Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

edistyksestä huolimatta adjuvanttihoitoa viime vuosikymmeninä, haiman ja paksusuolen syövät ovat edelleen kuolinsyistä maailmassa. Bakteeritoksiinit, jotka sitoutuvat spesifisesti solujen pinnalla esillä glykosfingolipidit, ovat potentiaalinen uusi hoito. Selvitimme ilmaus globotriaosyyliseramidi (Gb3Cer /CD77), Shiga-toksiini reseptorin, ihmisen haiman ja paksusuolen adenokarsinooman.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tissue lipidiuutteita Hyväksytty paria syöpä- ja viereisten normaalin kudoksen 21 haiman ja 16 paksusuolensyöpä potilasta tutkittu ohutkerroskromatografia overlay määrityksessä yhdessä uuden massaspektrometrialla lähestymistapaa. Gb3Cer /CD77 paikallistettiin immunofluoresenssimikroskopialla on kryoleikkeet pahanlaatuisia ja vastaavat tervettä kudosnäytteistä. 62% haiman ja 81% paksusuolen adenokarsinoomien osoittivat lisääntynyttä Gb3Cer /CD77 ilmaisu, kun taas 38% ja 19% pahanlaatuisten haiman ja paksusuolikudos vastaavasti ei, mikä osoittaa yhdistys tämän markkerin kanssa neoplastisen transformaation. Myös Gb3Cer /CD77 liittyi huono erilaistumiseen (G 2) haimasyövän (P = 0,039). Massaspektrometrinen analyysi osoittaa tehostettu ilmentyminen Gb3Cer /CD77 pitkä (C24) ja lyhytketjuisten rasvahappojen (C16) in pahanlaatuinen kudosten ja viittasi läsnäolo hydroksyloituneiden rasvahappo lipoforms, joita ehdotetaan olevan tärkeitä reseptorin kohdistamista. Niitä voidaan havaita 86% haiman ja noin 19% paksusuolen adenokarsinoomien. Immunohistologia kudosta kryoleikkeet osoitti kasvain-yhdistys näiden reseptorien.

Johtopäätökset /merkitys

Tehostettu ilmaus Gb3Cer /CD77 useimmissa haiman ja paksusuolen adenokarsinoomien johtaa tutkimaan Shiga-toksiini, sen B-alayksikköä tai B-alayksikkö-johdannaisten uusia terapeuttisia strategioita hoitoon Haastavasta syöpäsairauksia.

Citation: Distler U, Souady J, Hülsewig M, Drmić-Hofman I, Haier J, Friedrich AW, et al. (2009) Shiga-toksiinin Reseptori Gb3Cer /CD77: Kasvain-Association ja lupaava terapeuttinen kohde haimassa ja paksusuolen syövän. PLoS ONE 4 (8): e6813. doi: 10,1371 /journal.pone.0006813

Editor: Georg Häcker, Technical University Munich, Saksa

vastaanotettu: 30 maaliskuu 2009; Hyväksytty: 22 Kesäkuu 2009; Julkaistu: 28 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Distler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus on rahoitettu Deutsche Forschungsgemeinschaft (URL: www.dfg.de) myöntää FR2569 /1-1 ja MU845 /4-1 Graduiertenkolleg GRK1409 /1 (URL: http: //zmbe.uni-muenster.de/GRK1409 /) ja Deutsche Krebshilfe (URL: www.krebshilfe.de) myöntää DKH 106742. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman ja paksusuolen syövät ovat neljänneksi ja toiseksi yleisin syövän syiden kuolleisuuden länsimaissa vastaavasti osuus arvioitu 84250 kuolemantapausta vuonna 2008 pelkästään Yhdysvalloissa [1]. Kanssa eloonjäämismediaani ajan noin 6 kuukautta ja 5-vuoden eloonjäämisluvut 5% haimasyöpä joukossa kaikkein vaarallisin yhteisen kasvaimia. Ennuste kärsivien potilaiden paksusuolikarsinoomat etäinen etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi on lähes yhtä huono kuin haimasyövän [2]. Vain noin 10-15% haimasyövän potilaat ovat ehdolla mahdollisesti parantava leikkaus [3], [4], korostaa pikaista tarvetta kehittää uusia strategioita potilaiden hoitoon näillä leikkaushoitoon kasvaimia. Kohdennettu hoitojen, esimerkiksi, joka perustuu bakteerien ja kasvien toksiineja tai monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat solun pinnalla glykosfingolipidit (GSLs), jotka yli-ilmennetään haimassa ja /tai paksusuolen syövän, saattavat osoittautua lupaavia lähestymistapoja lisähoitona leikkauksen jälkeen [5] – [9].

GSLs, joka koostuu hydrofiilisestä oligosakkaridiketjun ja hydrofobinen keramidi membraaniankkuri [10], ilmaistaan ​​kiinteä ainesosina lipidilauttoja ulomman pakkausselosteessa solukalvon [11]. Lisäksi niiden osallistuminen solujen kasvun säätelyssä ja solun tarttumiseen [12], solun pinnalla sijaitsevat oligosakkaridiketjujen GSLs ”toimivat” kuin paikkoja tarttua kiinni bakteerit [13] ja hyödynnetään eri myrkkyjä, kuten Shiga-toksiinien (Stxs), pinta-sitovia , solun sisäiseen liikenteeseen ja signalointi tapahtumia [14]. Stxs (jota kutsutaan myös verotoxins), jotka on valmistettu patogeenista

Escherichia coli

kantoja [15] – [19], kuuluvat AB

5 perheessä bakteeritoksiineja. Ne koostuvat entsymaattisesti aktiivinen A-alayksikkö, joka estää proteiinisynteesiä biosynteesiä muuttamalla isäntä rRNA ja myrkytöntä homopentameerinen B-alayksikköä [20], [21]. B-pentameeri sitoutuu etuoikeutetut GSL reseptorin globotriaosyyliseramidi (Gb3Cer /CD77) ja laukaisee sisäistämisen AB

5-Gb3Cer kompleksin reseptorin endosytoosin

kautta

clathrin kuorrutettu rakkuloiden [22] tai endosyyttistä reiteillä, joihin ei liity clathrin päällystettyjä kuoppia [23]. Toksiini-reseptorikompleksin läpikäy taaksepäin kulkeutuminen Golgin verkon endoplasmakalvostoon. Sen jälkeen retro-translokaation sytosoliin [24], yksi molekyyli proteolyyttisesti käsitellyt

1-alayksikköä voivat estää proteiinisynteesiä ja tappaa solun.

Poikkeava ilmentyminen GSLs esiintyy lähes kaikissa ihmisten ja eläinten syövät [12], [25], ja monet kasvaimeen liittyviä antigeenejä ovat nyt tiedetään olevan GSLs. Lisääntynyt ilmentyminen Stx-reseptorin Gb3Cer /CD77 on raportoitu erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, kuten munasarjojen [26] ja rintasyövän [27] tai pahanlaatuinen meningiooma [28]. Viime aikoina tehostettu ilmentyminen Gb3Cer /CD77 on kuvattu korreloi etäpesäkkeiden kehittymisessä paksusuolen syöpä [9], [29]. Gb3Cer /CD77 mahdollistaa myös kasvain-spesifisen solukalvon lokalisointi proteiinien (esim. G. Hsp70) [30]. Kuten solun pinnan molekyylejä, kasvaimeen liittyvät GSLs ovat saatavilla vasta-aineita tai GSL-sitovan toksiinien (eli Stx), mikä tekee niistä ehdokkaan tavoitteet syöpäsairauksien hakemukset [31]. Niinpä STX-ligandi Gb3Cer /CD77 on parhaillaan tutkittavana mahdollisena kohteena ehdokas toksiinia terapeuttisten [28], [29], [32], [33].

Tässä tutkimuksessa analysoitiin haiman ja paksusuolen syövän kudoksen ilmentymistä Gb3Cer /CD77, käyttäen ohutkerroskromatografia (TLC) GSL poimii kudosten ja immunohistologinen värjäys kudoksen kryoleikkeet. Tehostettu ekspressio Stx-reseptorien oli havaittavissa useimmissa haiman ja paksusuolen syöpä kudoksiin, vastaavasti, mikä osoittaa yhdessä neoplastisen transformaation. Lisäksi rakenteellisia muutoksia lipidin ankkurit kasvaimeen liittyvien Gb3Cer /CD77 lajeja havaittiin syöpäkudoksiin sekä kasvaimen erilaisia ​​käyttämällä uutta massaspektrometrian lähestymistapa yhdistää TLC immuno- [8], [34]. Siten lisääntynyt ilmentyminen ja lipidien korjauksilla Gb3Cer /CD77 syövissä toistettava tämä tavoite lupaava ehdokas Stx ja /tai Stx-konstruktioita onkologisissa sovelluksissa sekä haiman ja paksusuolen syöpää sairastavilla.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Paikallinen eettinen komitea lääketieteellinen neuvoston Westfalen-Lippe ja lääketieteellisen tiedekunnan yliopistollisen sairaalan Münster (Münster, Saksa) hyväksyi nykyisen tutkimuksen (viitenumero 1IXHai). Kaikki potilaat ilmoitettiin ja suostumuksensa kirjallisesti.

Surgical näytteet

Tutkimus tehtiin käyttämällä näytteitä haiman (n = 21) ja paksusuolen (n = 16) adenokarsinooman potilailta, joille oli tehty leikkaus niiden ensisijainen kasvaimia [5]. Kasvainhistologiaa määritettiin seuraavat kriteerit UICC [35]. Ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia kohortin potilaiden kanssa karsinoomien kuvataan lisätaulukot S1 ja S2. Kasvaimen näytteet jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä välittömästi kirurgisen toimenpiteen avulla ja säilytettiin -80 ° C: ssa kunnes analysoitiin. Vastaavat ohjaus näytteet saadaan samasta potilaasta samaan elimeen sivuston ilman makroskooppisia etäispesäkkeitä joka vahvistettiin histologinen tutkimus.

valmistaminen lipidiuutteita välillä kirurgisista näytteistä

Kudokset homogenisoitiin ja uutetaan kahdesti 2 ml: ssa kloroformia /metanolia (1/2, v /v), 2 ml: ssa kloroformia /metanolia (1/1, v /v), ja 2 ml: ssa kloroformia /metanolia (2/1, v /v). Yhdistetyt supernatantit Kunkin kudoksen uute (12 ml), kuivattiin pyöröhaihduttimella ja fosfolipidit saippuoidaan inkuboimalla 4 ml: ssa natriumhydroksidin 1 N NaOH: a 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Neutraloinnin jälkeen 400 ui 10 N HCl: a, näytteet dialysoitiin deionisoitua vettä ja kuivattiin kiertohaihduttimella. Uutteet säädettiin määritelty tilavuutta kloroformi /metanolia (2/1, v /v), joka vastaa 0,1 mg märkäpainoa kohti ui.

puhdistus Stx1

Stx1 puhdistettiin

E. coli

C600 (H19J) kantavat

STX

1

geeni

E. coli

O26: H11 kanta H19 [36]. Lyhyesti, bakteerit hajotettiin sonikoimalla ja uutettiin polymyksiini B (3000 U /ml) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Saksa). Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti, joka sisältää raakaa Stx1 konsentroitiin ultrasuodattamalla ja kromatografoitiin hydroksi- sarakkeessa, jota seuraa kromato- [37]. Sarakkeessa sisältävät fraktiot Stx1 yhdistettiin, dialysoitiin ja alikvootteja säilytettiin -70 ° C: ssa käyttöön asti. Puhtaus Stx1 valmisteen seurattiin SDS-PAGE, ja rakenteellisen eheyden toksiini tarkistettiin peptidikartoituksella käyttämällä massaspektrometriaa [21]. Biologinen aktiivisuus määritettiin Vero sytotoksisuuden [38].

Anti-Gb3Cer /CD77 ja anti-Stx1 vasta-

valmistelu ja spesifisyys polyklonaalisten kanan anti-Gb3Cer /CD77-vasta tunnustetaan Galα1 -4Galβ1-4Glc-jäännös Gb3Cer /CD77 lajeja on kuvattu [39], [40]. Stx1 havaittiin hiiren IgG1 monoklonaalinen anti-Stx1-vasta-aine 109/4-E9b (Sifin, Berliini, Saksa).

Korkean suorituskyvyn ohutkerroskromatografialla (TLC) ja viite GSLs

seosta, jossa oli neutraalia GSLs ihmisen erytrosyyttien, joka koostuu monohexosylceramide, lactosylceramide, Gb3Cer /CD77, ja globotetraosylceramide (Gb4Cer), käytettiin viite [40] TLC-vasta-aineen ja Stx1 overlay määrityksissä. Nimistö GSLs noudattaa IUPAC-IUBM suositusten 1997 [41]. Viite GSLs ja kudosten lipidiuutteita levitettiin lasin tukema silikageeli 60 esipäällystetty korkean suorituskyvyn ohutkerroskromatografialla (TLC) levyä (ei. 1.05633.0001, Merck, Darmstadt, Saksa), jossa on automaattinen asetin (Linomat IV, Camag, Muttenz, Sveitsi) ja erotettiin kloroformi /metanoli /vesi (120/70/17, kunkin vol., 2 mM CaCl

2). Viite GSLs värjättiin orsinoli.

TLC Peite Pitoisuus

Gb3Cer /CD77 havaittiin käyttäen päällekkäisten polyklonaalista kanan vasta-ainetta tai Stx1 kuvatulla [40], [42]. Ensisijainen anti-Gb3Cer /CD77 ja toisen alkalisella fosfataasilla leimattua vasta-aineita (Dianova, Hampuri, Saksa) käytettiin 1:2000 laimennoksia. Sitoutuneet sekundaariset vasta-aineet visualisoitiin värin kehittymisen 0,05% (w /v) 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti-p-toluidiini suola (BCIP, no. 6368,3; Roth, Karlsruhe, Saksa). Immunovärjättiin kromatogrammit pestiin glysiinipuskuria ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Sininen immunopositiivista Gb3Cer /CD77-kvantitoitiin kanssa CD60 skanneri (Desaga, Heidelberg, Saksa, ohjelmistot ProQuant

R, versio 1.06.000). Gb3Cer /CD77 summat on laskettu semikvantitatiivisesti suhteellisena ilmentymisen verrattuna viitaten GSLs. Toissijainen densitometristä data (katso ”Tilastollinen analyysi” alla) käytettiin määrittämään 4 ryhmiin kasvaimen ilmaisun verrattuna normaaleissa kudoksissa muodollisella cut-pisteen analyysi: korkea yliekspressio (luokka I, 4000 x), kohtalainen yliekspressio (luokka II, 700 x 4000), yhtä suuri lauseke (luokka III, -700 x 700), ja alensi lauseke (luokka IV, x -700) ja haima syöpä ja korkea yli-ilmentyminen (luokka I, 2000 x), kohtalainen yliekspressio (luokka II, 200 x 2000), yhtä suuri lauseke (luokka III, -200 x 200), ja alensi lauseke (luokka IV, x -200) paksusuolen syöpä, vastaavasti.

Immunohistokemia

immunosytokemiallinen värjäys suoritettiin kuten on kuvattu [8]. Lyhyesti, kryoleikkeet (4 um) inkuboitiin anti-Gb3Cer /CD77-vasta-ainetta (1:15) ja anti-CD31-vasta-aine (1:200) (hiiren lgG1, klooni MEM-05, Immunotools, Friesoythe, Saksa). Sitoutuvien vasta-aineiden Gb3Cer /CD77 ja CD31 detektoitiin dichlorotriazinylamino fluoreseiini (DTAF) -leimattua anti-kana-IgY-vasta-aine (Dianova) ja Alexa Fluor 568-konjugoidulla anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Invitrogen, USA, CA), laimennettiin 1: 40 ja 1:250, vastaavasti. Negatiivisia kontrolleja, immunohistokemia suoritettiin käyttäen kanan esi-seerumia ja merkityksetön hiiren IgG1-vasta-aine (Immunotools). Tuman DNA: han solujen värjättiin 4 ’, 6-diamidine-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI, Sigma-Aldrich, USA). Fluorokromileimattuja vasta-aineita ja DAPI-värjätään tumat arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla (Axioskop, Zeiss, Jena, Saksa), alkuperäinen suurennos x 40 (tavoite linssin Plan-Neofluar, numeerinen aukko 0,75) jälkeen julkaistujen menetelmien [43]. Vahvistaa hydrofobisen luonteen tavoite anti-Gb3Cer /CD77-vasta-aineita, lipidit uutettiin metanolilla ja kloroformi /metanoli (1/1, v /v) asennettu osat ennen värjäystä.

Infrapuna Matrix-laserdesorptio /ionisaatio Orthogonal Time-of-Flight (IR-MALDI-o-TOF) massaspektrometria

Asianomaiset IR-MALDI-o-TOF massaspektrometrillä (MDS Sciex, Concord, Ontario , Kanada) ja suora TLC-IR-MALDI-MS-analyysin immunopositiivista bändejä Stx1 TLC overlay määritys on eritelty Distler et al. [34]. GSLs analysoitiin positiivisten ionien moodi käyttäen glyserolia matrix.

Tilastollinen analyysi

Ensisijainen densitometristä tietoja immuno- Gb3Cer /CD77 bändejä ja toissijainen densitometristen dataa, saadaan ero arvoista pareittain lasketaan vähentämällä normaalin samankaltaisesta kasvainkudoksen arvot olivat käännetty ohjelmistopaketin SPSS, versio 14.0.2 (SPSS Inc., Chicago, IL) ja nonparametric tilastollista analyysiä. Merkillä testiä käytettiin joukon ensisijainen densitometristä tietojen tutkia merkitystä suhdetta Gb3Cer /CD77 ilmaisun ja neoplastisen transformaation. Mediaani Testi suoritettiin perus- ja toisen densitometristen tietojen testata onko Gb3Cer /CD77-ilmentyminen oli merkitsevästi erilainen eri kasvaimet käsittävät eri ennusteeseen viittaavia ryhmiin. Korrelaatiokertoimet laskettiin sijoittui arvojen ensisijainen densitometrinen tietojen normaalien ja tuumorikudosten, vastaavasti, ja sijoittui erotusarvot. Kendallin τ käytettiin asteen arvioimiseksi yhdistyksen välillä Gb3Cer /CD77-ilmentymisen ja histopatologisia luokittelu. Kaikki testit kaksisuuntaisia ​​ja αwas asetettu 0,05.

Tulokset

koetettiin kudosta 21 haiman ja 16 koolonadenokarsinooma potilaiden ekspressioon Stx-reseptorin Gb3Cer /CD77 (rakenteelle katso kuva 1 ). Tätä tarkoitusta varten, raa’at lipidiuutteita ja kryoleikkeet alkaen postoperatiivinen pareittain pahanlaatuisten

versus

viereisen ennallaan kudoksiin samasta potilaat analysoitiin TLC overlay tekniikkaa ja immunofluoresenssimikroskoopilla. Päästääkseen rakenteellisia yksityiskohtia kasvaimeen liittyviä muutoksia Gb3Cer /CD77 laji, uusi massaspektrometria lähestymistapaa käytettiin, jossa yhdistyvät TLC immunodetektioon IR-MALDI-o-TOF-MS: [8], [34]. Märkä painot tutkitaan syöpä- ja terveiden kudosten ja vastaavien patologian tiedot on lueteltu Täydentävät taulukoissa S1 ja S2.

alikvootit raa’asta lipidiuutteita vastaa 2 mg kudosta märkäpainoa normaalin (N) ja kasvainkudoksen (T) lisättiin samanaikaisesti erotettiin TLC: llä. Neutral GSLs ihmisen punasoluihin toimivat positiivisina viittaus overlay määrityksessä (R, 10,8 ug) ja orsinoli tahra (O, 16,0 ug). Tiivistelmää Gb3Cer /CD77-ilmentymisen syöpäkudokset sekä kasvaimen yksiköiden on esitetty taulukossa 1, ja histopatologiset tulokset haiman ja paksusuolikarsinoomat esitetty yhteenvetona lisätaulukot S1 ja S2 vastaavasti. Edustavia esimerkkejä haiman (A) ja paksusuolen syövissä (B) kasvaimen luokkiin I-IV on esitetty. Yksikään tutkituista paksusuolikarsinoomat havaittiin yhtä ilmentymisen Gb3Cer /CD77 viereisissä normaalin kudoksen (B). Siten luokan III oli täyttämättä kohortin potilaista. C, rakenne Stx1 reseptorin Gb3Cer (D18: 1, C16: 0). Keramidin (CER) rasva-ankkuri ensisijaisesti esiintyy terveen ihmisen kudoksista C24 tai C16 rasvahappoa mutta vakio sfingosiinin (D18: 1).

TLC immunodetektio kasvainliitteisten Gb3Cer /CD77 haimassa ja Colon syöpä

Identtiset erillä Raakalipidikoostumuksen uutteiden pareina neoplastisista ja vastaavien muuttumattomina kudoksia tehtiin samanaikaisesti TLC, jonka jälkeen TLC overlay havaitseminen Gb3Cer /CD77 käyttäen Stx1 ja anti-Gb3Cer /CD77-vasta-aineen. Positiiviset nauhat rankattiin mukaan eri ilmentymistä Gb3Cer /CD77; listalla 1 tarkoittaa korkeinta intensiteettiä (taulukko 1). Perustuen densitometrian, kasvaimet jakaa neljään ryhmään: vaihtelee korkea (I), ja kohtalainen (II) yliekspressio, yhtäläiset (III), ja alensi lauseke (IV).

haimasyöpä.

Kuvio 1A esittää neljä yksi edustaja Stx1 TLC overlay tahroja kasvaimen ja liittyvien tervettä kudosta uutteita, joista kukin edustaa yhtä neljään haimasyöpä. Kaikkiaan 61,9% tutkituista haiman karsinoomat osoittivat kohtalaisesta suureen yli-ilmentymisen Gb3Cer /CD77, kun taas 14,3% näytteillä yhtäläiset ja 23,8% vähentynyt Gb3Cer /CD77 ekspressiotasoja (katso taulukko 1). Globotetraosylceramide (Gb4Cer), joka tunnetaan nimellä ”matalan affiniteetin” ligandi Stx1, oli havaittavissa haiman kasvaimet ja viereisten normaaleissa kudoksissa käyttäen Stx1 kuin tunnistus työkalu. TLC immunostains käyttämällä polyklonaalista Gb3Cer /CD77-vasta olivat samanlaisia ​​havaintoja kuin saatiin kanssa Stx1 TLC overlay jotka osoittavat hieman suurempi herkkyys jäljitettäessä Gb3Cer /CD77-lajeja (katso Täydennyskuvio S1A).

Colon syövät.

Kuvio 1B esittää kolme yhden edustajan Stx1 TLC overlay tahroja paksusuolen syövän pareittain, kukin edustaa yhtä kolmesta ryhmästä todennettu paksusuolen syövissä. Gb3Cer /CD77 oli kohtalaisen hyvin yli-ilmentynyt 81,3% pahanlaatuisten

versus

terve paksusuolen kudoksiin. Mikään paksusuolen kasvainten näytteillä yhtäläiset ilmaisun tuloksena vapautunut luokkaan III. Vähemmän Gb3Cer /CD77 havaittiin 18,8% tuumorin kudoksen (katso taulukko 1). Kuten haiman kudoksista, Gb4Cer ollut mitattavia määriä koolontuumoreissa ja viereisten normaaleissa kudoksissa käyttäen Stx1 kuin tunnistus työkalu. Rinnakkainen TLC immunostains käyttämällä polyklonaalista Gb3Cer /CD77-vasta esitetään Täydennyskuvio S1B.

immunohistokemiallinen Detection of Tumor-Associated Gb3Cer /CD77 haimassa ja paksusuolen syövän

Sitovat anti Gb3Cer /CD77 vasta jääleikkeille haiman ja paksusuolen syöpä kudoksia ja vastaaviin terveitä kudoksia saman potilaita seurattiin histokemiallisesti. Leikkeitä co-immunovärjättiin vastaista vasta-ainetta endoteelisolumarkkeri CD31, ja solujen tumat visualisoitiin DAPI fluorokromilla.

Esimerkiksi laaja vasta-aineen sitoutumisen haiman kasvainsoluja (T) todettiin potilaan 18 (kasvain luokka I), kuten on esitetty kuviossa 2A. Sitä vastoin vähän tai ei lainkaan Gb3Cer /CD77 havaittiin normaalissa haima- kudoksessa (N). Satunnainen endoteelisolujen verisuonten, joiden tiedetään kantavan Gb3Cer /CD77 [21], [39], [43], osoittivat myös positiivista värjäytymistä haiman pahanlaatuinen kudos.

Jaksot normaalin (N) ja kasvainkudoksen (T) haimasyövän potilaan 18 (A) ja paksusuolen syövän potilaan 13 (B) immunovärjättiin anti-Gb3Cer /CD77-vasta-aineen ja coimmunostained kanssa vasta-aine endoteelisolujen markkerin CD31. Solujen tumat havaittu DAPI. Mittaviivat vastaavat 20 um. Edustavia esimerkkejä kasvaimista luokan I esitetään (katso taulukko 1). Histopatologisen tiedot haiman ja paksusuolen syöpä on esitetty yhteenvetona lisätaulukot S1 ja S2 vastaavasti.

immunohistokemiallinen vertailut osoittavat suurta Gb3Cer /CD77 ekspressiotasot koolontuumoreissa (T) esimerkkeinä potilas 13, kuva 2B. Sen sijaan, viereisen normaalin kudoksen (N) samasta potilaasta ei ollut Gb3Cer /CD77. Angiogeneesi näyttää eteni joissakin tutkittu koolonsyöpien osoituksena CD31 ja Gb3Cer /CD77 positiivinen endoteelisolujen sisällä kasvain massa.

Ohjaus kohdat inkuboitiin hiiren IgG1 isotyyppikontrolleja sekä kanan esi-immunoseerumilla ei tahraa . Sen jälkeen GSL uuttamalla kudosten, Gb3Cer /CD77 ollut enää havaittavissa vasta (tuloksia ei ole esitetty).

Rakenteelliset karakterisointi kasvainliitteisten Gb3Cer /CD77 haimassa ja paksusuolen syövän

Stx1 positiivinen bändejä TLC eroteltu lipidiuutteita olivat suoraan analysoitiin TLC-levyillä TLC-IR-MALDI-MS kuvatulla [34]. Massaspektrit hankittiin positiivisen ionin tilassa ja kaikki Gb3Cer /CD77 lajeja havaittiin kuin yksittäin hintaan monosodiated molekyyli-ionit.

haimasyöpä.

Yhdistetty Stx1 havaitseminen ja TLC-IR-MALDI-MS osoittaa yksittäisen koostumukseen muutoksia yli-ilmentynyt Gb3Cer /CD77 lajien neoplastisia verrattuna ennallaan haimakudoksesta (esim potilas 19 (kasvain luokka I), kuva 3). Analysoidaan päällinen Stx1 positiivisen kolminkertainen bändi kasvaimen (T, vasen paneeli, upotus), runsain [M

3 * + Na]

+ molekyyli-ionit viittaavat läsnäolo Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C24: 0) kyllästetyllä D18: 0 sphinganine lisäksi yleisempää kertatyydyttymättömiä D18: 1 sfingosiiniä (sphingenine). Sama pätee alaikäisen [M

2 * + Na]

+ ja [M

1 * + Na]

+ ioneja, jotka viittaavat rakenteisiin Gb3Cer (D18: 1 /D18 : 0, C23: 0) ja Gb3Cer (d18: 1 /D18: 0, C22: 0), vastaavasti. Sitä vastoin vain vähäinen ekspressio Gb3Cer /CD77 voitiin havaita ylemmässä Stx1 positiivinen kaistan normaalin haiman kudoksen, kuten on esitetty kuviossa 3 (N, vasen paneeli). Korkea runsaus [M

4 + Na]

+ ionit alemman Stx1 positiivinen kaista kasvaimen (T, keskimmäinen paneeli) osoittaa vahvaa yliekspressio Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) kasvainkudoksessa verrattuna ja hyvin vähäistä ioneja vastaavan terveen kudoksen (N, keskimmäinen paneeli). Kuitenkin näkyvin rakenteellista muutosta havaittiin alimmalla Stx1 positiivinen bändi syöpäkudoksen havaitsemalla [M

5 * + Na]

+ ioneja (T, oikea paneeli), joka oli havaittavissa normaalissa kudoksessa ( N, oikea paneeli). Verrattuna Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) (t, keskimmäinen paneeli), muutos 16 atomimassayksikköä osoittaa hydroksylaatio Keramidin osan, joka johtaa ehdotetun rakenteen Gb3Cer (D18: 1, H16: 0) kuljettaa hydroksyloitu C16: 0 rasvahappo. Lisäksi ionit osoitteessa

m /z

1064,65 ilmaisemaan Gb3Cer (D18: 0, H16: 0). Tämä silmiinpistävä keramidiin muutos esiintyi 85,7% haiman kasvaimia toistaiseksi tutkittu. Synopsis Ehdotetun rakenteiden Gb3Cer /CD77 laji on säädetty täydentävä taulukossa S3.

lipidiuutteita vastaa 2 mg märkäpainoa normaalin (N) ja kasvainkudoksen (T) potilaan 19 (kasvain luokka I, katso taulukko 1 ja täydentävä taulukko S1) on samanaikaisesti erotettiin TLC seurasi overlay analyysin avulla Stx1. Stx1 positiivinen Gb3Cer /CD77 bändejä, jotka on merkitty nuolenkärkien vuonna takkakasetti analysoitiin TLC-IR-MALDI-MS. Vallitseva [M

3 * + Na]

+ molekyyli-ionit ylemmän kaistan kasvainkudoksen (T, vasen paneeli) vastaavat Gb3Cer (d18: 1 /D18: 0, C24: 0) ja pieniä ioneja voitaisiin osoittaa Gb3Cer (d18: 1 /D18: 0, C23: 0) ja Gb3Cer (d18: 1 /D18: 0, C22: 0), vastaavasti. Ylemmällä kaistalla normaalin kudoksen (N, vasen paneeli) paljon pienempi intensiteettien nämä molekyyli-ionit havaittiin. Korkea runsas [M

4 + Na]

+ ionit alemman kaistan kasvain (T, keskimmäinen paneeli) edustavat Gb3Cer (D18: 1, C16: 0), joka on havaittavissa vain pieniä määriä normaali kudos (N, keskimmäinen paneeli). Analyysi alimman kaistan kasvaimen (T, oikea paneeli) paljasti [M

5 * + Na]

+ ioneja, jotka ilmaisevat hydroksyloitu Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, H16: 0) . Tämä Gb3Cer /CD77 muunnos oli havaittavissa normaalissa kudoksessa (N, oikea paneeli).

m /z

arvot molekyyli-ionit ja ehdotti rakenteita Gb3Cer /CD77-variantteja pahanlaatuisten ja viereisten normaaleissa kudoksissa sekä viittaukset ihmisen erytrosyyttien luetellaan Täydentävä taulukossa S3.

Colon Syövät.

Stx1 tunnistus yhdistettynä TLC-IR-MALDI-MS pystyimme profiloida yksittäisiä rakenteita yli-ilmentynyt Gb3Cer /CD77 lajeja esimerkinomaisesti esitetty potilaalle 16 kuviossa 4 (T, vasen paneeli) . Korkea runsas [M

3 + Na]

+ ionit viittaavat Gb3Cer (D18: 1, C24: 1 /C24: 0) todennäköisimpänä Gb3Cer /CD77 variantteja ylemmällä Stx1 positiivinen bändi, mukana vähemmän lausutaan [M

2 + Na]

+ ja [M

1 + Na]

+ ioneja, jotka vastaavat Gb3Cer (D18: 1, C23: 0) ja Gb3Cer (D18: 1, C22: 0), vastaavasti. Sama ionit, mutta paljon pienempi intensiteetit saatiin ylemmän Stx1 positiivinen kaistan normaalin kudoksen (N, vasen paneeli). Alemmalla kaistalla kasvaimen (T, keskimmäinen paneeli), näkyvä [M

4 + Na]

+ ioneja voitaisiin määritetty Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) rakenne, joka on myös havaittavissa normaalissa kudoksessa mutta vähemmän ionin intensiteetti (N, keskimmäinen paneeli). Alimmassa kaistalla [M

5 * + Na]

+ ionit osoittavat läsnäolo Gb3Cer (D18: 1, H16: 0) variantti, jossa hydroksyloitu C16: 0 rasvahappo, joka ei löydy normaali kudos (N, oikea paneeli). Tämä merkittävä seramidi muutos havaittiin noin 19% paksusuolen kasvaimen TLC immunostains toistaiseksi tutkittu. Synopsis Ehdotetun rakenteiden Gb3Cer /CD77 laji on säädetty täydentävä taulukossa S3.

lipidiuutteita vastaa 2 mg märkäpainoa normaalin (N) ja kasvainkudoksen (T) potilaan 16 (kasvain luokka II, katso taulukko 1 ja täydentävä taulukko S2) on samanaikaisesti erotettiin TLC seurasi overlay analyysin avulla Stx1. Stx1 positiivinen Gb3Cer bändejä, jotka on merkitty nuolenkärkien vuonna takkakasetti analysoitiin TLC-IR-MALDI-MS. Vallitseva [M

3 + Na]

+ molekyyli-ionit ylemmän kaistan kasvainkudoksen (T, vasen paneeli) vastaavat Gb3Cer (D18: 1, C24: 1 /C24: 0) ja vähemmän runsas [M

2 + Na]

+ ja [M

1 + Na]

+ ioneja Gb3Cer (D18: 1, C23: 0) ja Gb3Cer (D18: 1, C22: 0 ), vastaavasti. Ylemmällä kaistalla normaalin kudoksen (N, vasen paneeli) paljon pienempi intensiteetit vastaavien molekyyli-ionit havaittiin. Vahva [M

4 + Na]

+ ionit alemman kaistan kasvain (T, keskimmäinen paneeli) edustavat Gb3Cer (D18: 1, C16: 0), joka on havaittavissa vain pieninä määrinä normaalissa kudoksen (N, keskimmäinen paneeli). Analyysi alimman kaistan kasvaimen (T, oikea paneeli) paljasti [M

5 * + Na]

+ ioneja, jotka ilmaisevat hydroksyloitu Gb3Cer (D18: 1, H16: 0). Tämä Gb3Cer /CD77 muunnos oli havaittavissa normaalissa kudoksessa (N, oikea paneeli).

m /z

arvot molekyyli-ionit ja ehdotti rakenteita Gb3Cer /CD77-variantteja pahanlaatuisten ja viereisten normaaleissa kudoksissa sekä viittaukset ihmisen erytrosyyttien luetellaan Täydentävä taulukossa S3.

tilastollinen analyysi

Rasiakuvaajat ensisijaisen densitometristä tiedot TLC overlay määrityksen määritetty Gb3Cer /CD77 tasoilla haiman (n = 21 potilasta) ja paksusuolen (n = 16 potilasta) kudoksia tarjotaan (kuvio 5A ja B, vastaavasti). Yliekspressio Gb3Cer /CD77 tallennettu 81,3% paksusuolen syövän verrattuna viereisiin terveen kudoksen oli merkittävä (P = 0,021), kun taas lisääntynyt ilmentyminen Gb3Cer /CD77 on 61,9% pahanlaatuisten haiman kudoksista ei ollut merkitsevä (p = 0,189). Sekä haiman ja paksusuolen syöpä, läsnäolo Stx tunnistettavasta Gb3Cer /CD77 nauhat eivät korreloineet mihinkään kliinis parametrit (patologiset data nähdä lisätaulukot S1 ja S2). Kuitenkin haiman kasvaimia, ero arvot Gb3Cer /CD77 ilmaisu korreloi luokan kasvaimen erilaistumiseen (P = 0,039, τ = 0,396), mikä osoittaa korkeampaa Gb3Cer /CD77 vähemmän eriytetty syöpäsairauksia. Tämä assosiaatio köyhien eriyttäminen kasvainten potilailla, joilla Gb3Cer /CD77 yli-ilmentyminen pahanlaatuinen haimakudos kuvattu rasiakuvaajien kuvion 5C. Lopuksi ilmaus Gb3Cer /CD77 on suurempi vähemmän eriytetty pahanlaatuinen kudos viittaa STX reseptorin mahdollisena merkki huonosta haiman kasvaimia.

Laatikot rajaavat ylä- ja alapuolella, että 25% ja 75 % prosenttipisteet. Viivat ruutuihin ja pikku neliöt ilmaisevat mediaani ja keskiarvot ja kahden × pienin ja suurin arvo, vastaavasti. A, vaikkakaan ei merkitsevä (P = 0,189, n = 21), tehostettu ilmentyminen Gb3Cer /CD77 voitiin havaita haimatuumorien verrattuna normaaleihin kudoksiin. B: n ilmentyminen Gb3Cer /CD77 on merkittävästi lisääntynyt kasvaimen paksusuolen kudoksiin verrattuna viereisen normaaleissa kudoksissa osoittaa välisen assosiaation Gb3Cer /CD77 ilmentymisen ja neoplastisessa transformaatiossa (*, P = 0,021, n = 16). C, korrelaatio Gb3Cer /CD77 ilmaisun ja haiman kasvain eriyttäminen (n = 20 potilasta, koska yksi kasvain ei voitu sijoittaa, katso taulukko 1). Kasvaimet jaettiin kahteen ryhmään sen mukaan, histopatologisten luokittelu: grade≤2 (n = 14 potilasta) ja laatu 2 (n = 6 potilasta). Sijoitus korrelaatio analyysi eroarvojen viittaa tilastollisesti merkitsevä korkeampi Gb3Cer /CD77 ilmentyminen haimassa kasvaimissa arvostellaan 2 (*, P = 0,039, τ = 0,396).

Keskustelu

By klustereiden in lipidilautan kalvo mikrodomaineja [11], [44], oligosakkaridiketjuissa on GSLs on voimakas sitova toiminta suhteessa niiden ligandit [45]. Siten, kasvaimeen liittyvät GSLs, ts GSLs osoittaa kohonnut ilmentyminen syöpäsoluissa verrattuna normaaleissa kudoksissa, sopivat erinomaisesti kasvainten diagnosointiin ja kohdennettuja syöpähoitoihin [31], [46], [47]. Näin ollen vasta-aineita, lektiinejä tai toksiinien GSL sitovia erityispiirteet ovat synnyttäneet suurta mielenkiintoa onkologian.