Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Paikallinen uusiutuminen on merkittävä osoitus hoidon epäonnistumisen potilailla, joilla on käytettävissä kurkunpään syöpä. Perustettu kliinis tekijät eivät voi riittävällä ennustaa potilaita, jotka ovat todennäköisesti toistuu hoidon jälkeen. Muita työkaluja on näin ollen tarkasti tunnistaa potilaat suuri riski toistumisen. Tämä tutkimus pyrkii tunnistamaan ja itsenäisesti vahvistaa geenin ilmentyminen malleja, prognostisia taudista vapaan eloonjäämisen (DFS), joka on käyttökelpoisessa kurkunpään syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Käyttämällä Affymetrix U133A Genechips, me profiloitu makean jäädytetty tuumorikudoksista 66 potilaalla on kurkunpään syöpä hoidettu paikallisesti leikkauksen. Käytimme Coxin suhteellisten riskien mallinnuksen tunnistaa monigeenisiin ennustavat toistumisen. Gene malleja sitten validoitu kaksi riippumatonta kohorttia 54 ja 187 potilasta (makean pakastetut ja formaliinikiinnitetyt kudoksen validointi sarjaa, vastaavasti).

Tulokset

keskittyneet geenejä yksimuuttujaisesti liittyy DFS (

p

0,01) koulutuksessa asetettu. Joukossa useita malleja, joka käsittää eri määrä geenejä, 30 koetinsarjaa malli osoitti optimaalisen suorituskyvyn sekä koulutukseen (log-rank,

p

0,001) ja 1

st validointi (

p

= 0,010) asetetaan. Tarkemmin sanottuna 1

st validointi asetettu mediaani DFS kuten ennusti 30 koetinsarjaa malli, oli 34 ja 80 kuukautta korkean ja matalan riskin potilailla, vastaavasti. Riskisuhde (HR) uusiutumisen korkean riskin ryhmässä oli 3,87 (95% CI 1,28-11,73, Wald n

p

= 0,017). Testaus ilmentyminen valitun geenin edellä mallia 2

nd validointi setti, jossa qPCR paljasti merkitseviä yhden markkereita, kuten ACE2, FLOT1 ja PRKD1, potilaan DFS. Korkea PRKD1 pysyi epäsuotuisa prognostinen markkeri upon monimuuttujamenetelmin (HR = 2,00, 95% CI 1,28-3,14,

p

= 0,002) sekä positiivisen imusolmukestatuksesta.

Johtopäätökset

Olemme perustaneet ja validoitu geenin malleja, joita voidaan menestyksellisesti osittaa potilaalla on kurkunpään syöpä, perustuu niiden riskien uusiutumisen. Tuntuu kelvollisia prospektiivisesti vahvistaa PRKD1 ilmaus kuin kurkunpään syöpä prognostinen merkki tavanomaisesta kliinisiä sovelluksia.

Citation: Fountzilas E, Kotoula V, Angouridakis N, Karasmanis I Wirtz RM, Eleftheraki AG, et al. (2013) tunnistaminen ja validointi on monigeenisiin Predictor uusiutumisen Ensisijainen Kurkunpään syöpä. PLoS ONE 8 (8): e70429. doi: 10,1371 /journal.pone.0070429

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 09 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Fountzilas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat sisäinen Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) tutkimus avustus (HE R_5G). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: Aikaan tutkimuksen Ralph M. Wirtz ja Elke Veltrup työskenteli Siemens Healthcare Diagnostics. Puolesta Hellenic Foundation for Cancer Research, Athens, Kreikka, vanhempi kirjailija (GF) on patenttihakemuksia Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Kurkunpään syöpä on yhdestoista yleisin syövän miehillä maailmanlaajuisesti. Joka vuosi 52000 tapausta äskettäin diagnosoitu Euroopassa ja 10000 Yhdysvalloissa [1], [2]. Vaikka uusimman diagnostisia ja terapeuttisia menetelmiä, suurin osa potilaista vielä uusiutua hoidon jälkeen [3]. Perustettu kliinis tekijät eivät voi riittävällä ennustaa potilaiden että uusiutuisi. Muita tekijöitä on näin ollen tarkasti tunnistaa potilaat, joilla on huono ennuste. Expression profilointi on onnistuneesti käytetty kerrostuneisuus syöpäpotilaat epäsuotuisa ennusteen [4], [5], [6], [7]. Aikaisemmat tutkimukset pään ja kaulan syöpä potilaat ovat sidoksissa geeniekspressioprofiilien on imusolmukestatuksesta [8], [9], [10], etäispesäkkeitä [11], [12] ja tautivapaan elinajan [13], [14], [15], [16]. Vaikka nämä tutkimukset tarjotaan hyvän käsityksen molekyyli monimutkaisuus pään ja kaulan alueen syöpä he eivät tunnistamaan vankkaa geenin profiilin. Kliininen käyttö näitä malleja on rajoittanut suuri määrä geenejä, pienikokoisen aineistoja ja puute toistettavuus ja riippumattomien validointi. Lisäksi yksikään näistä tutkimuksista keskittyy yksinomaan kurkunpään syöpään.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet tunnistamaan geenejä prognostisten uusiutumisen primaarista kurkunpään syöpä. Loppupiste meidän analyysien oli tautivapaan elinajan (DFS). Olemme profiloitu kasvain näytteet kahdesta erillisestä kohortin potilaista käyttävät globaalin geeniekspressioprofilointi. Käyttäen ensimmäistä kohortti kuin harjoitussetti tunnistimme useita ennustetekijöiden geenin malleja, jotka sitten validoitu toisella Potilaskohortti. Jotta edelleen vahvistaa tuloksemme, me profiloitu valitut geenit meidän malleja suhteellinen ilmaisutapoja kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) itsenäisessä kohortin potilaista.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuskanta

tutkimus koostuu 307 potilaalla on diagnosoitu primääri levyepiteelisyöpä kurkunpään cancinoma (harjoitussetti: 66, 1

st validointi asettaa: 54 ja 2

nd validointi asettaa: 187 potilasta ), jossa seuranta-ajan mediaani 52, 33 ja 89 kuukautta. Kaikki potilaat saivat kirurginen poisto kasvain on Korva- osaston AHEPA sairaalan Thessalonikissa Kreikassa, vuosina 1985 ja 2008. Leikkauksen jälkeinen anto sädehoitoa päätettiin hoitavan lääkärin ja useimmiten annettiin potilaille, joilla kasvain marginaalit, potilaat T4 kasvaimia tai joilla T1 /T2 supraglottiset kasvaimia, joille ennaltaehkäisevänä valittavia imusolmukkeiden ei tehty. Kukaan potilaista ei saanut systeemistä hoitoa osana niiden alustava käsittely. Tämä on nykyinen standardi hoitoa monissa Euroopan maissa [17], mutta tämä voi olla kyse myös muissa maissa, kuten Yhdysvalloissa, jossa pääpaino on säilyttää kurkunpään samanaikaisen kemosädehoito, edeltää tietyissä tapauksissa induktion kemoterapiaa [18]. Seuranta sisältyvät lääkärintarkastus, kolmen kuukauden välein ensimmäisten kolmen vuoden ajan ja kuuden kuukauden välein sen jälkeen. Kuvantamistutkimukset tehtiin, kuten on osoitettu oireet ja lääkärintarkastus. Yksityiskohtainen demografiset ja kliiniset ominaisuudet potilaiden kanssa voimassa geenin tiedot on lueteltu taulukossa 1, kun taas yksittäisten potilaiden tiedot näkyvät taulukossa S1.

kasvain näytteet

Pakastemarjat kasvain kudosnäytteitä, potilailta käsittää koulutuksen ja 1

st validointi sarjaa, otettiin prospektiivisesti kerätty leikkauksen aikana vuodesta 2004 vuoteen 2008, jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja varastoidaan -80 ° C, kunnes käsittely. Formaliinifiksoidusta parafinoidut (FFPE) kasvain kudosnäytteitä, potilailta käsittää 2

nd validointi asetettu otettiin takautuvasti kerättiin (hoidetuilla potilailla vuosina 1985 ja 2008). Jälkimmäinen kiinnitettiin formaliiniin vähintään 6 tuntia ennen parafiiniin. Kurkunpään olivat histologisesti arvioida ja todentaa kaikissa tapauksissa, mukaan lukien makean pakastetut kudosnäytteistä.

Ethics lausunto

Pakastemarjat ja FFPE kasvainkudoksen Näytteet kerättiin protokollien mukaisesti hyväksymän Institutional Review Board on ”AHEPA” sairaala ja bioetiikan komitean Thessalonikin Aristoteles-yliopiston, School of Medicine. Kirjallinen suostumus tieteellistä käytetään biologista materiaalia saatiin kaikista potilaista käsittää koulutuksen ja 1

st validointi asettaa ja potilailta on 2

nd validointi asettaa käsiteltiin vuoden 2004 jälkeen luopuminen suostumus saatiin bioetiikkaneuvoston hoidetut potilaat ennen vuotta 2004 ja joille FFPE kasvain kudosnäytteitä täytyi takautuvasti kerättävä. Kaikki kliiniset tutkimukset, jotka liittyvät tässä tutkimuksessa on tehty periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

RNA erillään makean pakastetut kudokset ja globaali geeniekspressioprofilointi

RNA: n eristämistä tuoreesta jäädytetty Tuumorinäytteet suoritettiin käyttäen RNeasy-protokollan (Qiagen, Hilden, Saksa), kuten aiemmin on kuvattu [19]. RNA-määrä määritettiin mittaamalla UV-absorbanssi 260 ja 280 nm: ssä, kun taas RNA laatu arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 LabChip kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). RNA käänteistranskriboitiin, merkitty ja hybridisoitiin Affymetrix (Santa Clara, CA) HG-U133A paneelit, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Kokeita koskevat koulutusta ja 1

st validointi sarjaa tehtiin erikseen eri ajankohtina, Siemens Healthcare Diagnostic Products (Köln, Saksa). Geeni ekspressiotietojen on talletettu National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ja ovat saatavina GEO Sarjan hakunumero GSE27020. Seuraava linkki on luotu, jotta tarkastelu GSE27020: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dxcdxksauqicizy acc=GSE27020

RNA erillään FFPE kasvain kudosnäytteitä ja qRT-PCR

Kaikki tutkimukset, joihin liittyy FFPE kudosnäytteitä suoritettiin laboratoriossa Molecular Oncology, Hellenic Foundation for Cancer Research, Thessalonikin Aristoteles-yliopiston School of Medicine. Validoida prognostisia arvo jotka on johdettu meidän microarray-analyysi, käytimme erillinen kohortin potilaista, joilla on käytettävissä kasvainkudoksen materiaalia. Tämä näyte ryhmään kuului 187 FFPE kudosnäytteitä, jotka oli macrodissected aikaisempien histologinen arviointi sisältää 50% kasvainsoluja. RNA eristettiin sen jälkeen, kun täydellinen yli yön kudoksen lyysin käyttämällä Trizol-LS (Life Technologies, Paisley, UK), kuten aiemmin on kuvattu [20], ja käänteistranskriptio Superscript III (Life Technologies), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA: t normalisoitiin 25 ng /ul, ja varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. mRNA-ekspressiota tutkittiin FAM-leimatun TaqMan® Gene Expression Analyysit duplex-reaktiot, joihin liittyy pohjamaali rajoitettu VIC-leimattua viite määritys glukuronidaasia beta (GUSB, määritys # Hs00939627_m1), koska endogeeninen mallin ohjaus. GUSB oli parempana sovelletaan yleensä endogeenisten valvontaa, koska ei pseudogeenien eivät toistaiseksi ole raportoitu tämän geenin. Lisäksi on todettu yksi parhaita säilynyt mRNA tavoitteita FFPE kudoksissa [21]. qPCR mRNA kohdistinvalinta lisäksi arvioitiin 30 koettimien U133A allekirjoituksen geenien kopioita, geeni ominaisuudet (voimassa geeni identiteettejä, tyyppi geeni, tallennetaan silmukointimuunnokset joka ei olisi erottaa koetin array tai qPCR), sekä muuttujien

p

-arvo 0,05 kertamuutosta geeniekspressiossa. Niistä 30 U133A antureista, 23 pysyi voimassa qRT-PCR sovellus (taulukko 2). Näistä 23 tavoitteet etsittiin valmiista TaqMan® Gene Expression Analyysit (Applied Biosystems), joka sopisi kohdesekvenssien havaitsema vastaava koettimina U133A array. Oli mahdollista hakea 16 tällaisissa määrityksissä (taulukko 2). Duplex 10 ul reaktiot suoritettiin kaksinkertaisina, joista jokainen sisältää 50 ng templaatti, ABI PRISM 7900HT järjestelmä (Applied Biosystems /Life Technologies) on 384-kuoppaisen lohko alle oletus olosuhteissa, joihin liittyy 45 amplifikaatiosykleissä yhdessä viittauksella RNA-näytettä ( TaqMan® Ohjaus Total RNA, kissa. no 4307281, Applied Biosystems) ja ei-templaattikontrollien. Viittaus RNA: ta käytettiin positiivisena levy ohjaus ja arviointia varten määrityksen suorituskykyä keskuudessa kulkee (inter-run validointi). Kaksi 16 valitun määritykset tuottivat deltaRQ arvot 1,5 eri kulkee ja siten epäonnistunut välisten run validointi ja ei niitä arvioidaan edelleen (taulukko 2).

Cycle kynnysarvot (CT, joka vastaa ja Cq in MIQE suuntaviivat) kohde ja endogeenisen viittaus olisi automaattisesti saatu default olosuhteissa ja suhteellisen kvantifioinnin (RQ) laskettiin lineaarisesti tilassa [22] vähentämällä (45-avg deltaCT), jolloin 45 oli kokonaismonistusaika jakson numero ja avg DCT = keskimääräinen [(CT kohde) – (CT GUSB)] kaksoiskappaleita. Kelpoisuusperusteet toisen näytteen arvioinnissa mukana GUSB CT arvoja 38 kutakin reaktiota ja deltaRQ kunkin kaksoiskappale (sisäinen run vaihtelu) 0,8. 3 määrityksiä ei monistuskäyriä saatiin FFPE ja viittaus mRNA näytteitä, kun taas ylimääräinen määrityksessä suuren sisäisen run RQ-arvo eroja havaittiin 87% näytteistä (taulukko 2). Edellä esitetyn perusteella suodatus vaiheet määrityksen ja näytteen kelpoisuus, se oli lopulta mahdollista arvioida RQ tulokset 10 geenien vain.

Soveltamalla edellä esitetyt näytteen kelpoisuus, seuraava määrä informatiivisia näytteiden saatiin per mRNA kohde (informatiivinen määritykset vain): ACE2, 159; DHTKD1 171; FLOT1, 178; MAP4K1, 169; NEK2, 156; SFRS8, 184; PRKD1, 162; TBC1D4, 165; TGOLN2, 183 ja YTHDC2, 176.

Tilastollinen

Prognostiset geeniekspressiota kehitettiin yksinomaan koulutusta asetettu. DFS mitattiin diagnoosia tehtäessä kunnes todennettu taudin etenemiseen tai kuolemaan. Alive potilailla, joilla ei vahvistanut taudin etenemiseen sensuroitiin ajankohtana viime yhteystiedot. Geenit valitut jouduttiin yksimuuttujaisesti liittyy DFS (

p

0,01, Coxin suhteellinen vaara malli). Algoritmi sopii suhteellisten riskien malleja liittyvät DFS kutakin geeniä, yksi geeni kerrallaan, ja tarjoaa

p

arvo kullekin geenille, testaus hypoteesi, että DFS on riippumaton ilmentymisen tason tietyn geenin. Geenit todettu liittyvän DFS harjoitussarjassa sitten paremmuusjärjestykseen perustuvat niiden absoluuttinen riskisuhde arvoa, edellyttäen algoritmilla. Prognostiset geeni malleja, jotka käsittävät eri määrä huippuluokan geenejä, kehitettiin käyttäen valvottu pääkomponenttina selviytymisen algoritmi [23]. Algoritmi laskee pääkomponentit ja suorittaa Coxin suhteellinen vaara regressioanalyysiä laskea regressio kerroin (paino) kunkin pääasiallinen komponentti. Valvottu pääkomponenttina malli on kehitetty tarjoamaan ennustetyövälineenä indeksin kullekin potilaalle tutkimuksen. Korkea ennustetekijöiden Indeksi vastaa korkea arvo vaaran toistumisen. Arvioida ennustearvo tätä menetelmää, käytimme hiuksiin One-Out-Cross-Validation, joissa kussakin tapauksessa on jätetty pois, ja koko analyysi suoritetaan käyttämällä muun näytteitä. Voidakseen suoraan soveltaa näitä malleja 1

st validointi asettaa, me normalisoitui koulutuksen ja 1

st validointi sarjaa käyttäen empiirinen Bayes (EB) menetelmä [24]. Menetelmä käyttää algoritmia suunniteltu toimimaan ei-biologinen kokeellinen variaatio ( ”erä effect”) eri aineistot. Se vähentää laboratorioiden välinen vaihtelu sekä tekniset erot johtuvat hyödyntäminen eri alustoilla ja menetelmiä. Normalisoinnin jälkeen, me suoraan soveltaa geenin mallien 1

st validointi asettaa ilman muutoksia.

Kaplan-Meier käyrät ja log-rank testejä käytettiin arvioimaan ja vertaa elossapysymisaikajakaumat potilailla suurilla – ja matalan riskin toistumisen. Kaikki raportoidut

p

arvot ovat kaksipuolisia. Coxin suhteellinen vaara-analyysin käytettiin yhden muuttujan analyysiin ja monimuuttuja oikaisu tiedossa ennustetekijöitä. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen BRB-ArrayTools kehittänyt Dr. Richard Simon ja BRB-ArrayTools Development Team ja SPSS tilastopaketista, versio 18,0, (IBM Corporation, Armonk, NY).

Käytimme valvomatta ”alaluokka Mapping” (Submap) menetelmää [25] arvioida molekyyli- vastaavuus sairastavien potilaiden positiivisista ja negatiivisista ennusteen välillä opetusjoukolla ja 1

st validointi asetettu. Tämä menetelmä kaksisuuntaisesti arvioi yhdistys ennalta alatyyppien useita itsenäisiä aineistoja, vaikka niiden tekninen vaihtelua. Algoritmi antaa laskemiseen

p

arvo osoittaa todennäköisyyttä molekyyli samankaltaisuus eri alaluokkien, se on toteutettu GenePattern ohjelmiston (versio 3.0, Broad Institute, Cambridge, MA) ja löytyy osoitteesta https://www.broad.mit.edu/genepattern/

Gene joukko analyysi (GSA) käytettiin havaita geeni verkko vapauttaminen ominaispiirre potilasryhmille hyvän tai huonon ennusteen [26]. Käyttäen julkisesti saatavilla oleviin tietoihin, me sitten ennusti kasvaimia synnyttävän reitin aktivoinnin asemasta kunkin potilaan koulutuksen ja 1

st validointi sarjoiksi. Käytimme geenien ilmentyminen malleja, aiemmin kehitetty ja validoitu in vitro, arvioida todennäköisyys reitin aktivaatio kunkin näytteen [27]. Lopuksi, käyttämällä Bayes probit regressiomalleja me kullekin potilaalle todennäköisyys reitin aktivoinnin.

Tulokset

tunnistaminen ja validointi prognoosi- luokittelijoiden geenien ilmentymisen profilointi

vuokaavio Tutkimuksemme on esitetty kuviossa 1 (consort kaavio). Analysoimme ensisijainen kurkunpään kasvaimissa 66 potilasta (koulutus set) ja 54 potilasta (1

st validointi sarja) käyttäen maailmanlaajuista geeniekspressioprofilointi. Arvioituaan laadun microarray data, me ulkopuolelle 7 ja 4 tekninen harha päässä kaksi, vastaavasti. Joidenkin geenien, ilmentymistä arvioitiin käyttämällä kahta erilaista koetinta sarjaa. Prognostiset koetinsarjaa mallien havaittiin yksinomaan koulutusta asetettu. Kun jätetään neljäsosa vähiten variantti geenit, keskityimme liittyviä geenejä DFS (Wald n

p

0,01). Sitten sijoittui 253 koetinsarjojen todettu merkitsevää yhteyttä DFS, joka perustuu niiden Coxin regressio kerroin. Olemme tunnistaneet useita ennustetekijöiden koetinsarjaa malleja koostuu jopa 250 niin vähän kuin 20 koetinsarjojen, joka suoritetaan yhtä hyvin harjoitussarjassa.

Myöhemmin haimme nämä monigeenisiin ennustajia suoraan 1

st validointi asetettu. 30-koetinsarjaa malli suoritettu paras validointi asettaa (malliin vähiten geenit osoittavat korkeimman tilastollista eroa DFS välillä korkean ja matalan riskin potilailla). Mediaani DFS varten potilasryhmiä epäsuotuisa ja suotuisa ennuste, kuten ennusti 30-koetinsarjaa malli, oli 34 ja 80 kuukautta, vastaavasti (log-rank,

p

= 0.010). Riskisuhde (HR) uusiutumisen että riskiryhmään verrattuna matalan riskin ryhmässä oli 3,87 (95% CI 1,28-11,73, Wald n

p

= 0,017). Kaplan-Meier -käyrät kaikki koetinsarjaa mallit koulutukseen ja 1

st validointi sarjaa löytyy File S1. Välistä yhdenmukaisuutta riskin toimeksiantoja sekä koulutusta ja 1

st validointi asettaa perustuu eri luokittelijoiden oli korkea, 81-87% (Cramer V testi = 0,62-0,75).

Annotations kaikista 30 koetin setit mukana meidän malliin on esitetty taulukossa 3, kun taas graafisesti geeniekspressiomalleja 30-koetinsarjaa malli korkean ja matalan riskin potilailla on esitetty kuvassa 2a. Havaitsimme, että tässä mallissa, kaksi geeniä (ACE2 ja MAP4K1) edustivat kaksi koetinsarjojen. Välttääkseen vaikutuksen painotetaan näiden kahden geenin kaksi kertaa niin paljon verrattuna kullekin muulle yksittäisten anturi asetetaan, joka edustaa yhden geenin, me testattiin uudelleen malliamme koulutukseen ja 1

st validointi sarjaa yhtä koetinta käyttäen asettaa kunkin geenin. Vuonna training set tilastollista merkittävyyttä 28-geenissä malli pysynyt samana (log-rank testi,

p

0,001, kuva 3a) kanssa yksi perustuu 30-koetinsarjaa malli. Mediaani DFS että 1

st validointi asettaa, kuten ennusti 28-geenin mallin, oli 34 ja 80 kuukautta, vastaavasti (log-rank,

p

= 0,029, kuva 3b). Riskisuhde (HR) uusiutumisen että riskiryhmään verrattuna matalan riskin ryhmässä oli 4,38 (95% CI 1,06-7,01, Wald n

p

= 0,036).

Graafinen esitys 30-koetinsarjaa malli ekspressiokuvioita potilailla, joilla on suotuisa ja epäsuotuisa ennuste on esitetty paneelin. Punainen väri merkitsee yli-ilmentymisen ja vihreä väri ali vastaavat geenit. Molecular samankaltaisuus potilaalla on suotuisa ja epäsuotuisa ennusteen koulutukseen ja 1

st validointi sarjaa käyttäen Submap, näkyy paneelissa b. Palkki alapuolella ilmaisee suhdetta värin ja Bonferonni korjattu

p

arvoja. Punainen väri edustaa suuri luottamus Molekyylien homogeenisuus välillä vastaavien ryhmien, kun taas sininen väri edustaa epäluottamusta viipymättä.

Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet varten korkean ja matalan riskin potilailla perustuu 28-geeni malliriski ennusteet harjoitussarjassa (a) ja 1

st validointi setti (b).

edelleen vahvistaa ennustetekijöiden merkitystä näitä profiileja, haimme meidän 28-geeni malli yleisesti saatavilla kohortin varhaisvaiheen potilaiden kurkunpään syöpä [28]. Johtuen teknistä vaihtelu kahden aineistoja, 23 ulos 28 geenien mallimme käytettiin ositusta potilaille perustuu niiden riski toistumisen. Huolimatta tekninen ja biologinen rajoitukset (eri alustoilla, eri määrä geenejä, varhaisen vs kaikki vaiheen tauti) mallimme säilytti ennustetekijöiden merkitys. Mediaani DFS varten potilasryhmiä epäsuotuisa ja suotuisa ennuste, kuten ennusti 23-geenin mallin, oli 118 ja 161 kuukautta, vastaavasti (log-rank,

p

= 0,011, kuva S1). HR uusiutumisen että riskiryhmään verrattuna matalan riskin ryhmässä oli 4,37 (95% CI 1,24-15,34, Wald n

p

= 0.022).

Molecular homologiaa sairastavien potilaiden suotuisat ja epäsuotuisa ennusteen koulutukseen ja 1

st validointi sarjaa

28-geenin profiili vaikuttaa ei pelkästään olla kokoelma prognoosi- geenien vaan todella vangita taustalla biologiaan kasvaimia. Osoittaakseen molekyyli tasalaatuisuus korkean riskin kasvainten, käytimme alaluokka kartoitus (Submap), menetelmä, joka arvioi molekyyli samankaltaisuus ennalta ryhmiä, jotka kuuluvat eri aineistoja. Me todellakin esitetty, että ryhmät joilla on huono ja hyvä ennusteen harjoitussarjassa sama biologinen kuvioita vastaavien ryhmien validointi asetettu, ylä-ja ulkopuolella spesifisten geenien. Charts näyttämällä hyvää ”molekyyli ottelun” on korkean ja matalan riskin potilailla on esitetty kuvassa 2b.

Independent ennustetekijöitä merkitys 28-geenin mallin

Olimme kiinnostuneita osoittaa itsenäisen prognostisia merkitys meidän monigeenisiin ennustajan. Olemme mukana analyysissä vaiheessa ja arvosana, ainoa tunnettu ennustetekijät, joista tietoja oli saatavilla potilaiden Tutkimuksemme. Olemme myös sädehoitoa, koska on tunnettua vähentää merkittävästi paikallisen uusiutumisen. Vuonna Monimuuttuja-analyysissä, meidän 28-geenin malli säilyy rajatapaus ennustetekijöitä merkitys 1

st validointi asetettu. HR uusiutumisen korkean riskin ryhmässä oli 2,67 (95% CI ,99-+7,22, Wald n

p

= 0,05) (yksityiskohdat on esitetty taulukossa 4).

Pathway analyysi että korkean ja matalan riskin ryhmiin

jotta saataisiin joitakin muita käsityksen biologisten prosessien potilailla, joilla on suotuisa ja epäsuotuisa ennuste, suoritimme Gene Set Analysis (GSA). Tutkimme geeni verkkojen ja biologisia teemoja, kuten kuvataan Kioton Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) Pathway Database. Me todellakin tunnistettu monenlaisia ​​polkuja, differentiaalisesti ilmaisi kahden potilasryhmissä (GSA Goeman globaali testi

p

arvojen 0,01). Keskityimme reittejä vapautettiin sekä koulutuksen ja 1

st validointi sarjoiksi. Taulukko 5 esittää valittujen reittien kohteisiin, kun taas täydellisen luettelon polkuja löytyy kuten taulukossa S2. Useat näistä reiteistä on aiemmin osoitettu olevan tärkeä rooli pään ja kaulan syövän etenemisessä. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että geenit fokaalisen adheesion (FA) reitin [29], osoitettiin olevan ennustetekijöiden meidän aineisto, sekä pään ja kaulan alueen syöpä, onnistuneesti ositettu potilaamme perustuu niiden uusiutumisen riskiä (yksityiskohdat kuviossa 4 ).

Kaplan-Meier tautivapaan elinajan arvioita korkean ja matalan riskin potilailla, jotka on määritelty polttovälin tarttuvuus reitin geenien (log-rank,

p

0,005).

onkogeeninen reitin aktivaatio kuvioita yksittäisillä potilailla

lisäksi edellä mainittujen polku analyysitulokset, jotka on johdettu arvioidaan potilasryhmien, pyrimme tutkimaan reitin aktivaatio yksittäisillä potilailla . Käytimme aikaisemmin kehitetty ja validoitu ”in vitro” geeniekspression ”read-out” tunnistaa aktivoinnin tunnettujen onkogeenisten reittejä kullekin potilaalle koulutuksen ja 1

st validointi sarjoiksi. Olemme tutkineet Src, Ras, β-kateniinin ja E2F3 polkuja, jotka on aiemmin osoitettu liittyvän eloonjäämisen muiden syöpien [27]. Mielenkiintoista on, olemme osoittaneet, että potilailla, joilla on huono ennuste useammin oli kasvaimia ominaista Ras-reitin aktivaatio, kerroinsuhde (OR) = 2,92 (95% CI 1,33-6,39, Wald

p

0,01), kun taas potilailla, joilla on hyvää ennustetta useammin ollut kasvaimia näytteille Src ja β-kateniinin reitin aktivaatio, OR = 4,54 (95% CI 1,64-12,50,

p

= 0,003) ja 2,63 (95%: n luottamusväli 1,16-5,88,

p

= 0,03), tässä järjestyksessä. Lisäksi teimme Coxin suhteellisen vaarat selviytymisen regressio ja totesi, että Ras-reitin aktivaatio havaittiin liittyvän huonoon ennusteeseen, HR = 2,55 (95% CI 1,19-5,45,

p

= 0,020). Src, β-kateniinin ja E2F3 reitit eivät näyttäneet liittyvän DFS potilaalla on kurkunpään syöpä. Vastaavat Kaplan-Meier käyrät on esitetty kuvassa 5. Lopuksi suoritetaan Monimuuttuja-analyysissä, kuten 28-geenin malli ja Ras polku ja totesi, että ennustaja säilytti itsenäisen ennustetekijöitä merkitys (Wald n

p

= 0,001) , samoin onkogeenisel- polku (taulukko 6).

RQ-arvot on yhdistetty niin binary muuttujia saamiseksi 3-asteikko profiilien mukaan array tietoja. Merkkiaineet kuten. Sininen ja punainen käyrät vastaa odotettua ennustetekijöiden kuviot saatu 28-geenin malli tiettyjen geenien. Harmaa käyrät: luokittelemattomat potilasta (välimittakaavassa).

qPCR validointi osajoukko geenien 28 geenin ennustaja

Edellä mainitut analyysit suoritettiin käyttäen tuoreita jäädytetty kudosnäytteistä. Tämä lähestymistapa on tiettyjä menetelmiin liittyvät rajoitukset, kun se tulee päivittäin kliinistä käytäntöä. Niinpä yritimme vahvistaa meidän monigeenisiin ennustaja käyttää qPCR on FFPE kasvain kudosnäytteitä, helpommin sovellettavissa menetelmiä. Kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät jaksossa, mutta se oli mahdollista luotettavasti tutkia meidän FFPE näytesarjan ilmentymistä vain 10 28-geenien alkuperäisessä ennustaja. Kuvaileva ominaisuuksia RQ-arvoja informatiivinen näytettä määritystä on kuvattu taulukossa 7 (keinoin, mediaanit, SD, min, max). Aluksi yritimme klusterin jatkuva RQ-arvot kaikkien näiden geenien. Kuitenkin hierarkkinen klusterointi eivät tuottaneet tulosta verrattavissa 28-geeni ennustaja mielekkäällä tavalla, jossa suurin osa korkean ja matalan RQ-arvot ryhmittyneet vastakkaiseen suuntaan (kuviot 6a ja b). Tämä oli mikään yllätys, koska me vain tutki 1/3 geenien probed array allekirjoitus, kun taittuva muutos näiden geenien ilmentymistä oli hyvin kapea ja voisi helposti olla päinvastainen eri menetelmällä (qPCR vs. array hybridisaatio ) tai erityyppistä materiaalia (FFPE vs. makean pakastetut kudokset). Yksityiskohtainen analyyttisiä ja tilastollisia lähestymistapoja käyttäytymistä kunkin qPCR määrityksen vs. array koetin Hyväksytty FFPE vs. makean pakastetut näytteet tarvittaisiin selventämään tämän eron, mutta tällainen perusteellinen analyysi oli kuulu nykyisen tutkimus. Siksi me seuraavaksi sovellettu ennalta määrätyn profilointi tutkinnan mahdollisista vaikutuksista geenien testattu qPCR potilaiden DFS. Tätä tarkoitusta varten olemme muuttaneet jatkuva RQ arvot binary parametrit (korkea /matala ilme). Perustuen kapea kertamuutosta geeniekspression välillä hyviä ja huonoja ennustetta ryhmien 28-geenin ennustaja, käytimme mediaani RQ-arvot luokitella korkean ja matalan lauseke 10 arvioitavissa geenejä. Log-rank testaus näitä geenejä yksittäisinä markkereita tuotti yhdistysten lopputulokseen samanlaisia ​​kuin vastaavalle geenien U133A allekirjoitus (korkea /matala kuvioita verrattavissa ylä- ja alas-säätely geenin ilmentymisen osalta, että 6 10 geenejä), joista jotkut olivat merkittäviä (PRKD1) tai oli suuntaus merkitys (ACE2, FLOT1) (taulukko 8). Hierarkkinen klusterointi jatkuvan RQ-arvot kolmen jälkimmäisen geenit saatiin kaksi potilasryhmiä merkittävästi erilainen DFS (kuviot 6c ja d). Odotettavissa geeniekspressiomalli oli läsnä oikea yhteydessä kanssa lopputulokseen, mutta se puuttui useimmissa tapauksissa.

Hierarkkinen klusterointi RQ arvojen geeneistä testattiin 2

nd validointi setti (FFPE näytteet ). Paneeleissa a ja b, RQ-arvot 10 sovelletaan geenien arvioitiin. Kaksi tärkeää klustereita yksilöitiin (a), joka oli osoitettu olevan merkittävä vaikutus potilaan DFS (b). Ryhmä 1 liittyi parempi ennuste kuin klusterin 2. Kuitenkin, suurin osa näistä geeneistä ryhmittyivät vastakkaiseen suuntaan kuin odotettavissa 28-geenin luokitin. Vuonna kaistat c ja d, ryhmittely 3 geenien yksilöllisesti merkitseviä tuotti 2 potilasryhmien kanssa erilliset tulokseen; verrattuna alkuperäiseen 28-geenin luokittelija, oikea malleja geenien ilmentymisen olivat läsnä vastaavassa hyviä ja huonoja ennustetta ryhmiä. Punainen ja vihreä väri paneeleissa A ja C tarkoittavat korkea ja matala ilme, vastaavasti.

soveltaminen hyvää ennustetta korkea /matala geeniekspressiomalleja binaariseen muuttaneet RQ-arvot paljastui yksikään kasvain odotetaan jakautuvan kaikkien 10 geenit.