Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monipuolinen bioreaktori soveltuu nopeaan keskeyttämistä soluviljelmässä alle viritettävä leikkausjännitys olosuhteissa on kehitetty ja alustavasti testattu viljely syöpäsolun pallosia. Hyväksymällä yksinkertaisia ​​teknisiä ratkaisuja ja välttää pyörivät komponentit, bioreaktorin hyödyntää laminaarisen hydrodynamiikkaa perustamisesta sisällä kulttuuri kammiossa mahdollistaa dynaamisen solususpensiota suotuisa ympäristö joukkoliikenne, monenlaisissa viritettävien leikkausjännityksen olosuhteissa. Suunnitteluvaiheessa laite on tuettu Multiphysicsin mallinnuksen ja on tarjonnut kattavan analyysin toimintaperiaatteet bioreaktorin. Lisäksi selittävä esimerkki on tässä esitetään Multiphysics simulaatioita käytetään asettamaan oikea bioreaktorin toimintaedellytykset alustava

in vitro

biologisten testien ihmisen keuhkokarsinoomasolulinja. Biologiset tulokset osoittavat, että ultralow leikkaus dynaaminen suspension, jonka laite on hyödyllinen viljelyn syöpäsolun pallosia. Verrattuna staattinen jousitus ohjaus, dynaaminen solususpensiota säilyttää morfologisia ominaisuuksia, edistää solujen välinen yhteys, lisää pallojakaantuminen koko (2,4-kertainen kasvu) ja numero pyöräily solujen (1,58-kertainen), ja vähentää kaksijuosteisen DNA-vaurioita (1,5-kertainen vähentäminen). Ajatellaan, että monikäyttöisyyttä bioreaktorin saattaa sallia tutkimus ja laajennus erilaisia ​​solutyyppejä tulevaisuudessa.

Citation: massai D, Isu G, Madeddu D, Cerino G, Falco A, Frati C, et al . (2016) Monipuolinen BIOREAKTORITEKNIIKKA dynaamisten Jousitus Cell Culture. Soveltaminen Culture of Cancer Cell Pallot. PLoS ONE 11 (5): e0154610. doi: 10,1371 /journal.pone.0154610

Editor: Maurizio Pesce, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA

vastaanotettu: Joulukuu 23, 2015 Hyväksytty: 15 huhtikuu 2016; Julkaistu: 4. toukokuuta 2016

Copyright: © 2016 Massai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: Tämä työ sai osarahoitusta (1) Euroopan FP7 yhteistyö – Collaborative Project ”Bioaktiivinen erittäin huokoinen ja Ruiskeena Scaffolds ohjaus Stem Cell rekrytointi, lisääntyminen ja erilaistuminen ja ottaminen Angiogeneesi Sydäntutkimussäätiö Engineered kudokset ”- BIOSCENT, 2009-2013 (ID 214539), ja (2) Italian kansallisen PRIN 2012 Project” Bioprosessitekniikan varten optimointi 3D Cardiosphere perustuvia konstrukteja Cardiac regeneratiivisen lääketieteen ”- BEAT3DHEART, 2014 -2017 (20123E8FH4) sekä lisärahoitusta sisäinen Politecnico di Torino ja Università degli Studi di Parma. Bioexpansys Srl tuki taloudellisesti muodossa palkan tekijän GFDL ja tutkimus, mutta ei ollut lisätehtävä tutkimusasetelma, tietojen keruun ja analysoinnin, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit kirjoittajat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikka ja laatijat käsikirjoitus on seuraavat kilpailevia intressejä: Giuseppe Falvo D’Urso Labate toimii toimitusjohtajana Bioexpansys Srl, jakelija dynaamisen kulttuurin laite. Mikään kirjoittajat ovat saaneet palkkioita tai tuntijapalkkioksemme kirjallisesti tämän käsikirjoituksen. Mikään muu mahdolliset eturistiriidat merkitystä tässä artikkelissa raportoitu. Kumpikaan Bioexpansys Srl eikä mikään muu yksityinen yritys on ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Olosuhteet Dr. Falvo D’Urso Labate tai muita kirjoittajien työhön eivät muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa tietojen yhteiskäyttöä tai materiaaleja.

Johdanto

suuren mittakaavan tuotantoon solujen on pakollinen askel perustaa taloudellisesti kannattavia in vitro kokeellisissa malleissa perustutkimukseen, tauti mallinnus ja huumetestejä, ja varmasti kääntää kudosteknologian ja regeneratiivisen strategioita kliininen käytäntö terapeuttisiin sovelluksiin. Kuitenkin skaalautuvuus ja standardoinnin solujen valmistusprosesseissa ovat edelleen suuria haasteita. Erityisesti silloin, kun suuri määrä soluja (10

10-10

12) vaaditaan, tavanomainen kaksiulotteinen (2D) kulttuuri strategiat, perustuu pääasiassa manuaalinen, erittäin tilaa ja työvoimavaltainen interventiot ovat käytännössä ja taloudellisesti kestämätön [1-5].

Kun skaalaus ylöspäin näkökulmasta ja innoittamana valmistusprosessien terapeuttisia biofarmaseuttisen teollisuuden [6,7], kolmiulotteinen (3D) suspensioviljelmäolosuhteissa on osoitettu olevan edullinen vaihtoehto yksikerroksista tekniikoita laajamittaista kasvua solujen [4,5,8,9]. Yksityiskohtaisesti, jousitus menetelmiä on laajalti hyväksytty: (1) varten skaalautuva ja hallitun laajentumisen kantasolujen [10-15] ja syöpäsolujen [16-18]; (2) ohjaamiseksi kantasolujen erilaistumista [13,19-22]; (3) tuotantoa varten solu- pallosia ja kudosten kaltaisia ​​konstruktioita [23-25]. Säännös 3D suspensioviljelmäolosuhteissa ympäristö matkien microenvironment matkapuhelinverkon kapealla, on osoittautunut hyödylliseksi, solun eloonjäämisen edistämisessä ja säilyttäen solujen toiminnallisia ominaisuuksia

in vitro

[9,26,27]. Lisäksi silloin, kun suspensio on saatu dynaaminen sekoittumisen viljelyalustan (1) muodostuminen gradientteja, esimerkiksi lämpötila, pH, liuennut happi, ravinteet /metaboliitit estetään, (2) hapen ja ravinteiden on lisääntynyt, ja (3) sedimentaatio viljeltyjen solujen /konstruktioita vältetään, mennään siis pidemmälle kuin luontaisista rajoituksista staattisen kulttuurin järjestelmien [4,7,9,28].

Nykyään dynaaminen jousitus kulttuurin skaalautuva tuotanto ja erilaistumista solujen on enimmäkseen suoritetaan nosti säiliön ja pyörivät bioreaktoreissa [2,4]. Tällaiset laitteet on suunniteltu tarjoamaan 3D homogeeninen kulttuuri ympäristölle ja jonka avulla voidaan seurata ja hallita kulttuurin parametreja, mikä aiheuttaa lisää toistettavissa, kestävä ja kustannustehokas prosesseja [5, 29,30,31]. Kuitenkin suurin osa näistä bioreaktoreissa kärsivät yhä kriittisiä kysymyksiä, rajoittamalla skaalaus ja standardointi laajennus bioprosessien. Koskevat sekoitetaan tankkibioreaktorit, niiden suorituskyky voidaan vaikuttaa (1) törmäykset Solujen juoksupyörän ja (2) puhkeamista turbulentti virtaus, että molemmat voivat aiheuttaa ei-fysiologisia mekaanisia ja hydrodynaaminen-leikkaus- rasituksia soluilla ja johtaa soluvaurioita. Lisäksi nämä epäsuotuisat olosuhteet voivat vaikuttaa solujen kasvua ja aineenvaihduntaa, häiritä kantasolujen pluripotenttisuus ja rajoittaa tehokkuutta ja toistettavuus kulttuurin prosessin [4,9,28,30,32,33]. Pyörivä bioreaktorit tuottaa alhaisen leikkausjännityksen kulttuuri ympäristö, jonka avulla voidaan osittain korjata puutteet sekoitetaan säiliön laitteita. Kuitenkin monimutkaisuus teknologisten ratkaisujen antoi pyörimään tekevät näistä laitteista ei helposti skaalautuva ja sopimaton jatkuvan keskipitkällä vaihto ja reaaliaikainen seuranta [4].

Esitämme tässä monipuolinen bioreaktorin soveltuu viritettävä leikkausjännitys dynaaminen jousitus soluviljelmässä. Yksityiskohtaisesti hyväksymällä yksinkertaisia ​​teknologisia ratkaisuja ja välttää pyörivät komponentit, ehdotettu bioreaktori mahdollistaa solususpensio vakuuttamalla laminaarisen sekoituksen virtaukset, mikä takaa hapen ja ravinteiden kuljetus ja lopulta homogeenisen kulttuurin ympäristöön monenlaisia ​​leikkausjännityksen olosuhteissa.

jotta ylittää kokeellinen tutkimus-ja-virhe lähestymistapa ja saavuttaa syvemmän ymmärryksen nesteen dynamiikkaa kehittämällä sisällä kulttuuri ympäristöön [34,35], suunnitteluvaiheessa laite on tuettu in silico Multiphysics mallinnus, joka tarjoaa kattavan analyysin toimintaperiaatteet bioreaktorin. Lisäksi havainnot Multiphysics simulaatiot toimi perusteita asettaa oikea bioreaktorin toimintaedellytykset alustava

in vitro

testeissä. Erityisesti tämä ensimmäinen tutkimus keskittyi soveltuvuutta arvioitaessa bioreaktorin ultralow leikkausjännitys dynaaminen jousitus laitteen syöpäsolun pallomainen kulttuuriin. Tätä tarkoitusta varten Calu-3 ihmisen keuhkokarsinooma solulinja käsiteltiin ultralow leikkausvoiman dynaaminen suspension, jonka laitteen. Biologinen tulokset osoittavat, että tämä lähestymistapa säilyttää syöpäsolujen kasvua

in vitro

, kuten pallomainen muodostumista, ja ehdottaa soveltuvuus ehdotetun bioreaktorin tutkittavaksi solun toiminnallisia ominaisuuksia ja laajentamiseen erilaisia ​​solutyyppejä.

Materiaalit ja menetelmät

dynaaminen jousitus bioreaktorissa

laitteen rakenteen (kuvio 1A) ajoi kaksi vaatimusta: (1) tarjota dynaaminen suspensioviljelmään asianmukaisen sekoittumisen; (2) taata viritettävä ultralow kohtalaiseen leikkausjännitys kulttuuri ympäristöön, säädettävä pohjalta kulttuurin vaatimusten yksinkertaisesti muuttamalla käyttöolosuhteissa. Nämä tavoitteet saavutettiin yhdistämällä erikoinen geometrinen ominaisuudet bioreaktorin kulttuurin kammio jatkuvan kierrätyksen viljelyalustan varmistettu suljetun silmukan kierrätysjärjestelmän piiriin, välttämällä juoksupyörät ja /tai rotaatio komponentteja. Tämä yhdistelmä edistää perustamista vilkasta pyörteitä kulttuurin kammioon, joka ylläpitää solua /konstruktioita dynaamisissa jousitus, minimoi niiden sedimentaatio.

(A) Kaavamainen arvotaan bioreaktorin osoittaa sen sisäosia ja sen aksiaalisymmetrian (punainen linjat). (B) Kuva bioreaktorin. (C) Kaaviokuva perustamiseen bioreaktorin kytketty suljetun silmukan kierrätyksen piiri ja sijoitettava inkubaattoriin.

Bioreaktoria (kuvio 1 B, ulkomitat = 95 mm x 70 mm x 70 mm) koostuu: AISI 316L ruostumattomasta teräksestä base; polykarbonaatti kulttuuri kammio asuntojen solujen /konstruktit (kammiotilavuus = 75 ml); polykarbonaatti kansi. Kaarevuus ja muoto sisäseinän kulttuurin kammion oli suunniteltu ja optimoitu sukupolven vilkasta pyörteiden näytteen jousitus (selitetään seuraavassa). Keskeytetty solua /konstruktit rajoitu sisällä kulttuuri kammion avulla läsnäolo (1) AISI 316L ruostumattomasta teräksestä yksisuuntainen takaiskuventtiili (joka estää takaisinvirtauksen ja takaa symmetrisen virtauksen syötössä), ja (2) kasvualustalla läpäisevä suodatin ( Durapore

®, MerckMillipore, Saksa), joka estää tahattoman lähdöt soluja. Bioreaktori on osa suljetun silmukan piiri kierrätyksen happipitoista viljelyalustaa (kuvio 1C). Tällainen kierrätys piiri koostuu väliaineen säiliön, happea läpäisevän peroksidi cured silikoniputkea (Masterflex L /S

®, Cole-Parmer, IL, USA), jossa pikaliitin kytkimet, ja peristaltiikkapumppu (Masterflex L /S

®, Cole-Parmer, IL, USA), yhteensä käyttötilavuus oli noin 200 ml. Takaamaan riittävä hapensaanti sisällä kulttuurin kammiossa, kierrätys- piiri mitoitettiin käyttäen analyyttistä happea massatase mallin mukaisesti Orr et al. [36].

toimintaperiaate bioreaktorin perustuu jatkuvaan kierrätyksen viljelyalustan sisällä kulttuuri kammiossa laminaarivirtausolosuhteissa, saatu modulaatio takaisinkierrätys piirin virtaus, jotta voidaan tuottaa alkaen ultralow kohtalaiseen leikkausjännitys dynaaminen jousitus olosuhteissa. Yksityiskohtaisesti väliaine virtaa sulkuventtiilin vetämänä peristalttisen pumpun vastaan ​​staattisen paineen muutos, ja tunkeutuu kulttuuriin kammioon. Peräkkäin, väliaine kulkee suodattimen ja virtaa ulos kannen, liikkuvat takaisin säiliöön jatkuvassa suljetun silmukan prosessi. Muodostuminen vilkasta pyörteiden sisällä kulttuuri kammion avulla dynaaminen keskeyttämistä viljeltyjen solujen /konstruktioita (S1 elokuva).

Laskennalliset mallit

laskennallinen Multiphysics lähestymistapa tukivat suunnittelu ja optimointi vaiheet laitteen, joka mahdollistaa tunnistamisen (1) optimaalinen geometria kulttuurin kammion, ja (2) toimintaolosuhteet dynaamisten keskeyttämistä soluviljelmässä määrätyissä leikkausjännitys arvoja. Massiivinen määrä simulaatioita suoritettiin vaihtelemalla sekä solu /rakentaa mitat (mitattuna niiden läpimitta) ja erittäin laimeaa soluinokulaation tiheydet, jotta voidaan tutkia herkkyyden nestevirtauksen näihin kulttuuriin parametrien sisällä kammion tilavuus.

teknisesti hyödyntäen aksiaalisymmetrian laitteen (kuvio 1A), joukko akselisymmetrisiä ajasta riippuvaa numeeristen simulaatioiden suoritettiin käyttäen räätälöityjä kontrollitilavuus tekniikka-pohjainen kaupallisia ohjelmistoja (FLUENT, ANSYS Inc., PA, USA). Nesteen domeeni oli diskretoidaan käyttäen ICEM CFD-ohjelmiston (ANSYS Inc., PA, USA). Mesh kardinaliteetti sama 6.5×10

3 nelisivuinen soluja pidettiin. Kuten aiemmissa tutkimuksissa [21,37], samanaikainen esiintyminen elatusainetta ja soluja mallinnettiin käyttämällä Eulerin-Eulerian monivaiheiset malli, joka mahdollistaa seoksia useiden erotetaan vielä vuorovaikutuksessa vaiheissa jatkumo kuvattava. Kunkin vaiheen hallintoelimen liikeyhtälöt, Navier-Stokesin yhtälöt, ratkaistiin numeerinen ratkaisija. Viljelyalustan, pidetään ensisijaisena vaiheessa oletettiin olevan Newtonin fyysisiä ominaisuuksia elatusaineita tavallisesti käytetään soluviljelmässä sovelluksissa (dynaaminen viskositeetti = 1×10

-3 Pa s, tiheys = 1000 kg /m

3) [21]. Suspendoidut solut, pidetään toisen upotetaan vaiheen, mallinnettiin ei-deformoituvan pallomaisia ​​helmiä. Vuonna selittävä esimerkissä raportoitu tässä työssä, tiheys yhtä kuin 1070 kg /m

3 [38] ja keskimääräinen halkaisija on 20 pm (eli mitattu halkaisija Calu-3 syöpäsolujen) katsottiin. Läsnäolo suodattimen mallinnettiin huokoisen väliaineen tunnettu arvo Darcy hydraulinen vastus yhtä 96×10

4 m

-2 elatusaineeseen ja asetetaan suurin hydraulinen vastus hyväksytty ratkaisija (1×10

20 m

-2) ja solut, joilla on suodattimen huokosten keskimääräinen koko on 5 um, mikä on läpäisemätön niitä. Soluinokulaation oletettiin olevan yhtenäinen ala-alueella viljelmän kammion. Tämä olettamus käännettiin laskennallisen kehyksen määräämistä alkuehtoina, yhtenäinen tilavuusosuus (VF) viemä solut (toissijainen vaihe) alempaan alus alue (10 ml, selittävässä esimerkiksi käyttämällä Calu-3 solulinja) . Simuloinnit suoritettiin harkitsee aina erittäin laimeaa suspensioviljelmissä (Stokes numerot huomattavasti pienempi kuin 1, VF-arvo pienempi kuin 1%), joille vaihtelut alkuperäisen VF eivät merkittävästi vaikuta virtaukset ensisijaisen vaiheessa. Kuten ohjeellinen raja-arvo sedimentaatio, VF-arvo suurempi kuin 20% katsottiin, mikä vastaa noin kolmannes suurimmasta täyterajaa 63%, eli täyterajaa muotoa ei voi muuttaa pallomaisia ​​helmiä säännöllisesti pakattu [21]. Simulaatiot laajennettiin yli virtausnopeus arvot välillä 5-120 ml /min, jossa on simuloitu kulttuurin yhtä suuri 60 min, jonka katsottiin riittävän täydellisesti kuvata dynamiikkaa väliaineen sisällä kulttuurin kammion. Vaihelukitun SIMPLE järjestelmää käytettiin paineen nopeuden kytkentä. Toinen Order vastatuuliasteikko ja QUICK muotoilua käytettiin spatiaalisen diskretisoinnista vauhtia ja toisen vaiheen liikenteen, vastaavasti. Tiedot liittyvät malliyhtälöt ja reunaehdot raportoidaan S1 teksti.

Lisäksi tutkiakseen vaikutuksen dynaamisen sekoituksen perustamisesta sisällä kulttuurin kammiossa kehityksestä fyysisen ja ympäristön määriä, kuljetukseen, jossa skalaari määrä sisällä kulttuurin kammiossa mallinnettiin. Yksityiskohtaisesti, hapen liuenneen keskipitkällä sisällä virtaavan kulttuurin kammion simuloitiin ratkaisemalla advection /diffuusio liikenteen yhtälö yhdistettynä Navier-Stokesin yhtälöt. Täysin hapettomia elatusaineeseen sisälle kulttuuriin kammion pidettiin alkuehtoina (pahimmassa tapauksessa). Tämä laskennallinen malli voidaan yleistää kaikkiin liuennut lajit ominaista samanlainen Péclet numeroita (eli suhde lämpö tasoittuu ja diffuusiosiirtymistä hinnat). Lisätietoja mallien oletukset ja yhtälöt raportoidaan S2 teksti.

In vitro

soluviljelmässä

Suorituskyky bioreaktori selittävä testattiin ultralow leikkausjännitys dynaaminen kulttuuri kehys (määräämällä virtausnopeudella 5 ml /min), koska tunnistaa in silico analogi in vitro kokeessa (katso tulokset). Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) solulinja Calu-3 (American Type Culture Collection, ATCC, VA, USA) valittiin ja tulokset dynaamisen kulttuurin verrattiin staattinen suspensioviljelmä ohjaus. Yksityiskohtaisesti, soluja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma Aldrich, MO, USA), lisättiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% penisilliini /streptomysiini (P /S) ja 1% ei-välttämättömiä Aminohapot (NEAA, Sigma Aldrich, MO, USA), ja ylläpidettiin vakio soluviljelmässä olosuhteissa 37 ° C: ssa vedellä kyllästettyä ilmakehässä 5% CO

2 ilmassa. Sen jälkeen laajeneminen soluviljelypullot, 9×10

6 Calu-3-solut (1.92×10

5 solu /ml) ympättiin reaktorin sisällä kulttuurin kammioon ja viljeltiin 5 päivää dynaaminen suspensiossa täydellistä kasvualustaa. Bioreaktori käytettiin virtausnopeudella 5 ml /min. Samanaikaisesti, Calu-3-soluja ympättiin samalla tiheydellä alhaisen kiinnityksen viljelypulloissa (Corning Inc., NY, USA), jota käytettiin verrokkina, edustaa mallin staattinen suspensioviljelmä. 5 päivän jälkeen, dynaaminen ja staattinen keskeytettiin viljeltyjä soluja pelastettiin bioreaktorissa ja matalalta kiinnitys kulttuuri pulloon, vastaavasti, ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen kasvualustaan ​​tarkempaa analysointia varten. Kolme erillistä staattisen ja dynaamisen suspension viljelmät tehtiin.

Arviot

in vitro

soluviljelmässä

Calu-3 kerättyjä soluja bioreaktorissa ja matalalta kiinnitys Viljelmäpulloa ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen kasvualustaan ​​tutkittiin käänteismikroskooppi (Olympus CK40, Japani). Mikrovalokuvia kerättiin ja analysoitiin kuva-analyysi-ohjelmisto (Image Pro-plus 4.0, Media Cybernetics, USA), jotta (1) laskea Määrässä yhden Calu-3-soluissa ja määrä Calu-3-solut muodostavat pallojen, ja (2) määrittää pallomainen kokoja.

Lisäksi Calu-3 solujen dynaamisen ja staattisen keskeytettiin kulttuuri käsiteltiin Lähetyksen (TEM) analysointiin ja immunosolukemiallinen. TEM-analyysi, Calu-3 solut kiinnitettiin Karnovsky liuokseen (4% formaldehydiä, 5% glutaarialdehydiä). Näytteet kiinnitettiin jälkikäteen 1% osmiumtetroksidiin ja dehydratoitiin lisäämällä keskittyminen alkoholia. Sitten näytteet pestiin propyleenioksidin ja upotettiin epoksihartsiin. Jaksot 0,5 pm paksuudeltaan värjättiin metyleenisinistä ja Safraniini ja morfologisesti valita alan kiinnostusta. Myöhemmin ultrathin osat koottiin 300-mesh kupari verkkoon ja värjäyksen jälkeen uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla olivat laadullisesti tutkittava TEM (Philips EM 208S, Alankomaat). Arvioidaan osa solujen aktiivisen solun syklin läsnäolo palautuvia DNA kaksinkertainen säikeen katkoksia, ja apoptoottisen solukuoleman, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja cytocentrifuged lasilevyllä saamiseksi tiheyteen 10

5 solua täplää kohti. Cell täplät värjättiin anti-Ki67 (Ki67, hiiri monoklonaalinen, DAKO, Italia) ja anti-gamma histoni H2AX (γH2AX, kanin polyklonaalinen, Bethyl Laboratories, TX, USA) vasta-aineet ja paljastaa DAB (3,3′-diaminobentsidiiniä) (HRP) substraattipakkausta reaktio (DAKO, Italia). Määrällistä arviointia osa Ki67 ja γH2AX positiivisten solujen toteutettiin laskemalla useita myönteisiä ytimien yli yhteensä 900-2000 ytimien laskettavissa kussakin analysoitu näyte. Apoptoottisen solukuoleman klo yksisoluiset tason tutkittiin käyttäen in situ Cell Death Detection Kit, fluoreskeiini määritys (Enzyme Solution TdT, Label Solution fluoreseiini-dUTP, Roche). Green ydinaseiden fluoresenssi positiivisuus mitattiin käyttämällä Olympus mikroskooppi BX60. Tumat tunnustettu sinisen fluoresenssin 4 ’, 6-diamidine-2-phenyndole (DAPI, Sigma, Italia). Osa kuolleet solut arvioitiin laskemalla apoptoottisten tumien yli yhteensä lähes 1000 solua. Data analysoitiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA-testi. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun p 0,05. Sen tutkimiseksi, mahdollisesti vahingossa solujen adheesiota /pallosia suodattimen jälkeen 5 päivää dynaamisen kulttuurin bioreaktorissa, suodatin kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja niitä inkuboitiin DAPI 15 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja peräkkäin tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla arvioida läsnä ydinten pinnalla. Lopuksi, jotta voidaan arvioida läsnäolo noudattanut Calu-3-soluissa ja sedimentaatio ala-alueella viljelmän kammion, kun solu pelastaa sisäseinän kulttuurin kammio rasped jonka solukaapijaa ja pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) . PBS siis kerätään petrimaljan ja noudatettava ylösalaisin mikroskoopilla havaitsemiseksi Calu-3-soluissa.

Tulokset

Flow dynamiikkaa bioreaktorissa kulttuuri kammion

Multiphysics numeeristen simulaatioiden sallittu luonnehtia virtauskentästä sisällä bioreaktori kulttuuri kammioon. Kuvio 2 esittää kaaviomaisia ​​esityksiä tyypillinen väliaineen virtaus rakenteiden perustamisesta sisällä kulttuuri kammion, jotka johtuvat keskinäistä vuorovaikutusta väliaineen (ensisijainen vaihe) ja solua /konstruktit (hajallaan vaihe), riippuen määrätty virtausnopeus. Yksityiskohtaisesti, tapauksessa virtauksen arvot alle 20 ml /min (kuvio 2A ja 2A1), väliaine streaming viljelmän kammioon venttiilin läpi ei ole riittävästi energiaa merkittävästi vuorovaikutuksessa sivuseinämän viljelmän kammion. Tasapaino hydrodynaamiset ja painovoima johtaa muodostumista dynaamisen iso kelluva pyörre sijaitsee kaukana seinästä kammion (kuvio 2A1). Tämä kelluva pyörre ympäröi pienempien pyörteinen rakenteita lähempänä seinää, joka vakuuttaa keskeyttäminen viljeltyjen solujen ja lisätä sekoittamalla ja liikenne (kuvio 2A1). Esimerkiksi kuvio 3 esittää aikakehitystä VF käytössä keskeyttää solujen sisällä kulttuuri kammion, joka saadaan simuloimalla läsnäolo 9×10

6 ympätty soluja (alustava VF = 0,48%) ja määräämällä virtausnopeus arvoon 5 ml /min (ultralow leikkausjännitys kunnossa, samoin kuin kokeellinen in vitro). Voidaan havaita, että viljellyt solut säilyvät pääosin tasaisesti ala-alueella viljelmän kammion. Yksityiskohtaisesti, kun ohimenevä noin 5 minuuttia, 95,3% ja ympättiin solut suspendoidaan keskimäärin VF-arvo on noin 0,33%, joka on lähellä alkuperäistä VF-arvo (0,48%), jolla on huippu todennäköisyystiheysfunktion (PDF) arvo on 2,5, joka vastaa VF arvojen 0 ja 0,5% (kuvio 4A). Alaosassa viljelmän kammion, pieni tilavuus on noin 194 ui on tunnusomaista VF-arvo on noin 6%, mikä dynaamisesti koskee vain 2%: n ympättiin soluja (kuvio 3). Tämä pakkaus-arvo on enemmän kuin kolme kertaa pienempi kuin kynnysarvo, sedimentaatio, joka on asetettu (20%) ja noin kymmenen kertaa pienempi kuin suurin täyterajaa 63%. Erityisesti silloin, kun virtausnopeus on alle 20 ml /min hyväksytään, jakauma leikkausjännityksen arvojen kokema solujen viljelmän kammion paljastaa, että korkeimmat leikkausjännityksen ovat pienempiä kuin 1 MPa (kuvio 4B), jonka keskiarvo ja mediaani arvot lähellä 1×10

-2 mPa (ns ultralow leikkausjännitys kunnossa).

Flow kentän visualisointi keskinäistä vuorovaikutusta väliaineen (ensisijainen vaihe) ja solua /konstruktit (hajallaan vaihe) sisällä kulttuurin kammiossa ultralow (A ja A1) ja matala tai keskivaikea (B ja B1) leikkausjännitys olosuhteissa. Flow kenttä on kuvattu käyttäen sekä lineaarisia kiinteä konvoluutio linjat (A ja B), ja klassisen Streamline edustus (A1 ja B1). Keltainen nuolet osoittavat virtauksen sisäänmenon ja ulostulon. Siniset nuolet osoittavat ensisijaisen kelluvan pyörteet. Punaiset nuolet osoittavat toissijaisen pyörteiden.

ääriviivapiirrokset ajallisen kehittymisen VF käytössä keskeyttää solujen sisällä bioreaktori kulttuurin kammion 0-60 min simuloitu aikaa, ja määrätty virtausnopeus 5 ml /min (ultralow leikkausjännitys kunnossa, samoin kuin kokeellinen in vitro) ja 9×10

6 ympätty soluja (alustava VF = 0,48%). Sen jälkeen ohimenevää noin 5 minuuttia, 95,3%: n ympätty solut suspendoidaan keskimäärin VF-arvo on noin 0,33%, hyvin lähellä alkuperäistä VF arvo. Alareunassa kulttuurin kammion, pieni tilavuus noin 194 ui on ominaista VF-arvo noin 6%, yli kolme kertaa pienempi kuin asetettu kynnysarvo sedimentaatio (20%), joka dynaamisesti koskee ainoastaan ​​2%: siirrostettua solut.

todennäköisyystiheysfunktiot (PDF) solun VF (A) ja leikkausjännitys (B) värin kokema solun vaiheen reaktorin sisällä kulttuuri kammion 60 minuutin jälkeen, jossa määrätty virtaus nopeudella 5 ml /min ja 9×10

6 ympätty soluja.

kasvattaminen virtausnopeus yli 20 ml /min edistävää esiintyminen Coandavaikutuksen [39] reaktorin sisällä kulttuurin kammio: suihkun tuleva kulttuuri kammioon viehättää lähellä seinää ja, johtuen erikoinen seinään kaarevuus, erottaminen alue tapahtuu kaukana pohjasta kammion seinämään (kuvio 2B ja 2B1). Tämän seurauksena suuri myötäpäivään kelluva pyörteen, joka tasapainottaa painovoiman ja siten ylläpitää solua /konstruktit suspensiossa, muodostetaan (kuvio 2B1). Lähellä ulkoseinän, vielä pienempi pyörre kehittyy, joka voi pelata hyödyllinen tehtävä parantaa sekoituksen ja keskeyttäminen kelluvan konstruktioita (kuvio 2B1). Käyttöön tällaisen virtausnopeus alue (30-120 ml /min), vinossa oikealle leikkausjännitys jakaumat saatiin, jossa keskiarvojen välillä 2 noin 7 MPa huippu leikkausjännitys arvojen kulttuurin kammion alle 50 mPa (matala- keskivaikea leikkausjännitys kunnossa, katso yksityiskohdat S3 teksti).

Mitä kuljetus liuenneen hapen viljelmän kammion määräämällä täysin hapettomia alkuehto keskipitkällä, numeerinen simulointi osoittaa selvästi, että sisällä 840 s ( 14 minuuttia) osapaine liuenneen hapen täydennetään enemmän kuin 90% viljelmästä kammion tilavuus (S2 elokuva, S2 teksti). Saadut tulokset voidaan yleistää kuljetukseen muiden lajien liuenneen viljelyalustassa, koska niiden kuljetus on ominaista Péclet numerot kahdesta kolmeen kertaluokkaa suurempi kuin ykkönen, jossa vahvistetaan, että neste rakenteiden vahvistamisesta kammiossa liikennealan liuenneen hapen ja ravinteet sekoittumisesta, mikä homogenizing niiden pitoisuus.

In vitro

kulttuurin tulos

5 päivän suspensioviljelmäolosuhteissa solut pelastettiin alhaisen kiinnityksen kulttuuri pulloon (staattinen jousitus ) ja bioreaktorista kulttuuri kammio (dynaaminen jousitus). Ensinnäkin, ne morfologisesti analysoitiin: havaittu faasikontrastimikroskopiassa, Calu-3 viljeltiin staattisen suspension osoittavat yksittäisiä soluja tai hyvin pieni klustereita (kuvio 5A), kun taas solut viljeltiin bioreaktorissa dynaamisten suspension osoittavat selvästi muodostumista pallosia (kuvio 5B ). Erityisesti suhde Calu-3-soluja, jotka muodostavat pallojen ja yhden Calu-3-soluissa on 59,7 ja Calu-3-solut kerättiin alhaisen kiinnityksen viljelypulloon ja 76,0 ja Calu-3-soluja viljeltiin bioreaktorissa.

5 päivän suspensioviljelmäolosuhteissa, (A) Calu-3 soluja viljeltiin staattisessa jousitus osoittavat yksittäisiä soluja tai hyvin pieniä klustereita, (B) Calu-3-soluissa viljelty dynaaminen jousitus osoittavat muodostumista pallosia. Mittaviivat 200 pm.

Lisäksi Mikroskooppitutkimus analyysi TEM avulla todeta, että Calu-3 staattinen jousitus ovat osittain yhdistetty heikko ja pieni noudattamista risteyksissä (kuvio 6A ja 6A1), jossa morfologisten muutosten ( S1 Kuva). Kääntäen, pallojen korjattu bioreaktorista kulttuuri kammio ovat 2,4-kertainen (p 0,001) suurempi (keskimääräinen pinta-ala = 23699 ± 5645 pm

2) kuin klusterit pelastettu alhaisen kiinnityksen kulttuuri pulloon (keskimääräinen alue = 9787 ± 2202 um

2), ja ne koostuvat soluista ominaista tyypilliset morfologiset ominaisuudet Calu-3, kuten näkyvä nucleoli ja kalvot mikrovillukset (kuvio 6B), jossa on hyvin kehittynyt noudattamista risteyksissä (kuvio 6b1).

TEM kuvat osoittavat (A) pieni klusterin (3 solua) Calu-3 soluja kasvatettiin staattisessa jousitus, ja (B) suurempi pallomainen (9 solua) Calu-3-solut viljeltiin bioreaktorissa, korjattu molemmat jälkeen 5 päivän jäädytyksen kulttuurin. Keskeiset nucleoli (N: ytimet), sytoplasman rakenteita ja pitkittäin ja poikittain suuntautunut mikrovillukset ovat tunnusomaisia ​​piirteitä NSCLC solulinjan Calu-3. Korkea suurennos näkemykset sisältyvät alueet musta suorakaiteen paneeleissa A ja B esitetty vastaavasti (A1) yksittäinen pieni sitoutumista risteykseen (nuolenkärki) joukossa soluja viljellään staattinen jousitus, ja (B1) useita hyvin kehittyneitä noudattamista risteyksissä (nuolenpäät) kehittämä by Calu-3 viljelty reaktorin sisällä. Mittaviivat: A ja B = 5 um; A1 ja B1 = 1 pm.

Nämä havainnot tukevat arvioinnissa Ki67 Immunovärjäyksen, mikä osoittaa, että osa pyöräily Calu-3-soluissa on merkittävästi suurempi (1,58-kertainen), kun viljellään dynaaminen sijaan staattisessa jousitus olosuhteissa (kuvio 7A). Lisäksi alkaen määrällisesti DNA kaksinkertainen katkeamisen, on mahdollista huomata laskusuunnassa (1,5-kertainen vähentäminen, vaikka ei ollut tilastollisesti merkittävä) on osa γH2AX

pos Calu-3-solut viljeltiin bioreaktorissa verrattuna soluihin viljelty staattisen suspension (kuvio 7B). Tämä on vahvistettu apoptoottisen solukuoleman määritys, todellakin osa apoptoottisten Calu-3-solut kerättiin staattisen suspension ohjaus (46,5 ± 4,5%) oli 16,9 kertaa suurempi kuin solut kerättiin bioreaktoriin (2,7 ± 0,2%), ( p 0,05).

(A) Pylväsgrafiikka mittauksen Ki67 positiivisten solujen, jotka osoittavat osa pyöräily Calu-3-solujen jälkeen staattisen ja dynaamisen jousitus kulttuuri (*: p 0,05 vs staattisia jousitus).