Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat syövät osoittavat lisääntyneen ilmentymisen Nicotinamide fosforibosyylitransferaasi (Nampt). Kuitenkin mekanismi, jonka avulla Nampt ylössäädellään on epäselvä. Tutkimuksessamme olemme huomanneet, että Nampt-spesifisen kemiallisen inhibiittorin FK866 esti merkitsevästi solujen eloonjäämistä ja vähensi nikotiiniamidiadeniinidinukleotidin (NAD) tasot LoVo ja SW480 solulinjat. Bioinformatiikan analyysissä todettiin, että miR-26b kohteena Nampt mRNA. Olemme määritelleet Nampt uutena kohteena miR-26b ja osoitti, että miR-26b estää Nampt ilmentymisen proteiinin ja mRNA-tasoja sitoutumalla Nampt 3′-UTR. Lisäksi olemme havainneet, että miR-26b oli säädeltiin syövän kudoksissa suhteessa, että viereisissä normaaleissa kudoksissa 18 peräsuolen syöpäpotilailla. Tilastollisesti merkitsevä käänteinen korrelaatio miR-26b ja Nampt ilmentymistä havaittiin näytteissä peräsuolen syöpäpotilaiden ja 5 peräsuolen solulinjoissa (HT-29, SW480, SW1116, LoVo, ja HCT116). Lisäksi yli ilmentyminen miR-26b esti voimakkaasti LoVo solujen eloonjäämistä ja invaasio, vaikuttaa osittain kumonnut lisäämällä NAD. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus osoitti, että NAD-pelastamaan biosynteesipolun joihin Nampt voisi olla rooli peräsuolen syövän solujen eloonjäämistä. MiR-26b voi toimia tuumorisuppressorina kohdistamalla Nampt.

Citation: Zhang C, Tong J, Huang G (2013) Nicotinamide fosforibosyylitransferaasi (Nampt) on tavoite on MicroRNA-26b peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 8 (7): e69963. doi: 10,1371 /journal.pone.0069963

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 helmikuu 2013; Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 29 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat tutkimusmäärärahat National Natural Science Foundation of China (numerot 30830038, 30970842, 81071180, 81000929); ”973” Project (2012CB932604); New Drug Discovery Project (2012ZX09506-001-005); Key Project Science and Technology komissio Shanghai kunta (numero 10JC1410000); ja Shanghai Leading Academic Kuri Project (numero S30203). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

proteiini nikotiiniamidi fosforibosyylitransferaasi (Nampt) on useita toimintoja. Se esiintyy solujen välisen (iNAMPT) ja solunulkoinen (eNAMPT) muodostaa [1]. Soluissa, se toimii nopeutta rajoittava entsyymi pelastaa reitti synteesiä nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD), joka on mukana solujen aineenvaihduntaa ja lisääntymistä [2]. Solunulkoista Nampt tunnistettiin ensin esi-B-solujen pesäkkeitä parantaa tekijä (PBEF), sytokiinia, kuten proteiini, joka stimuloi alussa B-solujen muodostumista [3]. Se nimettiin uudelleen äskettäin visfatin mukaan Fukuhara et al., Joka tunnistaa sitä viskeraalisen rasvan johdettua adipokine jonka uskotaan jäljittelemään insuliinin toiminta [4]. Nampt on tehnyt merkittävää kiinnostusta paitsi aloilla aineenvaihduntaa ja immuunivastetta, vaan myös alalla syöpä. Useat syövät osoittavat lisääntyneen ilmentymisen Nampt [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], ja estäjät Nampt lupaavia terapeuttisia sovelluksia syöpä [12] , [13], [14], [15]. Kuitenkin mekanismi, jonka avulla Nampt tulee voimistunut on epäselvä.

MikroRNA (miRNA) ovat luokka pienet ei-koodaavat RNA: t. Tunnistettiin uuden luokan geeniekspression sääntelyviranomaisten ne kohdennetaan mRNA: t translaation tukahduttamisen tai hajoaminen [16]. Joukko tutkimuksia ovat osoittaneet, että miRNA voi säätelemään erilaisia ​​geenejä, mukaan lukien tärkeitä tuumorin leviämisen, invaasio tai metastaasin [17], [18], [19]. Hyödyllisyyttä miRNA hoidossa syövän on osoitettu [20], [21], [22].

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että NAD-talteenotto biosynteesipolun johon Nampt tärkeä rooli kolorektaalisen syöpäsolun selviytymistä. Osoitimme ensimmäistä kertaa, että Nampt on tavoite miR-26b. Lisäksi ilmaus miR-26b ja Nampt määritettiin ihmisen näytteitä peräsuolen syövän potilaiden ja 5 peräsuolen syövän soluja. Roolit miR-26b ja Nampt ihmisen syövän kehitykseen käsitellään.

Methods

Ethics lausunto

Tämä tutkimus on hyväksynyt eettinen komitea Ren Ji Hospital, School lääketieteen, Shanghai Jiao Tong University. Tämä tutkimus suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö ihmisen näytteitä Ren Ji Hospital.

Solulinjat ja Kudosnäytteiden

Paksusuolisyöpä solulinjat SW480, SW1116 , HT-29, LoVo, ja HCT116 käytettiin tässä tutkimuksessa (saatu Shanghai Institute of ruuansulatuskanavan sairaudet, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kiina). Kaikkia solulinjoja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

Kudosnäytteet ihmisen paksusuolen ja peräsuolen ja viereisen normaalin peräsuolen kudokset saatiin 18 potilasta, joille tehtiin leikkaus Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong-yliopiston (Shanghai, Kiina). Kukaan potilaista ei saanut kemoterapian tai sädehoidon ennen leikkausta. Näytteet kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Histopatologisten diagnoosit arvioitiin sairaalan patologi käyttäen sekä morfologisia kriteerejä ja immunosolukemiallinen. Kaikki potilaat ovat kirjallisesti ilmoittaneet suostumuksensa (kuten hahmoteltu PLoS suostumuslomakkeessa) ennen kudoksen keräämistä ja tutkimuksen hyväksyi eettisen valiokuntien Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong-yliopiston.

CCK-8 Pitoisuus

solujen eloonjäämisaste tutkittiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo). Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille 5000 solua /kuoppa täydelliseen kasvualustaan ​​ja viljeltiin 24 tuntia. Elatusaine korvattiin sitten RPMI-1640, joka sisälsi 10% FBS: ää, kanssa tai ilman hoitoa. Inkubaation jälkeen, 10 ui CCK-8, lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyjä inkuboitiin edelleen 4 tuntia inkubaattorissa. Absorbanssi 490 nm: ssä luettiin spektrofotometrisesti käyttäen mikrolevylukijaa.

Apoptosis Assay

Solun apoptoosia määritettiin Vybrant apoptoosimäärityksessä kit # 2 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Kukin näyte arvioitiin virtaussytometrialla Coulter Epics XL virtaussytometrillä (Beckman-Coulter). Tiedot käsiteltiin kanssa Expo 32 sytometrillä ohjelmisto (Beckman-Coulter). Kokeet tehtiin kolme kertaa kahtena kappaleena.

NAD + ja NADH Kvantifiointi

pitoisuudet NAD

+ ja NADH soluissa todettiin käyttäen NAD

+ /NADH kvantifiointi Kit ( Bio Vision) ohjekirjan mukaisesti. Määrä NAD

+ kussakin näytteessä normalisoitiin proteiinipitoisuuden kunkin testinäytteen.

ennustaminen miRNA Tavoitteiden

Computer-pohjainen TargetScan (http: //www.targetscan .org /) käytettiin ennustamaan miRNA että tavoite Nampt mRNA.

knockdown tai yli-ilmentyminen miR-26b

Expression of miR-26b soluissa pudotettiin transfektiolla miR-26b estäjä (GenePharma) tai kasvoi transfektoimalla miR-26b matkii (GenePharma). Solut maljattiin viljelymaljoilla tai 24-kuoppaisilla levyillä 24 tunnin ajan ja transfektoitiin sitten estäjän tai matkii käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 24 tuntia. Transfektion jälkeen solut altistettiin vielä määrityksiä tai RNA /proteiini uuttamalla.

RNA uuttaminen ja Reaaliaikainen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin viljellyistä soluista ja peräsuolen syöpä yksilöt käyttämällä TRIzol (Invitrogen). Tasot Nampt mRNA ja miR-26b mitattiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Havaitsemiseksi Nampt mRNA käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen M-MuLV-käänteistranskriptaasia System, ja reaaliaikaisen PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green (Takara) ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin normalisointi. Mitata miR-26b tasolle, kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR-analyysi suoritettiin käyttäen TaqMan Reverse Transcription Kit ja TaqMan MicroRNA Analyysit Kit (Applied Biosystems) mukaan valmistajan ohjeiden. Ihmisen U6 pieni ydin- RNA-TaqMan-koettimella käytettiin normalisointia. Alukesekvenssit (eteen ja taakse) on lueteltu taulukossa 1.

Western-blottaus

sama määrä pelletoidut solut pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), jälleen pelletoitiin ja suspendoitiin uudelleen RIPA puskuriin. Sen jälkeen soluja inkuboitiin 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja sentrifugoitiin mikrosentrifugissa 5 minuutin ajan. Yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia oli lastattu elektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeeleillä ja sen jälkeen siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blokattiin 5% TBS-T 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen TBS-T: 1 h ajan huoneenlämmössä tai yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen 4 kertaa 5 min kukin TBS-T, membraaneja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Kangchen Technology) 1 h huoneen lämpötilassa. Pesun jälkeen 4 kertaa 5 minuutin ajan, proteiinijuovat visualisoitiin kautta kemiluminesenssin reaktion ja valotettiin röntgenfilmille. Primaarisen vasta-aineen, anti-Nampt-vasta-ainetta (luettelonumero AP9010c), oli peräisin Abgent. Data käsiteltiin käyttäen 2-ΔΔCT menetelmällä.

Reporter konstruktit

oletetun miRNA26b tunnustamisesta elementtejä Nampt geenin ja vastaavat mutantit kloonattiin 3′-transloimaton alue (UTR) ja lusiferaasigeeni on pEZX-MT01 sivektorissa (GeneCopoeia Inc.). Tämä ilmaus klooni sisälsi Nampt (liittymistä: NM_005746.2) 3′-UTR-sekvenssin insertoitu pEZX-MT01 toriin alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-geenin säätelyn alaisena SV40-promoottorin. PEZX-MT01 vektori sisälsi myös Renilla lusiferaasigeeni valvonnassa on CMV-promoottorin. Firefly lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Mutantti-kloonit Nampt konstruoitiin. Siemen sitova alue (5′-UACUUGAA-3 ’), muutettiin 5′-UACUUACA-3’ (2-bp vaihto). Kaikki rakenteet vahvistettiin DNA-sekvenssianalyysillä.

Luciferase Reporter Assay

SW480-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä ja transfektoitiin negatiivisen kontrollin matkivat (NC) tai miR-26b matkii (30 nM tai 60 nM; GenePharma) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Seuraavat toinen transfektio miR-26b reportteri-konstrukti tai sen mutantti (50 ng), SW480-soluja inkuboitiin 24 tuntia. Lusiferaasimäärityksiä suoritettiin käyttäen Dual-Light Yhdistetty reportterigeenimäärityksessä System (Promega) ja Promega Turner TD-20/20 Luminometer.

TranswellTM Pitoisuus

Solun muuttoliikettä suoritettiin transwell määritys (BD Biosciences) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ohjaus miRNA tai matkii Mir-26b transfektoidut solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Sitten 3,0 x 10

5 transfektoituja soluja tai käsittelemättömiä soluja seerumittomassa elatusaineessa lisättiin jokaiseen ylempään insertin esipäällystetty matrigeeliä matriisi. Sovitettuun alempi kammio, 500 ui 10% FBS: ia lisättiin. Inkuboinnin jälkeen, ei-invasiivisia solut poistettiin ylemmältä pinnalta transwell kalvon vanupuikolla, ja invasiiviset solut alemman kalvon pinta kiinnitettiin metanolissa, värjättiin 0,1% kristallivioletilla, valokuvataan, ja laskettiin.

tilastollinen analyysi

kokeet toistettiin 3 kertaa. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Vertailuun 2-ryhmät, kaksisuuntaista, parittomalla t-testillä. Arvo p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Tilastolliset testit tehtiin käyttämällä State Software 12,0 (Stata Corp).

Tulokset

Nampt-erityinen kemiallinen estäjä FK866 Estää NAD synteesi ja Cell Survival

Lisääntynyt Nampt ilme on raportoitu perus kolorektaalisyöpä [5], [6], [7]. FK866 on Nampt-spesifinen kemiallinen joka estää NAD-talteenotto biosynteesipolun sitoutumalla nikotiiniamidi-sitomiskohta Nampt, jolloin heikentäviä solujen NAD [23], [24]. Kertoman, FK866 on hyvin siedetty, ja se merkittävästi estää solukasvua tietyntyyppinen kasvaimissa [13], [15]. Kuitenkin vaikutus on FK866 kolorektaalisyövässä ei ole dokumentoitu.

Analysoimme vaikutus FK866 solun eloonjäämisaste paksu- ja peräsuolisyövän SW480 ja LoVo solujen CCK-8 määritys ja virtaussytometria. Tulokset osoittivat, että FK866 edistänyt merkittävästi apoptoosiin SW480 ja LoVo-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. IC

50 FK866 oli 14,3 nM SW480-soluja ja 32,7 nM LoVo-solujen, mukaan CCK-8-määritys (kuvio 1A). Virtaussytometria tutkimukset osoittivat, että altistaa SW480 ja LoVo solujen eri pitoisuutta FK866 3 päivän prosenttiosuus kasvoi varhaisvaiheen apoptoottiset solut 3,37 ± 0,83%: sta 27,27 ± 1,49% (SW480) ja 3,00 ± 0,37%: sta 21,53 ± 1,76% (LoVo) (kuvio 1 B).

. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla FK866 72 tuntia ja sitten arvioitiin käyttämällä Cell Counting Kit-8. IC

50-arvot laskettiin. Kukin määritys toistettiin vähintään 3 kertaa. B. kvantifiointi apoptoottisten solujen indusoima FK866 vahvistettiin virtaussytometrialla analysointia. Sub-G1 sisältö nimettiin apoptoottisia soluja. *: Versus negatiivinen kontrolliryhmä; **: Verrattuna 2 hoitoryhmissä. C. NAD tasot kolorektaalisyövässä solut mitattiin altistumisen jälkeen FK866. Jokainen pystypalkki on keskiarvo ± SD kolminkertaisten määritysten. Vertailuun 2-ryhmät, kaksisuuntaista, parittomalla t-testillä.

vieressä määritti FK866 NAD biosynteesiä soluissa käyttämällä NAD

+ /NADH kvantifiointi Kit . FK866 altistuminen 3 päivää laski tasolle NAD välillä 5,33 ± 0,96-1,17 ± 0,31 nM /ug (SW480) ja 6,63 ± 1,16-2,33 ± 0,85 nM /ug (LoVo) (kuvio 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, Nampt välittämää NAD-talteenotto biosynteesin on keskeisessä asemassa peräsuolen syövän solujen selviytymistä ja että FK866 on anti-karsinogeenisia vaikutuksia peräsuolen syövän soluissa.

MiR-26b Estää ilmentäminen Nampt sitoutumalla 3′-UTR

tietokone-pohjainen sekvenssianalyysi käyttäen TargetScans havaitseminen ohjelmisto (https://www.targetscan.org/), Nampt ennustettiin olla potentiaalinen kohde miR-26b. Siementen sekvenssi kypsän miR-26b oli konservoitunut ihmisen, simpanssin, rhesus, ja Bush vauva lajeja, mm. Näin ollen, miR-26b valittiin edelleen biologisia ominaisuuksia.

miR-26b jäljittelee, yliekspressio miR-26b tukahdutetaan Nampt mRNA: ta (kuvio 2A vasemmalla) ja proteiini (kuvio 2B) tasot SW480-soluissa, kuten havaitaan RT-PCR: llä ja western blot -analyysillä, vastaavasti. Samaan aikaan, miR-26b jäljittelee tukahdutti myös ilmentymisen taso NAD +, joka mitattiin NAD

+ /NADH kvantifiointi Kit (kuvio 2D vasemmalla). Toisaalta, transfektio miR-26b-estäjä lisäsi Nampt mRNA: ta (kuvio 2A oikealla) ja proteiinia (kuvio 2C) tasoilla, ja miR-26b estäjä myös lisääntynyt ekspressiotaso NAD + (kuvio 2D oikealla).

. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR Nampt in SW480 solulinjoissa transfektion jälkeen eri pitoisuuksilla miR-26b jäljittelee tai inhibiittorit. B ja C. Western blottaus Nampt in SW480 solulinjoissa transfektion jälkeen eri pitoisuuksilla miR-26b jäljittelee tai inhibiittorit. D. suhteelliset tasot NAD SW480 solulinjoissa transfektion jälkeen eri pitoisuuksilla miR-26b jäljittelee tai inhibiittorit. E. lusiferaasireporttiterilla määrityksissä validointi suoraa vuorovaikutusta miR-26b kanssa 3′-UTR Nampt. Nampt-3′-UTR-pEZX (tai Nampt-3′-UTR-mut-pEZX) oli kotransfektoitiin miR-26b matkivat tai negatiivisen kontrollin osaksi SW480 soluihin. *: Versus negatiivinen kontrolliryhmä; **: Verrattuna 2 hoitoryhmissä. Jokainen pystypalkki on keskiarvo ± SD kolminkertaisten määritysten. Vertailuun 2-ryhmät, kaksisuuntaista, parittomalla t-testillä.

Sen varmistamiseksi, että Nampt on tavoite miR-26b, vaikutus transfektion miR-26b jäljittelee on reportteriaktiivisuutta laaja tyyppi ja mutatoitu pEZX-Nampt tutkittiin. pEZX-Nampt on dual-lusiferaasireport- rakenteen, joka sisältää laajan tyypin tai mutatoitunut segmentti Nampt 3′-UTR kanssa miR-26b tunnistussekvenssiin välittömästi alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi toimittaja (kuva S1A). Kaavio Nampt villityypin tai mutatoidun sekvenssien mahdolliset miR-26b sitoutumiskohta on esitetty kuviossa S1B. Sekvenssi kartat villityypin ja mutatoidun Nampt saatu geenin sekvensointi on esitetty kuvassa S1C. Kuten on esitetty kuviossa 2E, transfektio eri pitoisuus miR-26b jäljittelee laski tulikärpäsen lusiferaasi reportteri aktiivisuutta villityypin pEZX-Nampt noin 51,7% ± 3,2% ja 64,3% ± 4,0%, vastaavasti. Induktio Reportteri-aktiivisuuden yliekspressio miR-26b by miR-26b jäljittelee, mutta ei havaittu, kun miR-26b tunnistussekvenssi 3′-UTR Nampt mRNA mutatoitiin (kuvio 2E). Tämän vuoksi tulokset kuvioista 2 vahvistaa, että Nampt on tavoite miR-26b.

Expression tasot miR-26b ja Nampt kolorektaalisyövässä sissa ja solulinjoissa

pohjapinta ekspressiotasot Mir-26b ja Nampt mRNA mitattiin qRT-PCR kolorektaalisyövässä solulinjoissa (HT-29, SW480, SW1116, LoVo, ja HCT116), ja pohjapinta ekspressiotasot NAD + myös mitattiin NAD

+ /NADH kvantifiointi Kit solulinjoissa. SW480-solut oli alhaisin Nampt ilmaisun ja NAD + taso, ja korkein miR-26b tason, jonka jälkeen HT-29, HCT116, LoVo, ja SW116-solut (kuvio 3A vasemmalla). Merkittävä käänteinen korrelaatio ilmaus miR-26b ja Nampt mRNA havaittiin, ja merkittävä positiivinen korrelaatio NAD + ja Nampt mRNA havaittiin myös (kuvio 3A oikealla).

. miR-26b, Nampt mRNA ja NAD + tasot analysoitiin kolorektaalisyövässä solulinjoissa. Ilmaisu Mir-26b oli korreloi käänteisesti Nampt ilme kolorektaalisyövässä solulinjoissa; ilmaus NAD + oli positiivinen korreloi Nampt ilme kolorektaalisyövässä solulinjoissa (A oikealla). B. miR-26b ja Nampt mRNA-tasot analysoitiin 18 kirurgisista näytteistä ihmisen peräsuolen syöpä kudoksiin ja viereisten normaali peräsuolen kudoksiin. Merkittävästi yliaktiivista Nampt tasoilla kolorektaalisyövässä kudoksissa näytetään suhteessa Nampt tasolle viereiseen normaaliin peräsuolen kudoksiin (kertamuutoksia 6); merkitsevästi vaimentua miR-26b tasot kolorektaalisyövässä kudoksissa näytetään suhteessa miR-26b tasolle viereiseen normaaliin peräsuolen kudoksiin (kertamuutoksia 2). C. ilmentyminen miR-26b oli korreloi käänteisesti Nampt ilme kolorektaalisyövässä kudoksissa (C vasemmalla), ja viereisten normaali peräsuolen kudoksiin (C oikealla). Nampt mRNA-tasot analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä ja normalisoitiin GAPDH. MIR-26b tasot määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR ja normalisoitiin U6. Jokainen pystypalkki on keskiarvo ± SD kolminkertaisten määritysten. Vertailuun 2-ryhmät, kaksisuuntaista, parittomalla t-testillä.

Lisäksi olemme laajentaneet tutkimuksen näytteitä kolorektaalisyövän potilaalla. Tuloksemme osoittivat, että Nampt ilmentyminen oli merkittävästi lisääntynyt syövän kudoksissa (6,3-kertainen) verrattuna, että pariksi viereisen normaaleista kudoksista paneelissa 18 kolorektaalisyövän potilaalla (kuvio 3B oikealla), joka oli yhdenmukainen muiden havaintojen [5 ], [6], [7]. Lisäksi olemme huomanneet, syöpäkudoksen osoitti merkittäviä menetyksiä miR-26b (~45.45%) verrattuna viereisen normaalin paksusuolen syövän kudoksissa paneelin 18 kolorektaalisyövän potilaalla (kuvio 3B vasemmalla), jota ei ole aikaisemmin raportoitu . Havaitsimme käänteinen korrelaatio miR-26b ja Nampt ilmentymisen syöpäkudokset (kuvio 3C vasemmalla) ja viereisten normaaleissa kudoksissa (kuvio 3C oikealla).

MiR-26b Estää Cell Survival ja Invasion, ja tämä voi olla osittain kumottu lisääminen NAD

Nampt tiedetään säännellä erilaisia ​​biologisia vaikutuksia, kuten solujen eloonjäämistä ja invaasiota. Koska miR-26b uskotaan kohdistaa Nampt, vaikutus miR-26b solun eloonjäämistä ja invaasio tutkittiin. Lisäksi olemme kotransfektoidaan solujen miR-26b matkivat, sitten 1,0 mM /L NAD + (maksimaalisesti tehokas) lisättiin onko vaikutuksia miR-26b välittävät Nampt-välitteisen NAD biosynteesiä.

käyttäminen CKK-8 määritystä solut käsiteltiin miR-26b estäjä oli korkein solujen lisääntymistä, minkä jälkeen solut käsiteltiin negatiivinen kontrolli, miR-26b jäljittelee plus NAD, ja miR-26b matkii yksinään (kuvio 4A). 21,1%: n lisäys solujen kasvun havaittiin LoVo-solujen 4 päivää transfektion jälkeen miR-26b estäjä, verrattuna kasvun negatiivisena kontrollina. Kuitenkin transfektion miR-26b jäljittelee tukahdutti kasvua LoVo solujen 31.48% verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Transfektion miR-26b matkii plus NAD lisäsi kasvua LoVo solujen 26,85% verrattuna ryhmään transfektoitu vain miR-26b matkii.

. LoVo-soluja käsiteltiin miR-26b jäljittelee et al., Ja solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8. B. määrällisesti apoptoottisten solujen aiheuttama miR-26b matkii (ja ilman NAD) tai miR-26b estäjä vahvistettiin virtaussytometrialla analyysi. Sub-G1 sisältö nimettiin apoptoottisia soluja. C. edustaja micrographs soluinvaasiota määritykset (vasemmalla) ja kvantifiointi (oikealla) eri hoidoista (* p 0,01). Värjätyt invasiivisia Solut valokuvattiin nojalla käänteisvalomikroskoopilla (100-kertainen suurennus). *: Versus negatiivinen kontrolliryhmä; **: Verrattuna 2 hoitoryhmissä. Jokainen pystypalkki on keskiarvo ± SD kolminkertaisten määritysten. Vertailuun 2-ryhmät, kaksisuuntaista, parittomalla t-testillä.

virtaussytometrialla määrityksen tulokset on esitetty kuviossa 4B. Altistaminen LoVo solujen miR-26b estäjät 4 päivän merkittävästi vähentynyt prosenttiosuutta alkuvaiheen apoptoottisia soluja (3,03 ± 0,72% verrattuna 7,33 ± 0,60% negatiivisessa kontrolliryhmässä). Transfektion miR-26b matkii ja NAD huomattavasti vähensi alkuvaiheen apoptoottiset rate (12,23 ± 0,35% verrattuna 24,2 ± 0,79% ryhmässä transfektoitu vain miR-26b matkii).

Mielenkiintoista, asennuspalveli- 26b vaimennus vaikuttaa paitsi solujen selviytymisen vaan myös hyökkäys (kuva 4C). Transfektion miR-26b estäjä huomattavasti lisääntynyt hyökkäyksen tehokkuus LoVo soluja (1,7-kertainen) mukaan Transwell määritystä. Transfektion miR-26b jäljittelee kuitenkin vähentynyt hyökkäyksen tehokkuus LoVo solujen 34.53%, ja tämä osittain pelastettiin lisäämällä NAD (nousi 66.10%). Tulokset kuviosta 4 siis osoittavat, että miR-26b esti solujen eloonjäämistä ja invaasiota LoVo soluissa. Lisääminen NAD osittain kumotaan tätä vaikutusta.

Keskustelu

Tutkimukset ovat osoittaneet, että Nampt lisääntyy merkittävästi ensisijainen kolorektaalisyövässä [5], [6], [7] ja muiden syöpien [8 ], [9], [10], [11]. Siten Nampt voi olla hyvä biomarkkereiden pahanlaatuistumisriskin ja vaiheen etenemistä [1], [8], [25], [26]. Nampt välittämä NAD biosynteesin on kriittinen rooli solujen aineenvaihdunnassa, selviytyminen toiminnot, ja kestää rasitusta kautta sirtuins ja muut NAD vievää sääntelyviranomaisten [1]. Nampt-spesifinen kemiallisen inhibiittorin FK866 kuluttaa solujen solunsisäisten NAD sitoutumalla nikotiiniamidi-sitomiskohta Nampt ja estämällä NAD salvage-reitin [23], [24]. Syöpäsoluissa, FK866 näyttää anti-kasvain [27], anti-metastaattinen [15], ja anti-angiogeenisten toimintaa [28] ja Chemo-herkistävää vaikutusta [27]. Sen sijaan jotkut tutkimukset osoittivat ei-tuumorigeenisiä soluja ei vaikuta FK866 [29], [30]. Niitä voidaan selittää sillä, että syöpäsolut edellyttävät korkeampia NAD + tasoilla sijoittaa korkean metabolisen kuin normaalit solut. Näin ollen, on olemassa ero annos-vaste välillä pahanlaatuisia ja normaaleja soluja kuin tasot solun NAD + sisältöä. Näin ollen, FK866 on hyvin siedetty, ja se inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua in vitro ja in vivo. Nämä tulokset tukevat monet tutkijat [12], [13], [14], [15]. Tässä tutkimuksessa, ensin osoittivat, että FK866 esti merkitsevästi solujen eloonjäämistä ja vähensi NAD tasoilla SW480 ja LoVo-soluja, mikä viittaa siihen, että Nampt-välitteinen NAD biosynteettisen mekanismi on aktiivinen peräsuolen syövän soluissa. Mielenkiintoista, oli vähän korrelaatiota laskun NAD + ja apoptoosin lisääntyminen käyttäen FK866 saamiemme tulosten (r = -0,8544,

p

= 0,3479). Saattaa olla kaksi eri arvauksia kuin tulos. Ensinnäkin saattaa olla kynnys vaikutus, koska korkea pitoisuus FK866. Toiseksi, Thakur, B. K. raportoitiin FK866 pystyy aiheuttamaan apoptoosin leukemiasolujen epäsuorasti aktivoimalla kasvaimeen soriproteiini p53 [13], ja tämä reitti voi toimia myös peräsuolen syövän soluissa. Vaikka oli vähän korrelaatiota NAD + ja apoptoosin mukaan tuloksemme, tämä ei vaikuta siihen, että FK866 voisi olla lupaava aine ja peräsuolen syöpiä. Ja molekyylitason mekanismeja vastuussa korkeasta ilmentymisestä Nampt kolorektaalisyövässä ei täysin tunneta.

Äskettäin on raportoitu, että sopimaton ekspressio miRNA myötävaikuttaa patogeneesiin syöpä. Alentuneet miR-26b havaitaan monenlaisia ​​kasvaimia [17], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]. Meidän tutkimuksissa osoitimme, että ilmaus miR-26b oli merkittävästi vaimentua 18 syöpä- näytteissä paksusuolisyövän potilaille. Kolorektaalisyövässä potilailla, miR-26b oli 2,2 kertaa suurempi viereisten normaaleissa kudoksissa kuin syöpäkudokset (p 0,0001). Olemme alun perin tunnistettu Nampt tavoitteeksi asetettiin miR-26b by bioinformatiikan analyysejä, lusiferaasireportteri määrityksiä, ja ryhmittymä määritys transfektoimalla miR-26 jäljittelee tai inhibiittorit. Yli-ilmentymisen miR-26b transfektoimalla miR-26 jäljittelee vähentynyt merkittävästi Nampt mRNA ja proteiini tasoilla in vitro. Meidän tutkimuksessa todettiin, että miR-26b matkii ovat tehokkaampia apoptoosin kuin lisääntymismäärityksissä. Tulokset yhdenmukainen muiden tutkimusten että esto Nampt aiheutti yleistä sytotoksisuutta [13]. Knockdovvn miR-26b transfektoimalla miR-26b estäjät huomattavasti Nampt mRNA ja proteiini tasoilla. Tämä osoittaa, että miR-26b säätelee Nampt ensisijaisesti translaation tukahduttaminen. Samaan aikaan tuloksemme säännöllisten reittien miR-26b liittyi invasiivisuus ja etäpesäkkeiden peräsuolen syövän soluissa. Ma et ai. osoitti, että yli-ilmentyminen miR-26b esti in vivo kasvaimen kasvua hiirissä, joihin injektoitiin LoVo-soluja [38]. Lisäksi olemme havainneet, että inhibitio solujen eloonjäämistä ja hyökkäyksen yliekspressio miR-26b voi osittain pelastaa lisäämällä NAD. Tämä tulos osoittaa, että miR-26b tuumorin solujen eloonjäämistä ja invaasio liittyy Nampt-välitteisen NAD biosynteesiä. Siksi meidän havainnot tarjoavat tietoa funktio miR-26b säätelyssä peräsuolen kasvaimien syntyyn. Kun lisäksi otetaan huomioon, että Nampt toimii aineenvaihduntaa ja immuunivaste, miR-26b voivat myös vaikuttaa näihin prosesseihin, koska se vaimentaa käännös Nampt. Tämä viittaa siihen, mekanistinen selitys downregulation miR-26b diabeettisen hiirissä [39].

Kuitenkin mekanismi, jolla miR-26b ja Nampt säätelevät kasvaimen kehittymisen voi olla niin yksinkertaista. Kun pitoisuus NAD + oli maksimaalisesti tehokas, pelastus ei ollut täysin toipunut. Vaihtoehtoisen reitin saattaisi olla mahdollista osallistumista. Ensimmäinen, viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että miR-26b on monia muita suoria tavoitteita, kuten EphA2 [40], SLC7A11 [32], Lef-1 [41], pRb proteiini [42], ja COX-2 [36]. Toinen, miRNA muut kuin miR-26b voi kohdistaa Nampt ilmaisua. Esimerkiksi, miR-182 vaimentua Nampt ilmentymistä Tat-indusoidun HIV-1 long terminal repeat (LTR) transaktivaatiodomeenin [43]. Kolmanneksi, vaikka se ilmoitti, että sääntelyn glukoosi stimuloi insuliinin eritystä ja mTORC1 ja ERK1 /2 signaalireitin osallistuvat Nampt-media NAD pelastus synteesi [12], [44], muut välittämiä signaalien kulkureittejä Nampt, kuten PI3K /Akt [45] ja STAT3 [46], [47], osallistuvat myös kasvainten muodostumiseen, transformaatio, ja angiogeneesi. Yhdessä MIR-26b-Nampt-NAD signalointireitin vaikuttaa peräsuolen syövän solujen eloonjäämistä ja invaasio, mutta se ei ole ainoa polku.

Johtopäätös

Yhteenvetona tämänhetkisiin tutkimus viittaa siihen, että miR-26b säätelee negatiivisesti Nampt ilmentymisen posttranskriptionaalisella tasolla sitoutumalla sen 3′-UTR. Lisäksi miR-26b esti kasvaimen kasvua ja invaasio, ja tämä vaikutus oli osittain kumonnut lisäämällä NAD. Olemme myös havainneet, että tasot miR-26b potilaan paksusuolen ja peräsuolen kasvaimen kudokset olivat paljon pienempi kuin viereisten normaaleissa kudoksissa, ja että miR-26b ilmentyminen korreloi käänteisesti ekspression Nampt mRNA: n 5 ja peräsuolen syövän solulinjat ja potilaan näytteitä. Nämä tulokset osoittavat, että tuloksemme ovat kliinisesti merkittäviä: miR-26b yli-ilmentymisen ja estämällä Nampt-NAD signalointireitin voi olla perusteet hoitotoimenpiteiden kolorektaalisyövässä tulevaisuudessa.

tukeminen Information

Kuva S1 .

lusiferaasireporttiterilla määrityksissä validointi vuorovaikutusta miR-26b ja Nampt. A. rakentaminen pEZX-MT01 lusiferaasireportteri (Luc-Nampt 3′-UTR). hLuc, tulikärpäsen lusiferaasi reportterigeeni; hRLuc, Renilla lusiferaasireportterigeeniin. Tulikärpäsen lusiferaasi ilmentymistä säätelee sitoutumisen miRNA 3′-UTR: n kohdesekvenssiin. Firefly lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuus. B. Kaavio Nampt villityypin ja mutatoidun sekvenssit mahdollisen miR-26b sitoutumiskohta. C. Sequence karttoja villityypin ja mutatoidun Nampt sekvenssit perustettu geenisekvensseihin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0069963.s001

(TIF) B