lla (tuloksia ei ole esitetty), nämä konstruktit eivät helpottamaan optimaalista vasta-aineen immobilisaatio myöhemmin kokeita.

tertiäärinen rakenne seerumialbumiinia koostuu kolmesta domeenista (I-III), jotka on edelleen jaettu yhdeksään silmukoita 17 disulfidisidosten [59]. Erityisesti BSA ylläpitää yksi vapaa sulfhydryylin tähteen Cys-34, joiden läsnäolo on sekaantunut sekä metallikelaatiopylväällä ja vapaa radikaalinsieppausaktiivisuus [60]. Fysiologisissa olosuhteissa, BSA ylläpitää 67% α-kierteisen pitoisuus, 10% β-kierrosta, ja 23% laajennettu ketjuja [59, 61]. Fysiologisessa pH: ssa BSA: ta ylläpitää negatiivinen nettovaraus (pI = 4,7), edistää sen erinomainen vesiliukoisuus, vaikka lasku tehokas vastaa odotetaan funktiona lisätä liuoksen pH [59, 62], selvittämiseen mahdollista merkitystä sähköstaattisten vuorovaikutusten on albumiiniin sitoutumiseen CTAB tai polydopamine muutettu pintoja. Tärkeää on, että sähköstaattisesti ajettu adsorptio negatiivisesti varautuneiden BSA, pH 8,5 AuNR pinnat koristeltu kationisen CTAB ammonium- pääryhmät havaittiin indusoivan joitakin denaturointi α-kierteisen sekundäärisen rakenteen, kuten havaittiin kautta CD (kuvio 2B).

ehdotimme polydopamine-välitteisen adsorption BSA yksinkertainen strategia parantaa kolloidisen kullan vakauden nanorod suspensioiden minimoiden toissijaisen proteiinin rakenne päällysteen. Olemme havainneet, että BSA-PD-NR kykenivät ylläpitämään korkeampia α-kierteisen taipumusta (p (α) = 0,899) verrattuna BSA-vasta modifioitu vastineet (p (α) = 0,824), ja että tämä suhde tarkemmin lähestyi ohjaus BSA-standardi (0,25 mg /ml, p (α) = 0,917). Korkea alfahelikaalisen taipumus pidetään edullisena, koska denaturaatio voi johtaa ei-toivotun altistumisen immunostimulatoristen verkkotunnuksia BSA [42, 63]. Lisäksi sähköstaattisesti ajettu muutos kuin olisi asianlaita ilman PD, voi olla epävakaa fysiologisia ympäristöissä [11], joka mahdollistaa siirtymisen passivointisovelluksiin BSA korkeammat affiniteetti proteiineja, jotka voivat ajaa poistaminen nanohiukkasten kautta retikuloendoteliaalijärjestelmän [64 ]. Osittainen BSA denaturaatio voi paljastaa ja häiritä sisä- disulfidisidoksia, joiden on osoitettu myötävaikuttavan liimaus kautta Au-tioli vuorovaikutusta [65].

On silmiinpistävää, BSA-PD-NR valmistettiin optimaalista 10 mg /ml BSA pitoisuudet yhteen kuin denaturoidun β-levyt (kuvio 2B).