Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sädehoito on tärkeä hoitomuoto suun syöpä. Kuitenkin kehittäminen radioresistance on merkittävä este tehoa sädehoidon suun syöpäpotilailla. Tunnistaminen ennustajia radioresistance on haastava tehtävä, ja se on edistynyt vain vähän. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli tutkia ero spektrin profiilit vakiintunut säteilyresistenteille alilinjat ja vanhempien suun syöpäsolun riviä Ramanspektroskopia. Olemme perustaneet säteilyresistenteille alilinjat nimittäin 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B sen vanhempien UPCI: SCC029B solulinjaan käyttämällä kliinisesti hyväksyttävä 2Gy fraktioitua ionisoiva säteily (FIR). Kehitetyn säteilyresistenteille hahmo oli vahvistanut klonogeeniset solujen eloonjäämisen määritys ja tunnetaan radioresistance liittyviä proteiinimarkkereita kuten Mcl-1, Bcl-2, Cox-2 ja surviviinin. Altered solujen morfologia nostamalla huomattavasti (p 0,001) määrän filopodia in säteilyresistenteille soluissa suhteessa vanhempien soluihin havaittiin. Raman spektrit vanhempien UPCI: SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B solut hankittiin ja spektrin ominaisuudet osoittavat mahdolliset erot biomolekyylien kuten proteiinien, lipidien ja nukleiinihapot. Pääkomponenttianalyysi (PCA) toimitti kolme klustereita vastaavat säteilyresistenteille 50Gy, 70Gy-UPCI: SCC029B alilinjat ja vanhempien UPCI: SCC029B solulinjan vähäinen päällekkäisyys, joka ehdottaa muuttunut molekyyliprofiilin hankkimat säteilyresistenteille solut johtuu useista säteilytysannoksille. Havainnot Tämän tutkimuksen tukevat potentiaalia Ramanspektroskopia vuonna ennustamiseen radioresistance ja mahdollisesti edistää parempaa ennustetta suusyövän.

Citation: Yasser M, Shaikh R, Chilakapati MK, Teni T (2014) Raman Spektroskooppiset Study of säteilyresistenteille Suusyöpä alilinjat perustama Fraktioitu ionisoivaa säteilyä. PLoS ONE 9 (5): e97777. doi: 10,1371 /journal.pone.0097777

Editor: Gabriele Multhoff, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 07 helmikuu 2014; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2014; Julkaistu: 19. toukokuuta 2014

Copyright: © 2014 Yasser et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Raman spektrometri työskentelee tutkimuksessa hankittiin DBT hanke BT /PRI11282 /MED /32/83/2008 otsikolla ”Development of in vivo laser Ramanspektroskopia diagnosointimenetelmät suun precancerous ja syöpätilat,” Department of Biotechnology, Intian hallitus. Mohd Yasser rahoitetaan apurahan yliopiston Grants komissio (UGC) – Intia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suun syöpä on kuudenneksi yleisin syöpä maailmassa [1]. Intiassa laaja tupakan käyttö eri muodoissa tekee johtava syöpätyyppi miehillä ja kolmanneksi yleisin syöpä naisilla [2], [3]. Myös esiintyvyys suun suun limakalvolta syöpä tyyppi on suuri Intian niemimaan [4]. Hoito yksityiskohtaiset suusyövän perustuvat useisiin tekijöihin, kuten sairauksien vaiheessa pääsy suullista sivuston, iästä ja fyysisestä tilasta potilaan. Vaikka leikkaus on hoitomuoto alkuvaiheessa; sädehoito on avainasemassa joko yksinään tai adjuvanttina kemoterapiaa [5], [6]. Standard sädehoitoa protokolla sisältää päivittäisen altistumisen 2Gy osa annoksesta muutaman viikon, jossa potilaat saavat kumulatiivinen annos 50Gy jotta 70Gy aikana sädehoidon kurssin [7], [8], [9]. Fraktioitua sädehoitoa tappaa nopeasti jakamalla tuumorisolupopulaatioon alentuneeseen vaikutuksia ympäröiviin normaaleissa kudoksissa. Siten tämä menetelmä antaa aikaa normaalien solujen kiinnittyä uudelleen ja palauttaa samalla pienenee syöpäsolujen ovat poikkeavasti aktivoitu signaalintransduktioreitteihin [10], [11]. Kuitenkin joskus kasvain uusiutuu kanssa hankittu säteilyresistenteille fenotyyppi poseeraa kuin esteen kohti tehoa sädehoidon. Jotta sädehoidon tehokkuutta; On tärkeää tutkia säteilyresistenteille fenotyyppi syöpäsoluja. Association useiden proteiinien kuten p53 [12], Cox-2 [13], Ras [14], Pakt [15], MDM2 [16], Klusteriinin [17], Surviviinispesifisiä [18], Bcl-2 [19] ja MCL-1 [20] kanssa radioresistance on raportoitu aikaisemmin. Tähän mennessä ei ole saatavilla väline, joka voi ennustaa sädehoidon vaste suun syöpäpotilailla johtaa kohti parempaa hoitoa.

Biomedical soveltamista optisen spektroskopian menetelmiä kuten fluoresenssi, Fourier siirto infrapuna- (FTIR), Epäsuora heijastuskyky ja Ramanspektroskopia (RS) luokittelua erilaisten patologisten tilojen ja syövän havaitseminen on jo raportoitu [21] – [24]. Näistä tekniikoista, RS on lisännyt etuja, kuten se on etiketti vapaa, herkkä biokemiallisia vaihteluita, joita sovelletaan

in vitro

ja

in vivo

olosuhteissa, on vähän häiriötä vedestä ja antaa molekyyli sormenjäljet ​​[ ,,,0],25] – [27]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet tehoa RS luokittelussa terve, esipahanlaatuinen ja pahanlaatuiset leesiot suun submukoosan [28] – [29]; luokittelu normaalin ja epänormaalin kuorinnan soluja [30] ja ennustaminen tuumorivaste kohti samanaikaista kemosädehoidon kohdunkaulan syövistä [31]. Olemme osoittaneet mahdollisuudet RS tunnistaa varhaisessa muutos muutokset suun suun limakalvolta [32], sen toteutettavuus havaitsemaan astman ja määritetään hoitovasteen kautta seerumin astmapotilaiden [33], luokittelussa normaali ja suusyövän seerumin [34] ja tunnistaminen monilääkeaineresistenssin fenotyypin ihmisen leukemian [35] ja kohdun sarkooma solulinjat [36].

(A) klonogeeninen solujen selviytymistä käyrä. UPCI: SCC029B emosoluista, 50Gy-UPCI: SCC029B väli säteilyresistenteille solujen ja 70Gy-UPCI: SCC029B lopullinen säteilyresistenteille soluja. Tiedot esitetään prosentteina eloonjäämistä solujen keskiarvo (± SD) on kolmen erillisen kokeen. Yksisuuntainen ANOVA tilastollinen analyysi suoritettiin elossa jakeet annettuun annoksina, p 0,01 0,001. (B) ilmentäminen radioresistance merkkiaineiden säteilyresistenteille suun alilinjat. Western blotting Cox-2, Bcl-2, Mcl-1 ja surviviinia proteiinit; β-Actin käytetään latauskontrollina. Densitometria analyysi western blotit kolmesta erillisestä kokeesta on esitetty alla, pylväät esittävät keskiarvo ± S.D. * Edustaa proteiinin ilmentyminen verrattuna emosolulinjassa, kun taas # edustavat proteiinin ilmentymisen verrataan 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B alilinjat (p 0,05).

RS tutkimukset liittyvät säteilyn aiheuttaman biokemiallisia muutoksia eturauhasen, keuhko- ja rintasyövän solulinjat säteilytetään säteilyllä annoksina välillä 15 ja 50Gy on raportoitu [37], [38]. Nämä tutkimukset tehtiin kerta annoksia säteilyä, jonka tarkoituksena oli tutkia

in vitro

säteilyn vastaus ihmisen syöpäsolujen linjat. Toisaalta, me suorittaa tässä tutkimuksessa, hyödyntämällä jatkuvaa pieniannoksista fraktioitu säteilytystä käytetään rutiininomaisesti vakiona sädehoidon protokollan klinikoilla suun syövän hoitoon. Tavoitteena oli kehittää

in vitro

radioresistance merkin solulinjassa yli ajan ja sitten tutkia mahdollisuutta Ramanspektroskopia kategorisoida hankittu piirre sen vanhempien käsittelemättömät solut. Olemme perustaneet säteilyresistenteille suusyövän alilinjat suun limakalvo peräisin kliinisten toteutettavissa 2Gy fraktioitua säteilyannos. Muodostamisen jälkeen alilinjat, heidän säteilyresistenteille luonne arvioitiin klonogeeniset solujen eloonjäämisen määritys ja Raman spektrin profiilit saatiin RS. Parhaan tietomme mukaan olemme raportoi ensimmäisenä hyödyllisyyttä RS hankittujen säteilyresistenteille suusyövän alilinjat perustettu vanhempien suun tasyöpäsolulinja kliinisesti annostella fraktioitua ionisoivaa säteilyä.

Materiaalit ja menetelmät

perustaminen ja karakterisointi säteilyresistenteille solulinjojen

a) Soluviljely ja perustamalla säteilyresistenteille alilinjat gamma sädehoitoa.

UPCI: SCC029B, ihmisen suun suun limakalvo kohdunkaulan noomasolulinjasta toimitti Dr. . Susanne M. Gollin, University of Pittsburgh, USA [39]. Soluja ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma-Aldrich) ja antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä.

(A) Cell morfologia analyysi. Vanhempien UPCI: SCC029B solut säteilyresistenteille 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B soluja. Mittaviivat: 100 pm. (B) konfokaali kuvia rihmamaisia-Actin värjätty Alexa Fluor-488 -falloidiinia solut laskuri värjättiin DAPI. Mittaviivat: 20 pm. Nuoli osoittaa filopodia hienoina solun pinnan laajennuksia. Analyysi perustuu 50 solua kohti väestölle keskiarvo ja keskihajonta kolmen erillisen kokeen, piirretty alle oikealle puolelle (p 0,01, 0,001).

Tuottaa säteilyresistenteille alilinjat, UPCI: SCC029B soluja (1 x 10

6 solua) siirrostettiin 100 mm: n viljelylevyillä (BD-Biosciences), joka sisälsi täydellistä väliainetta. Soluja kasvatettiin standardeissa ja säteilytettiin 2Gy ionisoivan säteilyn avulla

6 ° Co-γ Linear Accelerator (Bhabhatron-2, ACTREC, Tata Memorial Centre) 60% konfluenssiin. Välittömästi sen jälkeen säteilytys elatusaineeseen uusittiin ja solut saatettiin inkubaattoriin kunnes he saavuttivat 90% konfluenssin. Sitten solut trypsinoitiin, laskettiin ja kulkuväylää uuteen kulttuuriin levyille. Soluja käsiteltiin jälleen 2Gy ionisoivan säteilyn noin 60% konfluenssiin. Tämä menettely toistettiin 25 kertaa sukupolven välituotetta 50Gy-UPCI: SCC029B säteilyresistenteille alalinja ja jatkettiin enintään 35 kertaa aikana 5-6 kuukautta kunnes sukupolven lopullisen 70Gy-UPCI: SCC029B säteilyresistenteille alalinja.

( A) Vanhempien UPCI: SCC029B solulinja (b) 50Gy-UPCI: SCC029B alalinja (C) 70Gy-UPCI: SCC029B alalinja.

b) klonogeeninen solujen selviytymistä määrityksessä.

Lyhyesti tunnettu määrä sekä vanhempien ja säteilyresistenteille solujen UPCI: SCC029B ympättiin 100 mm viljelymaljoille ja säilytetään CO

2-inkubaattorissa yön yli noudattamista levyjen. Seuraavana päivänä solut säteilytettiin vielä annoksia 2Gy ja 8Gy ja inkuboitiin 37 ° C: ssa pesäkkeiden muodostumista. Jälkeen 14 päivää, pesäkkeet kiinnitettiin absoluuttiseen etanoliin ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Pesäkkeitä, jotka sisälsivät 50 tai enemmän solut lasketaan klonogeeniset eloonjääneitä. Prosentuaalinen maljaustehokkuus, D0-arvo (säteilyannos jossa 37% väestöstä selviää) ja eloonjääntifraktio tietyllä säteilyannos oli laskettu eloonjäämisen ei-säteilytettyjä soluja, kuten aiemmin on kuvattu [40]. Kolme riippumatonta koetta suoritettiin, kullakin kerralla kaksoiskappaleet vanhempien ja säteilyresistenteille alilinjat ja solujen eloonjäämistä käyrä piirrettiin laskemisen jälkeen eloonjääntifraktio kullakin annoksella. Edelleen, Yksisuuntainen ANOVA tilastollinen analyysi suoritettiin löytää merkittävää eroa selviytymisen eri säteilyannosten.

(A) 50Gy-UPCI: SCC029B alilinja – vanhempien UPCI: SCC029B solulinja (B) 70Gy- UPCI: SCC029B alilinja – vanhempien UPCI: SCC029B solulinja (C) 50Gy-UPCI: SCC029B alilinja -70Gy-UPCI: SCC029B alalinja.

(A) Paljon kerroin 1, 2 ja 3 (B ) 3-D sirontakuvaajan vanhempien UPCI: SCC029B solulinjaa säteilyresistenteille 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B alilinjat.

c) Western blottauksella.

Soluja hajotettiin nisäkässolussa lyysipuskuria, joka sisälsi 1% proteaasinestäjä (Thermo tieteellinen, USA). Solulysaatti sentrifugoitiin 13000 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti, joka sisältää solun kokonaisproteiinista kerättiin. Proteiinikonsentraatio kvantifioitiin kolorimetrisellä määrityksellä [41]. Näytteet, jotka sisälsivät 40 ug kokonais-proteiinit erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (PALL laboratorio, USA). Membraanit blokattiin huoneenlämmössä 1 tunnin ajan inkuboimalla TBS, joka sisälsi 0,1% Tween (TBST, pH 7,4) ja 5% (w /v) vähärasvainen maito. Sen jälkeen esto, kalvoja inkuboitiin kanin polyklonaalinen IgG ihmisen anti-Mcl-1 (1:1000, sc-20679); Bcl-2 (1:500, sc-492), surviviinia (1:1000, sc-10811), vuohen polyklonaalinen IgG anti-Cox-2 (1:500, sc-1747) ja siivous kanin polyklonaalista IgG anti-p Actin (1:3000, sc-1616); (Santa Cruz Biotech., USA) yön yli estopuskurissa. Pesun jälkeen kuusi kertaa TBST: ssä, kalvoja inkuboitiin HRP-konjugoitua anti-kani-lgG-vasta-ainetta (1:2800) tai anti-vuohi-IgG-vasta-ainetta (1:2500, Santa Cruz Biotechnology) estopuskurissa 1 tunti. Pesun jälkeen kuusi kertaa TBST: ssä ja kaksi kertaa TBS: llä, primaarinen vasta-aineen sitoutuminen visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssi- substraatti-järjestelmän (GE Healthcare, USA). Länsi-blottaus suoritettiin kolme itsenäistä Solulysaattien vanhempien, 50Gy ja 70Gy soluja. Densitometrian analyysi suoritettiin Image J ohjelmisto (NIH, USA) vastaan ​​β-Actin taloudenhoito proteiinin ilmentymisen.

d) Morfologiset arviointi ja F-Actin värjäystä.

morfologiset muutokset havaittu fraktioitua ionisoivaa säteily valokuvattiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Axiovert-200M, Zeiss) yhdistettynä digitaalikameralla. Edustavat kuvat vanhempien UPCI: SCC029B solulinjaa, 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B alilinjat käsiteltiin käyttäen Axiovision ohjelmistoa (release 4.7, Carl Zeiss).

rihmamaisia ​​aktiinivärjäyksen, soluja kasvatettiin coverslip, kiinnitettiin paraformaldehydillä (4%), 15 minuuttia ja tehtiin läpäiseviksi 0,7% Triton-X. Korkea affiniteetti rihmamaisia ​​Actin (F-Actin) koetin Alexa Fluor-488 phalloidin (Life technologies, USA) laimennettiin 1:20 (1 x PBS) ja inkuboitiin solujen peitinlaseil- 30 minuuttia huoneenlämpötilassa pimeässä. Inkuboinnin jälkeen peitelasit pestiin kaksi kertaa 1X PBS: llä 10 minuutin ajan. DAPI (1:20 laimennettu 1 x PBS) värjäys tehtiin noin 1 minuutti ja peitelaseja sitten asentaa anti-sammutusta asennus agentti (Vectashield, Vector Labs, USA) puhtaalle lasilevyllä ja tutkittiin LSM 510 Meta Carl Zeiss konfokaali järjestelmä (Carl Zeiss Micro Imaging GmbH, Saksa). Kukin vanhempien, 50Gy ja 70Gy soluja kasvatettiin kaksoiskappaleet coverslip ja satunnaisia ​​kuvia 50 soluja hankittiin. Tällä tavoin värjäys suoritettiin kolme kertaa, itsenäisesti, ja 50 solut analysoitiin aina kaikki solupopulaation tyypit filopodia laskentaa.

ramanspektroskopia

a) Näytteiden valmistus ja spektrin hankinta.

Lapsen UPCI: SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B soluja viljeltiin 100 mm: n viljelylevyillä. Eksponentiaalisesti kasvavat solut (3 x 10

6 solua) 6 riippumattoman viljelmän kunkin vanhempien, 50Gy ja 70Gy solut kerättiin ja fosfaattipuskurin suolaliuosta (PBS) pesun annettiin solupelletteihin ennen spektrit tallennus. Noin 7 spektrit saatiin jokaisesta solusta pelletti käyttäen kuituoptista Raman microprobe järjestelmä kuten aiemmin on kuvattu [33]. Siten yhteensä ~ 40 spektrien ryhmää kohti hankittiin kullekin vanhempien, 50Gy ja 70Gy soluja.

Kuten edellä mainittiin, Raman järjestelmä hyödyntää tutkimus koostuu laserin (Process Instruments) 785 nm aallonpituudella kuten magnetointilähde että korkea hyötysuhde (HE-785, Horiba-Jobin-Yvon, Ranska) spektrografissa yhdistettynä CCD (Synapse, Horiba-Jobin-Yvon, Ranska) kuin tunnistus elementti. Optinen suodatus kohinaa kuten Rayleigh signaalit onnistuu ”Superhead” ylimääräisten osa järjestelmää. Super pää yhdistettynä 40 × mikroskooppinen tavoite (Nikon, NA 0,65) käytettiin tuottamaan laservaloa sekä kerätä Raman-signaaleja. Spektrometrin ei ole liikkuvia osia, kiinteä 950 gr /mm säleikkö ja spektriresoluutiolla kohti valmistajan ohjeiden on ~ 4 cm

-1. Arvioitu lasertäplää kokoisista solupelletti otos oli 5-10 um. Spectra integroitiin 6 sekuntia ja keskiarvona 3 keskittymistä. Tyypillisiä laser valtaa näyte oli 40 + 0,05 mW.

b) Spektrin esikäsittely- ja tietojen analysointi.

Raman spektrit esikäsitellyt korjaamalla ladattu pari laite (CCD) vaste National Institute of Standards and Technology (NIST) varmennettu standardin vertailuaineistoa 2241 (SRM 2241) ja sen jälkeen vähentämällä tausta signaaleja optisia elementtejä ja CaF

2 ikkuna. Voit poistaa interferenssi hitaasti tausta, ensimmäinen johdannaisia ​​spektrien (Savitzky – Golay menetelmä) käytettiin data-analyysi [42], [43]. Sitten -spektrit interpoloidaan 900-1800 cm

-1 valikoima ja vektori normalisoida. Analyysi esikäsitellyn spektrit suoritettiin käyttäen PCA (pääkomponenttianalyysi) algoritmit toteutetaan MATLAB (Mathwork Inc.), joka in-house ohjelmistojen [44]. PCA on valvomatta tietoja katsaus työväline tarkastella eroja ja yhtäläisyyksiä keskuudessa spektrit. Tämä menetelmä paljastaa poikkeavuuksien ryhmiä ja kehityssuunta. Se kuvaa datan varianssi tunnistamalla uusia ortogonaalisia ominaisuuksia, näitä kutsutaan kuormien tekijä tai pääkomponentit (PC) (p 0,05). Pääkomponentit ovat lineaarikombinaatioita alkuperäisten tietojen muuttujia. Koska tässä tutkimuksessa on parhaillaan tutkimusta siksi olemme tehneet PCA analyysimenetelmä ja myös käytetty tätä menetelmää aikaisemmassa

in vitro

tutkimukset solulinjoilla [35], [36].

keskimääräinen ja ero spektrit laskettiin eri solupopulaatioiden ja käytettiin spektrin vertailu. Keskimääräinen spektrit laskettiin taustasta vähennetään spektrit ennen johdannaisten keskiarvoistamalla Y-akselin vaihtelut ja pitää X-akselin vakio kullekin luokalle. Perustaso korjaus suoritettiin sovittamalla 5

nnen kertaluvun polynomifunktion. Nämä lähtötilanteessa korjattu spektri käytettiin spektrin vertailut kaikissa ryhmissä. Ero spektrit saatiin aikaan vähentämällä keskimääräinen spektrit säteilyresistenteille soluja (50Gy-UPCI: SCC029B 70Gy-UPCI: SCC029B) vanhempien solujen (UPCI: SCC029B) sekä vähentämällä spektrit 50Gy-UPCI: SCC029B alkaen 70Gy-UPCI : SCC029B solut.

tilastollinen analyysi

Data analysoitiin tilastollisesti Yksisuuntainen ANOVA ja Studentin t-testiä, käyttäen Graph Pad Prism 5 (versio 5.01). P-arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen analyysi käytettiin Raman käsittelyä kuvataan kyseisillä osassa.

Tulokset ja keskustelu

a) kehittäminen ja validointi säteilyresistenteille alilinjat

sädehoito protokollat ​​suun syöpä hoito koostuu yhteensä 50Gy jotta 70Gy säteilyannoksen vide pienellä annoksella fraktioitua säteilyä 2Gy. Näin ollen, kaksi säteilyresistenteille alalinjoja eli 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B vahvistettiin yhteensä 25 ja 35 fraktiot 2Gy vastaavasti ajan 5-6 kuukautta. Säteilyresistenteille luonne alilinjat osoitettiin klonogeeniset solujen eloonjäämisen määritys. Olemme havainneet merkittävää kasvua solusäilyvyyden molemmat säteilyresistenteille alilinjat verrattuna sen vanhempien solulinjassa klonogeeniset määritys [Kuva-1 (A)]. D0 annoksia vanhempien, 50Gy ja 70Gy alilinja laskettiin ja todettu 4.5Gy, 5.1Gy ja 5.6Gy vastaavasti. Nostamalla D0 arvon säteilyresistenteille alilinjat sen emosolulinjassa osoittaa saavuttamansa radioresistance luonnetta. Olemme myös päättäneet tila tunnetaan säteilyresistenteille ja anti-apoptoottisen proteiinin markkereita, kuten Bcl-2 (B-solulymfooma-2), Mcl-1 (myeloidisolun leukemia-1), surviviinia Cox-2 (COX-2) Western-blottauksella. Kuten kuviossa 1 (B) tasojen nousu näiden proteiinien havaittiin säteilyresistenteille alalinjoja (paitsi Mcl-1 50Gy-UPCI: SCC029B) verrattuna emosolulinjassa. Mcl-1 tasojen välissä 50Gy-UPCI: SCC029B alalinja oli vaikka vertailukelpoisia (densitometria-analyysi, kuvio 1 B, alempi) kuin emosolulinjassa ja sen havaittiin olevan edelleen merkittävästi voimistunut on säteilyresistenteille 70Gy: UPCI-SCC029B alalinja . On huomionarvoista, että Mcl-1 on lyhyt puoliintumisaika johtuen sen nopeasta liikevaihdostaan ​​ubikinaa- [45] ja vaikka Mcl-1 solujen vakautta vastaan ​​eri stressitekijöitä on tutkittu, mutta vähän tiedetään sen sääntelymekanismiin vuoksi sädehoitoa. Tuloksemme mahdollisesti merkitsee, että reitit mukaan lukien Bcl-2, Surviviinispesifisiä ja Cox-2 voi myötävaikuttaa lisääntyneeseen selviytymisen säteilyresistenteille solujen alkuvaiheessa hankittu radioresistance kehitystä ja Mcl-1 voi olla oma roolinsa myöhemmässä vaiheessa. Lisäksi, kuten edellä on klonogeenisten solujen eloonjääminen määrityksessä 50Gy-UPCI: SCC029B solut ostettiin radioresistance luonne ja korkeampi muiden radioresistance liittyvien proteiinien verrattuna emo-soluihin. Näin ollen, kehittäminen radioresistance on monimutkainen ilmiö, jota ei voida yhdistää yhteen merkkiin tai proteiinin solun sisällä. Merkittävä kasvu ilmentymistä näiden merkkiaineiden vahvistavat aikaisempien tutkimusten kanssa, mukaan lukien meidän laboratorion heidän yhdessä radioresistance suun okasolusyöpää [13], [18] – [20], [46] – [47].

b) Morfologiset karakterisointi säteilyresistenteille alilinjat

Olemme havainneet muuttunut morfologia säteilyresistenteille alilinjat verrattuna sen emosolulinjassa. 50Gy-UPCI: SCC029B solut osoittivat karan muotoinen morfologia, kun taas 70Gy-UPCI: SCC029B solujen havaittiin olevan pitkänomaisen ja muodoltaan epäsäännöllinen [Kuva 2 (A)]. Vahvistuksen Näiden morfologisten ominaisuuksien säteilyresistenteille alilinjat ehkä aavistuksen kohti muuttaneet liittyvä ominaisuus migraation ja invaasion. Edelleen, saadakseen käsityksen niiden aktiini uudelleenjärjestely; olemme suorittaneet rihmamaisia ​​Actin (F-Actin) värjäytymisen vanhempien, 50Gy ja 70Gy UPCI: SCC029B soluja. F-aktiini värjäys osoitti merkittävää kasvua [kuvio 2 (B)] määrä filopodia in 50Gy (p 0,01) ja 70Gy-UPCI: SCC029B (p 0,001) soluja verrattuna vanhempien UPCI: SCC029B soluja. Morfologiset muutokset näytteille säteilyresistenteille solut voivat olla ylimääräinen fenotyyppi hankittu johtuu jatkuvasta fraktioitua sädehoitoa.

c) ramanspektroskopia lapsen ja säteilyresistenteille alilinjat

Keskimääräinen normalisoitu spektrien vanhempien UPCI : SCC029B solulinja säteilyresistenteille 50Gy ja 70Gy-UPCI: SCC029B alilinjat laskettiin ja kuviossa-3. Keskimääräinen spektri on käytetty edustavan spektrin vastaavien solulinjojen spektrianalyysi. Kuten, kuvassa-3, spektrin ominaisuudet hallitsivat nauhat noin 1008 (fenyylialaniinin), 1270 (amidi III), 1450 (δ CH

2) ja 1660 (amidi I) cm

-1 ja saattaa johtua solun proteiineihin. Katsovat, nauhat 1310 (CH

3 /CH

2) vääntyminen tai taipu- rasva), 1340 (rengasrakenne adeniinin) ja 1378 cm

-1 (rengas hengitys liikennemuotojen nukleiinihapon) ehdottaa läsnäolo solun nukleiinihapon ja lipidejä. Keskimääräinen spektrien 50Gy-UPCI: SCC029B soluja [kuvio-3 (B)] osoitti siirtää noin 1310, 1450 ja 1660 cm

1; vaikka näkyvä huippu havaittiin 1550 cm

-1 (tryptofaani). Vastaavasti keskimääräinen spektrit säteilyresistenteille 70Gy-UPCI: SCC029B solut [Kuva-3 (C)] intensiteetti liittyvät vaihtelut 1270, 1310, 1340 ja 1660 cm

-1 taas siirtyminen 1450 cm

-1 was havaittu. Siten voidaan havaita, että yleisiä eroja muodossa muutoksia Raman bändejä ja intensiteetti vaihtelut havaittiin keskimäärin spektrit sekä 50Gy ja 70Gy ryhmiä.

Jotta tuoda esiin spektrin eroja ryhmien; ero spektrit laskettiin keskiarvo spektrit. Ero spektri tarjota entistä selkeä kuvitus eroja ryhmien. Kuten on esitetty kuviossa-4, ero spektrit laskettiin varten 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B solut vähentämällä niiden vanhempien UPCI: SCC029B soluja [kuvio 4 (A, B)], ja näiden kahden säteilyresistenteille solut [Kuva-4 (C)]. Ero spektri (50Gy – vanhempien) näytteillä positiivinen piikit kohdilla 1008, 1340, 1378, 1450, 1550, 1664 cm

-1 ja negatiivinen piikit 1240 ja 1310 cm

-1; mikä viittaa muutoksiin proteiinien ja nukleiinihappojen, johtuen mahdollisesti muuttunut soluun signa- aiheuttama säteilytys [48]. Huomattava muutos 1550 cm

-1 50Gy soluihin on merkki vapaasti käytettävissä tryptofaanin mahdollisesti seurauksena proteiinin taitto /väärinlaskostumista aktivoitujen chaperones aiheutuu säteilystä stressistä. Samoin ero spektri (70Gy – vanhempien) positiiviset piikit havaittiin 1340 ja 1378 cm

-1, joka liittyy DNA, kun taas negatiivinen huippu havaittiin 1240, 1450 ja 1650 cm

-1 liittyy proteiinien muutos.

Kuten alla klonogeeniset määrityksen, sekä 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B solut ovat saaneet säteilyresistenteille hahmo verrattuna vanhempien soluihin. Lisäksi, 70Gy solut ovat suhteellisesti säteilyresistenteille kuin 50Gy soluja ja niillä on selvä ero spektrit, mikä voi johtua eri ominaisuuksia hankittu niitä. Lisäksi (50Gy-70Gy) erotus spektri positiivisia piikit 1008, 1450, 1550 ja 1664 cm

-1 kaikki liittyvät proteiineihin, kun DNA liittyvä negatiivinen huippu havaittiin 1378 cm

-1. Läsnäolo näkyvästi positiivisia tryptofaanin piikin (1550cm

-1) in 50Gy säteilyresistenteille alilinja vihje kohti rikastetun tryptofaania osat, jotka voivat olla anti-oksidatiivisen ominaisuus koska indolic ryhmään, joka toimii vetyradikaali lahjoittaja [49]. Koska ionisoiva säteily voi aiheuttaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto, joka voi aiheuttaa endogeeninen hyökkäys deoxyribosyl selkäranka DNA [50], [51]. Vaikutusten lieventämiseksi ROS, solujen on useita antioksidantti tekijöitä, jotka voivat kaivella ROS ja suojaavat säteilyltä [52]. Erillinen tryptofaanitähde huippu 50Gy säteilyresistenteille soluissa saattaa korreloida sellaisista tekijöistä, jotka ovat runsaasti näitä jäämiä tyypit joka suojaa solun oksidatiivista stressiä vastaan. Säätely Näiden tekijöiden on myös raportoitu yhteydessä radioresistance [53] – [55]. Lisäksi kirjattiin spektri voi johtaa keskimäärin ja edustava spektrin tietyn solulinjan, joka heijastaa yleistä tietoa solun tila; koska solussa pelletti, kosketustoimintoa säde kohtaa pino solujen ja hajaantumista voidaan odottaa eri soluelimiin kuten tuma, mitokondrioiden ja muiden solun osiin.

d) monimuuttujamenetelmin

Kuten edellä mainittiin PCA käytettiin tutkimaan mahdollisuutta luokittelun keskuudessa säteilyresistenteille 50Gy ja 70Gy alilinjat alkaen emosolulinjassa. PCA on usein käytetty menetelmä tiedon pakkaus ja visualisointi tarkkailla kuviota data. Se on matemaattinen analyysi, jolla ominaisuuksia koko data joukko tuhansia pisteitä ratkaistaan ​​osaksi muutamia merkittäviä ominaisvektorit, jotka voivat ilmaista koko datajoukon kanssa pistemäärät kullekin spektrin. Tämä voi tarjota välttämätöntä vihjeitä biokemiallisia vaihteluita eri ryhmien, meidän tapauksessamme eri luokkiin makromolekyylien. Edelleen profiilit pääkomponentit tunnetaan myös tekijä kuormitukset voivat tarjota elintärkeitä vihjeitä biokemiallisia vaihteluita eri luokissa. Lastaus tekijät 1, 2 ja 3, jotka johtavat rajauksen ryhmissä on esitetty kuvassa-5 (A). Standardin spektrin vaihtelevuus ehdottivat ero spektri; lastaus tontteja osoittavat myös eroja DNA-sisällöltään, aminohappoja ja proteiiniprofiileja vanhempien ja säteilyresistenteille ryhmiä. Visuaalista syrjintä, arvioimme jokaisen spektrin vastaperustetun koordinoida tila valituissa tietokoneissa. Ensin kolme merkittävää erotteleva PC valittiin kolmiulotteinen visualisointi. Kolme klusterit kuuluvat vanhempien UPCI: SCC029B solut ja säteilyresistenteille 50Gy- UPCI: SCC029B, 70Gy-UPCI: SCC029B solut havaittiin [Kuva-5 (B)]. Vaikka 50Gy-UPCI: SCC029B solut muodostivat erillisen klusterin mutta vähäisessä määrin samat klusterit 70Gy-UPCI: SCC029B ja vanhempien soluja havaittiin. Nämä kuvio klustereiden saattaa johtua yleisestä eri biokemialliset profiilin hankkiman solutyyppejä. Kun otetaan että PCA paljastavat yleisen muutoksen mukaan lukien solujen eri profiileja, se osoittaa, että säteilyresistenteille solut ovat hankkineet muuttuneessa molekyyliprofiilin poikkeaa vanhempien solujen hiuksenhieno vaihteluita.

Johtopäätös

Tässä työssä olemme laatineet säteilyresistenteille alilinjat päässä vanhempien suun suun limakalvolta solulinjaan käyttämällä kliinisesti tutkittavaksi fraktioitua säteilyannos. Hankittu kestävä luonne määritettiin standardin klonogeeniset solujen selviytymistä määrityksessä. 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B perustettu säteilyresistenteille alilinjat todettiin olevan enemmän säteilyresistenteille verrattuna sen vanhempien UPCI: SCC029B solulinjassa. Alalinjoja sävytti arvioimalla ilmentyminen radioresistance liittyvien proteiinimarkkereita kuten Mcl-1, Bcl-2, Cox-2 ja Surviviinispesifisiä tukevia hankittu säteilyresistenteille fenotyyppi. Altered morfologiset ominaisuudet todettiin nämä pitkän aikavälin säteilytettyjä soluja, jotka olivat erilaisia ​​kuin vanhempien soluista, mukaan lukien merkittävä kasvu filopodia numerot 50Gy-UPCI: SCC029B solut ja 70Gy-UPCI: SCC029B säteilyresistenteille soluja. Edelleen, Ramanspektroskopia suoritettiin seuraavilla säteilyresistenteille soluissa ja vanhempien soluja tutkia niiden ero spektrin profiili. Tämä tutkimus on ensimmäinen laatuaan suhteen hyödyllisyyttä RS luonnehdinta hankittujen säteilyresistenteille alilinjat. Havaitut ero spektrit emo ja molemmat säteilyresistenteille solut majorly muutosten vuoksi DNA, lipidien ja proteiinien profiilia soluja. Muutoksia DNA sisällöstä solujen voi johtua lukuisista geneettisen solvausten esiintyvät läpi useita murto säteilyn FIR ja muutos lipidien voi olla johtuu pääasiassa muuttuneen morfologian näiden solujen kuten yllä. Monimuuttuja-analyysi käyttämällä PCA osoitti, että säteilyresistenteille 50Gy-UPCI: SCC029B ja 70Gy-UPCI: SCC029B solut voidaan luokitella sen vanhempien UPCI: SCC029B soluja. Yhdessä tulokset työmme ovat varsin lupaavia ja ehdottaa mahdollisuuksia RS mahdollisena ei-invasiivisia väline suun syöpäpotilaiden ennustettaessa säteilyn vaste spektrin markkereita. Se voi parantaa potilaan eloonjäämisluvuissa nojalla optisten diagnoosi luokitella ne säteilylle ja kestävä tyypit;