Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tavoitteena Työmme oli tunnistaa geenien nimenomaan muuttaa haiman adenokarsinooma ja erityisesti ne, jotka ovat muuttuneet varhain syövän kehittymisessä.

Menetelmät /Principal havainnot

Gene kopioluku oli järjestelmällisesti arvioitu kanssa erittäin korkean resoluution CGH oligonukleotidi microarray DNA näytteistä haimasyövän. Useita uusia syöpään liittyvää vaihtelua ei havaittu. Tässä työssä keskityttiin yksi niistä, joihin

REG4

geeni. Geenikopiomäärä vahvistus

REG4

geeni vahvistettiin qPCR 14 syöpänäytteissä. Todettiin myös lisääntynyt kopiomäärä useimmissa PanIN3 näytteissä. Suhde betweena vahvistusta

REG4

geenikopiomäärä ja syövän kehittymisessä tutkittiin ihmisen haimasyövän solulinja Mia-PaCa2 ksenosiirrettyjä ihon alle nude-hiirten. Kun solut transfektoitiin vektorilla, joka mahdollistaa REG4 ilmaisu, ne tuotetaan kasvainten lähes kaksi kertaa suurempia. Lisäksi nämä kasvaimet olivat vastustuskykyisempiä gemsitabiinihoidon kuin kontrolli kasvaimia. Mielenkiintoista, viikoittain intraperitoneaalisesti monoklonaalisella vasta-aineella REG4 puolittunut kasvaimien koko tuottaman Mia-PaCa2 soluissa, mikä viittaa siihen, että vasta-aine puuttua paracrine /autokriinisella järjestelyihin REG4 ja edistää syövän etenemistä. Lisääminen gemsitabiinin johti edelleen vähentää, kasvaimet tulossa 5 kertaa pienempi kuin kontrolli. Altistuminen REG4 vasta-johti merkittävään laskuun sisäisessä kasvain tasot Pakt, Bcl-x L, Bcl-2 surviviiniperäiset ja sykliini D1.

Johtopäätökset /merkitys

Todettiin, että adjuvantti hoitoja kohdistaminen REG4 voisi parantaa tavanomaista hoitoa haimasyövän kanssa gemsitabiinia.

Citation: Legoffic A, Calvo E, Cano C, Folch-Puy E, Barthet M, Delpero JR, et al. (2009)

REG4

Gene, Amplified alkuvaiheessa haimasyövän Development, on lupaava terapeuttinen kohde. PLoS ONE 4 (10): e7495. doi: 10,1371 /journal.pone.0007495

Editor: Joy Sturtevant, Louisiana State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 8. kesäkuuta, 2009; Hyväksytty: 28 syyskuu 2009; Julkaistu 16. lokakuuta 2009

Copyright: © 2009 Legoffic et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia INSERM, Ligue Contre le Cancer ja INCA jotta JLI ja FIS PI081608 hanke, Acción Integrada HF2006-0092 ja CIBERehd. CIBERehd rahoittaa Instituto de Salud Carlos III EF-P ja DC. EF-P on vastaanottajaa Ramón y Cajal sopimus Espanjan opetus- ja tiede- ja MF-M on vastaanottajaa FIS-Instituto de Salud Carlos III sopimus PI050599. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on 2% kaikista uutta syöpätapausta vaan johtaa 5% kaikista syöpäkuolemista, jossa viiden vuoden eloonjäämisaste vain 4% [1]. Diagnoosi viivästyy ilman oireita ja puute markkereita mahdollistaa detektio potentiaalisesti parantava vaiheessa. Väestössä haimasyövän on elinikäinen riski on noin 0,5-1% [2]. Geneettinen alttius on mukana, koska elinikäinen riski haimasyöpä on 4,7% ensimmäisen asteen sukulaisten haimasyövän tapauksissa ja riski haimasyövän kasvaa jokaisen vaikuttaa perheenjäsenen. Lisäksi se voi periä osana usean syöpä oireyhtymä mutta valtaosa haimasyövis- ovat satunnaisia. Lopuksi, tupakoinnin ja sairauksien kuten diabeteksen ja erityisesti krooninen haimatulehdus altistaa haimasyövän ja noin 10% potilaista, joilla intrapapillary mucinous kasvaimet (IPMNs) kehittää haiman adenokarsinooma.

Perimän muutoksia voivat aiheuttaa yli- tai ali- geenien ilmentymistä, jolla on merkittäviä vaikutuksia kun onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille ovat mukana. Geneettinen poikkeavuuksia, jotka tapahtuvat esiasteleesioita [3] sekä aloitettaessa ja etenemisessä haimasyövän on osittain kuvattu [4] – [7]. Todellakin, vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) analyysit tunnistetaan usein voitot kromosomeissa 1Q, 3, 5, 7p, 8q, 11q, 12p, 17Q, 19q ja 20q, ja tappiot kromosomien 3p, 6, 8p, 9P, 10q, 13q, 15q, 17p ja 18q [8] – [13]. Tavoitteena Työmme oli tunnistaa, käyttäen erittäin korkean resoluution CGH oligonukleotidi mikrosirun, geenit nimenomaan muuttunut haiman adenokarsinooma soluissa ja erityisesti ne, jotka ovat muuttuneet varhain syövän kehittymisessä. Useita ehdokkaita tunnistettiin käyttäen tätä lähestymistapaa, joista

REG4

geeni [14] osoitti geenikopiomäärä voitto 14/14 analysoiduista näytteistä. Tämä on tietääksemme ensimmäinen raportti

REG4

geenikopiomäärä voitto haimasyövän.

Tässä tutkimuksessa raportoivat, että

REG4

geenin, sijoitetaan kromosomissa 1p13 0,1-p12, on läsnä kasvanut kopiomäärä haiman syöpäsoluissa ja myöhään syöpää edeltävät haiman vaurioita. Tutkimukset ksenosiirretty haimasyöpä solulinja osoitti, että REG4 yli-ilmentyminen stimuloi kasvaimen kasvua ja päinvastoin, että estämällä kiertävä REG4 proteiinin spesifistä vasta-ainetta kasvaimen kasvu estyy.

Tulokset

REG4

geeni esiintyy lisääntynyt kopiomäärä haiman syöpäsoluissa ja Panin 3 syövän esiasteita

käyttäen Affymetrix mikrosiru-pohjainen DNA skannaus lähestymistapa, tunnistimme useita geenejä, joissa on epänormaali kopioluku DNA haiman syöpäsoluja. Ensin keskitytään geenien muuttaa kaikissa 14 DNA-näytteitä ja havaitsi, että

REG4

osoitti kasvatettu kopiomäärä. Kaikki microarray tiedot raportoitu käsikirjoituksen kuvataan mukaisesti MIAME suuntaviivoja. Kattavia tietoja muista DNA poikkeavuuksia julkaistaan ​​muualla.

REG4

geenin lisääntynyt kopiomäärä oli erityisen mielenkiintoinen, koska sen ilmentyminen oli aiemmin mukana aggressiivisuus useiden syöpien [15] – [17], mukaan lukien haiman [18]. Kuvio 1 esittää monistettu lokuksen, joka sisältää

REG4

geenin, ja DNA näistä potilaista. Olemme myös seurata kopioluvun

REG4

haiman syövän esiasteita nimetty PanINs. Yhdistämällä laser kaapata lähestymistapa ja qPCR menetelmä, mittasimme määrä REG4 kopiota kolmessa luokilla Panin vaurioiden ja löysi lisääntynyt kopiomäärä

REG4

vuonna 0/6, 1/7 ja 6/7 ja PanIN1, PanIN2 ja PanIN3 leesioita, vastaavasti (kuvio 2). Kontrollina, kopioi numerot

TERT

(Telomerase käänteistranskriptaasi) ja

RPP21

(RNaseP proteiini p21) geenejä arvioitiin samalla DNA-näytteet ja kaksi kopiota olivat aina havaittu (tuloksia ei ole esitetty) . Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että

REG4

geenikopiomäärä usein lisääntynyt haimasyövän ja viimeisessä vaiheessa syövän esiasteita (PanIN3), mutta harvoin aiemmissa vaiheissa (PanIN1 ja PanIN2).

alleelisia suhteet laskettiin Partek Genomics Suite, versio 6.4. HapMap (270 näytettä) luotiin lähtötilanteen kopioluvun. Genominen segmentointi käytettiin havaitsemaan kopioluvun voitto tai tappio. Alueet havaittiin käyttäen seuraavia segmentointia parametrit: vähintään 10 genomista markkerit; segmentointi p-kynnysarvo alempi kuin 0,001; signaali-kohina 0,3. A. Kaaviokuva

REG4

lokuksessa. Kannat 7 geenien läsnä tässä lokuksessa on merkitty: vasemmalta righ:

ZNF697

,

PHGDH

,

HMGCS2

,

REG4

,

NBPF7

,

ADAM30

ja

NOTCH2

. B. kanta kopioluvun voitto segmentti esiintyy kaikissa 14 DNA-näytteet haimasyöpä, joka sisältää

REG4

geeni. C. Perimän muutokset monistettu segmentti

REG4

lokuksessa, määräytyy Affymetrix genominlaajuisia Human SNP Array 6.0 analyysi 14 haimasyövän näytteitä. Geneettiset voitot näkyvät punaiset palkit ja tappiot siniset palkit, harmaat palkit vastaavat 2: sta kuten mittakaavassa esitetty alla. Huomaa hallitsevuus voitot (punainen)

REG4

alue. D. Yksityiskohta voitot /tappiot

REG4

geenin ja sen viereisten alueiden kaikille 14 analysoiduista näytteistä.

homogeeninen populaatiot soluja varovasti microdissected käyttämällä Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä System. PanINs luokiteltiin 1-3 funktiona merkityksestä arkkitehtuurin ja sytologinen poikkeavuuksia. DNA haimasyövän näytteistä saadaan endoskooppinen ultraääni (EUS) -Opastettu hieno neula pyrkimys käytettiin. DNA verestä valkosoluista käytettiin kontrollina.

REG4

geenikopiomäärä määritettiin qPCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset analysoitiin käyttämällä RealQuant ohjelmistoa.

REG4 yliekspressio stimuloi solujen kasvua ja antaa paremman suojan gemsitabiinihoidon vuonna MiaPaCa2 soluissa

in vitro

Se oli aiemmin osoittaneet, että pakko REG4 yliekspressio

in vitro

nostaa solujen kasvua ja kestävyys ohjelmoitua solukuolemaa kuin haimasyövän peräisin olevat solut. Saimme Mia-PaCa2 solut yli-ilmentävät REG4 proteiinia (Mia-PaCa2 /REG4) transduktiolla rekombinantin retroviruksen (kuva 3) ja analysoitiin niiden kyky kasvaa ja vastustaa sen kasvaimen kasvua estävä lääke gemsitabiinin

in vitro

. Havaitsimme, että solut, jotka ilmentävät REG4 kasvoivat noin 50% nopeammin kuin Mia-PaCa2 /tyhjät solut. Olemme vahvisti, että lisääntynyt solujen kasvu johtuu REG4 yliekspressio jonka knockingdown REG4 tietyn siRNA transfektio ja löysi menetys tässä ominaisuudessa, kuten on esitetty kuviossa 4. Samalla tavoin, kun Mia-PaCa2 soluja käsiteltiin 50 uM gemsitabiinin 48 tuntia, vastus lääke lisättiin soluissa, jotka yliekspressoivat REG4, verrattuna kontrolliin, mutta hävisi soluissa lopulta transfektoitu siRNA vastaan ​​REG4 (kuvio 4). Nämä tulokset osoittavat, että REG4 on osallisena solujen kasvun ja kestävyys syöpälääkkeiden in haimasyöpä peräisin olevat solut, kuten aiemmin on ehdotettu ei-haiman soluja.

koko koodaava sekvenssi REG4 cDNA alikloonattiin pLPCX retroviruksen vektori. Phoenix amfotrooppinen pakkaus solut transfektoitiin retroviruksen plasmidin saamiseksi sisältävä supernatantti retroviruksiin. Target Mia-PaCa2 solut maljattiin läsnä sisältävä supernatantti retroviruspartikkeleihin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Populaatiot REG4 ilmentävien Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /REG4) ja valvonta-solut (Mia-PaCa2 /tyhjä), tartunnan tyhjän vektorin, eristettiin puromysiiniselektion. Expression of REG4 mitattiin western blot solujen uutteita, käyttäen anti-REG4 monoklonaalinen vasta-aine. Kehittämisen jälkeen, kalvo kuorittiin ja uudelleen koestettiin β-aktiini.

Mia-PaCa2 /REG4 ja Mia-PaCa2 /tyhjät solut transfektoitiin tietyn siRNA vastaan ​​REG4 (A) tai inkuboidaan kun läsnä on anti-REG4 monoklonaalinen vasta-aine (B) ja niiden kasvun ja niiden kestävyys gemsitabiinihoidon mitattiin MTS-määrityksellä. Tulokset ilmaistiin prosentteina käsittelemättömien Mia-PaCa2 /tyhjiä soluja.

REG4 on 16 kDa: n eritysproteiinia. Testata, onko vaikutuksia REG4 solujen kasvuun ja kestävyys gemsitabiinihoidon johtui sen hormonitoimintaa /parakriininen toiminto haiman soluja, lisäsimme erityinen monoklonaalinen vasta-aine REG4 proteiinia viljelyalustaan, estää sen toiminnan. Näissä olosuhteissa, vaikutukset REG4 yli-ilmentymisen katosi lähes kokonaan, kuten on esitetty kuviossa 4. Nämä tulokset osoittavat, että REG4 kykenee sen vaikutukset solujen kasvuun ja kestävyys gemsitabiinin kautta hormonitoimintaa /parakriinisella tavalla.

REG4 yli-ilmentyminen lisääntyy tuumorigeenisyyteen ja kestävyys gemsitabiinihoidon

Vertasimme valmiuksia Mia-PaCa2 /tyhjiä ja Mia-PaCa2 /REG4 solut muodostavat kasvaimia ihonalaisen injektion nude-hiirissä. Kuten kuviossa 5 on esitetty, kasvaimia, jotka muodostuvat soluista, jotka yli-ilmentävät REG4 proteiinin kasvoivat nopeammin kuin solut, jotka eivät ekspressoi geeniä. Kasvaimen tilavuus oli 70% suurempi käytettäessä Mia-PaCa2 /REG4 soluja kuin kontrolli Mia-PaCa2 soluissa. Mielenkiintoista on, että kun hiiriä käsiteltiin gemsitabiinin, kasvaimia yli-ilmentävät REG4 proteiinia näytetä lisääntynyt vastustuskyky hoitoon verrattuna tuumoreihin, jotka on muodostettu Mia-PaCa2 /tyhjiä soluja. Kun kasvainten tilavuuden syntyy Mia-PaCa2 soluissa vähenee 60%, kun gemsitabiinihoidon, tilavuus REG4-ilmentävien solujen laski 20% vain.

Noin 2 x 10

6 Mia-PaCa- 2-soluja istutettiin ihonalaisesti 0,1 ml Matrigel nude-hiirissä. Gemsitabiini (100 mg /kg) injektoitiin vatsakalvonsisäisesti kahdesti viikossa. Kasvaimen mitat mitattiin kerran viikossa ja kasvainten lasketaan kaavalla pituus x leveys x syvyys x 0,5236. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SE Kuuden mittauksen.

Systeeminen hoito vastaisella vasta-aineella REG4 pienenee tuumorigeenisyystesti

Seuraava vaihe oli analysoida vaikutus estää REG4 kanssa erityinen monoklonaalinen vasta-aine on kasvainten kasvua indusoitiin ihonalaisella Mia-PaCa2 soluja. Kuten kuviossa 6 on esitetty, käsittelemällä REG4 vasta-aineen laski kasvaimen kehittymisen noin 50%. Lisäksi yhdistyminen REG4 vasta-gemsitabiinihoidon johti edelleen vähentää kasvaimen tilavuuden. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että kohdistaminen REG4 proteiinia voidaan käyttää yhdessä gemsitabiinin hoitoon haimasyövän.

Noin 2 x 10

6 Mia-PaCa-2-soluja istutettiin ihonalaisesti 0,1 ml Matrigel kohteeseen nude-hiirissä. Yksi päivä ennen tuumori- solujen inokulaation Kontrolliryhmä sai intraperitoneaalisesti 150 ui PBS: ää, kun taas määritys ryhmä sai 0,25 mg REG4 monoklonaalista vasta-ainetta 150 ul: ssa PBS: ää. Apuainepuskurissa tai anti-REG4-vasta ruiskutettiin viikoittain eläimillä. Kasvaimen mitat mitattiin kerran viikossa ja kasvainten lasketaan kaavalla pituus x leveys x syvyys x 0,5236. Gemsitabiini (100 mg /kg) injektoitiin vatsakalvonsisäisesti kahdesti viikossa. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SE (n = 6).

intraperitoneaalisesti REG4 vasta-aineen alentaa veren antiapototic proteiinien ja solusyklin liittyvien proteiinien Mia-PaCa2-aiheutettujen kasvaimien

Koska systeemistä hoitoa vasta-aineella vähentää tuumorin kasvua ja lisää herkkyyttä gemsitabiinihoidon, käytimme western blot -analyysi seurata kasvainten vaikutuksesta REG4 vasta-aineen käsittely on solunsisäisiä tasoja liittyvien proteiinien apoptoosia (fosforyloitu AKT, Bcl- 2, Bcl-x L ja surviviiniperäisten) ja solukierron (sykliini D1). Kuten odotettua tasoa fosforyloidun AKT, Bcl-2, Bcl-x L ja surviviiniperäisten vähensi merkittävästi kasvainten käsiteltyjen hiirien kanssa REG4 vasta-aineen verrattuna kontrolliin. Taso sykliini D1 todettiin myös pienentää REG4 vasta-aineella käsitellyillä hiirillä (Kuvio 7). Nämä havainnot luultavasti selittää havaitut kasvun taittumisesta.

Kasvaimen kudosnäytteitä hajotettiin homogenointi puskurissa, joka sisältää antiprote- aasien cocktail. Cell roskat ja liukenemattomat aineet poistettiin sentrifugoimalla ja liukoinen fraktiot ladattiin Laemmli-puskuriin päälle 12,5% SDS-polyakryyliamidigeelillä. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja kalvo inkuboitiin anti fosforyloidun AKT (fosfo-Ser473), anti-pan AKT, anti-Bcl-2, anti-Bcl-x L, anti-surviviiniperäistä tai anti-sykliini D1-vasta-aineita. Kehittämisen jälkeen, kalvo oli riisuttu ja uudelleenseulottiin varten β-aktiini.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa hypoteesia oli, että varhainen genomista poikkeavuudet esiintyvät haimasyöpäsoluissa vastaavat huono prognoosi potilaalle ja riittämätön vaste syöpälääkkeet, kuten gemsitabiini. Useita DNA-alueet, joilla on muuttunut geenikopiomäärä todellakin havaittiin kasvainten potilailta, joilla havaittavissa etäpesäkkeitä aikaan tutkimuksen. Tässä työssä olemme keskittäneet huomiomme kromosomissa sisältävän alueen

REG4

geeni koska se oli kohonnut kopiomäärä kaikissa 14 potilasta analysoitiin. Lisäksi lisääntynyt kopiomäärä tämän alueen todettiin myös lähes kaikissa PanIN3, viimeisin vaihe prekanseroosisten haiman vaurioita, mikä viittaa siihen, että

REG4

geenimonistuman on varhainen tapahtuma haimasyövän kehittämiseen. REG4 on pieni erittyvä proteiini, joka sisältää yhden hyvin säilyneitä hiilihydraatti-tunnustamista domain [14], [15]. REG4 on jäsenenä multigenic perheen nimeltä

reg

(tarkistetaan 19). Ihmisillä, viisi rakenteellisesti liittyvät jäseniä on tunnistettu tähän päivään mennessä, ja ryhmitelty kolmeen alaluokkaan, joka perustuu primaarirakenteet koodattujen proteiinien eli REG1A ja REG1B (tyyppi 1), REG3A ja REG3G (tyyppi 3), ja REG4 (tyyppi 4). Toisin kuin

reg1A

,

reg1B

,

reg3A

ja

reg3G

geenit, jotka kaikki sijaitsevat kromosomissa 2p12,

REG4

on kromosomi 1p13.1-p12. Useat raportit kirjallisuudessa viittaavat merkittävä rooli REG4 syövän. Esimerkiksi, REG4 ilmentyminen näyttää olevan vastuussa solun resistentiksi syöpälääkkeet, kuten 5-fluouracil ja metotreksaatin [15], [20], se edistää AKT-fosforylaation ja yli-ilmentyminen antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2, Bcl-xL: n ja surviviini [21], [22], se aktivoi EGF-reseptorin /Akt /AP1 signalointireitille [21] ja sen ilme korreloi parannetun vatsakalvon etäpesäke mahakarsinoomat [22], [23]. Se on systemaattisesti yliekspressoituu syöpäkudoksiin johdettu paksusuolen [15], [24], vatsa [16], eturauhassyöpä [25] ja haiman [18] ja sairauksien altistavia paksusuolen syövän, kuten haavainen paksusuolen tulehdus [14], [26] , Crohnin tauti [14] ja peräsuolen adenooman [24]. Varhainen monistaminen sen geenin haimasyövän kuvataan tässä tutkimuksessa (kuviot 1 ja 2) ja sen onkogeeninen aktiivisuus raportoitu kirjallisuudessa sai meidät lisätutkimuksia roolia REG4 haiman kasvainten muodostumiseen ja vastus haimasyövän ja gemsitabiinihoidon. Ensimmäinen havainto oli se, että haimasyövän peräisin olevat solut yli-ilmentävät REG4 proteiinin kasvoi nopeammin ja olivat enemmän resistenttejä gemsitabiinihoidon (kuvio 4). Toinen, tärkeämpi havainto oli, että ksenograftimallia, kasvaimia indusoitiin Mia-PaCa2 solut, jotka ilmentävät REG4 kasvoivat nopeammin kuin kontrolli kasvaimet, saadaan natiivi Mia-PaCa2 soluja (kuva 5). Lisäksi olemme havainneet, että kasvaimia aiheuttama Mia-PaCa2 solut, jotka ilmentävät REG4 olivat vastustuskykyisempiä gemsitabiinihoidon kuin kontrolli kasvaimia, kanssa

in vitro

tietojen ja edellisten raporttien mukaan osallistuminen REG4 solussa vastustuskykyä syöpälääkkeiden [15], [20] ja vastauksena kemosädehoito [27]. Kolmas, hyvin jännittävä tulos saatiin, kun hiirillä, joilla Mia-PaCa2 aiheuttama kasvaimia käsiteltiin systeemisesti erityinen anti-REG4-vasta-ainetta (kuvio 6). Havaitsimme merkittävän kasvaimen koon pienentyminen ja lisääntynyt herkkyys gemsitabiinihoidon hiirillä annetaan kerran viikossa anti-REG4 vasta-aine. Koska rajallinen tehokkuus haimasyövän gemsitabiinihoidon voi johtua läsnäolosta strooman tuumoreissa [28], me katsoimme onko REG4 yli-ilmentyminen vaikutti laajuutta strooman muodostumisen ihon alle ksenosiirrettyjä Mia-PaCa2 soluissa. Semikvantitatiivinen analyysi ei paljastanut mitään merkittävää eroa kasvaimia yli-ilmentävät tai eivät REG4, tai käsitelty REG4 vasta-ainetta, jotka kaikki osoittavat hyvin vähän strooman (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin meidän tulokset voitaisiin selittää ainakin osittain siitä, että tasot antiapoptoottisten liittyvien proteiinien, kuten aktivoitu AKT, Bcl-2, Bcl-x L ja elossa, sekä solusyklin liittyvä proteiini sykliini D1 , voimakkaasti vähentynyt (kuva 7) osoittaa, että apoptoosin ja solusyklin säätelee REG4. Koska vasta-aineita ei pitäisi tunkeutua kasvainsoluihin suurina määrinä, autokriini tai parakriinistä vaikutus on otettava huomioon. Kun eritystä kasvainsolujen, REG4 aktivoisi, luultavasti spesifisten reseptorien kautta, solunsisäisiä reittejä, jotka suosivat syövän etenemisessä. Nämä tiedot ovat yhtä mieltä osumaa paksusuolen ja mahalaukun syövän solut

in vitro

[21], [22]. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen REG4 proteiinin, aiheuttama sen varhainen voitto geenikopiomäärä, on merkittävä rooli haiman kasvainten kehittymiseen ja kestävyys syöpälääkkeiden. Kohdistaminen kiertävä REG4 proteiini näyttää lupaavalta adjuvantti nykyisiin hoitoihin haiman adenokarsinooma, joka perustuu gemsitabiinin annon.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimus

REG4

geenikopiomäärä haimasyöpä

Neljätoista peräkkäisen haimasyöpä näytteet saatiin endoskooppinen ultraääni (EUS) -Opastettu hieno neula pyrkimys sytologia välillä kesäkuu 2007 ja syyskuun 2007 sairaalassa Nord, Marseille. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. Kuusi näytteet saatiin potilailta, joilla havaittavissa etäpesäke taas 8 esitetään etäpesäkkeitä klo aikaan punction. DNA uutettiin, monistettiin ja hybridisoitiin on Affymetrix genominlaajuisten ihmisen SNP array 6.0 mukaan valmistajan ohjeiden (Affymetrix Inc.). Affymetrix genominlaajuisten Human SNP Array 6.0 sisältää yli 1,8 miljoonaa merkkiaineita geneettinen vaihtelu, mukaan lukien yli 906600 yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) ja yli 946000 antureista havaitsemiseksi kopioluvun vaihtelua. Mediaani välinen markkeri matkan siirtyivät kaikki 1,8 miljoonaa SNP ja kopioluvun markkereita yhdistettynä on 696 emästä. Array sisältää myös 202000 antureista kohdistaminen 5677 tiedossa alueilla kopioluvun vaihtelu, ratkaista osaksi 3182 erillisiä, ei-päällekkäisiä segmenttejä, Toronton Database Genomisen vaihtoehdot. Hybridisaatio, pesu, värjäys, ja siru skannaus suoritettiin jonka CRCHUL mikrosirulla Core Facility käyttäen materiaaleja ja menetelmiä, joita valmistaja (Affymetrix Inc.).

Yleisesti hybridisaatio laatu arvioitiin puhelutaajuuden indeksin saatu GeneChip- Genotyyppausanalyysiin Software (GTYPE, birdseed algoritmi oletusparametriasetuksilla). Alleelisia suhteet laskettiin Partek Genomics Suite, versio 6.4 (Partek Inc., St. Louis, MO) käyttäen omaa oletusparametrit. 270 HapMap näytteet luotiin kopioluvun lähtötasosta. Genominen segmentointi käytettiin menetelmänä havaita kopioluvun muutoksia. Alueet havaittiin käyttäen seuraavia segmentointia parametrit: vähintään 10 genomista markkerit; segmentointi p-kynnysarvo alempi kuin 0,001; ja signaali-kohina 0,3. Käyttämällä näitä parametreja, 10263 segmenttejä havaittiin. Valitut segmentit visualisoitiin genomista yhteydessä kanssa Partek® Genomics Suite.

DNA Panin vaurioita

Seven mikronia osastoja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin kudosblokeista värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Homogeeninen solupopulaatiota huolellisesti microdissected käyttäen PixCell II Laser Capture Mikrodissektiomenetelmiä System (Arcturus, Mountain View, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. PanINs luokiteltiin 1-3 mukaisesti nykyisten suositusten (https://pathology.jhu.edu/pancreas_panin/ja [29]) funktiona merkityksestä arkkitehtuurin ja sytologinen poikkeavuuksia. Seitsemän ihmisen haiman Näytteet analysoitiin jota systemaattisesti löydetty PanIN2 ja PanIN3 vaurioita, mutta PanIN1 leesioita havaittiin vain 6 niistä. Kaikkiaan 300 solua kerättiin kunkin luokan valmistusnumerosta kudosleikkeiden. Kerätyt solut siirrettiin Eppendorf-putkeen ja suspendoitiin uudelleen 20-50 ul: aan lyysipuskuria, joka sisälsi 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20: tä (pH 8,3), ja 5 ui proteinaasi K (20 mg /ml). Näytteitä inkuboitiin 24 tuntia 55 ° C: ssa ja sen jälkeen keittämällä 10 min inaktivoimiseksi proteinaasi K DNeasy Tissue Kit (Qiagen) käytettiin DNA: n uuttamiseksi mukaan valmistajan protokollaa. Uutettu DNA kvantitoitiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE).

REG4

geenikopiomäärä arvioon Real-Time PCR

REG4

geenin kopioluku määritettiin käyttäen hreg4-F: 5′-TTTACTCCCTGTGGTCTGGG-3 ’ja hreg4-R: 5′-CTCTTTTCTCCAGCAAGGCA-3’-alukkeina. Monistaminen suoritettiin LigthCycler 480 (Roche Diagnostic) käyttäen seuraavaa aikataulua: 10 s denaturaatio 95 ° C: ssa, 45 sykliä 8 s denaturaatio 95 ° C: ssa, 7 s lämpökäsittely 60,5 ° C: ssa ja 14 s 72 ° C ° C. Sulamiskäyräanalyysillä saatiin kuumentamalla 20 ° C /s 95 ° C: ssa, jäähdytys nopeudella 20 ° C /s 65 ° C: ssa, ja kuumentamalla 0,1 ° C /s 95 ° C: ssa fluoresenssi tiedonkeruun 0,1 ° C: n välein. Standardikäyrät muodostettiin käyttämällä 10-kertaista laimennussarjaa alueella 0,1 ng: sta 100 ng. Suoritimme qPCR kunkin yksittäisen kolmena kappaleena ja määritetään normalisoitu suhteellinen kopiomäärä tuottamalla standardikäyrä ja normalisoida poikki näytteitä. PCR tulokset analysoitiin käyttämällä RealQuant ohjelmisto (Roche Diagnostic). Sama 14 DNA-näytteet haimasyöpä käyttää hybridisaatioon on Affymetrix genominlaajuisia ihmisen SNP array 6.0 käytettiin qPCR. DNA verestä leukosyytit saadaan ilmeisesti terveistä yksilöistä käytettiin kontrollina.

retrovirusvektorin ja retroviruksen geeninsiirto

koko koodaava sekvenssi REG4 cDNA monistettiin PCR: llä käyttämällä alukeparia 5 ”-GGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGCGG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GGCTCGAGCTATGGTCGGTACTTGCACAGG-3’ (taaksepäin), joka sisälsi EcoRI- ja Xhol-restriktiokohdat (alleviivattu). Tuote alikloonattiin EcoRI-Xhol-restriktiokohtien pLPCX retrovirusvektorin saatu S. Lowe (Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Phoenix amfotrooppinen pakkaus- soluihin, (10

6) maljattiin kuuden kuoppalevyllä, inkuboitiin 24 tuntia ja transfektoitiin polyetyleeni-5 ug retroviruksen plasmidia. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, väliaine, joka sisälsi viruksen suodatettiin (0,45 um: n suodattimen, Millipore), jolloin saatiin ensimmäinen supernatantti. Target Mia-PaCa2 maljattiin 2 x 10

5 solua kohti 35 mm lautasen ja inkuboitiin yön yli. Infektion, elatusaine korvattiin sopivan yhdistelmän ensimmäisen supernatantin ja kasvatusliuosta (v /v), jota oli täydennetty 4 g /ml polybreeniä (Sigma), ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Väestöstä REG4 ilmentävien Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /REG4) eristettiin valinnan läsnäollessa puromysiinin (1 mg /ml). Mia-PaCa2 tartunnan tyhjän vektorin (Mia-PaCa2 /tyhjä) käytettiin kontrollina.

in vitro

tutkimuksissa

Solun viljelyolosuhteet ja siRNA transfektio.

haimasyövän solulinjoissa Mia-PaCa2 /REG4 ja Mia-PaCa2 /tyhjä kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 2 mM L-glutamiinia kostutetussa 5% CO

2 ilmakehässä. Päivää ennen siRNA transfektion jälkeen solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille, ja lopulta saatiin 30-50% konfluenssiin. Poistamisen jälkeen väliaineen, solut pestiin kerran seerumittomalla alustalla ja transfektio tehtiin seerumia lisäämällä sekoitus, joka koostuu 10 ul: Oligofectamine reagenssia (Invitrogen) ja 200 pmol siRNA (REG4 siRNA [5’CTTCAGGAAGCTGAGGAAC3 ’ ] tai ohjaus siRNA [5’AATTCTCCGAACGTGTCACGT3 ’] kohdennetut sekvenssit) laimennettuna 240 ul seerumia. Itämisajan jälkeen 4 tuntia 37 ° C: ssa, transfektioväliaine sisältävä siRNA korvattiin tuoreella alustalla.

Solun kasvua ja gemsitabiinihoidon.

10

4 solua /kuoppa oli ympättiin 96-kuoppaisille levyille 100 ul: ssa viljelyalustaa. Seuraavana päivänä, gemsitabiini (ostettu Eli Lilly), lisättiin 100 ui elatusainetta loppukonsentraatioon 50 uM: n läsnä tai ei ole 1 ug: n REG4 monoklonaalinen vasta-aine. 48 tunnin jälkeen, 20 ui MTS ([3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium] reagenssi saatu Promega) lisättiin levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja absorbanssi luettiin 490 nm: ssä.

in vivo

tutkimuksissa

arviointi

in vivo

kasvaimen kasvua.

Institutional suuntaviivat asianmukaisesti ja ihmisten käyttöön tutkimuksessa seurattiin. Noin 2 x 10

6 Mia-PaCa-2-soluja istutettiin ihonalaisesti 0,1 ml Matrigel (BD Biosciences Discovery Labware) 6 viikon ikäisiä nude-hiirissä. Yksi päivä ennen tuumori- solujen inokulaation Kontrolliryhmä sai intraperitoneaalisesti 150 ui PBS: ää (ajoneuvo), kun taas määritys ryhmä sai 0,25 mg REG4 monoklonaalista vasta-ainetta 150 ul: ssa PBS: ää. Apuainepuskurissa tai anti-REG4-vasta ruiskutettiin viikoittain eläimillä. Kasvaimen mitat mitattiin kerran viikossa ja kasvainten lasketaan kaavalla pituus x leveys x syvyys x 0,5236 aiemmin raportoidun [30]. Gemsitabiini (100 mg /kg) injektoitiin vatsakalvonsisäisesti kahdesti viikossa. Kaikki tutkimukset suoritettiin mukaisesti Euroopan unionin määräyksiä eläinkokeita. Kokeet hyväksynyt eettinen komitea Marseille yliopistossa.

Western blot-analyysi.

Mia-PaCa2 solujen ja kasvaimen kudosnäytteet hajotettiin homogenisointipuskurissa sisältävä pepstatiinista (1,45 mM), leupeptiiniä (2,1 mM), DTT: tä, trietanoliamiinia (50 mM) ja EDTA /EGTA (0,1 mM). Solujätteen ja liukenemattomat materiaalit poistetaan sentrifugoimalla (14000 g, 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa), ja liukoinen fraktiot joko määritettiin välittömästi tai niitä säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kokonaisproteiinista (50 ug) ladattiin Laemmli-puskurissa päälle 12,5% SDS-polyakryyliamidigeelillä Mini Cell (Bio-Rad). Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille 1 tunnin ajan käyttäen Mini Trans-Blot Elektroforeettisen Transfer Cell (Bio-Rad). Membraani blokattiin 1 x PBS /0,05% Tween 20/5% rasvatonta kuivamaitoa yön yli 4 ° C: ssa. Kahden pesun jälkeen 1 x PBS /0,005% Tween 20, ensisijainen vasta-aineita lisättiin 1-2 tuntia. Kolmen useampia pesuja, sekundaarinen vasta-aine lisättiin 1,5 tunnin ajan. Kalvo kehitettiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL) (Amersham Life Science) Kodak elokuvan pimeässä huoneessa. Sitten membraania riisuttu ja uudelleenseulottiin varten β-aktiini käyttämällä kuvattua ECL kit.

Antibodies.

Anti-ihmisen REG4 monoklonaalinen vasta-aine (klooni 200214) ostettiin R D Systems; Bcl-2 (C21), Bcl-x L (H-62), surviviini (FL-142), sykliini D1 (C20) ja β-aktiini (N-21) kanin polyklonaalisia vasta-aineita olivat Santa Cruz Biotechnology; fosforyloidun AKT (fosfo-Ser473) polyklonaalinen vasta-aine oli Upstate Biotechnology Inc;