Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

proteiinityrosiinifosfataasi reseptorin tyypin D (PTPRD ) on otaksuttu tuumorisuppressoriproteiinia useissa syövissä kuten pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC). STAT3 on usein hyperactivated onkogeenin HNSCC. Koska STAT3 on suora substraatti PTPRD, pyrimme määrittämään geneettisiä tai epigeneettiset korjauksilla

PTPRD

jotka edistävät yliaktiivinen STST3 vuonna HNSCC.

Methods

Analysoimme tiedot The Cancer Genome Atlas (TCGA) ja edellisessä koko-exome sekvensointi tutkimus ja tiivistää mutaatio, metylaatio, ja kopioi määrä tila

PTPRD

vuonna HNSCC ja muita syöpiä.

In vitro

tutkimuksissa mukana standardin transfektion ja MTT protokollia sekä metylaatiospesifistä PCR.

Tulokset

havainnot osoittavat, että

PTPRD

mutaatio, sen sijaan, metylaatio tai kopioluvun muutos, on ensisijainen mekanismi, jolla PTPRD toiminto menetetään HNSCC. Osoitamme, että yli-ilmentyminen villin tyypin PTPRD in HNSCC soluissa estää merkittävästi kasvua ja STAT3 aktivointi, kun PTPRD mutantit eivät viittaa siihen, että mutaatio voi johtaa toiminnan menetykseen ja sen jälkeen hyper-fosforylaatioon PTPRD substraattien, erityisesti STAT3. Mikä tärkeintä, olemme päättäneet, että HNSCC -solut sisäsyntyinen

PTPRD

mutaatio ovat herkempiä STST3 saarto kuin

PTPRD

villityypin soluista. Olemme lisäksi havainneet, että

PTPRD

mRNA ilmaisu ei korreloi pSTAT3 ilme, mikä viittaa siihen, että muutokset, jotka ilmenevät läpi muuttunut mRNA ilmaisun, kuten hypermetylaation ja geenikopiomäärä muutoksia, eivät merkittävästi lisää STST3 yliaktivoituminen sisään HNSCC.

Johtopäätös

PTPRD

mutaatio, mutta ei metylaatio tai kopioida numeron menetys, voi toimia ennakoivaa biomarkkeri herkkyys STST3 estäjien HNSCC.

Citation: Peyser ND, Du Y, Li H, Lui V, Xiao X, Chan TA, et ai. (2015) Loss-of-toiminto

PTPRD

Mutaatiot johtaa lisääntyneeseen STST3 Aktivointi ja herkkyys STST3 esto pään ja kaulan syöpä. PLoS ONE 10 (8): e0135750. doi: 10,1371 /journal.pone.0135750

Editor: Qian Tao, Kiinan University of Hong Kong, HONGKONG

vastaanotettu: 26 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 25 heinäkuu 2015; Julkaistu: 12 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Peyser et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Genomisen ja proteomiikka tiedot ovat saatavissa The Cancer Genome Atlas (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm) ja The Cancer Proteome Atlas (https://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design /basic/index.html).

rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health (www.nih.gov) rahoitus P50CA097190 ja R01CA77308 on JRG, ja F31DE024007 että NDP, American Cancer Society (www .cancer.org) ja JRG, Kiina Scholarship neuvosto (https://en.csc.edu.cn) ja YD, ja General Research Fund päässä Research Grant neuvoston Hong Kong (http: //www.ugc. edu.hk/) 17114814 ja Seed perustutkimusrahoituksensa VL.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

proteiinityrosiinifosfataasi -reseptorin tyypin D (PTPRD) on jäsen reseptori-tyypin proteiinityrosiinifosfataasin (PTPR) perhe. PTPRs ovat kalvoon kiinteä entsyymejä, jotka katalysoivat poisto fosfaatin ryhmien spesifiset proteiinit, ja siten vaikuttaa solun signalointiin. Häiriöstä PTPR signalointi geneettisillä ja /tai epigeneettisiä mekanismit voivat siis lopulta johtaa syöpä fenotyypit. [1] Useat PTPR perheenjäsenten, mukaan lukien PTPRD, on raportoitu toimivan tuumorisuppressoreilla jossa toiminnan menetys muutokset voivat ajaa kasvaimen kasvua. [2,3] Geneettiset tapahtumia kuten mutaatio, geenideleetio- tai epigeneettiset hiljentäminen saattaa heikentää fosfataasiaktiivisuutta PTPRs ja tehostetun onkogeenisten signalointi. [1]

Olemme hiljattain raportoitu kumulatiivinen mutaatio profiilia

PTPR

geeniperheen syövän keskittyen

PTPRT

mutaatio johtaa STST3 aktivaation pään ja niskan levy- cell carcinoma (HNSCC). [4] Analyysi paljasti, että 15 kiinteän kasvaimen eri tunsivat mutaatioita vähintään yhden

PTPR

geenin.

PTPRD

on yksi yleisimmin mutatoitu

PTPR

perheenjäseniä HNSCC, ja PTPRD on raportoitu toimivan tuumorisuppressorina tässä maligniteetti. [5]

PTPRD

myös mutatoitunut, poistettu tai hyper-metyloitu glioblastoma (GBM), kun geeni on metyloitumaton ja ilmentyy normaaleissa aivokudoksessa. [6] Lisäksi,

PTPRD

mutaatioita havaittiin liittyvän lisääntyneen ilmentymisen fosforyloitua STAT3, suora PTPRD substraatti, GBM. Lisäksi GBM, 13% ja 25% HNSCC kasvaimia analysoitiin edellä mainitussa tutkimuksessa kanna

PTPRD

mutaation tai promoottorin metylaation, vastaavasti. Homotsygoottinen deleetio

PTPRD

on lisäksi todettu kurkunpään syöpä, mikä viittaa siihen, että geneettinen poikkeavuuksia, jotka vaikuttavat PTPRD toiminto voi olla yhteinen tapahtuma monilla syöpiä. [5]

Nämä kumulatiiviset havainnot saivat meidät oletuksen, että geneettinen ja /tai epigeneettiset muuttaminen

PTPRD

saattaa osaltaan parantaa signalointi ja kasvu HNSCC jossa avaintekijät reitti voi olla uskottavalta terapeuttisia kohteita. Täällä yhteenveto geneettiset ja epigeneettiset profiilia

PTPRD

vuonna HNSCC The Cancer Genome Atlas (TCGA) ja meidän ennen HNSCC mutaatiostatuksesta maisema tutkimus. [7] Sitten testataan seuraukset

PTPRD

muutoksia löydetty ihmisen HNSCC kasvaimia asiaan prekliinisissä arvioida STST3 toimintaa ja herkkyyttä STST3 eston.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, lääkehoitoa, ja transfektio

Kaikki HNSCC solulinjat genotyyppisesti vahvistettu, kuten edellä on kuvattu. [4] Cal27-solut saatiin ATCC: stä (Manassas, VA). PE /CA-PJ34clone12 ja PE /CA-PJ49 solut saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 686LN solut saatiin Georgia Chen MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). Cal27-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Mediatech, Inc., Manassas, VA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA). 686LN-soluja viljeltiin DMEM /F12 (Life Technologies, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. PE /CA-PJ34clone12 ja PE /CA-PJ49 viljeltiin Iscoven muuttaminen DMEM (Mediatech Inc., Manassas, VA), johon oli lisätty 10% FBS: ää ja 2 mM L-glutamiinia (Life Technologies, Grand Island, NY). Kaikki Soluja pidettiin inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. JSI-124 (Calbiochem, Billerica, MA) liuotettiin DMSO: hon. Transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY) tai FuGENE HD (Promega Corporation, Madison, WI) mukaan valmistajan ohjeiden kanssa 4 ug DNA: ta laimennettuna Opti-MEM (Life Technologies, Grand Island, NY).

mutageneesi

PTPRD

mutaatioita (K1502M, S384R, T1100M ja L1147F) muodostettiin villityypin plasmidi käyttäen Phusion kohdennetun mutageneesin kittiä ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) seuraten valmistajan protokollaa ja varmistettiin Sangerin sekvensoinnilla. Plasmidi monistukset suoritettiin käyttäen QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) tai Hurricane Maxi Prep Kit (GerardBIOTECH, Oxford, OH) mukaan valmistajan ohjeiden.

Immunoblottausmääritys

Ensisijainen vasta-aineita pSTAT3 (Y705) ja STAT3 saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). p-tubuliinia primaarinen vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge, MA). Toissijainen vasta-aineet hankittiin yhtiöltä BioRad (Hercules, CA). Blotit kvantitoitiin densitometrisesti käyttämällä ImageJ ohjelmistoa.

MTT-määritystä

MTT-määritykset suoritettiin inkuboimalla soluja 5 mg /ml 3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2 , 5 difenyylitetratsoliumbromidi PBS: ssä 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Inkuboinnin jälkeen liuos imettiin ja korvattiin DMSO: lla. Tämän liuoksen absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä spektrofotometrillä.

Metylaatiospesifinen PCR

kasvain ja normaali kudos saatiin alaisuudessa Institutional Review Board-hyväksytty protokolla yliopistossa Pittsburgh. DNA eristettiin formaliiniin parafiiniin upotettu kudokseen käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, ja solulinja DNA eristetään käyttäen QIAamp DNA Mini Kit. Bisulfiittikonversion suoritettiin käyttäen EpiTect bisulfiitti Kit ja metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio (MSP) suoritettiin käyttäen EpiTect MSP Kit. Kaikki sarjat käytettiin mukaan valmistajan ohjeiden (Qiagen, Hilden, Saksa). MSP-alukkeet suunniteltiin käyttäen MethPrimer ohjelmistoa. [8] metylaatio, eteenpäin ja taaksepäin-aluketta sekvenssien olivat GTTTTATTTTGGATTTTTGGAATC ja TACCTAACGCGACCTAAACG, vastaavasti. Varten unmethylation, eteenpäin ja taaksepäin-aluketta sekvenssien olivat TATTTTGGATTTTTGGAATTGT ja AACTACCTAACACAACCTAAACAAA, vastaavasti. Alukkeet spesifisiä aiottua metylaatiostatus määritettynä käyttäen EpiTect Ohjaus DNA Set (Qiagen, Hilden, Saksa).

Data lataa ja analysointi

mutaatio, kopioluvun muutos, ja RNA-Seq tietoja yhteen päässä cBio portaalin [9,10] ja julkaistu raportteja. [6,7,9] DNA: n metylaatio tiedot saatiin läpi TCGA data matriisi (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). DNA ja proteiinisekvenssien ja verkkotunnuksen merkinnät saatiin National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Käänteisfaasi proteiinijärjestelmäksi tiedot saatiin Syövän Proteome Atlas (https://app1.bioinformatics.mdanderson.org/tcpa/_design/basic/index.html). Tilastolliset testit suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 5-ohjelmisto (GraphPad, La Jolla, CA).

trypaanisiniekskluusiolla

PE /CA-PJ34clone12 solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille 100000 solua hyvin. 24 tunnin kuluttua solut transfektoitiin vektorilla, ohjaus, villityypin PTPRD tai PTPRD mutantteja kolmena kappaleena käyttäen 4 ug plasmidi-DNA, 12 ui FuGENE HD (Promega Corporation, Madison, WI), ja 200 ui Opti-MEM (Life Technologies , Grand Island, NY) kuoppaa kohti lisättiin suoraan kuoppiin, jotka sisältävät 3 ml täydelliseen alustaan. 72 tunnin jälkeen solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 0,2% trypaanisinisellä (MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA). Kukin solususpensio laskettiin neljällä kentät hemasytometriä ja keskimääräinen käytettiin laskea koko olevien solujen lukumäärää.

Tulokset

PTPRD mutaatioita esiintyy usein HNSCC ja muiden syöpien

Somaattiset mutaatiot on yhteinen tapahtuma johtaa muuttunut geeni ja proteiinien toiminnan syövässä. Kahdeksantoista kuin synonyymi

PTPRD

mutaatioita on tunnistettu tähän mennessä HNSCC kasvaimia. [6,7,9,10] Nämä mutaatiot näyttävät hajallaan geenin ja proteiinisekvenssin. (Kuvio 1A) Ne ovat kaikki ei-toistuvat, jossa kukin esiintyy yhdessä HNSCC kasvain, mikä viittaa siihen, että nämä ovat todennäköisesti menettämisestä toiminnon mutaatioita. Näiden 18 mutaatioita, 12 esiintyy solunulkoinen domeeni, 1 paikantuu katalyyttisen domeenin, ja 5 ovat transmembraaninen alue, jossa ei konservoitunut domeeni on tunnistettu. Lisäksi HNSCC,

PTPRD

mutaatiot ovat myös laajalti havaittu muissa syöpätyyppeihin. (Kuvio 1 B) In Cancer Genome Atlas (TCGA) keruu,

PTPRD

on useimmin mutatoitunut ihomelanooma (59/344 tapauksissa 17,2%), jonka jälkeen keuhkojen adenokarsinooma (33/230 tapauksissa 14,3% ), ja mahan adenokarsinooma (30/289 tapauksissa 10,4%). [9,10] Kuten HNSCC,

PTPRD

mutaatiot näiden syöpien eivät näytä klusterin osaksi hotspot alueiden tai jäämiä, mikä viittaa siihen, että menetys PTPRD toiminnon somaattinen mutaatio on tavallinen tapahtuma useiden syöpä sivustoja.

(A) lokalisaatio PTPRD proteiinin mutaatioiden raportoitu HNSCC kasvaimia. Red: TCGA kasvaimissa [9,10]; Green: alkaen [6]; Blue: [7]. IG, immunoglobuliini; IG2, toinen immunoglobuliinin (Ig) kaltainen domeeni ja reseptorin proteiinityrosiinifosfataasin (RPTP) -F; FN3, fibronektiinin tyyppi 3 domain; PTPc, proteiinityrosiinifosfataasi, katalyyttinen domeeni. (B) tiheys

PTPRD

mutaatioita ihmisen syöpien määritettynä TCGA, jossa HNSCC näkyy punaisella.

Ainoa mutaatio havaitaan HNSCC joka on aiemmin tunnistettu toisessa syöpä on T1100M, joka ilmoitettiin krooninen lymfaattinen leukemia. [11] On mielenkiintoista, useita muita mutaatiokohtia löytyy HNSCC on eri aminohapposubstituution raportoitu muissa syövissä. Esimerkiksi, kun K204E havaitaan HNSCC, K204Q on raportoitu ruokatorven syöpä. [12] Lisäksi tarkistamaan COSMIC-tietokannan (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/) osoittaa havaitseminen L503V maksasyöpää (verrattuna L503I vuonna HNSCC) ja L1036M paksusuolen adenokarsinooma (verrattuna L1036P in HNSCC). Ding

et al

lisäksi raportoitu mutaation sivustosta (L1036Q) keuhkojen adenokarsinoomaa. [13] On mielenkiintoista, kun K1502M on ainoa katalyyttinen domeeni mutaatio tunnistettiin tasalla HNSCC, TCGA on havainnut K1502 * nonsense-mutaation keuhkoadenokarsinooma. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että vaikka tietty

PTPRD

mutaatioita havaittiin mennessä HNSCC ovat ainutlaatuisia, aminohappo alueista, joilla ne esiintyvät voivat edustaa tärkeitä jäämiä, jotka ovat alttiita geneettisiä muutoksia. Itse asiassa, useita sekvenssin rinnastus analyysi osoittaa, että nämä jäännökset ovat hyvin konservoituneita lajien välillä, mikä viittaa siihen, niillä voi olla kriittinen rooli asianmukaisen PTPRD toiminto (analyysi ei esitetty).

HNSCC johdettu PTPRD mutanttien johtaa lisääntyneeseen solun kasvua

PTPRD on raportoitu toimivat tuumorisuppressorina ihmisen syövässä. [3,5,6] Sen määrittämiseksi, toiminnalliset seuraukset

PTPRD

mutaatio HNSCC, muodostimme useita edustavia HNSCC johdettu PTPRD mutanttien kohdennetulla mutageneesillä, joista yksi mutaatio solunulkoisen domeenin (S384R), yksi katalyyttinen domeeni (K1502M), ja kaksi läpäisevä alue (T1100M ja L1147F). Ohimenevä yliekspressio Näiden rakenteiden on HNSCC solulinja, jossa ei ole endogeenistä

PTPR

perheen mutaatioita (PE /CA-PJ34clone12) paljasti, että kaikki PTPRD mutantit testattiin lisäsi kasvua määritettynä MTT-määrityksellä verrattuna PTPRD villi tyyppinen-transfektoiduissa soluissa. (Kuvio 2A) MTT-määritystä tulokset vahvistettiin edelleen edustavien mutanttien trypaanisiniekskluusiolla määritys PE /CA-PJ34clone12-soluissa (kuvio 2B). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että

PTPRD

mutaatioita inaktivoimiseksi tuumoria tukahduttavan funktio PTPRD riippumatta niiden sijaintia koko geenin, mikä johtaa kasvun lisääntymiseen /proliferaatiota HNSCC soluissa.

(A) Cell kasvu arvioitiin MTT: llä 48 tuntia transfektion jälkeen ja normalisoidaan vektori-transfektoitujen valvontaa. Yksisuuntainen ANOVA P = 0,0007. Kolikon P-arvot ovat tulosta pairwise kaksisuuntaisia ​​parittomia t testejä. Koe suoritettiin kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. (B) Solujen proliferaatio määritettiin trypaanisiniekskluusiolla määritys 72 tuntia transfektion jälkeen. Yksisuuntainen ANOVA P 0,0001. On kuvattu P-arvot ovat tulosta pareittain kaksisuuntaisia ​​parittomia t testejä.

PTPRD mutaatio liittyy lisääntynyt pSTAT3 ilmaisu

STAT3 on hyper-aktivoidaan konstitutiivinen fosforylaatio tyrosiinin 705 ( Y705) monissa syöpätyypeissä, mukaan lukien HNSCC. [14,15] Tärkeää on, pSTAT3 (Y705) on tunnettu suora substraatti PTPRD. [6] vaikutuksen määrittämiseksi on

PTPRD

mutaatio STST3 fosforylaatiota HNSCC, ensin tarkasteltiin 200 HNSCC kasvaimia sekä koko exome sekvensointi ja RPPA analyysit suorittaa TCGA ja The Cancer Proteome Atlas (TCPA). HNSCC kasvaimia ei-synonyymi

PTPRD

mutaatioita ilmaista huomattavasti korkeampi pSTAT3 (Y705) suhteessa kasvaimiin villityypin

PTPRD

(kuvio 3A). Erityisesti

PTPRD

on ainoa

PTPR

perheenjäsen, joille tämä korrelaatio havaitaan. Testata yhdistyksen välillä

PTPRD

mutaatio ja pSTAT3 ilmaisun suoraan, me transfektoimme HNSCC solulinjan, joiden tiedetään endogeenisen

PTPRD

mutaatio (Cal27 kätkeminen mutaatio S387L) villiin

PTPRD

tai vektorisäätö ja totesi, että yli-ilmentyminen villin tyypin PTPRD johtaa merkittävästi vähentynyt pSTAT3 lauseke (P ≤ 0,05). (Kuvio 3B ja 3C) Lisäksi yliekspressio mutantti PTPRD vuonna HNSCC soluja ilman endogeenistä

PTPR

perhe mutaatioita (PE /CA-PJ34clone12) lisäävästi pSTAT3 (Y705) lauseke suhteessa PTPRD villityypin yli-ilmentäviä soluja lähes kaikki mutaatioiden testattu. (Kuvio 3D ja 3E) Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että

PTPRD

mutaatio johtaa lisääntyneeseen STAT3 signalointi HNSCC soluissa ja kasvaimia.

(A) HNSCC kasvaimia kätkeminen

PTPRD

mutaatiot ilmaista lisääntynyt pSTAT3 (Y705) suhteessa

PTPRD

villityypin kasvaimia määritettynä koko exome sekvensointi ja käänteisfaasi-proteiini array (RPPA). Kaksisuuntainen parittomalla t-testillä. (B) yli-ilmentyminen villin tyypin PTPRD on

PTPRD

-mutant solulinja (Cal27) johtaa alentuneeseen pSTAT3 (Y705) lausekkeen (C) kvantitointi kolmeen rinnakkaiseen kokeita, kuten on esitetty B. kaksisuuntaisia ​​parittomia t-testi. (D)

PTPRD

-wild-tyypin HNSCC soluja (PE /CA-PJ34clone12) lyhytaikaisesti yli-ilmentävät mutantti PTPRD osoittavat kasvanut pSTAT3 (Y705) ilmentyminen verrattuna villityypin ilmentäviä soluja. (E) kvantitointi kolmeen rinnakkaiseen kokeiluja, kuten on esitetty D. kahden otoksen parittomalla t-testillä.

HNSCC solujen endogeenisen PTPRD mutaatio ovat herkempiä STST3 reitin esto

Koska

PTPRD

mutaatiot lisäävät STST3 aktivoinnin HNSCC, meidän vieressä pyrittiin määrittämään, jos

PTPRD

mutaatio johtaa lisääntyneeseen herkkyyteen STST3 reitin esto. Testata hypoteesia, käytimme HNSCC solut, jotka satama sisäsyntyinen

PTPRD

mutaatio (PE /CA-PJ49). Hoito JAK /STAT-inhibiittori JSI-124 revels että nämä

PTPRD

mutantti-soluilla parannetun herkkyyden suhteen

PTPR

perheen villityypin solujen (PE /CA-PJ34clone12), viittaa siihen, että

PTPRD

mutaatio voi toimia ennustavan biomarkkeri vastauksena STAT3-reitin inhibiittorit (kuvio 4).

Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla JSI-124: ssa 24 tuntia ja sen jälkeen MTT-määrityksellä. Koe suoritettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

PTPRD mRNA ilmaisu ei korreloi pSTAT3 ilme

Järjestäjä hypermetylaation ja geenikopiomäärä menetys edustaa kaksi ylimääräistä mekanismeja saattavat johtaa toimimasta

PTPRD

kautta downregulation mRNA ilmaisun. Tärkeää on,

PTPRD

mRNA ilmaisu ei korreloi pSTAT3 ilmaisua TCGA HNSCC näytteissä, mikä viittaa siihen, että metylaatio ja kopioluvun menetys ei merkittävästi lisää STST3 yliaktivoituminen vuonna HNSCC (S1A kuvio). Todellakin, tarkempi analyysi paljastaa, että vaikka

PTPRD

metylaatio ei korreloi mRNA: n ilmentymisen kuten voidaan odottaa mistään geeni (S1B kuvio), havaitsemme mitään korrelaatiota metylaatio ja pSTAT3 ilmaisun (S1C kuvio), eivätkä vietämme kaikkia tapauksia poikkeavan promoottorin hypermetylaatio (määritelty tässä metylaation aste on suurempi kuin kolme standardipoikkeamaa yli keskiarvon metyloinnin sama geneettinen lokus elinten-vastaaviin normaaleihin näytettä). Voidakseen vahvistaa nämä havainnot, suoritimme metylaatiospesifistä PCR riippumattomaan kohortti HNSCC kasvaimia ja löytänyt todisteita

PTPRD

promoottori metylaation 75% kasvaimista analysoitu (30/40) (edustaja analyysi S2 kuvassa ). Mikä tärkeintä, me myös havaittu

PTPRD

promoottori metylaatio viidessä pariksi normaalissa suun limakalvon näytteitä näistä HNSCC potilaista (S3 kuvassa), lisäksi viittaa siihen, että

PTPRD

metylaatio havaittu HNSCC ei kasvain-specific .

PTPRD

kopioluvun muutoksia esiintyy merkittävässä määrin HNSCC ja muiden syöpien (kuvio 5A), jossa geeni kopio menetys, varsinkin heterotsygoottinen menetys, esiintyy useammin kuin voitto HNSCC ja kaikki syövät analysoitiin lukuun ottamatta peräsuolen ja kohdunkaulan syöpiä. Tärkeää on, emme havaita merkittävä korrelaatio kopioluvun muutoksia ja mRNA: n ekspression HNSCC (kuvio 5B). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että promoottori hypermetylaation ja geenikopiomäärä menetys ei merkittävästi lisää STST3 yliaktivoituminen vuonna HNSCC.

(A) Kopioi numero muuttaminen

PTPRD

ihmisen syövissä määritettynä TCGA . (B)

PTPRD c

opioi numero muutokset eivät korreloi muuttunut

PTPRD

mRNA ilmaisun HNSCC. Jonckheere-Terpstra testi suoritettiin käyttäen StatXact ohjelmistoa (Cytel, Cambridge, MA).

Keskustelu

STAT3 on onkogeeni, joka on hyper-aktivoitu moniin syöpiin, mukaan lukien HNSCC, jossa STAT3 hyper-aktivaatio liittyy vähentynyt selviytymisen ja uutena vastustuskykyä EGFR-täsmähoitoihin. [9,16,17] Mahdollisia mekanismeja, jotka voivat johtaa lisääntyneeseen STST3 aktivointi syövän ovat lisääntynyt signalointi kautta ylävirtaan reseptorin tai ei-reseptorityrosiinikinaaseilla kuten EGFR ja JAK ja /tai inaktivaation alipaineensäätöventtiileillä of STAT3, mukaan lukien proteiini tyrosiinifosfataasien . [18,19] Me raportoi äskettäin, että reseptori-tyypin proteiinityrosiinifosfataasin (PTPR) perhe on usein mutatoitunut HNSCC ja muiden syöpien ja osoittivat, että HNSCC johdettujen mutaatioiden PTPRT aiheuttaa STAT3 fosforylaatiota ja aja HNSCC solujen eloonjäämistä. [4] Kuten PTPRD edustaa lisäreseptori kaltainen fosfataasi suoraan kohdistuu STAT3, etsimme onko geneettinen tai epigeneettiset menetys PTPRD toiminto voi myötävaikuttaa STST3 yliaktivoituminen vuonna HNSCC.

Tässä tutkimuksessa, ensin tunnistettu 18 aikaisemmin tuntemattomia

PTPRD

mutaatioita HNSCC kasvaimia. Nämä mutaatiot ovat kertaluonteisia ja sijaitsevat ympäri geeni, malli, joka on sopusoinnussa yleisesti havaittu tuumorisuppressorigeeneille. Olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen villin tyypin PTPRD johtaa kasvun hidastuminen on HNSCC soluissa, kun taas yli-ilmentyminen edustajan mutanttien ei, jolloin syntyy funktionaalista seurauksena

PTPRD

mutaatio HNSCC malleissa. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien

in vitro

tutkimuksissa useiden syöpätyyppejä, mukaan lukien glioblastooma, melanooma, peräsuolen syöpä, ja neuroblastooma, jossa villityypin PTPRD on havaittu tukahduttaa pesäkkeiden muodostumisen ja solujen kasvua sekä kuten parantaa apoptoosin, kun taas syöpä johdettu PTPRD mutantit eivät. [3,6,20] Nämä kumulatiiviset havainnot viittaavat siihen, että

PTPRD

mutaatioita syövän johtaa menetykseen sen tuumoria tukahduttavan funktion.

Sen määrittämiseksi, jos

PTPRD

mutaatio vaikuttaa aktiivisuuteen STAT3, joka on PTPRD alustan, analysoimme TCGA ja TCPA tiedot ja todennut, että HNSCC kasvaimista

PTPRD

mutaatioita ilmaista selvästi kohonneet pSTAT3 (Y705) suhteessa

PTPRD

-wild-tyyppinen kasvaimia. Olemme aiemmin raportoitu samanlainen assosiaatio pSTAT3 (Y705) ilmentyminen ja mutaatio ryhmä oletetun

PTPR

tuumorisuppressorigeeneille, mukaan lukien

PTPRD

. [4] Kun kukin geeni pidetään yksittäin sijaan ryhmänä,

PTPRD

on ainoa

PTPR

perheenjäsen, jolle mutaatio liittyy merkittävästi pSTAT3 (Y705) lauseke (S4 kuvassa) . Tämä tulos viittaa siihen, että vaikka kasvainten määrä mutaation sisältävillä minkään yksittäisen

PTPR

perheenjäsen voi olla riittämätön havaita merkittävää eroa pSTAT3 (Y705) lauseke,

PTPRD

mutaatio erityisesti on liittyy yksilöllisesti lisääntyminen pSTAT3 (Y705), ilmentyminen, joka on riittävän suuri havaita tilastollista merkittävyyttä. Futhermore, yli-ilmentyminen villin tyypin PTPRD in HNSCC solulinjoissa kätkeminen endogeenisen

PTPRD

mutaatioita johtaa downregulation pSTAT3 (Y705), mikä vahvistaa, että PTPRD säätelee STAT3 aktivoinnin HNSCC malleissa. Kun taas villityypin PTPRD johtaa downregulation pSTAT3 (Y705) in HNSCC soluissa, yli-ilmentyminen useimmissa HNSCC johdettujen mutanttien ei muuta pSTAT3 (Y705) ekspressio suhteessa vektorisäätö, viittaa siihen, että nämä mutaatiot johtavat lakkaa toimimasta, mutta ei vallitsevaa negatiivista tavalla. Siinä tapauksessa, että L1147F mutaatio testattiin tässä, yli-ilmentymisen HNSCC soluissa johtaa lisääntyneeseen kasvuun, mutta ei lisääntynyt pSTAT3 (Y705) ilmentyminen (katso kuviot 2A ja 3D), mikä osoittaa, että tietyt mutaatiot voivat aiheuttaa syöpää fenotyyppejä on STAT3-riippumattomalla tavalla . Nämä mutaatiot voivat ilmetä kautta vaihtoehtoisen mekanismeja, jotka voivat sisältää solunulkoisen vuorovaikutuksen tai muuttaminen suhteellinen affiniteetti vaihtoehtoinen entsymaattista alustoille.

PTPRD

mutaatio johtaa lisääntyneeseen STST3 aktivoinnin HNSCC, me seuraavaksi testataan onko soluissa kätkeminen

PTPRD

mutaatio voi olla herkempiä STST3 reitin esto. Tässä me osoitamme, että HNSCC solujen endogeenisen

PTPRD

mutaation ovat herkempiä JAK /STAT-inhibiittori JSI-124 kuin HNSCC -solut ei

PTPR

perheen mutaatioita, mikä viittaa siihen, että HNSCC kasvainten

PTPRD

mutaatiot voivat olla erityisen herkkä STST3 estäjiä, jotka ovat tällä hetkellä prekliinisen ja kliinisen kehityksen. Jotta suunnitella optimaalinen hoito strategiaa HNSCC potilaalla on

PTPRD

mutaatioita, lisätutkimuksia ylimääräisiä PTPRD-vuorovaikutuksessa proteiineja, jotka voivat toimia terapeuttisina kohteina voi olla aiheellista. Erityisesti

PTPRD

mutaatio voi lisäksi antaa herkkyyttä Aurorakinaasi A-estäjät parhaillaan kliinisessä kehityksessä, jossa Aurorakinaasi fosforylaatio ja vakaus yleensä säädellään PTPRD. [3]

Toinen mekanismi, jonka

PTPRD

toiminta saattaa kadota kautta mRNA downregulation, mukaan lukien promoottori hypermetylaation tai geenikopiomäärä menetys. Ensinnäkin olemme päättäneet, että

PTPRD

mRNA ilmaisu ei korreloi pSTAT3 ilmaisun HNSCC, mikä viittaa siihen, että nämä mekanismit eivät todennäköisesti merkittävästi edistää STST3 yliaktivoituminen in HNSCC. On huomattava, että tämä analyysi voi mutkistaa useita tapauksia, joissa on vähän tai ei

PTPRD

mRNA: ta havaittiin. Itse asiassa, meidän yli-ilmentyminen tutkimukset HNSCC soluissa viittaa siihen, että ekspression PTPRD voidaan olettaa vaikuttavan pSTAT3 (Y705) ilmentyminen. Siitä huolimatta, tämä korrelaatio ei ole syntynyt HNSCC kasvaimissa tähän mennessä analysoitujen.

Tarkempi analyysi näistä mekanismeista ensi paljasti, että

PTPRD

promoottori ei hypermetyloitunut HNSCC suhteessa elimeen toisiaan normaali kudos, toteaminen me validoitu riippumattomalla kohortin HNSCC kasvain ja vastaaviin normaaleihin pareittain metylaatiospesifistä PCR. Erot nykyisen havaintoja ja aikaisemmat raportit

PTPRD

promoottori metylaation HNSCC johtuu todennäköisesti ennalta puute vertailussa kasvain ja normaali kudos. [6] Alhainen

PTPRD

promoottori metylaatio havaittiin HNSCC on lisäksi ei liity muuttuneeseen pSTAT3 (Y705) lauseke, edelleen viittaa siihen, että tämä tapahtuma ei merkittävästi edistää syövän fenotyypin HNSCC. Samanlainen puute poikkeavien

PTPRD

promoottori hypermetylaation on myös raportoitu ihon okasolusyöpä, mikä viittaa tämä voi olla melko harvinaisia ​​useita epiteelin pahanlaatuisia kasvaimia. [21]

analyysi TCGA tiedot osoittavat, että lähes puolet HNSCC kasvainten satama kopiomäärä muuttaminen

PTPRD

ja että kopioluvun menetys on useammin kuin kopiomäärä voitto HNSCC ja kaikkialla lähes kaikista syövistä analysoitiin.

PTPRD

homotsygoottinen tai heterotsygoottinen deleetio on myös raportoitu ihon okasolusyöpä [21,22], GBM [6,20,23,24], keuhkosyöpä [25,26], neuroblastooma [27], metastaattinen melanooma [28,29], okasolusyöpä häpy [30], maksasyövän [31], ja kurkunpään okasolusyöpä [5]. Mikä tärkeintä, ei merkittävää yhteyttä ei havaittu välillä

PTPRD

kopioluvun muutos ja

PTPRD

mRNA ilmaisun HNSCC, mikä viittaa siihen, että kopiomäärä menetys ei ole ensisijainen mekanismi menetys PTPRD funktion HNSCC.

Yhteenvetona olemme osoittaneet tässä, että somaattinen mutaatio

PTPRD

on ensisijainen mekanismi, jolla PTPRD toiminnan menetys tapahtuu HNSCC. Ehdotamme, että lähes kaikki nämä muutokset johtavat katalyyttisen aktiivisuuden menetystä ja siten vähentänyt defosforyloimalla alustan pSTAT3 (Y705). Vaikka promoottori metylaatio ja kopion numero menetys ovat havaittavissa

PTPRD

locus, nämä tapahtumat eivät liity säätelyä pSTAT3 (Y705) lauseke. Sen sijaan, somaattinen mutaatio

PTPRD

lisäävästi STST3 aktivaation HNSCC kasvaimia ja solulinjoissa, samanaikainen lisääntynyt solujen kasvuun ja herkkyyttä STST3 reitin esto. Nämä havainnot viittaavat siihen, että

PTPRD

mutaatio voi edustaa ennustavan biomarkkeri hieno vastaus STST3 täsmähoitoihin vuonna HNSCC.

tukeminen Information

S1 Kuva.

PTPRD

promoottori metylaatio korreloi

PTPRD

mRNA ilmaisun mutta ei korreloi pSTAT3 (Y705) ilmentyminen HNSCC.

(A)

PTPRD

mRNA ilmaisu ei ole merkitsevästi liittyvä pSTAT3 (Y705) lauseke. n = 172, Pearson r = 0,05157, P = 0,5017, R

2 = 0,002659. (B)

PTPRD

promoottori metylaatio korreloi

PTPRD

mRNA ilmaisun. n = 172, Pearson r = -0,5242, P 0,0001, R

2 = 0,2747. (C)

PTPRD

promoottori metylaatio ei merkittävästi liittynyt pSTAT3 (Y705) lauseke. n = 211, Pearson r = 0,0008795, P = 0,9899, ​​R

2 = 7.735e-007.

doi: 10,1371 /journal.pone.0135750.s001

(TIF)

S2 Kuva. MSP-analyysi edustavien HNSCC tuumorinäytteessä.

Metylointi havaittiin 30/40 (75%) HNSCC kasvaimet analysoitiin. M merkitsee alukkeita monistamiseen metyloidut sekvenssit, kun taas U merkitsee alukkeita monistamiseen metyloitumattomien sekvenssit.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0135750.s002

(TIF)

S3 Fig.

PTPRD

promoottori ei hyper-metyloitavaa HNSCC kasvaimissa verrattuna viereiseen normaaliin limakalvo.

Viisi HNSCC kasvaimia ja vastaaviin normaaleihin limakalvo samasta potilaista kerättiin ja analysoitiin MSP. M merkitsee alukkeita monistamiseen metyloidut sekvenssit, kun taas U merkitsee alukkeita monistamiseen metyloitumattomien sekvenssit.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0135750.s003

(TIF)

S4 Fig.

PTPRD

on ainoa perheenjäsen, jolle mutaatio liittyy pSTAT3 (Y705) ilmentyminen HNSCC.

Whole exome sekvensointi ja käänteisfaasi- proteiinijärjestelmäksi tietojen mukaan mikään muu

PTPR

perhe mutaatiot liittyvät merkittävästi pSTAT3 (Y705).