Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on synkkä ennuste. Korkea toistumisen riskiä seuraavien poistettu kirurgisella antaa perustelut adjuvanttihoito. Kuitenkin vain osa potilaat hyötyvät liitännäishoitona. Tunnistaminen molekyylimarkkereita ennustaa hoitotuloksia on siis perusteltua. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli arvioida, onko lauseke uusien ehdokas biomarkkereiden, kuten MikroRNA, voi ennustaa kliinistä tulosta PDAC hoidetuilla potilailla adjuvanttihoito.

Menetelmät /Principal Havainnot

Formaliinifiksoidusta parafiiniin näytteet kohortin 82 resektoidun Korean PDAC tapauksia analysoitiin proteiinin ilmentymistä immunohistokemiallisesti ja microRNA ilmaisun käyttämällä kvantitatiivista Real-Time PCR. Coxin suhteellisten riskien mallia analyysi alaryhmässä, jossa potilaita hoidettiin adjuvanttihoidon (N = 52) osoitti, että vähemmän kuin mediaani miR-21 ilmentyminen liittyi merkitsevästi pienempi riskisuhde (HR) kuolemalle (HR = 0,316; 95% CI = ,166-,600; P = 0,0004) ja toistuminen (HR = 0,521; 95% CI = ,280-+0,967; P = 0,04). MiR-21 ilmentymistilanne tullut suurin yksittäinen ennakoivan biomarkkeri hoitotulokseen kaikkien 27 biologisia ja 9 kliinispatologiset tekijät arvioitiin. Mitään merkittävää yhdistys havaittu potilailla joita ei ole hoidettu adjuvanttihoito. Itsenäisessä validointi kohortin 45 jäädytettyjen PDAC kudoksia Italian tapauksissa kaikki käsitelty adjuvanttihoito pienempi kuin mediaani miR-21 ilmentyminen vahvistettiin korreloivan pidentymistä sekä tautivapaan elinajan. Lisäksi transfektio anti-miR-21 tehosti kemosensitiivisyys on PDAC soluja.

Johtopäätökset merkitys

Low miR-21 ilmentyminen liittyi hyötyvät adjuvanttihoitona kahdessa itsenäisessä kohorttia PDAC tapauksissa ja anti-miR-21 lisäsi syöpälääkettä aktiviteetti

in vitro

. Nämä tiedot osoitettava, että miR-21 voi sallia ositusta adjuvanttihoito ja edustaa uutta potentiaalisimmaksi hoidon PDAC.

Citation: Hwang JH, Voortman J, Giovannetti E, Steinberg SM, Leon LG, Kim YT, et ai. (2010) tunnistaminen MicroRNA-21 biomarkkerina varten Chemoresistance ja kliinistä hyötyä jälkeen adjuvanttihoito in kokoisen Haimasyöpä. PLoS ONE 5 (5): e10630. doi: 10,1371 /journal.pone.0010630

Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 23 tammikuu 2010; Hyväksytty: 20 huhtikuu 2010; Julkaistu: 14 toukokuu 2010

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: osittain rahoittaa National Institutes of Health, National Cancer Institute sisäiset ohjelmaa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvä kuolema ja viime vuosikymmeninä vain vähän parannusta selviytyminen on havaittu huolimatta laajaa tutkimustyötä [1]. Noin 95% eksokriinisisten haimasyövistä ovat haimatiehyen adenokarsinoomat (PDAC), josta esiintyvyys on noussut tasaisesti viime vuosikymmeninä [1], [2]. Leikkaus on toteuttamiskelpoinen 15-20%: lla potilaista, mutta senkin jälkeen täydellinen resektio, ennuste on edelleen synkkä, jossa on 5 vuoden pysyvyys jääneet 10-20% [3].

Haimasyöpä on tunnetusti resistenttejä kemoterapiaa ja sädehoitoa. Adjuvanttihoitoa on vaatimattomasti tehokas ja voi olla merkittäviä toksisuuksia. Siksi rooli adjuvanttihoito vuonna kokoisen haimasyöpä on vielä epäselvä, vaikka yleensä ajatellaan hyötyä potilasalaryhmässä [4], [5]. Mahdollisuus tunnistaa tämä alaryhmä olisi suuri edistysaskel hallintaan tämän taudin koska se mahdollistaisi potilaan ositusta lisähoito [6]. Siksi ennakoiva markkereita herkkyys adjuvanttihoito sekä uusia terapeuttisia tavoitteita tarvitaan pikaisesti tässä sairaudessa [7], [8].

Altered ilmaus useita tekijöitä on liittynyt PDAC aggressiivista käyttäytymistä ja ennustetta. Esimerkiksi kaikkien syöpien, PDAC on korkein taajuus

K-Ras

mutaatioita, mikä on johtanut keinotteluun sen soveltamisen diagnostisena sekä ennustetyövälineenä merkki [7]. Proteiinituote

K-Ras

on GTP: tä sitova proteiini välittävä useita kriittisiä solujen toimintojen, kuten solujen lisääntymisen, solujen säilymiseen ja liikkuvuuteen. Kuitenkin suurin osa näyttöä, niin pitkälle, viittaa siihen, että

K-ras

mutaatiot eivät merkittävästi liittyy selviytymisen haiman syöpäpotilailla [9], [10]. Muut tutkimukset viittasivat ennustavia merkitys muuttunut proteiinien ilmentymisen mukana Ras signalointireitillä, kuten Akt. Kuitenkin fosforyloidun Akt ilmentymistasot liittyvät sekä lyhyempi ja pidempi eloonjäämisen kokoisen PDAC potilailla [11], [12]. Muut merkkiaineet raportoitu riippumattomia ennustajia PDAC ennusteen ovat p16, matriksin metalloproteinaasi 7 (MMP-7) ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) ilmentymistä [13]. Silti monet biologiset näkökohdat säätelevät tämä tauti tunnetaan edelleen huonosti eikä yksikään markkeri on osoitettu ennustaa kliiniseen tulokseen.

Viime vuosina on käynyt selväksi, että proteiinin ekspressiota voidaan säädellä MikroRNA (miRNA ) [14]. MikroRNA ovat luokan pienet ei-koodaavat RNA: t, jotka ovat vuorovaikutuksessa mRNA: t koodaavat geenit voivat suunnata posttranskriptionaalisella tukahduttaminen [15]. MicroRNA on osoitettu liittyvän kasvaimen synnyssä ja kasvaimen kasvua, ja myös olevan tärkeä rooli chemoresistance [16] – [19].

Lisäksi ilmaus MikroRNA on kudosspesifisiä ja tietyt syövän histotypes voidaan luokitella perustuu microRNA ekspressioprofiileja [20], [21]. Haimasyövän, useita miRNA on raportoitu poikkeavasti ilmaista, mukaan lukien MikroRNA keskeisten roolista syövässä, kuten ”onkopsykologista (patogeeniset) -miRs”, miR-21 ja miR-155, ja ”tuumorisuppressorin Mirs”, asennuspalveli- 29b ja miR-34 and Let-7 perheiden [22] – [29]. Prekliiniset tutkimukset PDAC solut osoittivat, että eksogeenista miR-34 yliekspressio liittyi käyttökuntoon p53 kasvain vaimennin toiminto p53-vajaiden solujen sekä estämällä haimasyövän kantasolun itseuudistumisen [30]. Ylössäätöä Let-7 liittyy käänteinen epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) in gemsitabiinin-resistenttien solujen [31]. MicroRNA-29b voi kohdistaa de novo DNA metyylitransferaasi 3A ja 3B (DNMT3A ja DNMT3B) ja johtaa maailmanlaajuiseen hypometylaatio ja yli-ilmentyminen eri tuumorisuppressorigeeneille, mukaan lukien p16 [32]. MicroRNA-21 ilmentyminen liittyy lisääntynyt leviäminen, invasiivisia ominaisuuksia, ja gemsitabiinin chemoresistance ja aiemman tutkimus osoitti, että korkea miR-21 ilmentyminen määritettynä in situ -hybridisaatiolla, oli ennustava lyhyempi selviytymisen PDAC solmussa-negatiivisten potilaiden [28], [33]. MicroRNA-155 on mukana tukahduttamisessa

tuumoriproteiinia 53 aiheuttama ydinaseiden proteiini 1

, joka on proapoptoottiset stressin aiheuttama p53 kohdegeenin ja negatiivinen prognostiset vaikutus korkean miR-155 ilmentymistä havaittiin kohortin of PDAC tapaukset mukaan lukien potilaat, joilla on pitkälle edennyt sairaus ja /tai paikallinen R2-resektio [34], [35].

tavoitteena tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida mahdollisia biologisia merkkiaineita ennustaa lopputulokseen adjuvanttihoitoa. Siksi olemme suorittaneet integroiva analyysi ilmentymisen miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155 ja anna-7a-2 in kohortin PDAC potilaita, joilla tiedetään olevan patologinen ja hoito ominaisuudet . Lisäksi olemme tutkineet ilmentymä 20 tunnettuja potentiaalisia proteiinimarkkereita ja tavoitteet hoito, mukana PDAC etenemisen ja ennusteen (katso taulukko S1 täydellinen katsaus 27 biologisten ja 9 kliinispatologiset tekijät Tutkimuksessa käytetty) [6], [13 ]. Koska miR-21 ilmentymistilanne tullut suurin yksittäinen ennakoivan biomarkkeri hoitotulokseen kaikista tekijöistä arvioitu adjuvanttia saaneilla potilailla, analysoida tarkemmin miR-21 ilmentyminen suoritettiin toisessa kohortissa 45 potilasta, kaikki hoidettu adjuvanttihoito. Tämä riippumaton joukko vahvisti merkittävän yhdistys miR-21 ilmentymistilanne sekä selviytymisen ja taudista vapaan eloonjäämisen. Lisäksi yhdistys matalan miR-21 ilmaisutapoja hyötyvät adjuvanttihoitona tukivat

in vitro

tietoja, jotka osoittavat lisääntyneen kemosensitiivisyys on PDAC solujen transfektion jälkeen anti-miR-21.

menetelmät

Osallistujat, tutkimus, käsittelystä details

kaksisataa viisi potilasta, joille tehtiin haimasyövän resektoimalla lopullinen diagnoosi haimasyöpä oli jälkikäteen tarkistetaan käyttämällä sähköiset potilastiedot vuosina 1999-2007 Seoul National University Hospital ja Seoul National University Bundang Hospital. Heistä kahdeksankymmentäkaksi potilaat olivat täysin resektoitiin (R0) haiman adenokarsinooma ja olivat mukana tutkimuksessa. Patologinen kasvain vaiheessa määritettiin mukaan American sekakomitean Cancer (AJCC) Cancer Staging, 6

painos [36]. Lyhyesti, patologisissa T1-2 vaiheissa (pT1-2) etäispesäkkeitä rajoittuu haima, kasvaimen koko on pienempi tai suurempi kuin 2 cm vaiheissa pT1 ja pT2, vastaavasti. Patologinen T3 (pT3) vaihe kasvaimet ulottuvat haima, ilman osallistumista keliakia akselin tai ylempi suolilievevaltimo, kun taas pT4 kasvaimet ominaista osallistumisen keliakia akselin tai ylempi suolilievevaltimo. Mitä imusolmukkeiden solmukohtien vaiheessa patologista solmukohtien vaihe 1 (PN1) osoittaa alueellinen imusolmuke etäpesäke. Lopuksi M1 osoittaa läsnäolon etäispesäkkeitä. Disease vaiheissa I, II A, II B, III ja IV osoittavat ”pT1-2 pN0 M0”, ”pT3 N0 M0”, ”pT1-3 PN1 M0”, ”pT4 tahansa N M0” sekä ”kaikki pT tahansa pN M1”, vastaavasti . Potilaat saivat adjuvanttihoitoa yhdistettynä kemosädehoito (CCRT) tai molempia (n = 52) tai eivät saaneet hoitoa (n = 27). Hoitostatus kolme potilasta oli tuntematon. Adjuvanttihoitoa ja kemosädehoidon koostui yhdistelmiä gemsitabiinin tai 5-fluorourasiilin (5-FU). FFPE näytteet tarkistetaan diagnosointiin ja kasvaimen sisällön Seoul National University Hospital, sekä National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD. Validointi kohortti koostui jäädytettyjen yksilöitä 45 peräkkäisen haiman adenokarsinooma Italian diagnosoidaan vuosina 2001-2004 Regional Referral Center for Haiman Sairauksien hoito Yliopistosairaalassa Pisa, Pisa, Italia [37]. Adjuvanttihoitona koostui gemsitabiinin perustuvan yhdistetyn modality hoitoa. Tiedot adjuvantti hoito ovat taulukossa S2.

Ethics

Potilaan suostumus ja tutkimus hyväksyntä saatiin paikallisesta Institutional Review Boards mukaan lain määräysten osallistujamaiden. Tietoon kirjallinen suostumus saatiin Korean potilaista, jotka olivat vielä elossa ajankohtana tutkimuksen kautta ihmisen kudospankille. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Institutional Review Board of Human Clinical Research Center. Mitä Italian potilaat, kirjallinen suostumus saatiin. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Pisan yliopiston eettisen komitean.

immunohistokemia

ilmentyminen 20 proteiinimarkkereita ja tavoitteet hoito tutkittiin immunohistokemiallinen (IHC). Kuten on raportoitu taulukossa S1 arvioimme ekspressiotasot seuraavat markkerit: verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), matriksimetalloproteinaasi-2 (MMP2), matriksimetalloproteinaasi-7 (MMP7), matriksimetalloproteinaasi-9 (MMP-9), kudoksen estäjä metalloproteinaasi-3 (TIMP-3), epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), Leikkauskorjauksessa rajat komplementaatioryhmässä 1 (ERCC1), kemokiini (CXC-motiivin) 3-reseptorin (CXCR3), kemokiini (CXC-motiivin) -reseptorin 4 (CXCR4), amfireguliini, epiregulin, hepatosyyttikasvutekijä (HGF), neuropiliini, insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 -reseptorin beta (IGF-1 R), Ron β, c-Met, fosforyloitu-c-Met (Pc-Met), tymidylaattisyntaasia (TS), E -cadherin, ja ribonukleotidireduktaasi alayksikköä M1 (RRM1). Tissue mikrosiru (TMA) kohdat muodostettiin käyttäen ydin kudosbiopsioista (halkaisija 2 mm) on saatu yksittäisistä parafinoidut Korean haimasyöpä yksilöitä. Koepaloja otettiin mukaan uusi vastaanottaja parafiiniblokit käyttäen trephine laitetta (Superbiochips Laboratories, Seoul, Korean tasavalta). Kunkin kudoksen array lohko sisälsivät jopa 50 ydintä ja 2 array lohkot valmistettiin tutkimuksen aikana.

TMA kohdat poistettiin parafiini käyttäen ksyleeniä, niihin lisätään alkoholiin ja värjättiin spesifisten vasta-aineiden kuten taulukossa S3. Sillä ERCC1, H-pisteet osoittavat värjäyksen voimakkuus (0-3) kerrottuna kertoimella määräytyy osuuden positiivisia soluja: 0 jos 0% positiivisia soluja, 0,1 jos 1-9%, 0,5 jos 10-49%, 1, jos 50% positiivisia soluja. Kaikki muut tekijät, positiivista värjäytymistä tarkoitetaan signaalin voimakkuus on sama tai suurempi kuin 2 ja enemmän kuin 20% positiivisia soluja.

MicroRNA ilmaisu

RNA eristettiin FFPE kohdat käyttäen RECOVERALL- Yhteensä Nucleic acid Isolation kit (Ambion, Austin, TX) ja pakastetusta kudosleikkeiden kuten raportoitu aiemmin [38]. RNA: ta (10-100 ng) käytettiin ilmentymisen analyysi miR-21 (italialainen kohortti) tai miR-21, miR-29, miR-34a /b /c, anna-7a-2, ja miR-155 (Korean kohortti ) kvantitatiivisella Real-Time PCR (qRT-PCR), jossa TaqMan-MicroRNA määrityksissä ja 7900 HT-Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen pieniä ydin- RNA U66 tai RNU43, koska endogeeninen normalisointi säätimet Korean ja Italian yksilöitä, vastaavasti. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja tuloksia, jotka eivät täytä menetelmien laadunvalvontakriteerit jätettiin pois. Kvantifiointi suhteellisen mikroRNA ekspressio suoritettiin käyttämällä delta-Ct-menetelmällä. Expression määritettiin korkea, kun ilmaisun taso oli yhtä suuri tai suurempi kuin mediaani kohortin ja alhainen, kun oli alle mediaani kohortin.

In vitro -tutkimuksissa

Ihmisen PDAC solujen linjat BxPc3 , HPAF-II, HPAC, PANC-1 ja PL45 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja viljeltiin RPMI-1640-media, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini (50 IU /ml) ja streptomysiiniä (50 ug /ml) (Gibco, Gaithersburg, MD). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä 5% CO

2 75-cm

2 kudosviljelypulloon (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Saksa) ja talteen trypsiinillä-EDTA niiden eksponentiaalisesti kasvavilla vaihe. RNA uutettiin käyttäen Trizol-kloroformi-protokollan (Sigma, St. Louis, MO). RNA saannot ja eheys tarkistettiin mittaamalla optinen tiheys 260/280 nm Nanodrop® spektrofotometrillä.

perusilmennystä miR-21 arvioitiin kvantitatiivisella-Real-Time PCR, kuten yllä on kuvattu PDAC kudosten . Kvantifiointi miR-21 ilmentyminen suoritettiin käyttäen delta Ct menetelmä, normalisoimalla Ct monistusdatan kanssa RNU43. Suhteellinen miR-21 ekspressiotasot ilmaistiin mielivaltaisina yksikköinä (au).

Solun kasvun estäminen 5-FU (0,1-1000 uM), ja gemsitabiinia (0,1-1000 nM) plus säteilytys (100 cGy), määritettiin kolmesta erillisestä kokeesta, joissa käytettiin SRB (sulforodamiini-B) määritys, ja ilmaistiin prosentteina kontrollin (kantaja-käsitellyissä soluissa) absorbanssi, korjattu absorbanssi, ennen lääkkeen lisäksi, kuten aiemmin on kuvattu [39]. Säteilytetty eksponentiaalisesti kasvavat solut maljattiin 100 mm: n kudosviljelymaljoilla (Costar), annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan, ja säteilytetään käyttämällä 6 MV fotoni lineaarinen kiihdytin (General Electric, Buckinghamshire, UK). Säteilytyksen jälkeen solut kerättiin ja 10

4 solua /kuoppa maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja annettiin kasvaa vielä 48 tuntia lääkkeen väliaineessa tai käsitelty gemsitabiinin, kuten aiemmin on kuvattu [40]. 50% estävä pitoisuus (IC

50) solujen kasvun kullekin solulinjan määritettiin epälineaarisella pienimmän neliösumman käyrän sovitus annos-vaste käyrät (GraphPad PRISM versio 5, intuitiivinen ohjelmisto Science, San Diego, CA ). Vaikutus miR-21 solujen kasvuun ja kemosensitiivisyys arvioitiin transfektoimalla solut antisense-oligonukleotidit (anti-miR-21) hankittiin Ambion-Applied Biosystems (määritys ID, AM10206), 30 nM lopullinen pitoisuus. Solut maljattiin 200000 solua /kuoppa 3 ml: ssa RPMI: ssä, jossa oli 10% FBS: ää ja 1% antibiooteilla. 24 tunnin kuluttua solut altistettiin 9 ui Oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK) seerumittomassa väliaineessa, sekoitettiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin 3 ui 6,25 uM miR-21 prekursori tai inhibiittori. Soluja inkuboitiin myös miRNA negatiivisten kontrollien ja FAM-leimattu anti-mir (Ambion). 24 tunnin kuluttua väliaine poistettiin kuopista ja korvattiin RPMI, jossa on 10% FBS: ää, ilman antibiootteja. Sitten solut kerättiin trypsinisaatiolla ja siirrettiin 96-kuoppalevylle, jossa niiden annettiin kasvaa vielä 48 tuntia lääkkeen väliaineessa tai käsiteltiin 5-FU, kuten edellä on kuvattu. Muihin kontrollina kuoppia käytettiin RNA: n eristykseen, kuten on kuvattu edellä, kun taas transfektion tehokkuutta FAM-leimatun anti-Mir valvontaa arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla.

Tilastolliset menetelmät

vertailu, jossa esine parametrit olivat teki kahden ryhmän välillä käyttämällä Fisherin testiä. Yleistynyt versio Fisherin testiä käytettiin vertailuissa iän, kasvaimen vaiheen ja erilaistumisen luokalla, kun jaettu kolmeen ryhmään [41]. Todennäköisyys kokonaiselinaika (OS) tai tautivapaan elinajan (DFS) kuin ajan funktiona määritettiin Kaplan-Meier menetelmä, jossa log-rank-testi käytetään määrittämään tilastollista merkitystä eron Kaplan-Meier käyrät [42], [43] yksiulotteista ennustetekijät analyysejä, joissa potilaat olivat lopulta ryhmitelty kahteen ryhmään, määrittää alustavan arvioinnin neljään ryhmään käyttämällä kvartiileihin jakelun ryhmittelyä parametrin, oli p-arvo säätää kertomalla oikaisematon p-arvo kolme. Tämä selittäisi implisiittinen testaus, joka johti päätökseen sijoittaa potilaita molempien luokkien suuremmalla ennustetekijöiden eroa ryhmien. Coxin suhteellisen vaarat mallin analyysi suoritettiin määrittämään yhteinen yhdistys tekijät alunperin Havaittuja mahdollisia yhdessä lopputulokseen yksiulotteista analyysit (arvioimiseksi tässä

lopullinen malli

vain ne parametrit oikaisematon p 0,10 log -rank testi) [44]. Kaikki p-arvot ovat kaksisuuntaisia, ja lukuun ottamatta edellä mainittiin, esitetään ilman säätö monimuuttujille.

Kaikki

in vitro

kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kaksi kertaa. Data ilmaistiin keskiarvoina ± SE ja analysoitiin Studentin t-testiä ja /tai Mann Whitneyn testin mukaan. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin p 0,05.

Tulokset

Ominaisuudet potilaista

Taulukko 1 on yhteenveto kliinis ominaisuudet. Korean potilailla, mediaani ja DFS olivat 18,1 ja 9,1 kuukautta. Tässä kohortissa OS oli merkitsevästi pidempi hoidetuilla potilailla adjuvanttihoitoa ja /tai CCRT (n = 52): Keskimääräinen elinaika oli 21,3 vs. 14,7 kuukautta saaneilla potilailla vs. ei käsitelty adjuvanttihoidon (n = 27); p = 0,017. Kuva S1 Kaplan-Meier tontteja.

Expression analyysin tulokset

Expression of miR-21, miR-34a, miR-155 ja anna-7a oli havaittavissa kaikissa 82 tapausta ja ilmentyminen miR-29b, miR-34b, ja miR-34c 81, 73 ja 80 tapauksissa vastaavasti. Yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, jotka osoittavat, että miR-34b ja miR-34c on sama transkription promoottori [45], ilmentyminen arvot näistä miRNA korreloivat (tuloksia ei ole esitetty). IHC tulokset olivat saatavilla neuropiliini ja MMP-9: 80 tapauksissa, amfireguliini, HGF, EGFR ja TIMP-3 79 tapauksissa, Ron, CXCR-3, E-kadheriinin, RRM1, IGF-1 R, TS, VEGF, MMP-2: ja MMP-7 78 tapauksissa, CXCR-4 77 tapauksissa, c-Met ja Pc-Met 76 tapauksissa, ERCC1 75 tapauksissa ja epiregulin 73 tapauksessa.

Kuten on kuvattu -osiossa on kunkin proteiinin me pisteytetään värjäytymisen intensiteetti ja prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen. Kuvassa S2, edustavat kuvat immunohistokemiallisella värjäyksellä P-c-Met näkyvät. Taulukossa 2 esitetään yhteenveto tuloksista immunohistokemiallisella värjäyksellä kaikille tutkittu proteiineja.

Univariate analyysi

Yhteensä 36 kliinis, microRNA ja proteiini muuttujia arvioitiin niiden yhdessä OS tai DFS Korean kohortissa. Perustuen yhden muuttujan analyysin, joukko 10 ja 12 parametrit harkitaan arviointikohteiden Cox malleja OS ja DFS, vastaavasti (katso taulukko S4). Valitut parametrit testattiin myös mukaan adjuvanttihoitona tila (taulukko S4). Lisäksi minkä tahansa parametrin, väestö jaettiin 4 ryhmään vertailun: (1) negatiivinen parametri, ei adjuvanttihoitona vs. (2) negatiivinen parametri, adjuvanttihoitona vs. (3) positiivinen parametri, ei adjuvanttihoitona vs. (4 ) positiivinen parametri, lisähoito. Taulukko S4 luetellaan ainoastaan ​​yhdistelmä, jossa on siihen liittyvä p-arvo 0,10. Erityisesti voimakas vuorovaikutus miR-21 ilmentymistilanne ja adjuvanttihoitona tilan OS ja DFS osoitettiin. Matala miR-21 ilmentyminen liittyi pidempi OS ja DFS adjuvanttia saaneilla potilailla, joilla p-arvot 0,016 ja 0,02, vastaavasti, mutta ei potilailla, joita ei ole hoidettu adjuvanttihoidon (p-arvot 0,49 ja 0,93, tässä järjestyksessä). Tämä ero assosiaatio miR-21 ja hoitostatus tukivat vertaamalla alaryhmään matalan miR-21, adjuvantti hoidetuista potilaista ja muut potilaat. Ryhmä potilaita, joilla on alhainen miR-21, jotka saivat hoitona oli mediaani ja DFS 27,7 ja 16,2 kuukautta, vastaavasti. Jäljellä potilaalla oli mediaani 14,3 ja DFS 7,0 kuukautta, p-arvot 0,002 OS, ja 0,0095 DFS. Katso myös kuva 1 ja kuva S3.

Kokonaiselossaoloaika mukaan miR-21 aseman (A) ei adjuvanttia saaneilla potilailla ja (B) adjuvanttia saaneilla potilailla. Tautivapaan elinajan mukaan miR-21 asema (C) ei adjuvanttia saaneilla potilailla ja (D) adjuvanttia saaneilla potilailla.

Cens .: sensuroitiin

.

Cox malleja kokonaiselossaoloaika ja taudista vapaan eloonjäämisen

Käyttämällä taaksepäin valinta-algoritmin, Coxin malli rakennettiin sisältävien parametreja, havaittiin yhdessä liittyvän OS. Toinen malli havaittiin prognostisiin määrittämiseksi DFS (taulukot 3 ja 4). Vuodesta monimuuttujamenetelmin kaikkien potilaiden, kaikkein merkittävästi liittyvä parametri sekä käyttöjärjestelmän ja DFS, potilaat, joilla on alhainen miR-21, joita hoidettiin adjuvanttihoidon osoitettiin olevan merkittävästi pienempi riskisuhde (HR) kuolemalle (0,443, 95% CI: 0,263-,748; p-arvo, 0,002) ja uusiutumisen (0,358, 95% CI: 0,188-0,682; p-arvo: 0,002) verrattuna kaikkiin muut potilaat. Sitä vastoin potilailla ei ole hoidettu adjuvanttihoito pienempi kuin mediaani miR-21 ilmentyminen ei liittynyt merkitsevästi erilainen HR kuolemasta tai toistumisen 0,880, p-arvot 0,76 ja 0,30, vastaavasti.

vertailu covariates mukaan adjuvanttia käsitellään vs. hoitamattomat potilaat

Koska tapauksia ei satunnaistettiin hoitoon tässä tutkimuksessa, halusimme määrittää, on huomattavia eroja kovariaattina jakautuminen saaneista potilaista ja ei käsitelty adjuvanttihoidon (taulukko S5). Ainoa merkittävä ero oli pienempi mediaani-ikä adjuvanttia hoidetussa ryhmässä 61 vuotta (vaihteluväli: 45-75 vuotta) vs. 66 vuotta (vaihteluväli: 49-83 vuotta) hoitamattomassa ryhmässä (p-arvo: 0,002, Wilcoxonin kaksi -sample testi). Katso taulukko S6 ero proteiinin ilmentymisen. Lisäksi rakensimme erillinen Cox malleja hoidetuilla potilailla adjuvanttihoidon vs. potilaita ei hoidettu adjuvanttihoito. Ensin teimme yhden muuttujan analyysiin, molemmissa ryhmissä (taulukot S7 ja S8). Cox malli analyysi osoittaa, että vain alaryhmässä adjuvanttia saaneilla potilailla matalan miR-21 asema liittyi merkitsevästi pienempi HR kuolemalle ja uusiutumisen (taulukko 5, taulukko 6, taulukko 7 ja taulukko 8). Alaryhmässä ei adjuvanttia saaneista potilaista, positiivinen angiolymphatic invaasion ja ilmentyminen miR-34a yläpuolella mediaani liittyvän kohonneeseen HR kuolemasta ja uusiutumisen, vastaavasti, kun taas miR-21 ei ole riittävän alhainen p-arvo sisällytettäväksi lopullinen malli.

vertailu covariates mukaan miR-21 ilmentyminen

Jakelu kliinis ja IHC covariates verrattiin välillä matalan miR-21 ja korkea miR-21 potilasta, kuten esitetty taulukossa 9 ja taulukossa S9. Mediaani-ikä matalan miR-21 ryhmä oli 63 vuotta (vaihteluväli: 45-83 vuotta), ei merkittävästi poikkea korkea miR-21 ryhmä, mediaani-ikä 64 vuotta (vaihteluväli: 46-78 vuotta), p-arvo: 0,94 . Oli kuitenkin suuntaus kohti kehittyneempiä AJCC vaiheessa (lla vs Hb) korkean miR-21 lauseke (p-arvo: 0,07). Samoin oli enemmän tapauksia, joissa huono eriyttäminen arvosana korkean miR-21 ryhmä, vaikka tämä ryhmä sisälsi myös enemmän tapauksia, joissa on hyvin eriytetty kasvaimia (taulukko 5). Emme voineet vahvistaa aiemmin raportoitu yhdistys miR-21 ja TIMP-3 ilmaisun [46], vaikka huomasimme, että Pc-Met ja VEGF: n ilmentyminen oli merkitsevästi yleisempää miR-21 korkea tapauksissa (taulukko S9).

Koska korkean miR-34a ilmentyminen osoitettiin liittyvän vähentynyt DFS olemme lisäksi verrata jakelu kliinis ja IHC covariates välillä matalan miR-34a ja korkea miR-34a potilaista. Korkea ekspressio miR-34a oli voimakkaasti yhteydessä korkea ekspressio fosfo-c-Met (p-arvo: 1x10E-6). Lisäksi korkea miR-34a ilmentyminen oli yhteydessä alhaiseen ilmaus HGF (p-arvo: 0,01) sekä korkean ilmentymisen VEGF (p-arvo: 0,01). Lopuksi pieni miR-21 ilmentyminen yleistyneet miR-34a alhainen tapaukset (p-arvo: 3x10E-8).

Korkean miR-21 ilmentyminen näyttää yhdessä lisääntynyt etäpesäkkeenä korko

Seuraavaksi vertasimme Paikallissarjaliikenneväylän vs. etäpesäkkeenä taudin alhainen verrattuna korkea ilmentymisen ryhmässä miR-21. Korkean miR-21 ilmentyminen ryhmä 25 ulos 41 potilaalla (61%) oli uusiutuva sairaus kaukana olevan sivuston, joka oli merkittävästi erilainen kuin matalan miR-21 ilmentyminen-ryhmää, jossa vain 12 pois 38 potilaalla (32%; 3 potilaat menettivät seurantaan) kokee etäpesäkkeenä (p-arvo: 0,013). Vertailun, ryhmässä, joka sai adjuvanttihoito 25 ulos 51 potilasta (49%) oli uusiutuva sairaus. Tämä ei ollut merkitsevästi erilainen ryhmästä ei käsitelty adjuvanttihoidon 11 ulos 26 potilaalla (42%) koki etäpesäkkeenä (p-arvo: 0,63; jossa 5/82 potilasta puuttuu, koska tiedot ovat riittämättömät).

Vaikka ei ole tilastollisesti merkitsevä, korkea miR-21 ilme osoitti myös suuntaus kohti suurempia vaiheessa ja positiivinen imusolmuke tila (taulukko 5).

Validation kohortti

sarja 45 resektoitiin haiman adenokarsinooma potilaiden kaikki potilaat saivat myös adjuvantin gemsitabiinin, käytettiin vahvistamaan ennakoivan roolin miR-21 ilmentyminen valkoihoisilla. Mediaani ja DFS olivat 20,4 ja 18,7 kuukautta, vastaavasti. Katso taulukosta 1 kliinis parametrien (Italian kohortti). MiR-21 ilmentyminen oli havaittavissa kaikissa yksilöitä. Univariate analyysi osoitti suuntaus kohti Merkitsevä yhteys köyhien kasvain erilaistumisen ja lyhyempi OS (p-arvo: 0,07), kun taas esiintyminen hermo tunkeutumisen niukasti liittyvän merkittävästi lyhyempi DFS (p-arvo: 0,047), mutta ei OS (p- arvo: 0,90), kuten esitetty taulukossa S10. Ikä, sukupuoli, vaihe, imusolmuke, ja verisuonten tunkeutuminen ei liittynyt lopputulokseen. Potilaat, joilla on korkea miR-21 ilmentyminen oli huomattavasti lyhyempi OS, eli mediaani 15,6 verrattuna 24,4 kuukautta potilailla, joilla miR-21 ilmentymistason huonompi mediaani (p-arvo: 0,006). Mediaani DFS potilailla, joilla on korkea miR-21 ilme oli 14,0 kuukautta verrattuna 23,8 kuukautta potilailla, joilla on alhainen miR-21 lauseke (p-arvo: 0,0042). Katso Kuva 2. Kaplan-Meier käyrät. Cox malleja rakennettiin joka vahvisti yhdistys miR-21 ilmentymistilanne ja selviytymisen kesto, korkea miR-21 lauseke, joka ainoana tekijä, liittyy lisääntynyt HR kuolema 3,538 (95% CI: 1,415-8,849; p -arvo: 0,007) ja toistuminen on 4,008 (95% CI: +1,385-11,595; p-arvo: 0,01). Yhdistetty analyysi kahdesta ikäluokat vahvisti merkittävän ennustava merkitys miR-21 ilmentymistilanne, kuten on raportoitu kuvioissa S4 ja S5.

(A) Kokonaiselossaoloaika mukaan miR-21 tila ja (B) taudista vapaan selviytymisen tila mukaan miR-21 tila.

Cens .: sensuroitiin

.

MiR-21 ja antiproliferatiivisia vaikutuksia 5-FU PDAC soluissa

Expression of miR-21 oli havaittavissa kaikissa PDAC solussa linjat, jotka vaihtelevat 4,5 PL45 soluihin 1,5 au että BxPC-3-soluissa (kuvio 3A). Annoksesta riippuva solujen kasvun esto havaittiin sen jälkeen, kun sekä 5-FU, ja gemsitabiinin sekä sädehoidon, kuten on esitetty kuviossa 3B-C. Erityisesti, 5-FU-hoito johti vaatimaton solujen kasvun esto in PANC-1 ja PL45 soluihin, IC

50s 138,4 ± 23,4 uM ja 174,2 ± 31,1 pM, vastaavasti. Niistä tutkittiin solulinjat, BxPC3 ja HPAF-II olivat herkkiä gemsitabiini ja 5-FU, vastaavasti, kun taas PL45 oli kaikkein kestäviä sekä 5-FU: n ja gemsitabiinin sekä sädehoito.

(A) MiR -21 ilmentyminen 5 PDAC solulinjoissa. Expression määritettiin kvantitatiivisen PCR: llä käyttämällä delta Ct menetelmää RNU-43 referenssinä ja arvot ovat au. (B-C) edustaja käyrät kasvua estäviä vaikutuksia 5-FU (B) ja gemsitabiinia plus sädehoito (C) , 48-tunnin lääkealtistuksen. (D). Solut ympättiin 10

4 /kuoppa, ja antiproliferatiivisia vaikutuksia arvioitiin käyttämällä SRB-määritys, kuten on kuvattu menetelmissä. Keskimääräinen IC

50-arvot 5-FU: ta (48 h jatkuva altistus) olivat seuraavat: 36,3 uM (BxPC-3), 30,9 uM (HPAF-II), 138,4 uM (PANC-1) ja 174,2 uM (PL45 ); kun taas IC50-arvot gemsitabiini (soluissa esikäsiteltiin 100 cGray) oli 2,1 nM (BxPC-3), 3,4 nM (HPAF-II), 10,2 nM (PANC-1) ja 11,4 nM (PL45).