Krooninen sairaus

tiivistelmä

laajentaminen myelooisen-sukuperää leukosyyttejä kasvaimia omaavilla hiirillä on ehdotettu syyksi systeemisen immunosuppression . Osoitamme, että sädehoito kasvainten johtaa laskuun myeloidisolulinjassa numerot veressä ja lasku pernan koon. Taajuus myeloidisolujen ei laskee tasolle nähdään kasvaimettomina hiiret: me osoittavat, että etäpesäkkeitä voidaan estää myeloidisolun numerot palaamasta lähtötasolle, ja että kasvaimen uusiutumisen välillä jäljellä tauti korreloi Uudelleenpaisutus myeloidiset soluja. Sädehoito johtaa lisääntyneeseen T-solujen lisääntymiseen pernassa ja kun T-solujen vasteet vieraille antigeeneille ei ole muuta tuumorimassa tai luuytimen solujen kasvua, vasteet kasvaimeen liittyviä antigeenejä on lisääntynyt sädehoidon jälkeen. Nämä tiedot osoittavat, että myeloidisolun numerot liittyvät suoraan ensisijainen tuumorikuorma, että tämä populaatio jälkeen sopimuksia sädehoitoa, ja että sädehoito voivat avata terapeuttinen leveys immunoterapiaa jäljellä taudin.

Citation: Crittenden MR, Savage T, Cottam B, Bahjat KS, Redmond WL, Bambina S, et ai. (2013) Perifeerinen Myelooisen Expansion ajamana Hiiren syövän etenemisessä korjaantuu Sädehoito kasvain. PLoS ONE 8 (7): e69527. doi: 10,1371 /journal.pone.0069527

Editor: Maria G. Castro, University of Michigan School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 25 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Crittenden et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tutkimusrahoituksen peräisin Susan G Komen varten Cure Ura Catalyst Award (KG110131) ja American Cancer Society Research Scholar Grant (RSG-12-168-01-LIB) ja MJG, ja Wayne D. Kuni ja Joan E . Kuni Foundation Kuni Scholar Award MRC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ydinsoluissa on tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen syövän. Kasvaimeen liittyvät makrofagit ovat kriittisiä angiogeneesi, invaasio, etäpesäke, immunosuppressioon ja hoitovaste [1], [2], [3]. Viime aikoina tutkimukset ovat keskittyneet väestöön myeloidisolujen, joka on usein laajentunut ääreisverenkierron syöpäpotilaiden [4], [5]. Tietyt hiiri malleja liittyy äärimmäisiä myelooinen laajennuksia detectible kasvaimessa, perna ja ääreisverenkierron, ja nämä ydinsoluissa kykenevät tukahduttamaan T-solujen aktivaation

in vitro

[6], [7], [8].

transplantable kasvainmuodoista kanssa kloonaamalla sama syöpäsolujen tarjota hyödyllisen mallin tutkia keskeiset piirteet myelooisen laajentamiseen. Jos myeloidinen laajennus liittyy syöpäsolujen määrä, ja käsittelemällä sitten primaarikasvaimen pitäisi estää myelooisen laajennus. Gemsitabiini ja 5-FU kemoterapia on osoitettu ohjaamaan myeloidinen laajeneminen pernat kasvainta kantavien hiirten [9], [10], [11]. Kuitenkin jokainen näistä aineista on kuvattu olevan suora estävä vaikutus myelooinen populaatioiden

in vitro

[10], [11]. Vaikka nämä eivät ole erityisen myelotoksista chemotherapies, mahdollisen systeemisen vaikutukset kemoterapian on aktiivisesti jakautuviin myeloidiesiasteista voi hämmentää osuus alentunut kasvaintaakkaa. Kirurginen poisto primaarikasvaimen myös aiheuttaa lasku myeloidisoluissa [9], [12]. On mielenkiintoista, että tämä vaikutus on puutteellinen, koska solut eivät palaa naiivi tasolle. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kasvaimet vaikuttavat myeloidisoluissa että jatkuu yli leikkaaminen. Kuitenkin tässä mallissa vaikutusta kasvaimen poiston on ohimenevä, sillä myelooinen laajennus palaa toistumisen primaarikasvaimen ja etäpesäkkeitä [12]. Näin ollen nämä tiedot voidaan tulkita uudelleen viittaavan siihen, että jäljellä syöpäsolut voivat estää täyden normalisoitumisen myelooisen numeroita. Kirurgisen mallissa, trauma voi toimia myös sekoittava tekijä. Trauma on osoitettu aiheuttavan liikkeelle myeloidisolujen samanlaisia ​​fenotyypin, morfologisia ja toiminta ominaisuuksia kasvaimen aiheuttama myeloidisoluissa [13]. Tämä trauman aiheuttamat myelooinen laajennus voi salata laajuuden vähentämisen ydinsoluissa aiheuttama kirurginen poisto primaarikasvaimen ja lisätä mihin tahansa myelooinen laajennus yllä jäljellä tauti.

seurauksena kasvaimen sädehoidon systeemiseen myeloidinen väestö ei ole kuvattu. Sädehoito voidaan toimittaa erittäin paikkasidonnainen tavalla, jolloin valvonta kohdennettuja kasvaimia ja normaaliolosuhteissa ei ole vaikutusta kasvaimiin ulkopuolella kohde kenttään. Näin ollen sädehoitoa tarjoaa tekniikan vaikuttaa primaarisen kasvaimen reuna-myeloidisoluissa ilman sekoittavat vaikutukset kemoterapia ja kirurgia. Osoitamme, että sädehoidon 4T1 kasvaimia aiheuttaa väheneminen myeloidisolulinjassa numerot veressä ja lasku pernan koon. Systeeminen sairaus, mitattuna keuhkoetäpesäkkeet, ei vaikuta sädehoitoa primaarikasvaimen. Osoitamme, että myelooinen laajeneminen seuraa tiiviisti ensisijaisen kasvaimen kasvua, mutta hoidon jälkeen, myelooinen numerot eivät laskee tasolle nähdään kasvaimettomina hiirillä, mikä viittaa siihen, että seuraava paikallinen hoito, joitakin paikallisia ja etäpesäkkeitä yhdistää ylläpitämään myelooisen numeroita. Kun primaarikasvainten uusiutunut seurauksena joitakin paikallisia sairaus, myelooisesta laajennus palautetaan. Osoitamme, että vaikka myelooinen numerot säätelevät kasvaimen kasvua ja vaikutteita sädehoitoa, T-solun numerot eivät muutu. Kuitenkin sädehoito primaarikasvaimen paransi myeloidinen: CD8-suhde ja johtaa lisääntyneeseen proliferaatioon endogeenisen T-solujen perna. Testata, onko myelooinen laajeneminen ja supistuminen vaikuttaa in vivo T-soluvasteiden, mittasimme antigeenispesifisen vaste rokotteeseen liittyvän ja kasvaimeen liittyvät antigeenit. Olemme osoittaneet, että ei ollut mitään muutosta

in vivo

vastauksena

Listeria monocytogenes

rokotuksen kasvain ja hoidetuissa hiirissä mutta yhdistelmä sädehoidon rokotuksen johtaa lisääntyneeseen vastauksia rokotetta antigeeni jaetaan kasvain. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, jonka mukaan myeloidinen laajeneminen liittyy suoraan tuumorikuorma, että nämä solut sopimus seuraavissa sädehoitoa, ja että sädehoito voivat avata terapeuttinen leveys immunoterapiaa jäljellä taudin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics

Kaikki eläin pöytäkirjat hyväksynyt Earle A. Chiles Research Institute IACUC (animal Welfare Assurance nro A3913-01).

Eläimet ja Solulinjat

Euroopan 4T1 rintasyöpä solulinjassa [14] (BALB /c) saatiin ATCC: stä (Manassas, VA). Panc02 hiiren haiman Adenokarsinoomasolulinja [15] (C57BL /6) luovutti ystävällisesti Dr. Woo (Mount Sinai School of Medicine, NY). 6-8 viikkoa vanhojen C57BL /6-hiiriä ja BALB /c-saatiin Charles River Laboratories (Wilmington, MA), joita käytetään näissä kokeissa.

Vasta-aineet ja reagenssit

Fluoresoivasti-konjugoiduilla vasta-aineilla CD11b -AF700, Gr1-PE-Cy7, IA (MHC-luokka II) -e780, Ly6C-PerCP-Cy5.5, CD4-E450, FoxP3-E450, CD25-APC, CD4-PerCP Cy5.5, CD8-FITC, IFNy -APC, ja CD40L-PE ostettiin Ebioscience (San Diego, CA). Ki67-FITC, CD4-V500, TNFa-PE-Cy7 ja Ly6G-FITC hankittiin BD Biosciences (San Jose, CA). CD8-PE-TxRD ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA).

Sädehoito Tuumorien

Kasvaimet istutettiin s.c. oikea jalka polven alapuolelta annoksella 5 x 10

4 4T1 soluja tai 2 x 10

5 Panc02 ja saavat perustaa 14 päivän ajan ennen hoidon aloittamista. Annostelu perustuu viimeaikaisiin kliinisiin tutkimuksiin [16], jossa on kolme päivittäistä 20 Gy käsittely jakeiksi käyttämällä Elekta Synergia lineaarikiihdytin (Atlanta, GA), jossa 6 MV fotonien joissa puolen palkki lohko minimoimaan annosta vartaloon ja 1 cm: boluksen.

klonogeeninen analyysi metastasoituneen syöpäsolut

klonogeenisten analyysi metastaattisen syövän solujen, keuhkot leikattiin tulee noin 2 mm: n fragmentit minkä jälkeen sekoitettiin 1 mg /ml kollagenaasia (Invitrogen), 100 ug /ml hyaluronidaasia (Sigma, St Louis, MO), ja 20 mg /ml DNaasia (Sigma) PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pilkkomistuote suodatettiin läpi 100 pm nylon mesh poistamiseksi makroskooppinen roskia. Sarjalaimennoksia kasvaimen solut ympättiin 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille väliaineessa, joka sisälsi 60 uM 6-tioguaniini valita syöpäsoluja yli stroomasoluista ja pesäkkeet laskettiin sen jälkeen 7 päivää. Sarjalaimennos ja pesäkeluvut käytettiin määrä lasketaan klonogeeniset syöpäsolujen alkuperäisessä elimessä.

virtaussytometria myelooisten verisolujen ja pernan

laajentaminen myelooisen solujen perifeerisen veren mitattiin käyttämällä kokoveren helmi määrityksessä. Kokoveri kerättiin EDTA putkiin Live hiiristä kautta jalkavarreniholaskimon, ja 25 ui tuoretta verta värjättiin suoraan fluoresenssivasta-cocktaileja. Tunnettu määrä accucheck fluoresoivia helmiä (Invitrogen) lisättiin kuhunkin näytteeseen, sen jälkeen punasolut lyysattiin Cal-Lyse kokoverta hajottava liuos (Invitrogen), ja näytteet analysoitiin BD LSRII virtaussytometria. Määritimme absoluuttinen määrä solujen näytteessä perustuen vertaamalla solu- tapahtumia helmi tapahtumia (solua /ul). Virtaussytometriaa Splenosyyttien, homogenoitiin pernat pestiin ja värjättiin vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä pinta-antigeenejä, sitten solut pestiin ja kiinnitettiin käyttämällä säätelijä-T-solujen värjäytymisen kit (EBiosciences) ja solunsisäisesti värjättiin FoxP3 ja Ki67. Osuus kunkin soluttautua solutyypin analysoitiin BD LSRII. Virtaus lajittelu verisolujen suoritettiin käyttämällä BD FACSAria Cell Sorter: sta yli 98%: n puhtaudella. Morfologia lajitellut solupopulaatioiden määritettiin Cytospin seuraa DiffQuick värjäys. Veritahrat värjättiin Wright’s-Giemsa tahra (Ricca Chemical Company, Arlington, TX). Kuvat otettiin käyttäen Nikon Eclipse TE2000-S fluoresenssi mikroskooppi NIS-elementit ja analyysiä ohjelmiston tai Leica SCN400 dia skanneri.

Sytokiini Helmi Pitoisuus

Kasvaimet kerättiin jäissä ja homogenoidaan 4,5 ui PBS, joka sisälsi HALT proteaasinestäjä per mg kudosta. Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla 14000 g 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantit säilytettiin erinä -80 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin. Sytokiinien tasot supernatanteissa todettiin käyttäen hiiren multiplex helmi-määritys (Life Technologies, Grand Island, NY), ja luetaan Luminex 100 array lukija. Sytokiinipitoisuudet rinnakkaiskokeista kunkin kasvaimen näytteen laskettiin standardikäyrän.

bakteerikantaa ja rokotus

ACTA-Poistetaan (Δ

ACTA

)

L. monocytogenes

ilmentävät ZH1-A5 peptidi Lm-ZH1-A5) on kuvattu aiemmin [17]. Bakteerit kasvatettiin midlog in brain-sydänuutelientä, pestiin ja suspendoitiin uudelleen DPBS: ssä injektiota. Annos 5 x 10

6 CFU toimitettiin laskimoon ja varmistettiin pinnoitus jäljellä inokulaattia. Ohjaus hiirillä tai hiirillä 4T1 kasvaimia jätetään hoitamatta tai kohdellaan edellä kolme päivittäistä 20 Gy käsittely jakeet rokotettiin 1 päivä kuluttua viimeisestä säteilyannos kanssa 5 x 10

6 CFU Lm-ZH1-A5. Pernat kerättiin 7 päivää rokotuksen jälkeen, ja solususpensiot stimuloitiin 2 uM LLO

91-99 (GYKDGNEYI), AH1 (SPSYVYHQF), tai DMSO: ajoneuvon läsnä brefeldin A 5 tuntia 37 ° C: ssa. Stimuloidut solut pestiin ja värjättiin CD4-PerCP Cy5.5 ja CD8-FITC: llä, sitten kiinteä ja permeabilisoitiin käyttämällä BD Cytofix /Cytoperm plus kit (BD Biosciences) ja jäädytettiin -80 ° C: ssa. Analyysiä solut sulatettiin ja solun värjättiin IFNy-APC, TNFa-PE-Cy7 ja CD40L-PE. Solut pestiin ja analysoitiin BD LSRII Flow Cytometer ja tietojen kuulusteltiin käyttämällä BD FACSDiva (BD Biosciences) ja FloJo (Puu Star, Ashland, OR).

Tilastot

Tiedot analysoitiin ja piirretään käyttämällä Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Veri myelooisesta numerot ajan sovitettiin toisen asteen polynomia käyriä käyttäen Prism. Yksittäiset aineistoja verrattiin Studentin t-testi ja analyysi useiden ryhmien suoritettiin käyttäen ANOVA yksittäisten ryhmien arvioitiin käyttäen Tukeyn vertailun.

Tulokset

laajennus myelooisen väestön liittyy syövän etenemisessä eläinmalleissa ja syöpäpotilailla. Hiirillä, myeloidisolu- laajennus vaihtelee kasvainmuodosta, esimerkiksi erityisen korostunut myelooinen laajennuksia kuvattu 4T1 rintasyöpä malli [18]. Näissä malleissa, hiirillä, joilla on kehittynyt kasvaimia esiintyy erittäin suuria pernat, joka sisältää erityisen huomattava laajeneminen CD11

+ Gr1

+ väestöstä. Seurata myelooisesta laajeneminen hiirillä kautta kasvaimen kasvua ilman tarvetta euthanize eläimen seurasimme myelooinen populaatioita ääreisverenkierron. Standard valmistamiseksi perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) tiheysgradienttisentrifugaatiolla voi johtaa menetykseen granulosyyttien populaatioiden, jotka muodostavat suurimman osan myeloidisolujen perifeerisessä veressä. Siksi olemme kehittäneet kokoveren virtaussytometria määritys sisältää count-helmiä mitata absoluuttinen määrä verenkierrossa myeloidisoluissa. Toistettujen mittausten useita hiirillä osoittivat, että tämä myelooinen väestö kasvoi 2-3 kirjautuu läpi kasvaimen kasvua, merkittävästi lisätä yleistä soluihin perifeeristä verta. Aiemmin hoitamattomilla hiirillä CD11

+ myeloidisoluissa laajasti koostuivat Gr1

+ ja Gr1

– soluja (kuvio 1a), jossa CD11

+ Gr1

+ solut olivat kauttaaltaan MHC-luokan II ( IA) negatiivinen ja CD11

+ Gr1

– solujen sisällytetty molemmat MHC-luokan II negatiivisia ja positiivisia soluja (kuvio 1aii). In 4T1 on kasvain havaitsimme samanlainen fenotyyppejä, mutta suuri määrä kasvaa näiden solujen, etenkin laajentunut CD11

+ Gr1

+ soluja, on yhtäpitävä muiden tutkijoiden havaittiin [4] , [19]. Sädehoidon hiirillä perustettu 4T1 kasvaimia säätelee kasvaimen kasvua; kuitenkin huolimatta suuret säteilyannokset, kasvaimet toistu paikallisesti (kuva 1b). Sädehoito primaarikasvaimen johti merkittävä ero reuna myeloidisoluissa verrattuna käsittelemättömiin hiiriin, viikon sädehoidon (p 0,01 päivää 21 seuraava kasvain haaste) (kuva 1b). Tässä vaiheessa, numerot verenkierrossa myeloidisolujen käsitellyissä hiirissä olivat huomattavasti alhaisemmat kuin ennen hoitoa tasot hieman yli viikko ennen laajentumista palautetaan (RT d14 vs. RT D21 (p 0,05), RT d14 vs. RT D23 ( p 0,05), RT d14 vs. RT D27 (p = 0,26)). Numerot kiertävien myeloidisolujen käsitellyissä hiirissä jäi huomattavasti pienempi kuin käsittelemättömän hiirillä asti noin kaksi viikkoa hoidon jälkeen (p 0,05 päivää 27 seuraava kasvain haaste). Tässä vaiheessa, toistumisen primaarikasvaimen näkyi (kuva 1bi) viittaa välistä mahdollista yhteyttä ensisijaisen kasvaintaakkaa ja myelooisesta numeroita. Nämä tiedot osoittavat, että sädehoito primaarikasvaimen ohimenevästi kääntää kasvaimeen liittyvien myelooinen laajennus.

a) i) Virtaussytometria tuoreen perifeeristä kokoverta naiiveista ja 4T1 kasvain BALB /c-hiiriä, jotka osoittavat CD11b

+ SSC

hi myelooisesta populaatiot. ii) Gr1 ja IA (MHC-luokka II) värjäys aidatulla CD11

+ SSC

hi myelooisen väestöä naiiveja ja 4T1 tuumoreita kantavaa hiirtä. b) i) Mean ja keskivirhe jalan halkaisija BALB /c-hiirillä 4T1 kasvaimia hoitamattomana (NT) tai käsitellä alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20 Gy polttoväli säteily (RT). Ydinsoluissa /ul ääreisveren of ii) hiirten hoitamattomana ja iii) hiiriä käsiteltiin alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20 Gy keskipiste säteilyä. iv) asennetaan käyrät kaavioita ii) ja iii) piirrettiin ilman mittauksia. c) i) klonogeeninen määritykset keuhkometastaasien läsnä eutanasia BALB /c-hiirillä 4T1 kasvaimia hoitamattomana (tyhjät ympyrät – NT) tai käsitellä alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20 Gy polttoväli säteily (täytetyt ympyrät – RT). ii) Myelooinen solua /ul ääreisverenkierron naiivien hiirten (Naiivi) ja hiirillä päivänä 17 injektion jälkeen 4T1 i.v. (I.v.) tai s.c. (S.c.) iii) Totaalipernasolut cellularity aiemmin hoitamattomilla hiirillä (NT) ja hiirillä päivänä 24 injektion jälkeen 4T1 i.v. (I.v.) tai s.c. (S.c.) d) i) Myelooisen solua /ul perifeerisen veren C57BL /6-hiirillä, joilla on Panc02 kasvaimen talteen eri aikapisteissä. ii) päivä 24 jalan halkaisija ja iii) ydinsoluissa /ul ääreisverenkierron C57BL /6 hiirillä Panc02 kasvain hoitamattomana (NT) tai käsiteltiin alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20 Gy polttoväli säteily (RT). Kussakin kuvaaja, kukin symboli edustaa yhtä hiirtä. NS = Ei merkittävä; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Data edustaa useita rinnakkaisia ​​kokeita.

4T1 malli on spontaanisti metastaattinen, pääasiassa keuhkoihin. Etäpesäkkeitä ympätään kuluessa 10 päivää primaarisen kasvaimen istutuksen – tämän jälkeen kirurginen poisto primaarikasvaimen ei paranna hiiriä, vaan johtaa lopulta aiheuttaman kuolleisuuden asteittaisen kasvun metastaattisen taudin [20]. Seurata metastasointiin meidän sädehoito malli, me korjataan keuhkot hiiristä, jotka tarvitaan eutanasia koska niiden ensisijainen kasvain on yli 12 mm, tai heikon kunnon. Hoidetuilla hiirillä sädehoitoa 14 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen haaste, ohjaus primaarikasvaimen hidasti keuhkojen sato verrattuna käsittelemättömiin hiiriin. Kuitenkin keuhkojen sato, klonogeeniset analyysi osoitti, että etäpesäkkeiden edistyi (kuvio 1ci). Jopa hiirissä, joissa säteilyä saaneista kasvain oli stabiili tai etenee hitaasti, 35-50 päivän haaste kaikkien hiirten tuli riittävän pahoinvointia vaatia eutanasiaa, ja tämä sairastuvuus oli yleisesti liittyy laaja taakkaa keuhkosairaus. Nämä tiedot vahvistavat laajat historialliset tiedot että polttoväli sädehoito primaarikasvaimen on erittäin paikallista hoito johtaa syövän valvontaa yksinomaan säteilykenttä: satoja tuhansia hoidetuista potilaista vuodessa sädehoitoa, abscopal vaikutukset – indusoi valvonta kasvaimia ulkopuolella säteilykenttä – ovat äärimmäisen harvinaisia, jossa säteily on ainoa hoitomuoto [21]. Koska myelooisesta laajeneminen potilailla on liittynyt invasiivisen ja etäpesäkkeitä [5], on mahdollista, että jäljellä etäpesäkkeitä estää täysimääräinen normalisointi myelooisen numeroita seuraavien paikallisen hoidon. Tutkia osuus metastaattisen taudin myelooinen laajennus, hiiriin injektoitiin 4T1 kasvaimia suonensisäisesti suoraan muodostaa etäpesäkkeitä puuttuessa primaarisen kasvaimen. Hiirillä vain etäpesäkkeitä näytteillä oheislaitteiden myelooisen laajennus (kuva 1cii), mutta oli merkittävästi vähemmän ydinsoluissa läsnä kuin hiirillä synkronimoottori ihonalaista ensisijainen kasvaimia. Tämä suhde säilyi pernassa, jossa hiiret, jotka kantavat vain etäpesäkkeitä osoitti merkittävästi enemmän soluja kuin ei-kasvain kantavissa hiirissä, mutta tämä oli huomattavasti vähemmän kuin hiirillä, joilla ihonalaiseen primaaristen kasvainten (kuvio 1ciii). Koska tiedämme, että polttoväli sädehoito ohjaa primaarikasvaimen paikallisesti, mutta ei valvo etäpesäkkeitä, hiiret, jotka saivat sädehoitoa säilyttävät molemmat jäljellä olevan paikallinen tauti

ja

keuhkofunktion kasvaintaakkaa. Siksi nämä tiedot ovat sopusoinnussa yhdistelmä joitakin paikallisia ja etäpesäkkeitä estävät myelooinen numerot palaavat perustason seuraava sädehoito, ja on sopusoinnussa havaintojen kemoterapian jälkeen [9] ja kirurginen [9], [12].

Tämä vaikutus sädehoidon ei rajoitu 4T1 malliin. Panc02 haiman adenokarsinooma kasvainmuoto ajaa myelooinen laajennus syövän etenemiseen, vaikkakin vähemmässä määrin kuin 4T1 (kuva 1di). Sädehoidon Panc02 kasvaimia aiheutti ohimenevää ohjaus kasvaimen kasvun (kuvio 1dii), jota seurasi aggressiivinen kasvain [22]. Kuten hoito 4T1, sädehoitoa Panc02 kasvaimia johti merkittävään väheneminen syrjäisillä myeloidisoluissa (Fig. 1diii). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että sytotoksisen hoidon suunnattu primaarikasvaimen aiheuttaa systeemistä, vaikka ohimenevä käänteinen myelooisen laajeneminen ohjaa kasvaimen kasvua.

aallonpohjan veren myeloidisolujen seuraavat sädehoito, pernat olivat näkyvästi pienempi (kuvio 2a). Laskimme solut pernassa mittana myelooisen supistumista sädehoito ja kun koko pernan soluihin väheni seitsemän päivän sädehoito, se pysyi väli- koko – merkittävästi vähemmän soluja kuin hiiret ilman hoitoa (p 0,01) ja merkittävästi enemmän soluja kuin hiiret ilman kasvaimet (p 0,01) (kuvio 2bi). Sen määrittämiseksi, onko vähentää systeemisiä myelooisen määrä johtui sädehoitoa riippumatta vaikutuksia kasvain, hiirillä 4T1 kasvaimia käsiteltiin säteilyn contralateral kuin kasvain jalan. Hiiret, jotka saivat sädehoitoa kasvaimen näkyy huomattavasti vähemmän koko solut pernassa kuin käsittelemättömien hiirien tai saaneista kontralateraaliselle raajan (kuvio 2bi). CD11

+ solut olivat selvästi suurin väestö laajennetulla pernassa kasvainta kantavien hiirten, ja CD11

+ väestöstä perna oli samanlainen välitulos seuraava sädehoito primaarikasvaimen, jossa hiiriä hoidettiin kasvaimen sädehoito näytteille merkittävästi vähemmän CD11

+ soluja kuin käsittelemättömien hiirien tai hiirillä säteilytettyjen ei-kasvain jalan (Kuva 2bii). Jälleen vähenemisestä huolimatta aiheuttaman kasvaimen säteilystä, käsitellyillä hiirillä säilyttänyt merkitsevää nousua ydinsoluissa yli ei ollut kasvainta kantavien hiirten ja ei ollut merkittävää eroa käsittelemättömän hiirillä ja hiiriä säteilytettiin ei-hoito jalan (Kuva 2bii). Samanlainen myelooisesta vastaus säteily kasvaimen nähty ääreisverenkierron ja perna johtaa läheinen korrelaatio näiden toimenpiteiden riippumatta kasvaimen tai hoidon tila (kuva 2c). Koska sädehoitoa kasvaimen ja vastakkaiseen raaja säteilyttää verta altaan kautta hoitoa, että sädehoito toimitetaan vastapuolen raajan ei ei vähennä myelooinen numeroita pernassa osoittaa, että vaikutus myeloidinen väestölle ei johdu suorat vaikutukset säteily myeloidisoluissa tai mahdolliset scatter-annoksia.

a) Vasta leikattiin pernat D24 4T1 kasvain BALB /c-hiiret jätetään käsittelemättä (NT) tai käsiteltiin alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20 Gy polttoväli säteily (RT). Laatikot osoittaneet ovat 3 cm leveä. b) i) Totaalipernasolut cellularity aiemmin hoitamattomilla hiirillä (nro kasvain) ja hiirillä päivänä 24 injektion jälkeen 4T1 hoitamattomana (kasvain NT) tai käsiteltiin alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20 Gy polttovälin säteilyä kasvain (kasvain RT) tai sivullisten vastakkaiseen raajan (kasvain Leg RT). ii) määrä CD11

+ solua pernan hiiriä esitetyssä kokeessa i). c) määrä CD11

+ soluja pernassa funktiona määrä CD11

+ solua /ul ääreisveren sadonkorjuun kunkin kasvaimen ja hoitoryhmässä.

Voit selvittää mitään erityistä myelooisesta väestöstä vaikuttivat erityisesti sädehoitoa, suoritimme alakohtia fenotyypitykseen ääreisverenkierron myeloidisoluissa. Gr1 vasta-aine tunnistaa sekä Ly6G ja Ly6C, ja vasta-aineita näitä markkereita käytettiin erottamaan alapopulaatioiden sisällä CD11

+ solujen [6]. Yhdenmukainen kirjallisuuden sisällä CD11

+ Gr1

+ soluja oli kaksi suurta väestön erottuu Ly6C ja Ly6G: selvästi erillinen populaatio Ly6G

-Ly6C

+ solujen ja suuri väestö Ly6G

+ soluja, jotka näytetään vaihteleva ilmentyminen Ly6C (kuva 3AI-iii). Sen jälkeen sädehoito, oli ilmeinen menetys CD11

+ Gr1

+ Ly6G

+ soluja, jotka ilmentävät alempien Ly6C (kuva 3aiii). Sellaisten ohjainten tunnistaa Ly6G

+ Ly6C

– soluja (kuvio 3aiv) osoitimme, että sädehoitoa kasvaimen johti vähentynyt merkittävästi CD11

+ Gr1

+ Ly6G

+ soluja, olivat Ly6C

-. Tämä ei tapahdu, kun toiseen raajaan säteilytettiin (kuvio 3av). Luonnehtia näitä populaatioita, me lajitellaan nämä osa-fenotyyppejä perifeerisestä verestä hiirillä 4T1 kasvaimia (kuva 3b). Yhteisymmärryksessä aiempien luonnehdintoja [6], Ly6G

-Ly6C

+ soluilla oli monosyyttien morfologia, Ly6G

+ Ly6C

+ oli morfologian neutrofiilien ja Ly6G

+ Ly6C

– solut oli morfologiaa kypsien neutrofiilien. Vastaavasti, veritahrat päässä on kasvain osoitti selvästi laajennus neutrofiilien, jotka olivat huomattavasti vähentynyt seuraavat sädehoitoa kasvaimen (kuvio 3c). Nämä tiedot osoittavat, että sädehoidon kasvain johtaa erityisesti käänteinen kasvaimeen ajettu neutrofiilien laajennus.

a) Virtaussytometria tuoreen koko perifeerisen veren i) naiivi hiiret tai hiirillä 4T1 kasvaimia ii) jätetään hoitamatta tai iii) säteilytetty, osoittaa Ly6C ja Ly6G sisällä aidatulla CD11

+ Gr1

hi myelooisesta populaatiot. iv) histogrammit Ly6C ilmaisun aidatulla CD11

+ Gr1

hiLy6G

+ soluja, mukaan lukien negatiivinen kontrolli värjäys (FMO) ja osoittaa prosenttiosuuden Ly6C

– hiirillä säteilytetty kasvain (kasvain RT) tai päinvastainen raajan (kasvain Leg RT). v) prosenttiosuus CD11

+ Gr1

hiLy6G

+ soluja, jotka ovat Ly6C

– alkaen naiiveja hiiriä (nro kasvain) ja hiirillä päivänä 24 injektion jälkeen 4T1 hoitamattomana (kasvain NT) tai käsiteltiin alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20Gy polttovälin säteilyn kasvain (kasvain RT) tai sivullisten vastakkaiseen raajan (kasvain Leg RT). Kukin symboli edustaa yhtä hiirtä. b) Cytospins lajitellun CD11

+ Gr1

hi soluja käsittelemättömiä hiiriä, jotka ovat i) Ly6C

+ Ly6G

-, ii) Ly6C

+ Ly6G

+, tai iii) Ly6C

-Ly6G

+. Jokainen cytospin näkyy vieressä lajitella puhtauden juoni lisääntynyt suurennus upotetun laatikon. c) Wright-Giemsa tahra D24 veritahrat maasta i) naiivi hiiret (nro kasvain) ja hiirillä päivänä 24 injektion jälkeen 4T1 ii) hoitamattomana (kasvain NT) tai iii) käsitellyn alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20 Gy polttoväli säteilyn kasvain (kasvain RT). Inset laatikko pyöritetään ja esitetään lisääntynyt suurennus. NS = Ei merkittävä; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Data edustaa useita monistaa kokeet; kukin alakuviossa sisältää dataa eri jäljitellä kokeessa.

Tumor-driven myelooinen laajennuksia liittyvät paikalliseen tulehduksellinen ympäristön ja suunniteltu ilmentyminen GM-CSF: n [23] tai IL-1β [24] syöpä solut on osoitettu ajaa myelooisen laajentamiseen. Sen määrittämiseksi, ovatko sädehoitoa vaikuttaa myelooinen numerot moduloimalla Näiden sytokiinien, analysoimme niiden tasot kasvain. Tasot GM-CSF, IL-1α, ja IL-1β ei muuttunut kasvaimen seuraavat sädehoidon (kuvio 4a). Nämä tiedot osoittavat, että tasapaino näiden tulehdusta edistävien sytokiinien ja kasvutekijöiden kasvainta ei ohjaa muutosta myelooisen numeroita. Vaikka emme voi sulkea pois sääntely muita kasvutekijöitä, se on ehkä merkittävää, että seuraava sädehoito primäärikasvaimissa ovat huomattavasti pienempiä halkaisijaltaan (kuva 4bi) ja paino (kuva 4bii). Jos laskemme solujen lukumäärä pernassa per mg primaarikasvaimen, ei ole mitään eroa käsittelemättömän ja säteilytettyjen hiirissä (kuvio 4biii). Näin ollen, jopa ilman kasvutekijä sääntelyä kasvainkohdassa, pienempi tuumorimassa tarkoittaa vähemmän kasvaimen kasvutekijöiden vaikuttaa myelooinen numeroita. Siksi nämä tulokset viittaavat siihen, että myelooinen supistuminen sytotoksisen ja sytoreduktiivisen hoito määräytyy ensisijaisesti vaihtelut syöpäsolujen määrää.

a) Helmi määritys i) GM-CSF, ii) IL-1α ja iii) IL-1β homogenaateissa of 4T1 kasvainten päivänä 24 injektion jälkeen 4T1 hoitamattomana (NT) tai käsiteltiin alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20 Gy polttovälin säteilyä kasvain (RT) tai sivullisten vastakkaiseen raajan (RT Opp ). b) D24 kasvaimen haaste kaaviot osoittavat i) jalan halkaisija ii) kasvaimen paino ja iii) pernasolua per pernan /kasvaimen paino hiiriä hoitamattomana (NT) tai käsiteltiin alkaen päivänä 14 3 päivittäistä annosta 20 Gy polttoväli säteily (RT) . Kussakin kuvaaja, kukin symboli edustaa yhtä hiirtä. NS = Ei merkittävä; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Data edustaa kolmea koetta uudestaan.

alapopulaatioita myelooisen solujen tuumoreita kantavaa hiirtä voidaan käyttää tukahduttava vaikutus T-solun funktion

in vitro

. Tästä syystä tutkittiin T-solut pernassa seuraavat sädehoitoa. Johtuen myelooinen laajeneminen pernassa, T-solut muodostavat pienemmän prosenttiosuuden pernasolujen; kuitenkin yhteensä CD8-T-solujen määrä ei ollut erilainen kasvaimen kantavien hiirten tai sen jälkeen sädehoidon kasvain (kuvio 5a). Tämä CD8 T-solut pysyvät ennallaan, kun ydinsoluissa kasvaa johtaa dramaattisesti vinossa myelooinen: T-solujen suhteen – pernassa suhde kasvaa keskimäärin noin 1,7 CD11

+ per CD8

+ 29 CD11b

+ per CD8

+ (p 0,001). Tulos säteilyn aiheuttama lasku ydinsoluissa on parannus myelooisen: CD8-suhteen perna – 20 CD11

+ per CD8

+ (p 0,01) – mikä viittaa hieman parempi mahdollisuus aloittaa

de novo

immuunivasteita. Yhdenmukainen tietojen CD8 T-solujen, ei muuttunut määrä kuin sääntelyyn CD4-T-solujen kasvaimia omaavilla hiirillä ja käsiteltyjen hiirten kontrolleihin verrattuna (kuvio 5b). Kuitenkin kasvaintaakkaa ja sädehoito on mukana määrä kasvaa T sääntelyn solujen (T

reg) pernassa (kuvio 5b), mitattuna CD4

+ soluja, jotka ilmentävät CD25 ja FoxP3 (kuva S1 ). Mielenkiintoista, sädehoito merkittävästi lisääntyvän leviämisen CD8 T-solujen ja muiden kuin sääntelyyn CD4-T-solujen (kuvio 5c) mitattuna ilmaus Ki67 (kuva S1), mikä viittaa siihen, että endogeeninen immuunivasteet voivat olla aktiivisempia pernassa seuraavat sädehoidon primaarikasvaimen.