Krooninen sairaus

tiivistelmä

Äskettäin kuvatut transcriptomic kytkin mitoosia ohjelman kastraatio kestävä eturauhassyövän ( CRPC) viittaa siihen, että mitoottisia proteiineja voidaan järkevästi suunnattu tässä tappavan sairauden vaiheesta. Tässä tutkimuksessa osoitimme säätelyä mitoosi-vaihe proteiinin tasolla meidän kohortissa 51 kliinisen CRPC tapauksissa ja todettu centrosomal poikkeamia myös esiintyä tapahtuu ensisijaisesti CRPC verrattuna niihin, korkea Gleason-asteen hormoniherkän eturauhassyöpä (

P

0,0001). Expression profilointi kemoterapiaa vastustuskykyisten CRPC näytteitä (n = 25) suoritettiin, ja tuloksia verrattiin tietoihin ensisijainen kemoterapia-naiivi CRPC (n = 10) ja hormoni-herkkä eturauhassyöpä tapauksissa (n = 108). Tuloksemme osoittivat rikastuminen mitoosia vaiheen geenejä ja polkuja, joissa eteneminen sekä kastraatio kestäviä ja kemoterapia-resistenttejä. Mitoosi sentromeeriantigeenin liittyvä kinesiiniin (MCAK) tunnistettiin uutena mitoosia vaiheen tavoite eturauhasen syöpä, joka oli yli-ilmentynyt useissa CRPC geenien ilmentymisen aineistoja. Löysimme yhtäpitävät geenin ilmentymistä MCAK välillä emo- ja hiiren CRPC ksenografti paria ja nousi MCAK proteiinin ilmentymistä kliinisiä etenemisen eturauhassyöpä kastraatiotasolle-resistenttejä vaiheessa. Knockdovvn MCAK pidätettiin kasvun eturauhasen syöpäsolujen viittaa sen hyödyllisyys mahdollisena terapeuttisena kohteena.

Citation: Sircar K, Huang H, Hu L, Liu Y, Dhillon J, Cogdell D, et al. (2012) Mitosis Phase Väkevöiminen kanssa tunnistetiedot Mitoottista Sentromeeri-Associated kinesiiniin terapeuttisena kohteena in kastraatio hylkivät Eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (2): e31259. doi: 10,1371 /journal.pone.0031259

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10. heinäkuuta 2011; Hyväksytty: 04 tammikuu 2012; Julkaistu: 17 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Sircar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä paperi tukevat yhteisörahastoihin MD Anderson Cancer Center (KS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syöpäkuolleisuuden Yhdysvalloissa [1], jossa suurin osa kuolemista tapahtuu epäonnistumisen jälkeen androgeenipuutteen terapia kun kasvain kasvaa kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC), tappaminen potilas kuluessa mediaani 18 kuukauden ajan. Doketakseli kemoterapian on perustettu hoidon taso vuonna CRPC, jossa pieni, mutta selvä eloonjäämishyötyä [2], [3]. Tunnistaminen tavoitteet terminaaliin kastraatio kestävä ja kemoterapiaa kestäviä vaiheessa taudin näin edustaa tyydyttämätön tarve eturauhassyövässä [4], [5].

Tärkeä viimeaikainen edistysaskel tällä alalla oli osoitus siitä, että androgeenireseptorin reseptori aktivoi erilliset mitoosia vaihe transkription ohjelma CRPC muttei hormoniherkän eturauhassyöpä (HSPC) [6], osittain selittää suhteellisen menestyksen dosetakselin, antimitoottisena kemoterapeuttista ainetta käytetään hoitamaan CRPC. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että muut mitoosia vaiheen proteiinit voivat olla potentiaalisia kohteita hoitojen hoitoon tämän taudin vaiheesta.

pyrki ensin validoitava säätelyä mitoosi-vaihe transkription ohjelman proteiini tasolla CRPC kliinisten CRPC ja korkea-asteen HSPC tapauksissa. Seuraavaksi me verrattiin transcriptomic profiilit paikallisten CRPC näytteistä, jotka olivat kemoterapiaa kestäviä kanssa CRPC kemoterapia-naiivi kasvaimia ja hormoni-herkkä eturauhasen syöpiä. Pathway tiedon analysointi meidän talon yksilöitä ja julkiset tietokannat tunnistettu rikastuminen mitoosin liittyvien geenien tauti eteni sekä kastraatio kestävä ja kemoterapiaa kestäviä vaiheessa. Mitoosi sentromeeriantigeenin liittyvä kinesiiniin (MCAK), jonka geeniekspressio yläreguloituja useita CRPC kemoterapiaa kestäviä aineistoja, valittiin kliinisen ja toiminnallinen validointi. MCAK proteiinin ilmentyminen liittyi kliiniseen etenemiseen eturauhassyöpä, ja sen knockdown pidätti kasvua eturauhasen syöpäsoluja.

Tulokset

CRPC kasvaimet näytä täydennettiin mitoosia vaihe proteiinin ilmentymisen ja centrosomal poikkeamia verrattuna korkealaatuisesta HSPC

vahvistaa oletetun transcriptomic kytkin mitoosia vaiheen ohjelma CRPC proteiinitasolla käytimme ydin- phosphohistone H3 immuunivärjäysmenetelmällä joka mitoosia vaihe merkki, koska histonien fosforyloidaan lopussa prophase ja niiden fosforylaatiota piikit metafaasissa [7]. Me määrällisesti tutkittavan kudoksen-mikrosiru osat HSPC ja CRPC kanssa Ariol kuvan analysointijärjestelmä. Meidän kudosmatriisien mukana 557 ydintä ja 250000 ytimiä 75 kliinisistä tapauksista. Tuloksemme osoittivat merkittävää voimistumista phosphohistone H3 kastraatio kestävä eturauhassyövän verrattuna HSPC (kuviot 1G-1I ja taulukko S2). Nämä tulokset antavat näyttöä siitä, että mitoosia vaiheen proteiinit yläreguloituja CRPC. Tärkeää on, korkea-asteen hormoniherkän kasvaimista Gleason laatujen 4/5 osoitti myös huomattavasti pienempi phosphohistone H3 ilmaisu kuin kastraatio vastustuskykyisten kasvainten adenokarsinooma tai pienisoluinen karsinooma histologialtaan (P 0,0001) (kuviot 1G-1J ja taulukko S2) . Koska hyvin erilaisia ​​transkription profiileja ja huomattavasti aggressiivisempia kliininen käyttäytyminen korkean Gleason-asteen (Gleason laadut 4/5) eturauhassyöpä verrattuna matala Gleason-luokan (Gleason aste 3) eturauhassyöpä, tietomme korostaa erottamiskykyä CRPC kaikista histologisen alatyyppejä HSPC.

hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,0001) ja korkea-asteen HSPC (P = 0,008) (kuviot 1D-1F ja 1K ja taulukko S3). Tämä havainto on sopusoinnussa tunnetun roolin sentrosomimäärän vahvistusta ja geneettinen epävakaus etenemisessä muiden syöpien [8], [9], [10], [11].

lisääntymisen merkkejä mitoosilaitteen CRPC kasvaimista eteneminen kastraatio kestävyys ja kemoterapian resistenssin

macrodissected kasvainsolut, jotka olivat kastraatio kestävä ja kemoterapiaa kestäviä lokalisoidusta kuin metastasoituneen jäädytetty kirurginen näytettä 20 ainutlaatuinen potilaista ja viisi ksenograftit niistä johdetut (taulukko S1). Transcriptomic profilointi kokonais-RNA: ta suoritettiin näiden tuumorinäytteistä ja viisi hyvänlaatuinen eturauhasen näytteitä, joita käytettiin normalisoimaan meidän ilmentymisen tietoja. Meidän array raakadataa toimitetaan GEO (GSE 33277). Kuten tiedot olivat peräisin sekä päätelaitteet kastraation kestävä ja dosetakseli kemoterapiaa kestäviä kasvaimia, vertasimme mRNA: n ilmentymisen profiili näistä näytteistä kuin näytteet aiemmissa vaiheissa eturauhassyövän etenemisen. Erityisesti vertasimme tietojamme julkisiin geenien ilmentyminen saatujen tietojen käsittelemättömästä HSPC (GSE 21032, n = 108) ja kemoterapia-naiivi CRPC (GSE 6811, n = 10). Tällaiset meta-analyysit ovat haastavia annetaan lukuisia muuttujia, jotka voivat vaikuttaa intensiteetti hybridisaatiosignaaliin. Luotettavampi vertailu, me nimenomaan valitsi aineistoja paikallista, ei-metastasoitunut HSPC ja kemoterapia-naiivi CRPC näytteet, jotka oli normalisoitu data yhteenkerätystä hyvänlaatuinen eturauhasen näytteitä tai joissa geenien ilmentyminen tietoja hyvänlaatuinen eturauhasen näytteiden sallinut normalisointi toimitettiin . Kuten odotettua, löysimme yliekspressio mitoosia vaiheen geenejä ja väyliä suhteessa hoitamattomiin HSPC näytteitä Memorial Sloan Kettering Cancer Center aineisto (GSE 21032). Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä aikaisempien raporttien [6], mutta käytettävä erillisiä aineistoja ja menetelmiä.

The University of Tokyo aineisto (GSE 6811) on yksi harvoista, joka sisältää CRPC kemoterapia-naiivi näytteitä. Merkitys microarray (SAM) analyysi verrataan CRPC kemoterapia-naiivit ryhmä meidän CRPC kemoterapiaa kestäviä ryhmä tunnisti kaksi informatiivinen geenin sarjaa, joka koostui 2490 voimistunut ja 2121 vaimentua geenien kemoterapiaa kestävä ryhmä. Pathway analyysi näiden kahden geenin sarjaa suoritetaan käyttämällä Ingenuity Pathway Analyysi osoitti, että useat solusyklin säätelyreaktioissa merkittävästi rikastettu ilmen- tymisen lisääntymisen geeniperimä (kuvio 2A). Erityisesti kemoterapia kestävä ryhmä osoitti merkittävää yliekspressio mitoosia mukana polku (kuvio 2B), verrattuna kemoterapia-naiivi ryhmä (kuva S1). Lisäksi päällekkäisiä analyysi näiden kahden geenin sarjaa, joka arvioidaan hypergeometrisen jakelujärjestelmämalliin (kuvio 2C) käyttäen mitoosia vaihe (M-vaihe) geenit on saatu MSigDB tietokannasta (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb /index.jsp), osoitti merkittävää päällekkäisyyttä vain ne geenit, jotka upregulated kemoterapiassa kestävä ryhmä (n = 27;

P

= 5,0 × 10

-7). Geenit vaimentua kemoterapiassa kestävä ryhmä ei merkittävästi päällekkäinen M-vaiheen geenejä (n = 9;

P

= 0,416). Tämä havainto tukivat geeni set-rikastus analyysi (GSEA; https://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp, Version 3.7), jotka osoittivat, että M-vaiheen geeniperimä merkittävästi rikastettu kemoterapiaa kestäviä ryhmä väärä löytö määrä (FDR) 10% (kuvio 2D). Nämä analyysit osoittavat, että mitoosia liittyvien geenien ja reitit voidaan välittämisessä osallisena kemoterapian resistenssin.

(A) Cell syklin säätelyreaktioissa merkittävästi voimistunut on CRPC kemoterapia-resistenttejä (TX) ryhmä verrattuna CRPC kemoterapiaa -naïve ryhmä. (B) Ingenuity Pathway Analysis. (IPA) on ilmen- tymisen lisääntymisen geeniperimä osoittaa, että kanoninen reitin mitoosi roolit polo kaltainen kinaasi on huomattavasti liittyy CRPC kemoterapiaa kestävä ryhmä (

P

= 0,004).

P

arvo lasketaan Fisherin testiä. Geenejä, jotka voimistussäädellään CRPC kemoterapiaa kestäviä ryhmä ja ovat mukana tämän reitin on värikoodattu punaisena. Toinen geenit, jotka sisältyvät tämän reitin, mutta eivät ole ilmen- tymisen lisääntymisen geeniperimä on merkitty valkoisella. (Katso teksti tunnistamiseen upreguated geenin asetettu yksityiskohtia). (C) Merkittävät päällekkäisyys ilmen- tymisen lisääntymisen geenin asetettu CRPC kemoterapiaa kestäviä kasvaimia M-vaiheen (n = 27,

P

= 5.00E-7) verrattuna vaimentua geeniperimä (n = 9,

P

= 0,416). (D) GSEA osoitti, että M-vaihe oli merkittävästi rikastettu CRPC kemoterapiaa kestävä ryhmä FDR 10%.

Mitoottista Sentromeeri liittyvä kinesiiniin liittyy etenemiseen hoidon vastarintaa, kun taas sen hiljentäminen estää eturauhasen syöpäsolun kasvua

tutkiminen nimenomaan muuttunut mitoosi sääntelyviranomaisten meidän transcriptomic data päädytty koodaavat geenit mitoosi kinesiinin perheen moottorin proteiinien olevan yläreguloituja CRPC kemoterapiaa kestäviä näytteitä. Nämä mitoottisten kinesiinien myös yläreguloituja kaksi muuta suurta CRPC kemoterapiaa kestäviä aineistoja päässä University of Michigan (GDS 1439) ja Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032). Valitsimme mitoosi centromere liittyvän kinesiinin (MCAK) ovat kohteena eturauhasen syöpä, koska se oli uudenlainen ja oli selvästi yli-ilmentyminen MCAK geenin (

P

= 1,55 x 10

-15) paikallisessa CRPC päässä MD Anderson Cancer Center aineisto verrattuna hormoniherkkien eturauhassyövän tapauksista (n = 108) päässä Memorial Sloan Kettering Cancer Center aineisto (GSE 21032). MCAK myös voimistunut kanssa eteneminen metastaattista CRPC sisällä Memorial Sloan-Kettering Cancer Center kohortti (

P

= 3,73 x 10

-10) (kuva S2). Lisäksi löysimme yhtäpitävät ilmentymistä MCAK niin meidän ihmisten vanhemman CRPC kasvaimia ja hiiren ksenografteissa johdettu niiden kasvainten (

r

= 0,428) kuten kuvassa S3. Olemme myöhemmin mitattiin MCAK proteiinin ilmentymistä immunohistokemiallisella analyysi kudossiruina riippumattomien hormoniherkän (n = 38) ja kastrointi kestävä (n = 51) tapauksissa. Löysimme MCAK sytoplasminen värjäys voidaan merkitsevästi liittyviä kliinisiä etenemiseen kastraatio-resistenttejä (P 0,0001) (kuviot 3A-D ja taulukko S4).

MCAK-immuno- osat kastraation kestävä adenokarsinooma (A) kastraatio kestävä pienisoluinen karsinooma (B), ja hormoni-herkkä eturauhasen karsinooma (C). D) Runsaasti lisää merkintöjä varten mitoosi centromere liittyvä proteiini MCAK kanssa eteneminen CRPC, merkitty tähdellä.

määrittämiseksi vaikutusten kaatamalla MCAK vuonna HSPC ja CRPC, käytimme kaksi erillistä sarjaa sirna (siRNA) spesifinen MCAK hiljentämään sen ilmentymistä hormoniherkän LNCaP ja kastraatio kestävä kemoterapia-naiivi C4-2B eturauhassyövän solulinjoissa. Sekä CRPC ja HSPC solulinjat osoittivat runsaasti luontaisia ​​MCAK proteiinin ilmentymisen ja molemmat osoittivat kasvun inhibitio 3 päivän kuluttua MCAK pudotus ensimmäisen siRNA (si-MCAK # 1), jota arvioidaan MTT-määritys (kuvio 4A-D) (C4-2B : 3 d, P = 5,45 x 10

-7, 4 d, P = 4,85 x 10

-10, 5 d, P = 3,78 x 10

-8, LNCaP: 3 d, P = 1,43 × 10

-3, 4 d, P = 3,86 x 10

-5, 5 d, P = 1,48 x 10

-5). Samanlaisia ​​tuloksia toinen joukko siRNA (si-MCAK # 2) esitetään kuviossa S4.

A) Western blot, jossa vahvistetaan knockdovvn MCAK by si-MCAK # 1. Koko-solu-lysaatit LNCaP-soluja, jotka on transfektoitu si-ohjaus (C) tai si-MCAK # 1 (M) kerättiin eri aikapisteissä transfektion jälkeen, kuten on osoitettu. Tubuliinia käytettiin lastaus ohjaus. B) MTT solukasvumäärityksessä. LNCaP-soluja käsiteltiin sama kuin A), ja sen jälkeen 24-h transfektion, 4000 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppalevyllä (n = 10 kussakin ryhmässä) ja MTT-määritys suoritettiin 24 h välein. C) Western blot, jossa vahvistetaan knockdovvn MCAK kanssa si-MCAK # 1. Koko-solu-lysaatit C4-2B transfektoitujen solujen si-ohjaus (C) tai si-MCAK # 1 (M) kerättiin eri aikapisteissä transfektion jälkeen, kuten on osoitettu. Tubuliinia käytettiin lastaus ohjaus. D) MTT solukasvumäärityksessä. C4-2B-solut transfektoitiin si-ohjaus ja si-MCAK # 1, vastaavasti. Sen jälkeen, kun 24-tunnin transfektion, 4000 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä ja inkuboitiin eri ajanjaksoja, kuten, minkä jälkeen MTT-määritystä (n = 10 kussakin ryhmässä).

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme laajentaneet havainnot Wang et ai [6] tarkistamalla, on proteiini tasolla transcriptomic kytkin mitoosia ohjelman riippumaton sarja CRPC kliinisistä näytteistä ja osoittaa, että erot kastraatio kestävä ja käsittelemättömän hormoniherkkien eturauhasen syöpiä säilyvät jopa verrattaessa korkea Gleason asteen eturauhasen syöpiä. Tämä on tärkeä havainto ottaen huomioon erilaiset transcriptomic ohjelmat nähdään eturauhassyövissä matala ja korkea Gleason laadut [12], jotka heijastavat niiden dramaattisesti erilaisia ​​kliinisiä käyttäytymistä. Olemme myös osoittaneet centrosomal poikkeamia esiintyy tapahtuu ensisijaisesti CRPC, sopusoinnussa epänormaali solunjakautumisen nähty muissa pitkälle edenneitä syöpiä. Nämä tulokset tukevat käsitystä, että CRPC on biologisesti erillisiä eikä jatkeita korkealaatuisesta hormoni herkkä eturauhassyöpä, vaikka niiden histologisia yhtäläisyydet ja taipumus kliiniseen aggressiivisuus.

Vertaamalla transcriptomic profiilit CRPC kirurgisten näytteiden, jotka olivat kemoterapia-naiivit kanssa CRPC kemoterapiaa kestäviä data, löysimme rikastaminen mitoosi-vaiheen proteiinit ja reittejä kemoterapiaa kestäviä kasvaimia. Niistä mitoosin liittyviä geenejä, valitsimme mitoosi kinesiinin perheen moottorin proteiinien lisätutkimuksia-erityisesti MCAK, jota ei ole aiemmin tutkittu eturauhassyövän. Mitoottisten kinesiinien tiedetään ratkaiseva rooli säätelyssä sukkularihmaston laitteen solunjakautumisen aikana. Ne ovat mukana solujen lisääntymistä ja säätelevät aurora-B-kinaasin [13]. Progression keuhkojen, aivojen, paksusuolen ja peräsuolen syöpä [14] [15] on liittynyt lisätyn kinesiiniin ilme, kun sen estäminen on johtanut solusyklin pysähtymisen mitoosin vaiheessa [16], [17]. Mitoosi sentromeeriantigeenin liittyvä kinesiiniin on runsaasti sentrosomien, depolymeroi mikrotubulukset, ja välittää siirtyminen prometaphase metafaasin [18], joukossa muita keskeisiä liittyvien toimintojen asianmukaisen kromosomi eriytymistä [19] solunjakautumisen aikana. Yliekspressio mitoosi kinesiinien, joiden oletettu toimivan vastustamalla mikrotubuleihin vakauttava vaikutus taksaanin kemoterapian, on yhdistetty doketakselin vastarinnan rintasyövän [20], ja MCAK yli-ilmentyminen on syy-paklitakselille resistenssin [21].

kohdistaminen mitoottisten kinesiinien on siis nousemassa houkutteleva hoitomuoto on syöpiä, jotka reagoivat huonosti taksaania perustuvia chemotherapies että vaikuttamaan sukkularihmaston, koska esto kinesiinin moottori proteiineja ei suoraan kohdistaa mikrotubulusten. Lisäksi mitoottisten kinesiinien eivät ilmaisseet neuronien [22] ja ovat heikkoja substraatteja P-glykoproteiinin effluksipumpun [23], jotka johtavat doketakselin n annosta rajoittavaa neurotoksisuutta ja monilääkeresistenssi. Siksi mitoosi kinesiinin esto on arveltu aiheuttavan mitoosia erityinen solusyklin pidätyksen, joka voi täydentää nykyistä kemoterapeuttisia protokollia vähemmän sivuvaikutuksia [18].

Eri mitoottisten kinesiinien palvelevat tiettyjä toimintoja, ja rooli näiden proteiinien eturauhasen syöpä on vain tutkittu suhteessa eniten vakiintunut tämän perheen jäsen, kinesiiniin kara proteiini (KIF11 /Eg5), joiden hiljentäminen on osoitettu estävän kasvua LNCaP ja PC3 solulinjoissa

in vitro

ja

in vivo

[24], [25]. Varhaisessa kliinisissä tutkimuksissa CRPC käyttävillä potilailla ensimmäisen sukupolven Eg5 estäjä, ispinesib, ovat onnistuneet vain rajoitetusti [26] [27]. Kuitenkin uudempi sukupolven Eg5 estäjien on raportoitu olevan suurempi teho

in vitro

[28], ja kolmas kliininen tutkimus rekrytoi parhaillaan potilaita useista maligniteetteja, mukaan lukien kastraatio kestävät eturauhassyöpä (# NCT01065025) .

Yhteenvetona olemme osoittaneet rikastuminen mitoosia vaiheen reittejä ja proteiineja eturauhasen syöpä etenee sekä kastraatio kestävä ja kemoterapiaa kestäviä tilassa. Olemme tutkineet rooli MCAK ensimmäistä kertaa eturauhasen syöpä, ja osoittivat, että MCAK ilmentyminen korreloi kliiniseen etenemiseen tätä tautia. Lisäksi olemme osoittaneet kasvun estäminen in MCAK-vaiennetaan kastraation kestävä eturauhasen solulinjoissa. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että MCAK on toiminnallisesti tärkeä proteiinin terminaalin eturauhassyöpää. Seurantatutkimukset perustuu tämän selostuksessa tulee käyttää synteettisiä estäjiä vastaan ​​suunnattuja MCAK (esim patentti # 7294640, Merck) kokeellisissa malleissa ja tulevissa kliinisissä kokeissa eturauhasen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Hormoni-herkkä ja kastraatio kestävä eturauhassyövän kudosnäytteet saatiin hyväksyntää institutionaalisesta tarkastuslautakunta of The University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas) ja McGill University (Montreal, QC, Kanada). Kudosnäytteet käytetään kehittämään MDA PCa 79, MDA PCa 117-9, MDA PCa 124, MDA PCa 130, MDA PCa 149-1, ja MDA PCa 180-30 -ksenografteja peräisin kasvain näytteistä kirurgisista näytteistä (cystoprostatectomy, eturauhasen tai lantion exenteration) progressiivisen ensisijaisen kastraatio kestävä eturauhassyöpä. Kirjallinen suostumus oli saatu potilailta ennen näytteen ottamisen, ja näytteet käsiteltiin protokollan mukaisesti hyväksymän MD Anderson Institutional Review Board, mukaan lukien hyväksynnän eläinten hoidon ja käytön komitea. Laboratorio protokolla numerot kattoi käyttää näitä näytteet ovat MDACC LAB 03-0336 ja LAB 09-0213.

Patient kudosnäytteitä

molecularly profiloitu kudokset olivat peräisin MD Anderson jäädytetty kasvain näytteet potilailla, joilla on kastraatio-ja kemoterapia-resistenttejä eturauhassyöpä (n = 20) ja eturauhasen hyvänlaatuisen kudoksen valvonta (n = 5). Kastraation kestävä kemoterapiaa kestäviä näytteet otettiin pelastaa cystoprostatectomies tai lantion exenterations. Hiiren ksenografteissa peräisin viidestä näistä 20 kasvainten osoittaa histologialtaan adenokarsinoomaa arvioitiin myös. Kliiniset tiedot on genomisesti profiloitu näytteet mainitaan taulukossa S1. Neljä kudossiruina käytettiin vahvistamaan genomista tietoa ja koostui formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut näytteet 58 potilaalla on HSPC ja 51 potilaalla CRPC.

Expression profilointia ja analysointia

kasvain-mRNA arvioitiin käyttäen ihmisen koko genomin oligonukleotidi mikrosirujen kit Agilent (tuot # G4112F) mukaan valmistajan protokollaa ja kuten aiemmin on kuvattu [29]. Meidän CRPC data normalisoitiin keskimääräiseen geenien ilmentyminen arvot viidestä hyvänlaatuinen eturauhasen näytettä löytää ilmen- tymisen lisääntymisen tai vaimentua geenejä käyttämällä log-suhdearvo 0,3, kun cut-off informatiivinen geenien läsnä yli kaksi kolmasosaa tapauksista. Vertasimme ilmaisun profilointi tiedot University of Michigan (GDS 1439), University of Tokyo (GSE 6811), ja Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032) aineistot. Näiden aineistoja, normalisointi suoritettiin vastaan ​​sisäisen valvonnan (hyvänlaatuinen näytettä).

immunohistokemiallinen analyysi

Standard 3,3′-diaminobentsidiiniä (DAB) immunohistokemiallinen analyysit kudossiruina tehtiin Dako Autostaineriin Plus (Dako) käyttäen hiiren anti-humaani monoklonaalinen MCAK vasta-ainetta (Abgent AT2621a) 1:50 laimennusta, fosfo-histoneH3-vasta-ainetta (Santa Cruz SC-8656) on 1:100 laimennus ja gamma-tubuliinin-vasta-ainetta (Abcam AB27074) on 1:400 laimennus, kuten aiemmin on kuvattu [30]. Värjäys gamma-tubuliinia ja MCAK arvioitiin manuaalisesti määrittämällä prosentilla positiivinen arvo kulloinkin perustuen yhteenlaskettu immunohistokemiallinen merkitseminen kaikkien kudoksen ytimet kuuluvat tapauksessa.

Automatisoitu kuvien analysointi

phosphohistone H3-positiiviset tumat kvantitatiivisesti käyttämällä automatisoitua kuva-analyysi Ariol ohjelmiston Applied Imaging (Genetix Ltd.). Mittati-, automatisoitu ydin- kvantitointi algoritmin avulla Ariol ohjelmisto oli pohjalta laaditaan väri muunnelmia ruskea tahra DAB-positiivisia soluja vastaan ​​negatiivisen ydinvoiman hematoksyliinillä tausta saavuttaa prosentin positiivinen kohti ennalta valitun alueen edustus kunkin dian .

Soluviljely

C4-2B solut talletettiin MD Anderson kehitettiin jälkeen sarjareittien LNCaP-solujen kastroitu hosts, kun solut eivät enää reagoi androgeenireseptorin manipulointia eläimillä (PMID: 8168083 ). LNCaP-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Molemmat solulinjat viljeltiin RPMI1640 väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa atmosfäärissä, 5% CO

2.

Vieraslajisiirteen tutkimukset

kudosnäytteet käytetään kehittää MDA PCa 79, MDA PCa 117-9, MDA PCa 124, MDA PCa 130, ja MDA PCa 149-1 -ksenografteja jäljellä kudoksia kirurginen resektio (cystoprostatectomy tai lantion exenteration) edetä ensisijainen CRPC. Pieni kasvain paloja istutettiin ihonalaiseen taskuun 6- 8 viikon ikäinen uros CB17-SCID-hiirillä (Charles River Laboratories). Kasvaimet kehitetty 6 kuukauden kuluessa ja pidettiin hiiret, koska solut ei voitu kasvattaa

in vitro

. Kulkua ja kasvaimen käsittelyn menetelmät olivat samat kuin ne, jotka on raportoitu aiemmin (PMID: 18618013).

siRNA transfektion

LNCaP tai C4-2B-solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle tiheys 5 x 10

4 solua /kuoppa ja niitä viljeltiin RPMI1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää tavanomaisissa kudosviljelyolosuhteissa. Jälkeen 20-24 tunnin inkuboinnin siRNA transfektio suoritettiin käyttäen LipofectamineRNAiMax Reagent Invitrogen (Invitrogen, cat # 56532) noudattamalla valmistajan protokollaa. Kahdet si-MCAK siRNA käytettiin kokeissa. si-MCAK # 1 ostettiin Ambion (Ambion, kissa # 4390824) ja si-MCAK # 2 ostettiin Dharmacon (Chicago, IL, USA, kissa # L-004955-00). Universal Negatiivinen kontrolli # 1 siRNA Sigma (cat # SIC-001) käytettiin verrokkina. Lopullinen pitoisuus siRNA oli 50 nM.

Western blot-analyysi

MCAK monoklonaalinen vasta-aine saatiin Abgent (cat # AT2621a) ja sekä β-aktiini (cat # sc-1616) ja β-tubuliinia (cat # sc-9104) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Western-blottaus suoritettiin, kuten on kuvattu [31]. Lyhyesti, solu-uutteita, jotka sisältävät 30 ug proteiinia erotettiin 10% SDS-PAGE-elektroforeesilla, siirrettiin Hybond ECL nitroselluloosa- membraaneihin (Amersham Pharmacia Biotech) tai polyvinylideenifluoridia kalvoja (Cat # IPVH20200) Millipore (Millipore Corporation, cat. # IPVH20200) , estetty 5% rasvaton maito 1 x Tris-puskuroitua suolaliuosta plus 0,05% tween-20 (pH 8,0) ja testattiin primaarisilla vasta-aineilla, joiden pitoisuudet ovat 1:1000 varten MCAK ja 1:2500 varten β-aktiini tai β-tubuliinia. Toissijainen vasta-aineita käytettiin konsentraatioina 1:10,000. Proteiinit visualisoitiin käyttäen SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraatti (Prod # 34708) tai SuperSignal West Femto Suurin herkkyys Substraatti (Prod # 34096) Pierce (Pierce Chemical, Rockford, IL, USA).

soluproliferaatiomääritykset

Solujen proliferaatio määritettiin MTT-absorbanssin määritys. Solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA (si-kontrolli) tai MCAK siRNA (si-MCAK) trypsinoitiin maljoilta 24 tunnin transfektion jälkeen ja 4000 solua 200 ul: ssa täydellistä alustaa ympättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevyllä ( n = 10). Solujen annettiin kiinnittyä 24 h täydellisessä väliaineessa, ja MTT-analyysi suoritettiin 24 tunnin välein sen jälkeen. Sen jälkeen 2,5 tunnin inkubaatio 50 uM MTT-reagenssia normaaleissa soluviljelyolosuhteissa, kuopat tyhjennettiin tyhjiinimu, ja 200 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi mitattiin 590 nm: ssä mikrolevylukijalla (MRX; Danatech Laboratory).

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona +/- S.D. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testin ja Wilcoxonin-sum test. Erot välineet arvioitiin käyttämällä kaksisuuntaista

t

-testi, olettaen epätasainen varianssit. S P value≤0.05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Mitosis reittejä ei liittyy vaimentua geenin asetettu CRPC kemoterapia-resistenttejä. Kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) on vaimentua geeniperimä osoittaa kanoninen reitin mitoosi roolit polo kaltaisen kinaasin ei ole merkittävästi liittyy CRPC kemoterapiaa kestävä ryhmä (

P

= 0,16).

P

arvo lasketaan Fisherin testiä. Geenejä, jotka vaimentua siinä CRPC kemoterapiaa kestäviä ryhmä ja ovat mukana tämän reitin on värikoodattu vihreänä. Toinen geenit, jotka sisältyvät tämän reitin, mutta eivät sisälly vaimentua geeniperimä on merkitty valkoisella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0031259.s001

(TIF) B Kuva S2.

Lisääntynyt MCAK transkriptipitoisuuksissa kanssa eteneminen CRPC. (A) MCAK osoittaa transcriptomic säätelyyn ylöspäin lokalisoitu CRPC (

P

= 1,55 x 10

-15) ja (B) metastaattinen CRPC (

P

= 3,73 x 10

– 10) verrattuna HSPC.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031259.s002

(TIF) B Kuva S3.

Concordance of MCAK geenin ilmentymisen välillä CRPC hiiren ksenografteja (MDA-79, MDA-117, MDA-130, MDA-149) ja niiden vastaavat ihmisen emo- kasvaimia (

r

= 0,428).

doi: 10,1371 /journal.pone.0031259.s003

(TIF) B Kuva S4.

kasvun inhibointi LNCaP ja C4-2B solujen si-MCAK # 2. A) Western blot, jossa vahvistetaan knockdovvn MCAK by si-MCAK # 2. Koko-solu-lysaatit LNCaP si-ohjaus (C) tai si-MCAK # 2 (M) kerättiin eri aikapisteissä transfektion jälkeen, kuten on osoitettu. Aktiini käytettiin lastaus ohjaus. B) MTT solujen kasvua määrityksissä. LNCaP-soluja käsiteltiin sama kuin A), ja sen jälkeen 24 h transfektion, 4000 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppalevyllä (n = 6 kussakin ryhmässä) ja sen jälkeen MTT: llä. C) Western blot, jossa vahvistetaan knockdovvn MCAK kanssa si-MCAK # 2. Koko-solu-lysaatit C4-2B transfektoitujen solujen si-ohjaus (C) tai si-MCAK # 2 (M) kerättiin eri aikapisteissä transfektion jälkeen, kuten on osoitettu. Aktiini käytettiin lastaus ohjaus. * Tarkoittaa epäspesifisiä bändejä. D) MTT solujen kasvua määrityksissä. C4-2B-solut transfektoitiin si-ohjaus ja si-MCAK # 2, tässä järjestyksessä. Jälkeen 24 h transfektion, 4000 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä ja inkuboitiin eri ajanjaksoja, kuten, minkä jälkeen MTT-määritystä (n = 5 kussakin ryhmässä).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0031259.s004

(TIF) B Taulukko S1.

Lyhenteet: CXPX – cystoprostatectomy; PE – lantion exenteration; TURP – höyläysleikkaus; TAB – yhteensä androgeenien saarto (lupron + Casodex); LHRH – lupron; ORCH – kahdenvälinen orkiektomia; XRT – sädehoito. * Pienisoluinen karsinooma komponentti profiloitua sekoitetusta histologian pieni solu /adenokarsinooman kasvain.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0031259.s005

(DOC) B Taulukko S2.