Krooninen sairaus

tiivistelmä

Olemme hiljattain kehittänyt menetelmän tuottaa ydinsoluissa kanssa leviämisen kapasiteetti ihmisen iPS soluista. iPS-ML (iPS-soluista peräisin myelooinen /makrofagi line), muodostetaan syöttämällä lisääntymistä ja anti-vanhenemista tekijät huomioon iPS-soluista peräisin myeloidisoluissa, kasvoi jatkuvasti M-CSF-riippuvaisella tavalla. Suuri määrä soluja, joilla makrofagin kaltaisia ​​ominaisuuksia voidaan saada helposti käyttämällä tätä tekniikkaa. Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme mahdollista soveltamista iPS-ML syövän hoitoon. Olemme perustaneet malli vatsakalvonsisäisesti levittää mahasyövän intraperitoneaalisesti ruiskuttamalla NUGC-4 ihmisen mahasyövän soluja SCID hiiriin. Kun iPS-ML ruiskutettiin intraperitoneaalisesti hiiriin ennalta laadittujen vatsakalvon NUGC-4 kasvaimia, iPS-ML massiivisesti kertynyt ja tunkeutui kasvainkudoksessa. iPS-ML ilmentävät IFN-β (iPS-ML /IFN-β) inhiboi merkittävästi vatsaonteloon kasvua NUGC-4 syöpä. Lisäksi iPS-ML /IFN-β esti myös kasvua ihmisen haimasyövän MiaPaca-2 vastaavaa mallia. iPS-ML ovat siis lupaava hoito agentti vatsakalvonsisäisesti levitetään syöpiä, joille ei tavanomaista hoitoa on tällä hetkellä saatavilla.

Citation: Koba C, Haruta M, Matsunaga Y, Matsumura K, Haga E, Sasaki Y, et al. (2013) terapeuttinen vaikutus ihmisen iPS-soluista peräisin ydinsoluissa ilmaiseminen IFN-β vastaan ​​vatsakalvonsisäisesti Disseminated Cancer ksenograftimalleissa. PLoS ONE 8 (6): e67567. doi: 10,1371 /journal.pone.0067567

Editor: Joseph Najbauer, Pécsin yliopisto Medical School, Unkari

vastaanotettu: 30 syyskuu 2012; Hyväksytty: 21 toukokuu 2013; Julkaistu: 24 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Koba et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grants-in-Aid nro. 23650609 ja 24300334 ja YN ja 23659158 ja S. S. päässä MEXT, Japani; apuraha Y. N. Princess Takamatsu Cancer Research Fund; Tutkimus apuraha S. S. varten Vaikeasti sairaudet alkaen terveys- ja hyvinvointi, Japani; ja avustuksen S. S. päässä Japanista Science and Technology Agency (JST). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Makrofageilla on olennaiset roolit säilyttää homeostaasiin kehossa. He asuvat kaikki kudoksiin ja harjoittavat eri toimintoja, kuten poistaa tunkeutuvat taudinaiheuttajia, remodeling kudoksia, ja clearing kuolleita soluja. Lisäksi, makrofagien tunkeutuminen havaitaan usein erilaisissa syövissä [1]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että nämä kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) pääasiassa edistää etenemistä syövän nopeuttamalla paikallista invaasiota ja etäpesäkkeiden syöpien [2]. Sen sijaan muut tutkimukset osoittavat kasvaimia tuhoavaa vaikutusta makrofagien [3], [4]. Perustuen syövän vaikutukset makrofagit havaittu prekliinisissä tutkimuksissa soveltaminen makrofagien syöpähoidon on kokeiltu; esimerkiksi siirtää makrofagien esiaktivoitiin IFN-γ testattiin mahdollisena käsittelyaine syöpäpotilaiden [5] – [9]. Ei kuitenkaan ole selvää terapeuttista hyötyä syövän on tähän mennessä havaittu, että makrofagien terapiassa.

vahvistaa makrofagien terapiassa tehokkaampi syövän hoidon parantamiseksi menetelmä syöttämiseksi makrofagien on tarpeen. Vuonna raportoitu kliinisissä tutkimuksissa, makrofagit käyttää terapeuttiseen tarkoitukseen kertyi luovuttajasta ääreisverenkierron monosyytit, jotka eristettiin leukafereesin. Kuitenkin ääreisveren monosyytit eristetään ei voida helposti levittävät. Makrofagien määrä syntyy tällaisia ​​menetelmiä on siis rajallinen (enintään 10

9-10

10), ja ne voivat jäädä saavuttamatta kliinisiä vaikutuksia. Jos riittävä määrä (esim yli 10

10) makrofagien kanssa voimakas anti-syöpä omaisuus voitaisiin antaa, voisimme ymmärtää tehokas syövän hoitoon makrofageihin.

Pluripotentit kantasoluja, kuten alkion kantasoluja (ES-solut) tai indusoi pluripotenttien kantasolujen (iPS-solut) voi edetä loputtomiin ja niillä on kyky erilaistua eri somaattisten solujen, mukaan lukien verisolut. Hävittäminen ihmisalkion on tarpeen tuottaa ihmisen ES-soluja. iPS-soluja, toisaalta, voidaan luoda viemällä useita määritellään tekijöiden somaattisten solujen, jotka ovat peräisin minkä tahansa luovuttajalta [10] – [13]. Siten iPS cell tekniikka voi voittaa eettiset kysymykset sekä histoincompatibility riitaisia ​​terapeuttisen luovuttajan solut ja vastaanottaja, ja tulevaisuus soveltaminen iPS solujen kliinisen lääketieteen odotetaan [14], [15].

Useita ryhmiä, myös meidän, ovat toistaiseksi perustettu menetelmiä tuottaa makrofagien hiiren tai ihmisen pluripotenttien kantasolujen [16] – [24]. Kuitenkin ihmisen pluripotenttien stemα soluissa alhaisemmat makrofagien määrä kuin hiiren pluripotenttien kantasolujen. Toistaiseksi vakiintuneita menetelmiä tuottaa ihmisen makrofagi luvut, jotka ovat vähemmän kuin 100 kertaa määrä erilaistumattoman iPS soluja käytetään lähtöaineita; Lisäksi tuottaa makrofagien tavanomaisilla menetelmillä kestää yli kuukauden. Täten tavanomaisia ​​menetelmiä ovat liian työläitä ja kalliita voidaan soveltaa käytännön lääketieteessä.

Viime aikoina olemme perustaneet menetelmän indusoida iPS-soluista peräisin myeloidisoluissa (iPS-MC), jonka lentivirus-välitteisen transduktion geenejä, jotka voivat edistää soluproliferaatiota tai estävät solujen vanhenemista, kuten cMYC plus BMI1, EZH2 tai MDM2, tuottamaan iPS-soluista peräisin myeloidinen /makrofagisolulinjassa (iPS-ML) [25]. iPS-ML voi lisääntyä käytettäessä M-CSF-riippuvaisella tavalla vähintään useita kuukausia säilyttäen voivat erilaistua dendriittisoluja (iPS-ML-DC), jossa on voimakas T-solua stimuloivan kapasiteetin.

nykyisessä tutkimuksessa arvioimme mahdollisuuden käyttää iPS-ML, kuten syövän efektorisolujen. Olemme tutkineet, onko geneettisesti muunnettuja iPS-ML ilmentävät anti-HER2-vasta-aineen tai interferoni (IFN) pystyvät kohdistamaan terapeuttista vaikutusta vatsakalvonsisäisesti levitettävä maha- ja haiman syövät ksenograftimalleissa.

Materiaalit ja menetelmät

solut ja reagenssit

Tämä hyväksyi tutkimuksen eettinen tarkastelu hallitus Kumamoto University Graduate School of Medical Sciences. Ihmisen mahasyöpä solulinja, NUGC-4, ja ihmisen haimasyövän solulinja, MiaPaca-2, toimittivat Japani Collection of Research Bioresources (JCRB, Osaka, Japani). Menetelmät tuottamiseen, huolto-, ja geenimuunteluun ihmisen iPS-soluja on kuvattu aiemmin [21].

virtaussytometrianalyysin

Seuraavat mAb: t konjugoituna FITC tai PE ostettiin BD Pharmingen (San Diego, CA), Beckman Coulter (Brea, CA), Miltenyi Biotec (Bergish-Gladbach, Saksa), Sigma (St. Louis, MO), tai eBioscience (San Diego, CA): anti-CD45 (klooni HI30, hiiren IgG1), anti-CD33 (WM53, hiiren IgG1), anti-CD36 (FA6.152, hiiren IgG1), anti-CD11b (ICRF44, hiiren IgG1), anti-CD14 (61D3, hiiren IgG1), anti-CD4 ( 11830, hiiren IgG2a), anti-CD97 (VIM3b, hiiren IgG1), anti-CD13 (WM15, hiiren IgG1), anti-CD87 (62022, hiiren IgG1), anti-CD115 (2-3A3-1B10, rotan IgG2a), anti-CD116 (4H1, hiiren IgG1), anti-TLR2 (T2.5, hiiren IgG1), anti-TLR4 (HTA125, hiiren IgG2a), anti-HER2 /neu (Neu 24,7, hiiren IgG1) ja anti-cMYC ( 9E10, hiiren IgG1). Isotyyppiyhteensovitettu valvontaa, hiiren IgG2a (G155-178) ja hiiren IgG1 (MOPC-21), käytettiin. Solun näytteitä käsiteltiin FcR-esto-reagenssia (Miltenyi Biotec) 10 minuutin ajan, värjättiin fluorokromilla-konjugoidulla mAb: t 30 min, ja pestiin 3 kertaa PBS /FCS: llä (2%). Värjätty solu näytteet analysoitiin käyttäen FACScan (Becton Dickinson) -virtaussytometriä.

Tsymosaani -fagosytoosikoe

Solususpensiot DMEM /10% FCS lisättiin 48-kuoppaisille viljelylevyille (2 x 10

5 solua /kaivo 200 ui) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tuntia, jotta solut tarttuvat levyihin. FITC-leimattua tsymosaani hiukkasia (Molecular Probes) lisättiin kuoppiin (2 x 10

6 hiukkasia /kuoppa 200 ui). Inkuboinnin jälkeen annetun ajanjakson, soluja mikroskooppisesti (Axio Observer Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa) ja kerättiin trypsiini /EDTA hoitoa virtaussytometrianalyysin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä.

rakentaminen ekspressiovektoreiden

plasmidi klooni, joka sisältää cDNA: ta yhdessä ketjun vaihtelevan alueen fragmentti (scFv) spesifinen ihmisen HER2 /neu oli lahja Lieberman (Addgene plasmidi # 10794) [26]. ScFv-sekvenssi on liitetty PCR-nukleotidisekvensseihin varten cMYC tag (EQKLISEEDL) ja C-terminaalinen fragmentti hiiren FcyRI. Proteiinia koodaavan DNA-fragmentti kloonattiin ensin pENTR-D-Topo (Life Technologies), ja sen jälkeen siirretään nisäkkään ekspressiovektoriin pCAG-IRES-Puro, joka ohjaa CAG-promoottorin ja sisältää sisäisen ribosomin (IRES) -puromycin

N

asetyyli-transferaasigeenin kasetti. cDNA ihmisen IFN-α: n, IFN-β: n, IFN-γ: n, TNF-α, TRAIL, ja FAS-ligandia, jonka NITE Biological Resource Center (Kazusa, Japani), Kazusa DNA Research Center (Kazusa, Japani), tai RIKEN BRC (Tsukuba, Japani). Lentiviruksesta vektori, CSII-EF, ja pakkaus konstruktit tuotetaan H. Miyoshi (RIKEN BRC) ja työtovereiden [27]. CDNA-fragmentit insertoitiin CSII-EF-plasmidi yhdessä IRES-hygromysiinifosfotransferaasi tuottaa lentiviral ekspressiorakenteita. Rekombinantti lentivirus tuotettiin ja puhdistettiin aikaisemmin kuvatun menetelmän [21].

Generation iPS-ML ekspressoivat scFv

plasmidivektori (pCAG-IRES-Puro), joka koodaa anti-HER2-scFv oli tuotu ihmisen iPS-solujen elektroporaatiolla ja valitaan käyttämällä puromysiiniä (5 ug /ml). Transfektoitu stabiilisti kloonit eristettiin aiemmin kuvatulla menetelmällä [21]. Sen jälkeen, iPS-solujen klooneja, joissa anti-HER2-scFv-rakenne pantiin erilaistumista kulttuuriin tuottaa iPS-MC /anti-HER2. IPS-MC ilmentävät scFv ominaisia ​​HER2 transdusoitiin lentivirusvektoreita varten cMYC plus BMI1 tai cMYC plus EZH2, tuottaa iPS-ML. Menetelmä tuottaa ja ylläpitää iPS-ML on aikaisemmin raportoitu [25].

geneettinen muutos iPS-ML /scFv ilmaista muita tekijöitä

iPS-ML oli transdusoitiin lentivirus- koodaavalla IFN-α: n, IFN-β: n, IFN-γ: n, TNF-α, FAS-ligandi, tai TRAIL. Niiden solujen valitsemiseksi, jotka ekspressoivat stabiilisti siirtogeenejä, soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi hygromysiiniä (0.5~2 mg /ml). Kvantitoimiseksi tuotanto siirtogeenin sytokiinit ja FAS-ligandi, transfektoituja iPS-ML viljeltiin (1 x 10

5 solua /kaivo 200 ui) 96-kuoppaisille, tasapohjaisille soluviljelylevyille 24 tuntia, ja pitoisuus sytokiinien ja FAS-ligandin viljelmän supernatantissa mitattiin käyttäen ELISA-kittejä ostettu Endogen tai R W Isoplate, Wallac), kun läsnä on 10 ng /ml yhdistelmä-IFN-α: n, IFN -β, IFN-γ, tai TNF-α. Kolme päivää myöhemmin, lusiferaasin substraattiliuosta (SteadyLite Plus, Perkin-Elmer), lisättiin (50 ul /kuoppa), ja luminesenssi mitattiin mikro-levylukijalla (TriStar, BertholdTech, Bad Wildbad, Saksa).

Analyysi antituumorivaikutuksen iPS-ML

in vitro

NUGC-4-soluja (5 x 10

3 solua /kuoppa), joka ilmaisee lusiferaasin viljeltiin kanssa tai ilman iPS- ML (2,5 x 10

4 solua /kuoppa) 96-kuoppaisille, tasapohjaisille kulttuuri levyjä (B W Isoplate, Perkin-Elmer). Jälkeen 3 päivän ikäisestä viljelmästä, 50 ul /kuoppa lusiferaasisubstraattia lisättiin, ja luminesenssi mitattiin micro-levylukijalla.

Analyysi iPS-ML tunkeutumisen syöpäkudoksissa SCID-hiirissä

hiiri kokeet hyväksynyt eläin tutkimuskomitea Kumamoto University. Vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) ilmentävä NUGC-4-soluja (5 x 10

6 solua /hiiri) injektoitiin vatsaonteloon SCID-hiirillä. Jälkeen 15 päivää, iPS-ML leimattiin PKH26 (Sigma), seuraten valmistajan ohjeita, ja oli intraperitoneaalisesti (i.p.) injektoitiin hiiriin (3 x 10

6 solua /hiiri). Hiiret tapettiin seuraavana päivänä, ja suoritettiin fluoresenssi analyysin makroskooppisesti paikantamaan NUGC-4 kasvaimia ja iPS-ML on Nightowl II (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksa). NUGC-4 /GFP havaittiin 475 nm: n virityksellä ja 520 nm emissiosuodattimia, ja PKH26-leimatun iPS-ML havaittiin 550 nm: n virityksellä ja 600 nm emissiosuodattimia. Mikroskooppista tutkimusta, syöpä kudoksia suuremman omentum poistettiin, kiinnitettiin 4% paraformaldehydi /PBS, ja upotettu Tissue-TEK lokakuu yhdistettä (Sakura Finetechnical, Tokio, Japani). Kudosleikkeet 20 um paksuus tehtiin kryostaatilla ja analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Axio Observer Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).

Analyysi antituumorivaikutuksen iPS-ML

in vivo

SCID olivat ip ruiskutettiin syöpäsoluja (5 x 10

6 solua /hiiri). Päivänä 3 tai 4, hiiret altistettiin luminesenssin kuva-analyysi tutkia kasvaimen perustamiseen. Sen jälkeen, hiiret, joilla on todettu kasvaimia jaettiin satunnaisesti käsitellyissä ja kontrolliryhmissä. Hiiret hoitoryhmässä injektoitiin iPS-ML mukaisesti ilmoitettu aikataulun, ja syöpäsolujen kasvua seurattiin hiirissä luminesenssikuvantamisessa analyysi. Suuruus syövän kasvua määritettiin muutos koko luminesenssin laskee kullekin hiirelle.

Tulokset

karakterisointi ihmisen iPS-soluista peräisin lisääntyvien myeloidisoluissa

aikaisemmin sopinut menettelystä tuottaa myelomonocytic solujen lisääntyvissä kapasiteetti (iPS-ML) by lentivirusta välittämää transduktion cMYC plus BMI-1 ihmisen iPS-soluista peräisin ydinsoluissa (iPS-MC) [25]. iPS-ML kasvoi enimmäkseen suspensiossa M-CSF-riippuvaisella tavalla. He ilmaisivat useita makrofagien päättäjät, ja olivat heterogeenisiä morfologian ja kuvaamaan joitakin solun pinnan molekyylejä (Fig. 1A, B).

. Faasi-kontrasti kuva elävien iPS-ML kulttuurissa levy (ylempi) ja kuva iPS-ML värjättiin May-Giemsa levyllä lasi (alempi) on esitetty. B. Solun pinnan ekspression makrofagimarkkeri molekyylien CD11, CD14, CD4, CD13, CD33, CD36, CD87, CD97, CD115, CD116, TLR2 ja TLR4 iPS-ML analysoitiin virtaussytometrialla. Värjäytymisen profiilit erityisiä mAb (paksu riviä) sekä isotyypin kontrolli-mAb (harmaa alue) on esitetty. C. iPS-ML in viljelylevyillä lisättiin FITC-leimatun tsymosaanipartikkeleita. Phase-kontrasti (ylempi) ja fluoresenssi (alempi) kuvien jälkeen 90 min inkubaation näkyvät. D. Kun 40-min inkuboinnin läsnä ollessa tai poissa ollessa zymosans, solut kerättiin käyttämällä trypsiiniä /EDTA: ta ja analysoitiin sitten virtaussytometrillä. Prosenttiosuudet Solujen korkean fluoresenssin voimakkuus osoittaa solunsisäisen tsymosaanista näkyvät. E. Aika kurssi fagosytoosia näkyy. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kahtena määrityksissä.

analysoimiseksi fagosyyttisten kyky iPS-ML, me mikroskooppisesti iPS-ML kulttuuri lisäämisen jälkeen FITC-leimatun tsymosaanipartikkeleita. Sen jälkeen, kun 90-min inkuboinnin fluoresenssisignaalit havaittiin useimmissa soluissa, mikä osoittaa, että suurin osa iPS-ML nautittuina tsymosaanipartikkeleita (Fig. 1 C). Noin 60% iPS-ML sisälsi tsymosaanipartikkeleita jälkeen 40 minuutin inkuboinnin FITC-leimatun tsymosaanipartikkeleita, arvioituna virtaussytometrianalyysillä (Fig. 1 D). Aika kurssi fagosytoosia esitetään kuvassa 1E.

Anti-syöpä aktiivisuus iPS-ML ilmentävät anti-HER2-scFv

in vitro

syöpään liittyvää antigeeniä, HER2 /neu, ilmaistaan ​​erilaisten ihmisen syöpien, kuten rinta- ja syöpien [28]. Päätimme tutkia syövän vaikutusta iPS-ML ilmentävät anti-HER2-scFv vastaan ​​HER2-ilmentäviä mahasyövän solulinja, NUGC-4 (Fig. 2A). Tätä tarkoitusta varten olemme syntyy iPS-ML stabiilisti ilmentävät anti-HER2-scFv (iPS-ML /anti-HER2) (Fig. 2B). iPS-ML /anti-HER2 kertyi iPS-MC, joka on peräisin iPS-solukloonin käyttöön ekspressiovektorilla, anti-HER2-scFv: n, jonka aiemmin kuvatulla menetelmällä [21]. Olemme ajoittain tutkitaan ja vahvisti ilmentymisen scFv iPS-ML /anti-HER2.

. HER2 /neu ilme NUGC-4 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja analysoitiin. Värjäytyminen profiilit anti-HER2-mAb (paksu viiva) ja isotyypin kontrollivasta-ainetta (harmaa alue) on esitetty. B. Solun pinnan ekspression anti-HER2-scFv iPS-ML (iPS-ML /anti-HER2) havaittiin värjäämällä anti-cMYC-tag-vasta-ainetta. C. Luciferase-ilmentävät NUGC-4-soluja (5 x 10

3 solua /kuoppa) viljeltiin yksin tai co-viljeltiin 96-kuoppaiselle viljelylevylle kanssa iPS-ML (1 x 10

4 solua /kuoppa ) kanssa tai ilman anti-HER2-scFv ilme. Määrä elävien NUGC-4-soluissa mitattiin lusiferaasiaktiivisuus jälkeen 3-päivän kulttuuriin. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona + SD päällekkäisiä määrityksissä.

Ensin arvioitiin vaikutus iPS-ML /anti-HER2 vastaan ​​NUGC-4-solut

in vitro

. Tulikärpäsen lusiferaasi-käyttöön NUGC-4-soluja viljeltiin yhdessä iPS-ML kanssa tai ilman anti-HER2-scFv. Havaitsimme, että iPS-ML vähentää elävien NUGC-4-solut, ja tämä ilmaisu anti-HER2-scFv iPS-ML parannettu inhiboiva vaikutus kasvua vastaan ​​NUGC-4-solut (Fig. 2C).

arvosanojen ja soluttautumista ip pistetään iPS-ML kasvainkudoksissa

Halusimme arvioida iPS-ML oli terapeuttinen vaikutus vatsakalvonsisäisesti levitetään syöpään. Makrofagi tunkeutuminen on usein havaittu kliinisissä näytteissä syövän kudoksen [1]. Tutkimme, onko i.p. annetaan iPS-ML tunkeutui syöpäkudoksissa ennalta perustettu vatsaonteloon hiirien.

Tämän vuoksi, GFP-proteiinia ekspressoivien NUGC-4 ihmisen mahalaukun syövän soluja, perustetaan vatsaontelon metastaattinen vaurio diffuusi-tyyppinen mahasyöpä potilas, injektoitiin ip SCID-hiirissä. 15 päivän kuluttua, iPS-ML leimattu punainen fluoresoivalla värillä PKH26 injektoitiin. Olemme samanaikaisesti pistetään rekombinantti kudoksen plasminogeeniaktivaattori (tPA) hiireen vatsaonteloon, odottaen että tPA edisti soluttautuminen iPS-ML osaksi kasvain kudoksiin. Hiiret uhrattiin seuraavana päivänä, ja leikeltiin sijainnin määrittämiseksi injektoidun iPS-ML fluoresenssin analyysi.

makroskooppinen fluoresenssin analyysi havaita GFP (eksitaatio /emissio: 475/520 nm) osoitti, että NUGC-4 kasvaimet pääasiassa lokalisoitu suurempi omentum (Fig. 3A). Injected iPS-ML havaita PKH26 fluoresenssi (eksitaatio /emissio: 550/600 nm) on myös pääosin lokalisoitu suurempi omentum, mikä osoittaa, että iPS-ML tehokkaasti kertynyt kasvaimeen kudoksiin. Tällainen selvästi kertynyt iPS-ML osaksi suurempi omentum ei havaittu, kun iPS-ML inokuloitiin hiiriin ilman olevien kasvainten (tuloksia ei ole esitetty).

. GFP-proteiinia ekspressoivien NUGC-4-soluja (5 x 10

6 solua /hiiri) injektoitiin vatsaonteloon SCID-hiirillä. 15 päivän kuluttua, iPS-ML leimattu fluoresoivalla PKH26 injektoitiin i.p. hiiriin (3 x 10

6 solua /hiiri). Hiiret tapettiin seuraavana päivänä ja alistettiin fluoresenssin kuvantamisen analyysi määrittää sijainnin NUGC-4-GFP kasvaimia (eksitaatio /emissio: 475/520 nm) ja PKH26-iPS-ML (eksitaatio /emissio: 550/600 nm ). B. Kasvain kudosten suurempi omentum hiirten eristettiin, ja 20-pm paksu jääleikkeitä tehty. Leikkeet analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla ja yhdistetyn kuvan vihreitä fluoresenssi osoittaa NUGC-4 /GFP-soluja ja punainen fluoresenssi osoittaa PKH26-värjätty iPS-ML näkyy. C, D Kudosleikkeet valmistettiin samanlaisella menetelmällä kuin B, paitsi, että tPA: ta ei ole käytetty. Suurempi suurennus näkymä alueen ympyröity pisteillä neliö C on esitetty D.

sitten eristetään ja tutkimme ne mikroskoopilla tuumorikudoksissa. Kudoksessa osassa on esitetty kuviossa 3B, PKH26-leimattu iPS-ML tunkeutui pesä GFP-proteiinia ekspressoivien NUGC-4-soluja. Samanlaiset kokeet tehtiin ilman tPA injektio, ja suuremmalla suurennuksella analyysi kudosleikkeiden osoittaa selvästi tunkeutumisen iPS-ML syöpä kudoksen (Fig. 3C, D). Nämä tulokset osoittavat, että iPS-ML tehokkaasti tunkeutui syöpäsoluissa, kun i.p. injektoidaan hiiriin kuljettaa syöpiä perustettu vatsaonteloon.

Ei syövän vastaista aktiivisuutta iPS-ML ilmentävät anti-HER2-scFv

in vivo

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus iPS-ML /anti-HER2 vastaan ​​NUGC-4

in vivo

. Luciferase-ilmentävät NUGC-4-solut ympättiin vatsaonteloon SCID-hiirten (5 x 10

6 solua /hiiri). Jälkeen 3 päivää, syöpäsolun juurtumista hiirillä tutkittiin bioluminesenssi analyysi, ja hiiret, jotka kantavat syöpäsolujen jaettiin satunnaisesti hoitoa tai kontrolliryhmiin. Päivinä 4-8, hoitoryhmässä hiiriin ruiskutettiin päivittäin iPS-ML /anti-HER2 (2 x 10

7 solua /hiiri). Päivänä 10 hiiret altistettiin bioluminesenssi analyysin uudelleen tutkia syövän etenemisestä.

Kuten kuviossa S1, NUGC-4 kasvaimia iPS-ML-käsiteltyjen hiirten kasvoivat nopeammin kuin kontrollihiiriin. Ne pikemminkin vahvistaa NUGC-4 syöpäsolun kasvua tällä

in vivo

mallissa, vaikka tilastollisesti merkitsevä. Tämä voi johtua siitä, iPS-ML /anti-HER2 vaikutti syövän mikroympäristön hankkia pro-syöpä fenotyypin.

herkkyys NUGC-4 solujen sytokiinien ja solujen tappaminen molekyylien

jotta iPS-ML pystyy voittamaan syöpä mikroympäristön ja käyttämään syöpälääkkeen vaikutuksia

in vivo

, päätimme edelleen muokata iPS-ML /anti-HER2 ilmaista ylimääräisiä molekyylejä. Sytokiinit, kuten IFN: t, joiden tiedetään aiheuttavan kuoleman tai estävät syöpäsolujen kasvua [29], [30]. Lisäksi nämä sytokiinien tiedetään lisäävän syövän vastaista aktiivisuutta makrofagien [31] – [33].

Analysoimme herkkyyttä NUGC-4-solujen IFN-α: n, IFN-β: n, IFN -γ, tai TNF-α. Sen jälkeen, kun 24-tunnin inkubaation läsnä joko näiden tekijöiden (10 ng /ml), analysoitiin apoptoosin värjäämällä solut FITC-anneksiini-V. Havaitsimme, että kaikilla testatuilla sytokiinien indusoi tiettyjä tasoja NUGC-4 apoptoosia (kuvio. S2A). Tarkastella vaikutusta vähentää elävien NUGC-4-soluja, lusiferaasi-ilmentävät NUGC-4-soluja viljeltiin 3 päivää, kun läsnä on näistä tekijöistä. Yhdenmukainen anneksiini-V-värjäys tietoja, kaikkien testattujen sytokiinien merkittävästi vähentynyt määrä elävien NUGC-4-solut (Fig. S2B). Molemmissa määrityksissä, IFN-β: n ja IFN-γ esillä kaikkein syvällinen vaikutus.

Generation iPS-ML /anti-HER2-ilmentävät muita molekyylejä

syntyy lentivirus ekspressiovektoreita IFN-proteiinit ja TNF-α, ja esitteli ne iPS-ML /anti-HER2. Lisäksi toimme lentivirus ekspressiovektorit ”apoptoosin indusoiva tekijät”, FAS-ligandi tai TRAIL. Pystyimme transfektoitujen iPS-ML jotka tuottivat sytokiinit yli 3 ng /24 h /10

6 solua, paitsi IFN-γ (Fig. S3A). Olemme voisi tuottaa transfektantti iPS-ML tuottavat vain alhaisen tason IFN-γ, luultavasti koska myrkyllisyys IFN-γ että iPS-ML. Ilmentyminen solun pinnalla TRAIL transfektoiduissa iPS-ML varmistettiin virtaussytometrianalyysillä (Fig. S3B).

viljeltiin yh- iPS-ML /anti-HER2-ilmentävät uusia syövän molekyylien luciferase- ilmentävät NUGC-4-solut ja analysoitiin useita live NUGC-4-solut perustuen lusiferaasivaikutusta 3 päivän jälkeen (Kuva. 4). iPS-ML /anti-HER2-ilmentävät IFN-α: n, IFN-β, tai TRAIL esiintyi voimakkaampaa vaikutusta vähentää NUGC-4-soluja kuin iPS-ML /anti-HER2, ja ne, jotka ilmentävät IFN-β-solut olivat voimakkaimmat. iPS-ML /anti-HER2-ilmentävät IFN-γ: n tai TNF-α osoitti vastaava vaikutus iPS-ML /anti-HER2. Puute paranevat merkittävästi anti-NUGC-4 vaikutus IFN-γ transduktio voi johtua siitä, että määrä IFN-γ tuotettu iPS-ML /anti-HER2 /IFN-γ oli alhaisempi kuin käyttämään anti -cancer vaikutus. Tässä kokeessa, pakko ilmentyminen FAS-ligandin odottamatta heikentynyt anti-NUGC-4 vaikutus iPS-ML /anti-HER2.

Luciferase-ilmentävät NUGC-4-soluja viljeltiin 96-kuoppaiselle viljelylevylle (5 x 10

3 solua /kuoppa) iPS-ML /anti-HER2-ilmentävät IFN-α: n, IFN-β: n, IFN-γ: n, TNF-α, FAS-ligandi, tai TRAIL (2,5 x 10

4 solua /kuoppa). Määrä elävien NUGC-4-soluissa mitattiin luminesenssi analyysin jälkeen 3-päivän kulttuuriin. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona + SD kolmen rinnakkaisen määrityksissä.

terapeuttinen vaikutus iPS-ML /IFN-β on vatsakalvonsisäisesti levitetään NUGC-4 mahalaukun syövän solujen SCID-hiirissä

tulosten perusteella on

in vitro

kokeissa tutkimme

in vivo

anti-NUGC-4 vaikutus iPS-ML /anti-HER2 joka joko IFN-α, IFN-β, tai TRAIL. Hoito ei iPS-ML /anti-HER2 /IFN-α eikä iPS-ML /anti-HER2 /TRAIL osoitti selvää estävää vaikutusta syöpäsolujen kasvua

in vivo

(tuloksia ei ole esitetty). Toisaalta, iPS-ML ilmentävät IFN-β osoitti merkittävää vaikutusta kasvun estämiseksi syöpä, kuten alla on kuvattu.

Kokeissa on esitetty kuviossa 5, kasvu NUGC-4 kasvaimia seurattiin bioluminenssina analyysi päivinä 4, 10 ja 17 jälkeen syöpäsolujen inokuloinnin. Hiirillä NUGC-4 kasvaimia päivänä 4 jaettiin terapiaan tai ei-hoitoa (kontrolli) ryhmässä. Hiiret hoidon injisoitiin i.p. IPS-ML /IFN-β tai iPS-ML /anti-HER2 /IFN-βfrom päivänä 4 (2 x 10

7 solua /injektio /hiiri, 3 injektiota viikossa). Kuvio 5A esittää kuvadatan luminesenssin analyysi hiirillä. Kuvio 5B osoittaa kertaluokkamuutos luminesenssin aktiivisuuden päivästä 4 ohjaus- ja hoitoryhmissä, jotka osoittavat, että kasvaimen kasvu inhiboitui käsittelemällä iPS-ML /IFN-β tai iPS-ML /anti-HER2 /IFN-β. iPS-ML /IFN-β ja iPS -ML /anti-HER2 /IFN-β olivat vastaavasti tehokas, mikä osoittaa, että ilmentyminen anti-HER2 on tarpeeton syövän vaikutusta iPS-ML tuottavat IFN-β.

Luciferase-ilmentävät NUGC-4-soluja injektoitiin ip SCID hiiriin (5 x 10

6 solua /hiiri). Päivänä 4 hiiret altistettiin luminesenssikuvantamisessa analyysi. Hiiret injektoitiin päivinä 4, 6, 8, 11, 13, ja 15, joissa iPS-ML /IFN-β tai iPS-ML /IFN-β /anti-HER2 (2 x 10

7 solua /hiiri kutakin injektio, n = 5 kussakin ryhmässä). Kontrollina, 8 hiiret jätettiin käsittelemättä. Kaikki hiiret altistettiin bioluminenssina analyysi päivinä 10 ja 17. A. luminesenssi kuvat näkyvät. B. Kunkin hiiri, luminesenssi signaali laskettiin suhteellinen arvo, jossa fotoneja luottaa päivänä 4 määriteltiin 1. keskiarvoja ± SD kertamuutosta päivästä 4 ja kontrolliryhmiin on esitetty.

Kuva S4 esittää tulokset samanlaisia ​​kokeita suhteellisen vaikutusten tutkimiseksi iPS-ML, iPS-ML /IFN-β, iPS-ML /anti-HER2, ja IFN-β vastaan ​​NUGC-4 syöpä

in vivo

. Johdonmukaisesti tietojen kanssa kuviossa 5, käsittelemällä iPS-ML /INF-beeta suppressoi merkitsevästi etenemistä syöpä. Toisaalta, sekä iPS-ML ja iPS-ML /anti-HER2 pikemminkin edistää syöpäsolujen kasvun, vaikka tilastollisesti nonsignificant. Injektio 400 ng, mutta ei 200 ng /hiiri /injektio IFN-β on samaa aikataulua kuin iPS-ML injektio osoitti jonkin verran estävää vaikutusta kasvaimen kasvuun, mutta vaikutus ei ollut tilastollisesti merkitsevä.

Yhdessä , yksinkertainen iPS-ML eivät osoittaneet syövän vaikutusta

in vivo

. Geneettinen muutos tuottaa IFN-β siirrettävä huomattava syövänvastainen aktiivisuus iPS-ML. Toisaalta, ilmentyminen anti-HER2-scFv: n ei ole tällaista vaikutusta.

terapeuttinen vaikutus iPS-ML /IFN-β vastaan ​​haimasyövän ksenograftimallia

vieressä tarkasteltiin vaikutus iPS-ML /IFN-β hoitoa vastaan ​​haiman syöpäsoluja. Lisäksi IFN-β on MiaPaca-2 ihmisen haimasyövän soluja indusoiman apoptoosin ja vähensi elävien solujen

in vitro

kokeissa (Fig. S5).

tutkittiin, mikä vaikutus iPS-ML /IFN-β vastaan ​​MiaPaca-2-solujen

in vivo

. Voisimme perustaa vatsakalvon syöpää malli i.p. injektio MiaPaca-2 solut, jotka ilmentävät lusiferaasia SCID-hiirissä. Kokeissa on esitetty kuviossa 6, 6-hiiriä käsiteltiin iPS-ML /IFN-β injektio 3 kertaa viikossa 2 viikkoa päivästä 4; tulokset 8 verrokkihiirten ilman hoitoa on myös esitetty. Havaitsimme, että iPS-ML /IFN-β hoito merkitsevästi esti MiaPaca-2 kasvaimen kasvu verrattuna kontrollihiiriin. Lasku keskimääräinen luminesenssi laskea päivästä 10 päivään 17 ohjaus (ei hoitoa) ryhmä olisi johtunut kasvu Askites aiheuttama syöpä, koska havaitsimme asteittainen laajentuminen vatsan hiirillä tämän ryhmän. Tulokset on esitetty kuviossa 6 osoittavat, että hoito iPS-ML /IFN-β tehoaa haimasyöpä.

Luciferase-ilmentävät MiaPaca-2-soluja inokuloitiin i.p. SCID-hiiret (5 x 10

6 solua /hiiri), ja hiiret altistettiin luminesenssikuvantamisessa analyysin päivänä 3. Hiiret Siirto tehty syöpäsolujen jaettiin satunnaisesti hoitoa (n = 6) ja kontrolli (n = 8 ) ryhmät. Hiiret hoitoryhmässä injektoitiin iPS-ML /IFN-β (2 x 10

7 solua /hiiri kutakin injektiota) päivinä 4, 6, 8, 11, 13, ja 15. Kaikki hiiret altistettiin bioluminesenssi analyysi päivinä 10 ja 17. luminesenssi kuvat näkyvät A. jokaisen hiiren muutos luminesenssin signaali hiirtä kohden laskettiin suhteellinen arvo, jossa fotoni laskenta päivänä 3 määriteltiin 1. keskiarvo ± SD taitteen muutoksen ohjaus ja hoitoryhmien esitetään B.

keskustelu

makrofaagianalyysi tunkeutuminen havaitaan usein kliinisissä näytteissä kiinteiden syöpien, ja nämä makrofagit kutsutaan TAM. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että i.p. ruiskutetaan iPS-ML tehokkaasti kertynyt ja tunkeutui ennalta asetetut syövän kudosten vatsaonteloon SCID-hiirten (Fig. 3).