Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme ominaista uudenlainen 21 aminohapon peptidi on johdettu antrum limakalvon Protein (AMP) -18 joka välittää kasvun edistämiseen viljeltyjen normaaleja epiteelisolujen ja lievennetään säteilyn aiheuttamista mukosiitin eläinmalleissa, kun taas tukahduttaa

in vitro

toiminta syöpäsoluja. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida näitä dual mahdollisia terapeuttisia vaikutuksia AMP peptidin kliinisesti merkittävää eläinmallissa pään ja kaulan alueen syöpä (HNC) samanaikaisesti arvioimalla sen vaikutusta kasvaimen kasvuun ja säteilyn aiheuttamista mukosiitin ortotrooppinen mallin HNC . Bioluminoivat SCC-25 HNC solut injektoitiin anteriorisen kielen ja kasvaimet, jotka muodostivat alistettiin sitten polttovälin sädehoitoa. Kasvaimen koko arvioitiin käyttämällä

in vivo

kuvantamisjärjestelmä ja laajuudesta mukosiitin verrattiin eläinten välillä käsitelty AMP peptidin tai ajoneuvo (valvonta). Synergian AMP peptidin ja sädehoito ehdotti havainto, että kasvaimia AMP peptidi /sädehoito kohortti osoittanut estivät kasvun vs. sädehoitoa vain käsiteltyjen kasvainten, kun taas AMP peptidi-hoito viivästyy puhkeamista ja vähentää vakavuutta säteilyn Therapy aiheuttama mukosiitti. Differentiaalinen vaikutus apoptoosiin näyttää olevan yksi mekanismi, jolla AMP-18 voi edistää kasvua ja korjaus loukkaantuneiden limakalvon epiteelisolujen taas proliferaation HNC soluja. RNA mikrosiruanalyysi tunnistaa polkuja, jotka ovat eri tavoin kohteena AMP-18 HNC vs. transformoimattomissa soluissa. Nämä havainnot vahvistavat käsitystä, että normaalit solut ja kasvaimen solut voivat reagoida eri tavoin yhteisiä biologisia ärsykkeitä, ja että hyödyntämällä tätä havaintoa, kun kyseessä on AMP-18 voi tarjota kliinisesti merkittävää mahdollisuutta.

Citation: Chen P, Mancini M, Sonis ST, Fernandez-Martinez J, Liu J, Cohen EEW, et al. (2016) uudentyyppinen peptidin samanaikaisesti Tehostettu hoito Pään ja kaulan alueen syöpä ja lieventäminen mukosiitin. PLoS ONE 11 (4): e0152995. doi: 10,1371 /journal.pone.0152995

Editor: Craig Murdoch, University of Sheffield, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 01 lokakuu 2015; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2016; Julkaistu: 06 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta National Cancer Institute (www.cancer.gov): CA 176032 ja FGT. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Biomodels, LLC. tuettiin muodossa palkkojen tekijöille MM, STS ja JFM, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet Author Avustukset osiossa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut. Maria Mancini, Stephen T. Sonis ja Juan Fernandez-Martinez työskentelevät Biomodels, LLC. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuttanut tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaasta tekijöille.

Johdanto

Huolimatta esiintymistiheys, vakavuus ja oireenmukaista ja taloudellisia vaikutuksia, ei ole olemassa tehokasta intervention mukosiitin (OM) aiheuttama kemoterapeuttisten tai säteilyn hoito (CRT) hoitoon käytettävä pään ja kaulan alueen syövät (HNC) [1-4]. Kliinisesti, OM on ominaista limakalvon jakautuminen saatiin runsaasti, syvä haavaumat, vakava toiminta muuttavia kipu, kohonnut toisen tartunnan, bakteremia ja sepsis, ja laajennettu tarve gastrostomian ruokkimista, ja avohoidossa sekä potilaan oireenmukaista hoitoa. Lähes kaikki potilaat, jotka saavat CRT hoitoon HNC kehittyy vähintään kohtalainen OM; yli kaksi kolmasosaa kärsivät vaikeista kunnossa.

Nykyinen standardi terapiaa mukosiitti on pääosin lievittävä taas keskittyneet kivun ja ylläpito ravitsemuksen. Ainoa hyväksytty hoito mukosiitti toistaiseksi on palifermiini (Kepivance®), ja sen soveltaminen on rajoitettu mukosiitti saavilla potilailla ilmastointi hoito ennen hematopoieettisten kantasolujen siirto [5].

Monimutkaisuus mukosiitti biologisena prosessi on vasta arvostettu äskettäin [6-8]. On ehdotettu, että ehto merkitsee peräkkäisiä vuorovaikutus suun limakalvon soluja ja kudoksia, reaktiivisen hapen, pro-inflammatoristen sytokiinien, välittäjiä apoptoosin, ja paikalliset tekijät, kuten syljen ja suun mikrobiston. Näyttää siltä, ​​että varhaisen muutoksia, jotka liittyvät säteilyn aiheuttamien limakalvoon kohdistuva toksisuus esiintyy endoteeliin, ja sidekudoksen submucosa [6]. Tämä johtaa lopulta vahinkoja ja häiriöitä Epiteeliesteen, kriittisin vaihe kehityksessä mukosiitti. Epiteeliesteen toiminta riippuu pitkälti välisissä liitoksissa on apikaalisella-eniten verkkotunnuksia solukalvon, eli tiukka liittymissä (TJS), jotka säätelevät parasellulaarista läpäisevyys kaikkialla epiteelin yksikerroksisessa soluviljelmissä ja

in vivo

[9 ].

Olemme tunnistettu ja karakterisoitu uusi 21-aminohapon peptidi on johdettu aminohapoista 77-97 ja antrum Limakalvojen Protein (AMP) -18, joka tunnetaan myös gastrokine-1 (GKN1) [10-12 ], joka on alun perin löydetty epiteelisolujen mahalaukun limakalvon [10]. Sekä AMP-18 ja peptidi suojaavat ja palautumaan limakalvon vauriota eläinmalleissa OM aiheuttama säteily ja /tai kemoterapia käytetään hoitamaan potilaita, joilla HNC [13, 14]. Peptidi voidaan helposti syntetisoida ja jolla pitkän aikavälin vakaus. Hiirimallissa OM aiheutettiin yhdellä säteilyannoksen kuonon, AMP peptidi annettiin kerran päivässä neljä päivää ennen säteilyn ja jatkui 10 päivää sen jälkeen esti tehokkaasti täydellinen menetys kielen epiteelin havaittiin säteilytetyn hiirillä, joille annettiin vehikkeliä (suolaliuosta) [13 ]. Vakiintuneilla hamsterin OM malleja aiheutettiin yhdellä säteilyannoksen, fraktioitua säteilyä, tai fraktioidut säteilyä yhdessä sisplatiinin simuloida tavanomaista hoitoja HNC, päivittäinen anto ihon alle AMP peptidin viivästynyt alkaminen limakalvon punoitus, vähentää vakavuutta haavaumat ja nopeutetun suun limakalvon toipuminen kaikissa kolmessa mallissa, todennäköisesti osittain sen antiapoptooppinen vaikutukset nähdään kulttuureissa epiteelisolujen ja endoteelisolujen [14].

toisin kuin muut tällä hetkellä trialed tai oire lievittäviä aineita nyt käytössä hoitoon mukosiitin, AMP peptidi ja rekombinantti ihmisen (rh) AMP-18 näyttävät ainutlaatuisesti kohdistaa TJs jotka yhdistävät vierekkäiset epiteelisoluihin lisäämällä kertyminen TJ proteiinien, rajoittamalla niiden menetys aikana vammoja, ja helpottaa muodostamalla uusia TJs seuraavista limakalvon vamma [12, 15]. Tämä TJ tehostuminen tiiviisti uudelleenjärjestelyn perijunctional aktiini ja muodostumista ”napaisuus proteiini” komplekseja. AMP-18 näyttää saavuttaa terapeuttisia vaikutuksia sitoutumalla gastriini /kolekystokiniini B-reseptori (CCKBR) ja aktivoimalla useita signalointireittien, kuten MAPK, PI3K /AKT, RhoA, ja PKCζ [13, 15, 16].

jatkaa kehittymistä AMP peptidin tehokkaana ja turvallinen terapeuttinen aine, sen vaikutuksia syöpäsolujen kasvua asettamisessa sädehoidon protokollien

in vivo

tutkittiin ksenograftimallia käyttäen ympätty ihmisen syöpä solujen tuottaa kasvaimia nude rotilla [14]. Me kertoi, että polttoväli sädehoitoa vähensi merkitsevästi kasvaimen tilavuus odotetusti. Yllättäen anto AMP peptidin merkittävästi lisätä säteilyn aiheuttamaa kasvun inhibitiota, joka osoittaa tuumorisuppressorigeenin omaisuutta AMP-18 me ja muut aiemmin havaittu [11, 17, 18]. Yhdessä nämä havainnot ehdotti, että AMP peptidi kohtelu OM ei häiritse terapeuttisia vaikutuksia säteilyn protokollien hoidossa pään ja kaulan kasvaimia, tai edistää syöpäsolujen kasvua, mutta voisi sen sijaan herkistää tuumorisoluja säteilylle.

tässä tutkimuksessa esitetyt onko AMP-18 voi herkistää HNC solujen kemoterapia-aineiden, ja myös osoitettava samaan eläimeen, myönteisiä vaikutuksia suun limakalvon suoja yhdessä tukahduttaminen kasvainsolujen kasvua sädehoidon.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

kemiallisesti syntetisoitu AMP peptidi (LDALVKEKKLQGKGPGGPPPK), sekoitettua peptidiä (GKPLGQPGKVPKLDGKEPLAK), ja rekombinantti ihmisen (rh) AMP-18 valmistettiin GenScript (Piscataway, NJ) kuten aiemmin on kuvattu [13]. Lyhyesti, rhAMP-18 ilmennettiin ja puhdistettiin His

6-leimatun fuusioproteiinin. Koodaavan sekvenssin täyspitkän ihmisen AMP-18 kloonattiin

E

.

coli

ekspressiovektoriin, pGSE3, ja ilmennetty proteiini puhdistettiin 5 L viljelyalustasta affiniteettipylväskromatografiaa. AMP peptidi ja rhAMP-18 todettiin olevan yhtä tehokas laukaista soluvasteita aiemmin raportoidun [13-15]. Soluviljelyväliaineeseen naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä ja streptomysiiniä saatiin Gibco BRL, Life Technologies (Gaithersburg, MD). Tuumorinekroositekijä (TNF) -α hankittiin PeproTech (Rocky Hill, NJ), ja muut reagenssit yhtiöltä Sigma-Aldrich, ellei toisin mainita.

Cell Cultures

tutkimiseksi hoidon vaikutuksia AMP peptidin tai AMP-18 syöpäsoluja altistetaan sisplatiinin, kaksi vakiintunutta ihmisen HNC solulinjoja, jotka on esitetty alustavia tutkimuksia näytteille ero herkkyys sisplatiinia käytettiin: SCC-25 (American Type Culture Collection, ATCC CRL1628) (Manassas, VA), joka on herkempi kuin SCC-61 [19]. SCC-25 solulinjaa on säilytetty kirjoittajien laboratoriossa 3 vuotta; SCC-61-soluja perustettiin ja todistaa oikeaksi Weichselbaum

et al

. [20-22], sai lahjaksi, ja ylläpidetään 4 vuotta. Soluja kasvatettiin 1: 1-seosta Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa ja Hamin F12 -alustassa, joka sisälsi 1,2 g /l natriumbikarbonaattia, 2,5 mM L-glutamiinia, 15 mM HEPES ja 0,5 mM natriumpyruvaattia, ja johon oli lisätty 400 ng /ml hydrokortisonia, 10% FBS: ää, penisilliiniä (50 U /ml) ja streptomysiiniä (50 ug /ml), 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, jota oli täydennetty 5% CO

2. SCC-25: n ja SCC-61-soluja (2 x 10

3 /kuoppa) kasvatettiin 96-kuoppalevyillä 24 tunnin ajan kasvatusliuoksessa, joka sisälsi 1% FBS: ää, ja sitten ne jätettiin käsittelemättä, altistetaan sisplatiinin vain (2 uM SCC-25-soluja, 10 uM SCC-61-soluja), sisplatiini, kun läsnä on 2 ug /ml AMP peptidi, tai rhAMP-18 (liuotettuna fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, PBS, ajoneuvo) 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin CellTiter-Blue reagenssia käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Bio-Tek, Winooski, VT). Kokeet suoritettiin neljänä rinnakkaisena. Ihmisen, aikuisen, (alhainen pitoisuus) Kalsium, kohonnut lämpötila (HaCaT) ihon keratinosyyttejä, transformoimaton solulinjaa mallintaa normaaliin kerrostunut levyepiteelillä suun limakalvojen [23], saatiin Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) ja ylläpidetään Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa, jossa FBS, penisilliiniä ja streptomysiiniä, kuten on kuvattu [13] ja 5 vuotta. Oral tert- 2 ikuisti keratinosyyttejä pitää solumallin verrata suusyövän [24], mutta HaCaT solulinja valittiin, koska se on laajemmin käytetty tähän tarkoitukseen.

luominen Orthotopic malli HNC nude-hiirissä

tutkia mahdollisia synergiavaikutuksen AMP peptidin rajoittamiseen syöpäsolujen kasvua samalla suojaavat OM samassa eläimessä, joka on potilaalle tehdä mallin HNC käytettiin. Kasvaimia kielen kertyi, niiden koko arvioitiin käyttämällä

in vivo

kuvantamisjärjestelmä (IVIS), ja laajuus säteilyn aiheuttamista OM verrattiin eläinten välillä käsitelty AMP peptidin tai ajoneuvo (valvonta). Eläinten käyttö hyväksyttiin Biomodels ”Institutional Animal Care ja Käytä komitea (12-1016-01). Office of Laboratory Animal Welfare varmuus määrä on A4591-01.

Alustavien

in vivo

tutkimuksissa, SCC-25-solut leimattiin lentiviraalinen dual bioluminescent ja loisteputki kuvantaminen vektori UBC-GFP -T2A-Luciferase (LUC) (System Biosciences, Inc., Mountain View, CA), ja ruiskutetaan anterior kielen muodostaa kasvaimia. Nämä bioluminoivat SCC-25 soluja, kutsutaan SCC-25-LUC, mahdollistaa

in vitro

valinnassa positiivisten solujen virtaussytometrisellä lajittelemalla käyttäen vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP) ja ei-invasiivisia seuranta solujen dynamiikan hyödyntäen

in vivo

kuvantamisjärjestelmä (IVIS) (Perkin Elmer) mittaamiseksi kasvaimen kokoa. SCC-25-LUC-solut lajiteltiin 3 kertaa BD FACSAria (BD Biosciences), niin että GFP-positiiviset solut olivat 95% (dataa ei ole esitetty). Herkkyys ja tarkkuus

in vitro

ja

in vivo

Cell Monitoring tarjoaa useita etuja perinteisiin menetelmiin, jotka vaativat lopettamalla eläimet ja histologinen analyysi. Lisäksi histopatologinen korrelaatteja kliinisen muutosten arvioidaan mallissa on laajasti dokumentoitu [13, 25], joten histologia ei ollut osa nykyistä tutkimusta.

Kateenkorvattomia karvattomia hiiriä (Foxn1

nu ) (ikä 6-8 viikkoa, paino 29,5 ± 2,0 g) hankittiin Charles River Laboratories. Hiiret nukutettiin isofluraanilla ja 1 x 10

6 SCC-25-LUC solut suspendoitiin 30 ui 1 x HBSS ruiskutettiin suoraan etummaisen kielen käyttäen 0,1 ml tuberkuliiniruiskuun 30 neulaa kuten julkaisussa Myers

et al

. [26]. 21 päivän kuluttua sallia kasvaimen kasvua, yhteensä 32 hiiret satunnaistettiin 4 ryhmään (8 hiirtä /ryhmä), joka perustuu määrälliseen arviointiin kasvaimen määritetty koko yhteensä flux kustakin kasvain mitataan IVIS kuvantamisen [27].

päivä satunnaistamisen nimettiin päivänä 0. Eläimet ryhmässä 1 ei ole käsitelty, ryhmä 2 hiiret saivat ajoneuvo (PBS), ja ryhmät 3 ja 4 saivat AMP peptidi annoksella 25 mg /kg kerran päivässä ihonalaisena (sc) ruiskeena. On tutkimus Päivä 4, eläimet Ryhmät 2 ja 4 annettiin yksi akuutti annoksella 30 Gy säteilyn suunnattu kielen hoitoon kasvaimia ja aiheuttaa OM. Malli eristää kohdekudoksen (kieli), jossa on lyijysuojassa, jolloin vältetään systeemistä toksisuutta. Annon anestesian, hiiriä säteilytetään käyttäen 160 kilovoltin potentiaali (18,75-ma) lähteellä polttovälin 15 cm, kovetettiin 3,0 mm Al suodatusjärjestelmä. Käsittely AMP peptidin tai ajoneuvon jatkettiin 14 päivän ajan.

Eläimet nukutettiin, heidän kielensä kevyesti pursottaa käyttäen pihtejä ja valokuvia saatiin dokumentoida syövän etenemiseen. Kasvaimen kasvu arvioitiin ja verrattiin päivää 5, 8, 10 ja 14 käyttäen IVIS injektion jälkeen D-lusiferiini. Sen jälkeen otettiin valokuvia, OM teki kliinisesti, ja eläimet oli kuvattu käyttäen IVIS järjestelmää. Ennen kuvausta, hiiriin injektoitiin 0,1 ml /20 g kehon paino 15 mg /ml D-lusiferiini-K

+ bioluminescent substraattia PBS: ssa. Kymmenen minuuttia injektion jälkeen hiiret nukutettiin ja sijoitettiin IVIS® Lumina suurimmalla herkkyys jopa 5 minuutin altistuksen havaitsemaan bioluminenssina avoimin emissiosuotimen. Tallennetut kuvat ladattiin Living Image® analyysin ohjelmisto ja väriasteikkoja sovitettiin perustuen suurin ja pienin säteilyä (fotonien /toinen /cm

2 /steradiaani). Identtiset kiinnostavat alueet vedettiin jokaiselle eläimelle ja koko vuon määritettiin suhteen fotonit /sekunti kutakin aluetta kohteisiin.

mukosiitin

puhkeaminen ja eteneminen OM teki kliinisesti käyttäen vakiintunut kuuden pisteen asteikolla: Grade 0, mitään poikkeavaa. Grade 1, lievää limakalvojen muutokset ominaista alueilla lievä punoitus, limakalvon ehjänä. Grade 2, lievä mukosiitti määritellään alueet kohtalaisen tai vaikean punoitus ja epiteelin pinnallista kuolion niin, että voi olla lieviä sloughing, mutta epiteelin pohja on ehjä. Asteen 3, kohtalainen mukosiitti tunnettu Frank haavaumia mahalaukussa. Haavaumat tyypillisesti alueita kuolion joihin liittyy kellertävä /harmaa väri kanssa pseudomembrane muodostumista. Kumulatiivinen alue haavaumia ≤ 25% kielen pinnan ala. 4. asteen, vakava mukosiitti kanssa haavauma muodostumiseen vaikuttaa 25%: sta 50% kielen limakalvon. Merkitty punoitus ja pseudomembrane muodostumista. Menetys taipuisuus. Arvosana 5, vakava mukosiitti haavauma muodostumiseen lähes kaikki limakalvo riskialueet. Liikuntakyvyn heikkenemistä ja pliability [25, 28, 29]. Tulokset 1 ja 2 osoittavat lievää vaiheissa mukosiitti. Haavainen mukosiitti on ominaista laadut 3-5 arvosanoja 3 ja 4 edustavat vakavia vaiheissa kunnossa. Edustavia kuvia tästä skaala määritetään kuvassa 1. Kun visuaalinen kliininen pisteytys, valokuva otettiin jokaisen eläimen suun limakalvon käyttäen standardoitua tekniikkaa. Päätteeksi kokeen, valokuvien satunnaisesti numeroitu ja tekee kaksi riippumatonta koulutettua tarkkailijoita, jotka arvostellaan kuvien sokkona käyttäen edellä kuvattua asteikkoa (sokaissut pisteytys). Kunkin valokuvan, varsinainen sokaissut pisteet perustui keskiarvoon 2 tarkkailijoiden tulokset. Vain pisteitä sokaisi, valokuvaus- arviointi raportoitu ja käytettiin tilastollisiin analyyseihin.

Kuvat ovat säteilyn aiheuttaman mukosiitin käytetään pisteytys on esitetty. Tarkempi selvitys Methods.

Eläimet punnittiin ja seurattiin yleistä terveydentilaa päivittäin. Lisäksi standardin ruokavalio, kaikki eläimet saivat erittäin maukas pehmeää ruokaa häkeissään. Ryhmä painon muutos kirjattiin keskimäärin prosentin painon muutos.

natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidi–polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja immunoblottaustestiä kaspaasi 3 lohkaisu

määrittämiseksi rooli apoptoosin putkijohdon erilaisia ​​AMP-18 vaikutuksia normaaliin epiteelin ja HNC syöpäsoluja, kaspaasi 3 katkaisu käytetään indeksinä solujen apoptoosin ja verrattiin transformoimattomina HaCaT ja HNC SCC-25-soluja altistettiin TNF-α käyttäen immunoblottauksella. Valmistella solulysaatit, viljelmät huuhdotaan ja korjattu jääkylmää PBS raaputtamalla yksikerroksista kanssa solun nostaja. Irrotettu Solut pelletoitiin 4 ° C: ssa ja uutettiin jäillä 30 min lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 150 mM NaCl, 100 mM NaF, 10 % glyserolia, 10 mM EDTA), joka sisälsi proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit (2 mM natriumortovanadaattia, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 50 ug /ml antipaiinia, 1 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä ja 1 ug /ml pepstatiinia). Solulysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 14000 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä (Pierce).

immunoblottaus määrityksiä, 30-50 ug proteiinia /kaista erotettiin SDS-PAGE, siirrettiin Immobilon kalvoja (Millipore, Bedford, MA), minkä jälkeen salvattiin 5% naudan seerumin albumiinia TBST (20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 0,1% Tween 20, pH 7,5), ja inkuboitiin nimetty vasta-aineita. Inkuboinnin jälkeen piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua sekundaarisia vasta-aineita, immunoreaktiivisia vyöhykkeitä visualisoidaan kemiluminesenssin (ECL, Amersham Biosciences). Kun uudelleenseulottiin, blotteja ensin stripattiin puskurilla, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS: ää, ja 0,1 M 2-merkaptoetanolia. Kuvat analysoitiin densitometrisesti. Immunoblottauksia kuvassa edustaa yhtä vähintään kolmen kokeen.

RNA Microarray Analysis Vertaamalla transformoitu ja HNC soluissa, joita käsiteltiin AMP-18

Jos haluat määrittää ero biologisia vaikutuksia ja merkitystä AMP- 18 normaaleilla ja kasvainkudoksen, ja tunnistaa otaksuttu polku geenikohteet että voisi välittää dual terapeuttiset vaikutukset vertasimme sen vaikutus geenien ilmentyminen viljeltyjen transformoimattomina (HaCaT) tai okasolusyöpä soluja käsiteltiin AMP-18.

Me [13, 14] ja muut [30-34] ovat käyttäneet ihmisen kuolemattomaksi transformoimattomina ihon keratinosyyttien HaCaT linjan [23] mallintaa suun limakalvon epiteelin ja vertailu levyepiteelikarsinooma pään ja kaulan syöpäsolut, kun taas kuolemattomaksi suullinen tert- 2 keratinosyytit on käytetty harvemmin mallintamaan suun limakalvotulehdus.

Yhteensä RNA eristettiin SCC-61 ja HaCaT solujen kanssa tai ilman AMP-18 hoito käyttäen RNeasy kit (Qiagen) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA eheys ja konsentraatio arvioitiin käyttäen Agilent Bioanalyzer 2100. Yhteensä RNA jalostetaan biotinyloitiin cRNA käyttäen Illumina® TotalPrep ™ -96 RNA -monistustarvikesarjaa (Ambion, kissa ei: 4393543). CRNA hybridisoitiin Illumina HumanHT12v4 taulukoihin käyttäen Illumina edellyttäen protokollia ja skannataan käyttäen Illumina HiScan yliopistossa Chicagon Genomics Core laboratorioissa.

Käyttämällä microarray tietoja HaCaT ja SCC-61-solut saadaan 2 tuntia ja 24 tuntia altistumisen jälkeen AMP-18 (eikä käsittelykontrollit), käytimme lähestymistapaa, joka on optimoitu ensimmäisen valvotun komponentti myöhemmin tilastollisesti ajettu hierarkkinen sijoitusta. Geenit, jotka olivat erittäin syrjiviä näiden kahden ryhmän välillä oli luokiteltu niiden syrjivän arvo määritellään niiden Fisherin suhde, jossa ennustavan tarkkuutta eri määräsi vähentää sarjaa määritettiin käyttämällä taaksepäin rekursiivinen toiminto poistamista algoritmi. Tämä menettely poistaa tarpeeton tai merkityksetön geenejä saadaan tarkin joukko geenejä, joilla on suurimmat ennustearvo. Sitten arvioitiin kaikkein differentiaalisesti ilmentyvien geenien tautien myöntämiseen, polku yhdistys, ja geeni ontologian avulla GeneAnalytics ohjelmistoja ja testattu toiminnallinen /fenotyyppinen yhdistysten käyttäen VarElect [8, 35, 36]. Top 20 geenit ilmentyvät differentiaalisesti SCC-61 ja HaCaT soluja käsiteltiin AMP-18 2 h esitetään S1 taulukossa.

TILASTOANALYYSI

Limakalvontulehdus pisteytettiin käyttäen sokkoutetuilla valokuvien, joka alkaa päivänä 4, ja joka päivä sen jälkeen. Tilastolliset erot hoitoryhmien määritettiin käyttäen Mann-Whitney Rank Sum testi ja chi-neliö analyysi kriittinen arvo on 0,05. Vaikutus huumeiden hoidon mukosiitin verrattuna ajoneuvon kontrolli arvioitiin seuraavien tekijöiden perusteella: 1. Ero päivien hiirtä kussakin ryhmässä oli vaikea mukosiitti (pisteet ≥ 3) analysoitiin. Jokaisena päivänä eläimet pisteytettiin (arviointi päivä), eläinten lukumäärä, joilla on sokaissut limakalvotulehdusta pisteet ≥ 3 kussakin hoitoryhmässä verrattiin vehikkeliryhmässä. Erot analysoitiin päivittäin sekä kumulatiivisesti. Hoito menestys määritettiin tilastollisesti merkitsevästi vähemmän määrä hiiriä tämän pisteet huume hoitoryhmässä, vehikkeliä vastaan, määritettynä chi-neliö analyysi. 2. sijoitus summan eroja päivittäin mukosiittipisteet in hoitoryhmissä versus vehikkeliryhmässä määritettiin. Jokaiselle arviointi päivä tulokset ajoneuvon ryhmässä verrattiin käsiteltyjen ryhmien avulla ei-parametriset rank sum analyysi. Hoito menestys määritettiin tilastollisesti merkitsevä aleneminen tulokset hoidetussa ryhmässä kahden tai useamman päivää Päivä 4 päivään 14. yksisuuntainen ANOVA tai ANOVA riveissä käytettiin arvioimaan alue-käyrän alla eläinten painot ja IVIS mittaukset. Aineisto analysoitiin Minitab ohjelmisto (Minitab, State College, PA). Ryhmät verrattiin kaksisuuntaisella

t

testi tai, yli kaksi ryhmää, analysoimalla varianssi. Mietimme

P

≤ 0,05 merkittävä.

Tulokset

estovaikutus AMP peptidi ja rhAMP-18 HNC Cells

vaikutusten tutkiminen AMP peptidi tai AMP-18 HNC viljeltyjen solujen ihmisen pään ja kaulan okasolusyöpä SCC-25 (kuvio 2, paneeli A) ja SCC-61 (paneeli B) solut jätetään hoitamatta, altistuvat AMP-18 (2 ug /ml), sisplatiini (2 uM SCC-25-soluja, 10 uM SCC-61-soluja) vasta, sisplatiinin läsnä ollessa tai ilman AMP peptidin tai rhAMP-18. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kanssa CellTiter-Blue® solunelinkykyisyysmääritys reagenssit (Promega) käyttämällä mikrolevyn lukijaa. AMP-18 yksinään esti kasvua SCC-25 (P = 0,02) ja SCC-61 (P = 0,04) soluja 10-15% (kuvio 2). Sisplatiinia inhiboi merkittävästi kasvua molemmissa solulinjoissa: SCC-25-solujen 25%, ja SCC-61-solujen 50%: lla verrattuna kontrolliviljelmiin (P 0,001). Lisäämällä joko AMP peptidi tai rhAMP-18 monistettiin sytotoksisuutta Sisplatiinin estämällä kasvun SCC-25-soluissa 30% (AMP peptidi, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03), ja SCC-61 solujen 65 % (P 0,05) ja 75% (P 0,02), vastaavasti.

SCC-25 (A) tai SCC-61 (B) solut jätettiin käsittelemättä, altistuvat AMP-18 (2 ug /ml), sisplatiini (2 uM SCC-25-soluja, 10 uM SCC-61-soluja) vasta, sisplatiini, kun läsnä on 2 ug /ml AMP peptidi, tai rhAMP-18: ssa 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin CellTiter-Blue reagenssia. Kokeet suoritettiin neljänä rinnakkaisena. Arvot ovat keskiarvoja ± SE. Lisäämällä joko AMP peptidi tai rhAMP-18 monistettiin sytotoksisuutta Sisplatiinin estämällä kasvun SCC-25-soluissa 30% (AMP peptidi, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03), ja SCC-61 solujen 65 % (P 0,05) ja 75% (P 0,02), tässä järjestyksessä.

AMP Peptide Treatment Additiivisesti Estää syövän kasvua kanssa Radiation

Edellinen näyttö siitä, että AMP peptidi voi herkistää syöpäsolut säteilylle ksenograftimallia [14] ja kaksi ihmisen HNC solulinjoja sisplatiiniin kulttuuri (kuvio 2), yhdessä hiirillä tai hamstereita että peptidillä hoitamisen ollut myönteisiä kliinisiä vaikutuksia säteily- ja sisplatiinin aiheuttama OM [ ,,,0],13, 14], johti meidät kysymään, jos nämä kaksi vaikutukset AMP peptidin voitiin osoittaa käytettäessä potilaalle tehdä mallin HNC samassa eläimessä. Neljä ryhmää eläimiä tutkittiin: 1. käsittelemätön; 2. PBS (ajoneuvo) ja säteily; 3. AMP-peptidi; ja 4. AMP peptidin ja säteily.

määrittämiseksi hoidon vaikutusta AMP peptidin kasvaimen etenemiseen ja ilman sädehoitoa, kasvaimet kaikkien eläinten arvioitiin käyttäen IVIS järjestelmää. In ei säteilytetty hiirissä potilaalle tehdä kasvaimia kielen kasvoi progressiivisesti, ja anto AMP peptidi ei muuttunut kasvaimen kokoa merkittävästi (ryhmät 1 ja 3) (kuva 3). Vuorokausina 5 ja 8 IVIS arvot käsittelemättömän (6,59 x 10

7 ± 9,6 × 10

6) ja AMP peptidi käsiteltiin (6,50 x 10

7 ± 8,67 x 10

6) eivät olleet tilastollisesti erilainen, kuten myös tässä päivinä 10 ja 14, kun IVIS arvot käsittelemättömän (1,78 x 10

8 ± 2,47 x 10

7) ja AMP peptidi käsiteltiin (1,61 x 10

8 ± 2,32 x 10

7) eivät eronneet. Hiirillä annetaan säteily (30 Gy), kasvaimen koko, mitattuna keskimääräisenä IVIS säteilyä, jatkoi kasvuaan PBS (ajoneuvo) käsittely (ryhmä 2), mutta pysyi ennallaan AMP peptidi kohtelun päivää 5 ja 8 sekä päivää 10 ja 14 ( ryhmä 4) (kuvio 4). Kasvaimen kokoa (keskiarvo ± SE) säteillyllä hiirillä, koska AMP peptidi verrattuna hiirillä PBS, väheni merkitsevästi (P ​​= 0,03), kun arvioidaan päivää 10 ja 14 (kuvio 4). Tämä havainto viittasi siihen, että AMP peptidi ei häiritse kykyä keskittyi säteilyn estävät solujen kasvua, vaan pysähtyi syöpäsolujen kasvun.

ortotrooppinen malli HNC syövän perustettiin ymppäämällä bioluminesoiviin SCC-25-LUC soluja etummaisessa kielen nude-hiirten. Kasvaimen koko eri ryhmissä arvioitiin ja verrattiin päivää 5 ja 8 sekä päivää 10 ja 14 käyttäen IVIS injektion jälkeen D-lusiferiini. Hiiret Ryhmien 1 ja 3 ei ollut säteilytetty, kun taas eläimet Ryhmät 2 ja 4 saivat 30 Gy päivänä 0 tutkimuksen. Käsittely PBS (ryhmä 2) tai AMP peptidi (ryhmä 4) annettiin ruiskeena s. c. kerran päivässä. Säteilytetyssä hiirillä, käsittely AMP peptidi liittyy paljon pienempi IVIS radianssi verrattuna hoitoon PBS, joka osoittaa, että AMP-peptidi vähensi kasvainten kasvua. Edustavia IVIS kuvia kielen kasvainten 32 hiirillä esitetään.

Säteilytetyt eläimiä käsiteltiin AMP peptidin tai PBS, ja IVIS säteily mitattiin vuorokausina 5 ja 8, ja sen jälkeen päivinä 10 ja 14. tarkoittaa ± SE verrattiin. Hiirillä annettiin PBS, IVIS loiste vaikutti lisäävän välillä päivää 5 ja 8 sekä 10 ja 14, kun taas loiste hoidettuihin eläimiin AMP peptidi oli muuttumaton välillä päivää 5 14. päivää 10 ja 14, hoito AMP peptidi vähensi kasvaimen kokoa verrattuna hoitoon PBS (* P = 0,03). In ei säteilytetty hiirissä potilaalle tehdä kasvaimia kielen kasvoi asteittain; anto AMP peptidi ei muuttunut kasvaimen kokoa merkittävästi (ei kuvassa).

AMP peptidi eivät osoittaneet mitään haittavaikutuksia kehon painoon. Hiiret kaikissa 4 ryhmissä näytteillä painonlasku kasvaimia perustettiin kielen, joka oli selvempi säteilytettyyn eläimillä (tuloksia ei ole esitetty).

terapeuttinen vaikutus AMP peptidin säteilyn aiheuttamista mukosiitin

suostumuksella tulokset aiempien tutkimusten AMP peptidi lieventää kehittämiseen mukosiitti aiheuttama säteily [14]. Vaikka säteilyteho ohjaus (PBS) eläimet kaikissa kehittyneissä haavainen mukosiitti (ryhmä 2) päivällä 12, vain 37,5% AMP-käsiteltyjen eläinten (ryhmä 4) on tällainen (P = 0,03), kun taas 11. päivänä, limakalvon haavaumia esiintyi 62,5 % ryhmän 2, mutta mikään tietty AMP peptidi (P = 0,003) (kuvio 5). Siten AMP peptidi viivästynyt puhkeamista haavaisen mukosiitin ja vaikuttaneet myönteisesti sen kesto.

Säteilytys kielen ja suun limakalvon seurasi päivittäinen käsittely AMP peptidin tai ajoneuvo (PBS). Haavainen mukosiitin kehittäneen pisteytettiin kuvatulla

Methods

. Mukosiitti pisteet 3,0 (katkoviiva) osoittaa limakalvon haavaumat, joka korreloi merkittävästi ihmisen suun mukosiittia. Eläimet käsiteltiin ajoneuvon saavutti pisteet 3 päivänä 12, kun taas hiiret, joita käsiteltiin AMP peptidillä ei. Mukosiitti tilanne oli merkittävästi pienempi vuorokausina 11 (* P = 0,003) ja 12 (** P = 0,03), mutta ei Päivä 13 (P = 0,1) hoidettuihin eläimiin AMP peptidin verrattuna tietyn ajoneuvon. Arvot ovat keskiarvoja ± SE.

AMP-18 Inhibioitu apoptoosi HaCaT mutta ei HNC Solut

Viimeaikaiset tulokset tutkimuksissamme [10-15] ja muut [17] viittaavat siihen, että AMP-18 on dalmatialaistäpläisiä. AMP-18 stimuloi kasvua ja on anti-apoptoottisia epiteelisoluissa, kuten HaCaT keratinosyyteissä [13]. Se näyttää toimivan tuumorisuppressorina [37], mahdollisesti indusoimalla apoptoosin [38], estävät epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja syövän solumigraation [39], ja /tai indusoimaan solun vanhenemista [40]. Todellakin, ilmentyminen AMP-18 vaimentua tai poissa mahasyövän kudoksessa [11, 17, 18], ja pienenee, kun krooninen gastriitti etenee surkastumista ja metaplasiaa [40, 41].

Voit selvittää apoptoosin voisi