Krooninen sairaus

tiivistelmä

Plumbagin, joka on kinoniyhdistelisäaine löytyy kasveista lyijykukkakasvit hallussaan lääkinnällisiä ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa tutkittiin anti-proliferatiivista ja apoptoottisen aktiivisuuden plumbagin käyttämällä kahta ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, HT29 ja HCT15. IC50 Plumbagin varten HCT15 ja HT29 (22,5 uM ja 62,5 uM) olivat merkittävästi erilaiset. Tutkia vaste syöpäsolujen hoidon aikana strategioita, soluja käsiteltiin kahden eri pitoisuuksia, 15 uM, 30 uM HCT15 ja 50 uM, 75 uM ja HT29. Vaikka aktivoituminen NFKB, Kaspaasit-3, kohonneet

TNF-α

, sytosolin sytokromi C nähtiin molemmissa HCT15-solujen HT29 käsiteltiin plumbagin poikkeava apoptoosin alentunut taso pEGFR, Pakt, pGsk-3β, PCNA ja sykliini D1was havaittu vain 15 uM ja 30 uM plumbagin käsitelty HCT15 ja 75 uM plumbagin käsitelty HT29. Tämä viittaa siihen, että plumbagin indusoi apoptoosia sekä HCT15 soluissa ja HT29 käsitelty, kun taas, proliferaatio inhiboitui vain 15 uM ja 30 uM plumbagin käsiteltiin HCT15 ja 75 uM plumbagin käsiteltiin HT29, mutta ei 50 uM plumbagin käsiteltiin HT29. Expression of COX-2 aleni 75 uM plumbagin käsiteltiin HT29 verrattuna 50 uM plumbagin käsiteltiin HT29, kun taas HCT15 soluista puuttuu COX. Näin ollen havaittiin resistenssi apoptoosin induktio 50 uM plumbagin käsiteltiin HT29 luetaan sen ilmentymisen COX-2. Lopuksi plumbagin indusoi apoptoosia paksusuolen syövän soluihin TNF-α-välitteisen reitin riippuen ekspressioon COX-2: n ilmentymisen.

Citation: Subramaniya BR, Srinivasan G, Mohammed Sadullah SS, Davis N, Baddi Reddi Subhadara L , Halagowder D, et al. (2011) Apoptoosin indusoiva vaikutus Plumbagin on Colonic Syöpäsolut Riippuu Expression of COX-2. PLoS ONE 6 (4): e18695. doi: 10,1371 /journal.pone.0018695

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 17 joulukuu 2010; Hyväksytty 9 maaliskuuta 2011; Julkaistu: 29 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Subaramaniya et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National lääkekasveja Board, Intian hallitus, tohtori S. Niranjali Devaraj. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on ensisijainen kansanterveyden huolenaihe ihmiskunnalle ja on kolmanneksi yleisin syöpä Yhdysvalloissa [1]. Viimeaikaiset tiedot peräsuolen syöpä on hälyttävää kanssa arviolta 153760 tapauksia CRC lukien 52180 kuolemantapausta vuonna 2007 [1], [2]. Progression normaaleista paksusuolen epiteelisolujen osaksi kolorektaalisyöpää on monivaiheinen prosessi. Vaikka monet tekijät, kuten, menetyksen tai mutaatio tuumorisuppressorigeeneille, epigeneettiset muutokset valvontaan solujen eloonjäämistä, solujen lisääntymisen ja angiogeneesin, tulehdus on keskeinen rooli CRC kehitykseen ja etenemiseen [3] – [8].

NF-KB on keskeinen tulehduksellinen välittäjänä mukana aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden CRC [9]. Erilaisia ​​karsinogeenien ja kasvaimen promoottorit on osoitettu aktivoivan NF-KB: n ja ilmentämällä NF-KB: n havaitaan usein tuumorisoluissa. Useita geenejä mukana kasvain aloittamista edistäminen, ja etäpesäkkeiden säätelevät NF-KB: n sekä NF-KB tukahduttaa apoptoosin ja edistää leviämistä. Näin ollen aineet, jotka voivat alas-säädellä NF-KB: n vuoksi, olisi kyky estää syövän kehittymisen.

Plumbagin (5-hydroksi-2-metyyli-1,4-naftokinonia), joka on kinoniyhdistelisäaine, löytyy kasveista lyijykukkakasvit, Droseraceae, Ancestrocladaceae, ja dioncophyllaceae perheitä. Chief lähde Plumbagin on juuri

Plumbago zeylanica

L. (tunnetaan myös nimellä ”Chitrak”). Plumbagin on osoitettu aiheuttavan syöpää, ateroskleroosia torjuvaa ja antimikrobiaalista vaikutusta [10] – [13]. Juuri

P. zeylanica

L. on käytetty Intian lääketieteen ~2,750 vuotta ja sen komponenttien hallussaan antiatherogenic, kardiotonisia, hepatoprotective ja hermoja suojaava ominaisuuksia [11].

Sugie et al. [14] ovat osoittaneet, että plumbagin esti merkittävästi azoxymethane aiheuttama suoliston syövän syntymistä rotilla, mikä viittaa sen kemiallinen estoaktiivisuus. Plumbagin on myös osoitettu indusoivan S-G2 /M solusyklin pysähtymisen indusoimalla p21 (inhibiittori sykliini-riippuvaisen kinaasin) [15]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että Plumbagin aiheuttaa apoptoosia estämällä NF-KB erilaisissa syöpäsolulinjoissa myös ihmisen kroonisen myelooisen leukemian, ihmisen multippelimyeloomaa ihmisen alkion munuaisen syöpä ja rintasyöpä solujen [16], [17]. Tässä tutkimuksessa selvitimme antiproliferatiivisia ja apoptoottista aktiivisuutta plumbagin mukaan

in vitro

kokeellisissa malleissa käytetään kahta ihmisen paksusuolen syövän solulinjoissa, HT29 ja HCT15. Lisäksi mekanismi syövän vastaisen aktiivisuuden plumbagin perustettiin analysoimalla solukierron säätelyssä ja molekyylejä, jotka liittyvät solujen selviytymiseen ja apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja huolto

Ihmisen paksusuolen kasvainsolulinjoja HT29 ja HCT15 saatiin väärennöskeskukset Pune. Soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO BRL, Saksa), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Sigma, USA), 100 yksikköä /ml penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä, 10-20 ug /ml fungisone (Himedia, Intia ), pH 7,4 25 cm

2, kudosviljelypulloon (Himedia, Intia) 37 ° C: ssa 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

hoito

Plumbagin ostettiin Sigma. 100 mM liuosta, jossa oli plumbagin valmistettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), tallennetaan pienissä erissä -20 ° C: ssa ja sitten laimennettiin tarpeen soluviljelyelatusainetta. Annos-vaste-tutkimukset suoritettiin määrittämään sopivan annoksen solujen kasvun esto ja apoptoosin induktion.

MTT-määritystä

herkkyys HT29 ja HCT15-solujen plumbagin määritettiin MTT- kolorimetrisellä määrityksellä [18]. Solut (1 x 10

3 per kuoppa) ympättiin tasapohjaiseen 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin 24 h 37 ° C: ssa ja 5% CO 2. Molemmat solulinjat altistettiin plumbagin (1, 2,5, ja 5 uM 24 h). Liuotin DMSO käsiteltyjä soluja toimi kontrollina. Soluja käsiteltiin sitten MTT-reagenssia (10 ul /kuoppa) 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja sitten isopropanolia (100 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet. Optinen tiheys (OD) tallennettiin 570 nm: ssä mikrolevylukijalla. Prosenttiosuus jäljellä solujen elinkelpoisuus määritettiin [1- (OD hoidettujen solua /OD valvonta solujen)] x 100.

vaikutus plumbagin on PBMC

PBMC eristettiin heparinisoidusta laskimoverestä saatu terveen ihmisen vapaaehtoinen Ficoll-Paque (Histopaque 1077, Sigma Aldrich Inc., USA) tiheysgradienttisentrifugointi kohti vakiomenettelynä [19]. PBMC: (1 x 105 solua /kuoppa) viljeltiin täydellisessä RPMI-1640-media kuten tavallisesti ja inkuboitiin plumbagin 48 tuntia, minkä jälkeen MTT: llä.

Solusyklianalyysiä käyttämällä virtaussytometria

Sekä HT29 ja HCT15 solut ympättiin 6-kuoppaiseen levyyn tiheydellä 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Solut trypsinoitiin ja kerättiin sentrifugoimalla 1700

g

. Virtaussytometria-analyysi solusyklin suoritettiin värjäämällä läpäiseviksi solujen propidiumjodidilla (PI) ja DNA-pitoisuus. Solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, kiinnitettiin 70% etanolilla, värjättiin PI-liuosta (0,05 mg /ml PI, 2 mg /ml RNaasi A, 0,1% Triton X-100 PBS: ssa) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT) on pimeys. Fluoresenssi-intensiteetti mitattiin virtaussytometrillä (Becton-Dickinso) käyttämällä viritys- ja emissioaallonpituuksilla 488 ja 525 nm, vastaavasti. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Comet määritys

Komeetta määritys suoritettiin menetelmän mukaisesti ja Singh et al. (1988) [20] pienin muutoksin. HT29 ja HCT15-solujen (5 x 10

5) ympättiin 24-kuoppaisille levyille ja altistettiin halutun pitoisuudet plumbagin (lopullinen DMSO-konsentraatio ei ylittänyt 0,1%, verrokit samanaikaisesti käsiteltiin 0,1% DMSO: ta) ja määräaikoina. Käsittelyn jälkeen solut pelletoitiin sentrifugoimalla 1500 rpm. Pelletti suspendoitiin uudelleen 60 ul: aan PBS: ää (pH 7,4). 10 ui solususpensiota sekoitettiin 100 ul: aan 1% alhaisessa lämpötilassa sulavaa agaroosia ja 75 ui tätä solu–agaroosi-seosta levitettiin mikroskooppisen dioja esipäällystetty 1% agaroosia. Kolmas kerros 0,5% alhaisen sulamispisteen agaroosia (75 ui) levitetään kerros agaroosi solususpension kanssa. Leikkeitä inkuboitiin 1 h lyysausliuoksella (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 1% SDS, pH 10). Sen jälkeen solut altistettiin alkaliseen puskuriin (300 mM NaOH, 1 mM dinatrium-EDTA) 30 minuutin ajan. Mikroskooppisen dioja tehtiin elektroforeesi 0,8 V /cm-1 30 minuutin ajan, minkä jälkeen objektilasit upotettiin neutralointi puskurissa (0,4 M Tris, pH 7,5) 15 minuutin ajan. Värjäyksen jälkeen etidiumbromidilla (20 ug /ml) liukuu analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla (Nikon PCM-2000). Kuvia vähintään 50-solujen kolmesta Objektilasit analysoitiin käyttäen Cometscore ™ -ohjelmistoa. Kutakin komeetta kaksi alueet valittiin: koko solun DNA ja alueellinen joka sisältää vain pään alueelle komeetta. Kussakin valinnassa tiheydet mitattiin ja tulokset esitettiin hännän hetki määritellään tuloksena DNA: n prosenttiosuus hännän kerrottuna hännän pituus.

eristäminen RNA

valmistamiseksi kokonais-RNA: fenoli – guanidiinitiosyanaattimenetelmää perustuu Tri-reagenssia (genei ™, Bangalore) käytettiin. 10

7-soluissa, 1 ml Tri-reagenssia lisättiin ja hajotettiin toistuvia pipetoimalla ja sen annetaan seistä 5 minuutin ajan, minkä jälkeen lisättiin 200 ui kloroformia faasierkautumiasta .Vigorously vorteksoitiin 15 sekuntia ja sen annettiin seistä 15 min, jota seurasi sentrifugointi 12000 g 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Ylempi vesipitoinen kerros, joka sisältää RNA siirrettiin uuteen steriiliin DEPC käsiteltiin mikrofugiputkeen. Tämän, 500 ui jääkylmää isopropanolia lisättiin, sekoitettiin varovasti ja annettiin seistä 10 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 12000 g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti heitettiin pois ja RNA-pelletti pestiin 1 ml: lla 75% etanolia DEPC käsiteltyyn veteen ja jälleen sentrifugoitiin 14000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa saada kokonais-RNA. Tämä pelletti liuotettiin 25 ui: aan steriiliä RNaasitonta vettä kuumentamalla 55 ° C: ssa 20 minuutin ajan ja varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti.

RT-PCR (RT-PCR)

cDNA: n syntetisoimiseksi, käänteistranskriptioreaktio, joka sisälsi 1,0 ug kokonais-RNA: ta RNaasi /DNaasi-vapaaseen veteen ja 1,5 ui satunnaisia ​​heksamee- aluketta (GeNeiTM, Bangalore) inkuboitiin 10 min 72 ° C: ssa ja jäähdytettiin välittömästi. Tämän, 5,0 ui esisekoittaa 10 mM dNTP-liuosta (GeNeiTM, Bangalore), 3,0 ui 10 x M-MLV käänteistranskriptaasia puskuria (GeNeiTM, Bangalore), 1,0 ui (200 yksikköä /ul) M-MLV käänteistranskriptaasia (GeNeiTM, Bangalore) , lisättiin ja lisätään 50 ui käyttäen steriiliä RNaasi /DNaasi-vapaaseen veteen.

amplifioimiseksi cDNA, polymeraasiketjureaktio (PCR) ready mix (GeNeiTM, Bangalore) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden. Kaikki PCR näytteet denaturoitiin 94 ° C: ssa 5 minuutin ajan ennen pyöräily ja jatkettiin 10 minuuttia 72 ° C: ssa seuraavat pyöräily. PCR-määritys käyttäen alukkeita suoritettiin 39 sykliä 94 ° C: ssa 60 s, 60 ° C: ssa 60 s, ja 72 ° C: ssa 60 s. Alukkeet GAPDH, COX-2, TNF-α on esitetty taulukossa 1. Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer3 ohjelmistoa saatavilla ilmaiseksi https://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm ja nukleiinihapposekvenssi pääsee https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fci?val=Reference ID Taulukko. Alukkeet hankittiin Integrated DNA teknologioita, USA. Lisäksi ilmaus COX-2 ja TNF-α analysoitiin osittain määrällisesti käyttäen YK skannata ohjelmisto.

eristäminen proteiinia

0,5 ml fenoli-etanolia supernatantti, 3 tilavuutta asetonia lisättiin proteiinien saostamiseksi. Näytteet sekoitettiin inversion 10-15 sekunnin ajan, jotta saadaan homogeeninen liuos, ja annettiin seistä 10 min huoneen lämpötilassa. Proteiini saostettiin sentrifugoimalla 12000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti poistettiin ja pelletti dispergoitiin 0,5 ml: aan 0,3 M guanidiinihydrokloridia 95% etanolia 2,5% glyserolia (V:V). Dispergoinnin jälkeen pelletti, toinen 0,5 ml: n näyte guanidiinihydrokloridia /etanoli /glyseroli pesuliuosta lisättiin näytteeseen ja säilytettiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiini pelletoitiin nopeudella 8000 g 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pesuliuos poistettiin ja kaksi pesua suoritettiin 1 ml: lla guanidiini /etanoli /glyseroli pesuliuoksen. Lopullinen pesu suoritettiin 1 ml: ssa etanolia, joka sisälsi 2,5% glyserolia (V:V). Proteiini pelletoitiin ulos sentrifugoimalla nopeudella 8000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja ilmakuivattiin 5 minuutin ajan. Jälkeen lyhyesti Ilmakuivauksen proteiini pelletti liuotettiin 1% SDS. Proteiinikonsentraatiot solulysaateista arvioitiin Lowryn et al., 1951 [21], ja yhtä suuri kuin pitoisuudet proteiinin osa ajettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi- geelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja immunobloted spesifisten vasta-aineiden.

siRNA transfektio

COX-2-geenin hiljennettiin transfektoimalla COX-2 siRNA. Kuusi-kuoppaiselle kudosviljelylevylle, 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti ympättiin 2 ml antibiootti-free normaaliin kasvualustaan, jota oli täydennetty FBS: ää. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa, kunnes solut olivat 60-80% konfluentteja. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin ennen transfektiota. Seuraavat liuokset valmistettiin: Liuos A: Kutakin transfektiota, laimennettu 6 ui siRNA duplex (eli 0,25-1 ug tai 20-80 pmol siRNA) otetaan 100 ui siRNA transfektioväliainetta (Santa Cruz, USA). Liuos B: Kutakin transfektiota varten laimennetaan 6 ui siRNA Transfection Reagent (Santa Cruz, USA), otetaan 100 ui siRNA transfektio Medium. siRNA-duplex-liuosta (liuos A), sekoitettiin laimennettiin Transfection Reagent (liuos B) ja inkuboi seosta 45 minuuttia huoneen lämpötilassa. Kutakin transfektiota varten 0,8 ml siRNA Transfektio Medium lisättiin kuhunkin putkeen, joka sisältää siRNA Transfection Reagent seos (liuos A + liuos B), sekoitettiin varovasti, päällekkäin päälle pestyt solut ja inkuboitiin 5-7 tuntia 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa. Inkuboinnin jälkeen 1 ml: ssa normaalia kasvua väliaineessa, joka sisälsi 2 kertaa normaalia seerumia ja antibiootteja pitoisuus (2 x normaalin kasvun väliaineessa) lisättiin irrottamatta transfektioseosta. Soluja inkuboitiin vielä 18-24 tuntia. Medium korvattiin 1 ml: lla tuoretta 1 x normaalin kasvun väliaineessa ja käytetään edelleen määrityksessä.

Tilastollinen analyysi

Arvot mitataan keskiarvona x ± SD kolmesta kokeesta. Kokeelliset tulokset analysoitiin Studentin t-testiä. P 0,00 pidettiin tasoa erittäin merkittäviä ja P 0,05 katsottiin merkitys arvoihin, jotka saatiin hoidetuissa ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään.

Tulokset

Plumbagin indusoi sytotoksisuutta HCT15 ja HT29 koolonkarsinoomasoluissa

Käyttäen HCT15 ja HT29 koolonsyöpäsolulinjoissa, ensin arvioitiin vaikutus sytotoksisuuden plumbagin MTT: llä. Lisäksi poikkeavan Wnt-signalointi molemmissa solulinjoissa, HT29 tiedetään ilmaista COX2, kun taas HCT15 soluista puuttuu COX2 ilmaisua. Molemmat solulinjat olivat herkkiä plumbagin, mikä osoittaa, että plumbagin voivat aiheuttaa sytotoksisuutta sekä paksusuolen syövän soluja riippumatta siitä, COX2 tila (Fig. 1 a ja 1 b). Kuitenkin, HCT15 solut olivat herkempiä plumbagin IC

50 24 tuntia oli 22,5 uM, mikä on huomattavasti vähemmän kuin IC

50 plumbagin käsiteltiin HT29, joka on 62,5 uM. Vain ei merkittäviä muutoksia elinkelpoisuutta PBMC: n (normaalit solut) havaittiin jopa IN100 uM Plumbagin inkuboitiin solujen (Fig. 1 c) B

a. Sytotoksisuus vaikutus eri konsentraatioiden Plumbagin on HCT15-solujen

. Annoksesta riippuva sytotoksisuus vaikutukset Plumbagin on HCT15 solut edustettuina edellä kaavion. HCT15 solut olivat herkempiä plumbagin IC

50 24 tuntia oli 22,5 uM. Kaikki kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena, ja ilmoitetaan keskiarvona ± SD. Merkitys on merkitty *

p 0,001

.

b. Sytotoksisuus vaikutus eri konsentraatioiden Plumbagin HT29-soluihin

. Annoksesta riippuva sytotoksisuus vaikutukset Plumbagin HT29-soluihin oli edustettuna edellä kaavion. HT29-solut olivat herkempiä plumbagin IC

50 24 tuntia oli 62,5 uM. Kaikki kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena, ja ilmoitetaan keskiarvona ± SD. Merkitys on merkitty *

p 0,001

.

c. Sytotoksisuus vaikutus eri konsentraatioiden Plumbagin on PBMC-soluissa

. Annoksesta riippuva sytotoksisuus vaikutukset Plumbagin on PBMC-soluja edustettuina edellä kaavion. PBMC-solut olivat vastustuskyky plumbagin indusoitua sytotoksisuutta jopa 100 uM. Kaikki kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena, ja ilmoitetaan keskiarvona ± SD. Merkitys on merkitty *

p 0,001

.

Plumbagin estää leviämisen HCT15 ja HT29 paksusuolen syöpäsoluissa

Leviämisen HCT15 soluja käsiteltiin 15 uM ja 30 uM plumbagin nousi hieman 24 tuntia ja laski merkittävästi 48 tuntia ja 72 tuntia, kun taas käsittelemätön kontrolli-soluja pidettiin eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa. Sen sijaan, HT29 käsiteltiin 50 uM plumbagin osoitti eksponentiaalisen kasvun, joka on samanlainen kuin käsittelemätön kontrolli-solujen, ottaa huomioon, että HT29-solujen kasvuun käsiteltiin 75 uM plumbagin kasvoi hieman 24 tuntia ja väheni merkittävästi 48 tunnin ja 72 tunnin (kuvio . 2a ja 2b).

a. HCT15 soluja. b. HT29

. Leviämisen HCT15-solujen käsiteltiin 15 uM ja 30 uM plumbagin ja HT29-soluja käsiteltiin 75 uM plumbagin kasvoi merkittävästi 48 h ja 72 h, kun taas 50 pM plumbagin käsiteltiin HT29 taipumus lisääntyä. Kaikki kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena, ja ilmoitetaan keskiarvona ± SD. Merkitys on merkitty *

p 0,001

.

Plumbagin indusoi apoptoosin HCT15 ja HT29 koolonkarsinoomasoluissa

Voit selvittää DNA vahingoittamatta ominaisuuksia plumbagin, HCT15 soluja inkuboitiin 15 uM ja 30 uM plumbagin 24 tuntia, kun taas, HT29-soluja inkuboitiin 50 uM ja 75 uM plumbagin 24 tuntia. Ulkonäkö komeetta hännät vastaavan induktion kanssa DNA-vaurion olivat näkyvissä (Fig. 3). HCT15 soluja käsiteltiin 30 uM plumbagin ja HT29 käsiteltiin 75 uM plumbagin osoittivat lisääntynyttä säilynyt DNA-vaurion. Jänneväli Komeetan pyrstö oli kymmenen ja kuusi kertaa ohjaus- HCT15 soluja ja 15 uM plumbagin käsitelty HCT15, vastaavasti, kun taas, 50 uM ja 75 uM plumbagin – käsiteltyjen HT29 näkyy neljä ja kaksi aika span hännän vastaavasti verrattuna ohjata HT29. DNA-vaurioita ei havaittu, kuten halo ympäröivän soluytimet näkyi selvästi valvontaa soluissa.

HCT15 soluja käsiteltiin 30 uM plumbagin ja HT29 käsiteltiin 75 uM plumbagin osoittivat lisääntynyttä säilynyt DNA-vaurion. Pituus komeetta hännän oli kymmenen ja kuusi kertaa ohjaus- ja 15 uM plumbagin käsitelty HCT15, vastaavasti, kun taas, 50 uM ja 75 uM plumbagin – käsiteltyjen HT29 näkyy neljä ja kaksi aika span hännän vastaavasti verrattuna ohjaus HT29. DNA-vaurioita ei havaittu, kuten halo ympäröivän soluytimet näkyi selvästi valvontaa soluissa.

Analyysi NFKB, kaspaasi-3 aktivointi ja sytokromi C vapautumisen plumbagin inkuboidaan HCT15 ja HT29

kaspaasi-3, NFKB (p65) ja sytosolin vapautuminen sytokromi C analysoitiin western-blottauksella (Fig. 4a). Aktivointi NFKB (p65) oli merkittävästi lisääntynyt sekä 15 uM ja 30 uM plumbagin – käsitelty HCT15 sekä 50 uM ja 75 uM plumbagin – käsiteltyjen HT29, kun vertailuryhmän HCT15 ja HT29. Kaspaasi-3 ja tasot sytosolin sytokromi C oli huomattavan suuri, sekä 15 uM ja 30 uM plumbagin – käsiteltyjen HCT15-solujen, verrattuna käsittelemättömiin HCT15 soluihin. Kuitenkin kaspaasi-3 ja tasot sytosolin sytokromi C olivat korkealla vain 75 uM plumbagin käsiteltiin HT29, mutta ei HT29 käsiteltiin 50 uM plumbagin.

a. Immunoblottaus analyysi NFKB aktivaation, kaspaasi-3 aktivointi ja sytokromi C release

. Lane 1- Control HCT15; Kaista 2- 15 uM plumbagin käsiteltiin HCT15; Lane 3- 30 uM plumbagin käsiteltiin HCT15; Lane 4 Ohjaus HT29; Kaista 5- 50 uM plumbagin käsiteltiin HT29; Lane 6- 75 uM plumbagin käsiteltiin HT29.

b.i. Solusyklianalyysiä valvonta- ja plumbagin hoito HCT15 ja HT29 virtaussytometrialla

. Verrattuna kontrolli HCT15, HCT15 käsiteltiin plumbagin näkyy selvä nousu Saharan G1 osa viittaa siihen, että nämä solut apoptoosin. HT29 altistuvat 75 uM Plumbagin yksin näytteille kasvu Saharan G1 osa taas HT29 altistetaan 50 uM Plumbagin Saharan G1 jae oli paljon vähemmän.

b.ii. Määrää koskevia tietoja solusyklin analyysi

. Kaikki kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena, ja ilmoitetaan keskiarvona ± SD. Merkitys on merkitty *

p 0,001

.

Solusyklianalyysiä valvonta- ja plumbagin käsiteltiin HCT15 ja HT29

HCT15 soluja altistetaan 15 ja 30 uM ja Plumbagin näytteillä jatkuva kasvu osa-G1 osa, joka voi sisältää sekä apoptoottisten ja roskat osa mikä yhdessä solukuolemien. Vahinko oli ilmeinen 30 uM Plumbagin. Sub-G1 murto valvontaa oli 6,8%, kun taas sama oli 24.52 ja 37.87% 15 ja 30 uM Plumbagin käsiteltyjen HCT15 soluissa (Kuva. 4b.i). Tämä osoittaa annosriippuvaisen apoptoosin lisääntyminen on HCT15 soluissa Plumbagin. Tulokset myös kuvitettu liittyy kertyminen solujen G0 /G1 vaihe, joka ilmaisee esto liikkuvuuden soluja G0 /G1 vaiheesta S-vaiheeseen, mikä viivyttää tai estämään pääsyn tytär solujen mitoottisiin sykli.

Jos HT29 altistuvat 75 uM Plumbagin yksin näytteille kasvu Saharan G1 osa taas HT29 altistetaan 50 uM Plumbagin Saharan G1 jae oli paljon vähemmän. Sub-G1 osa valvontaa oli 4,39%, kun taas sama oli 6,14 ja 26,76% 50 ja 75 uM Plumbagin käsiteltiin H29-soluissa, osoittaen, esiintyminen laaja apoptoosin ainoastaan ​​75 uM Plumbagin käsiteltiin H29-solujen, verrattuna 50 uM of Plumbagin käsiteltyjen H29 soluista ja valvoa HT29. Tulokset myös osoittavat, että kertyminen solujen G0 /G1 vaihe vain 75 uM Plumbagin käsiteltyjen H29 soluista, mikä aiheuttaa merkittävää laskua väestöstä S ja G2 /M vaiheessa, mikä osoittaa, viive tai esto tulo näiden solujen synteesiä vaiheeseen ja mitoosi sykli. Runsaasti lisää solupopulaation havaittiin S ja G2 /M vaiheessa 50 uM Plumbagin käsiteltyjen H29 soluista osoittaa solujen lisääntymistä (kuvio. 4.b.ii) B

Analyysi fosforyloidun Akt, fosforyloitu EGFR, PCNA ja sykliini D1 plumbagin inkuboitiin HCT15 ja HT29

Expression of PCNA, sykliini D1 sekä fosforylaation Akt ja EGFR analysoitiin western-blottauksella (Fig. 5). Expression of PCNA oli merkittävästi vähentynyt 15 uM ja 30 uM plumbagin käsiteltiin – HCT15 soluja käsittelemättömiin soluihin verrattuna. Merkittävä lasku tasoilla PCNA havaittiin vain 75 pM plumbagin käsiteltiin HT29-soluissa, mutta ei 50 uM plumbagin käsiteltiin HT29. Merkittävästi alentuneet fosforyloidun EGFR, Akt ja GSK-3β havaittiin 15 uM ja 30 uM plumbagin käsiteltiin HCT15 ja 75 uM plumbagin käsiteltiin HT29 verrattuna kontrollisoluihin. 50 uM plumbagin käsitelty HT29, tasot fosforyloitua EGFR, Akt ja GSK-3β osoitti merkityksetön muutoksia. β – Actin toimi sisäisen valvonnan.

Lane 1- Ohjaus HCT15; Kaista 2- 15 uM plumbagin käsiteltiin HCT15; Lane 3- 30 uM plumbagin käsiteltiin HCT15; Lane 4 Ohjaus HT29; Kaista 5- 50 uM plumbagin käsiteltiin HT29; Lane 6- 75 uM plumbagin käsiteltiin HT29. Expression of PCNA, sykliini D1 yhdessä fosforylaatioon Akt ja EGFR olivat merkittävästi vähentyneet 15 uM ja 30 uM plumbagin käsitelty HCT15 ja 75 uM plumbagin verrattuna ohjaus HCT15, ohjaus HT29 ja HT29 käsiteltiin 75 uM plumbagin. β-Actin toimi sisäisen valvonnan.

Analyysi

TNF-α

ja

cox-2

ilmentymisen HCT15 ja HT29 käsiteltiin plumbagin

a. b. c. d.