Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on todettu epänormaaliin ilmentymiseen tai mutaatio Ras proteiineja. Onkogeeninen Ras aktivointi hyödyntää niiden laaja signalointi ulottuville vaikuttaa useiden solujen prosesseja, joissa mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) signalointi kiinnostavuus tärkeä rooli kasvainten synnyssä. Therapies kohdennetut Ras ovat siten merkittävä etu haimasyöpä. Vaikka pieni molekyyli APY606 on onnistuneesti poiminut virtuaalisilla lääkeseulontamenetelmä perustuu Ras reseptoria, sen perusteellista mekanismi on vielä selvittämättä. Olemme tässä arvioitiin antituumorivaikutuksen APY606 ihmisen haimasyövän Capan-1 ja SW1990 solulinjojen ja tutkia vaikutusta Ras-MAPK ja apoptoosiin liittyvien signalointireitin aktiivisuuteen APY606. APY606 hoito johti annoksesta ja ajasta riippuvaa inhibitio syöpäsolun elinkelpoisuuden. Lisäksi APY606 osoitti vahvaa antituumorivaikutus, mistä on osoituksena paitsi väheneminen kasvainsolun invaasiota, muuttoliike ja mitokondrion kalvon potentiaalia, mutta myös muutoksiin useissa apoptoottisen indekseissä. Lisäksi APY606 hoito suoraan esti Ras-GTP ja loppupään MAPK, joka johti alas-säätely anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2, joka johtaa ylös-säätely mitokondrioiden apoptoosireitin liittyviä proteiineja (Bax, sytosolin Sytokromi

c

ja kaspaasi 3) ja sykliini-riippuvaisen kinaasin 2 ja sykliini, E. Nämä tulokset viittaavat siihen, että haittaamatta Ras-MAPK signalointi on uusi vaikutusmekanismi varten APY606 aikana terapeuttinen intervention haimasyövän.

Citation: Guo N, Liu Z, Zhao W, Wang E, Wang J (2016) pienimolekyylisiä APY606 Näyttää laaja antituumorivaikutus in Haimasyöpä kautta haittaavaa Ras-MAPK Signaling. PLoS ONE 11 (5): e0155874. doi: 10,1371 /journal.pone.0155874

Editor: Hiroyasu Nakano, Toho University School of Medicine, JAPAN

vastaanotettu: 29 maaliskuu 2016; Hyväksytty: 05 toukokuu 2016; Julkaistu: May 25, 2016

Copyright: © 2016 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

rahoitus: kirjoittajat haluavat tunnustaa seuraavat rahoituslähteet, jotka tukivat tätä tutkimusta: National Natural Science Foundation of China (81573448, 11174105, 91227114 ja 91430217), National Science Foundation (MCB- 0947767) ja Natural Science Foundation of Jilin (20150101009JC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on tappava tauti johtuu haiman adenokarsinooma sijoittuminen neljänneksi syöpään liittyvien kuolemien [1]. Luonne tämän kasvain on ominaista huono tulos kaikissa vaiheissa taudin ja vain 1-4% haimasyövän potilaat ovat yhä elossa 5 vuotta diagnoosin [2]. Erilaiset hoito-ohjelmat eivät merkittävästi parantaa potilaiden selviytymiseen [3,4]. Solunsalpaajahoito haimasyövän johtuu pääasiassa monilääkeaineresistenssin ja annosta rajoittava haittavaikutuksia. Tähän mennessä se on epäselvää, miten solunsisäisen signaloinnin reittejä johtaa poikkeavaan biologisia ominaisuuksia haimasyövän. Lisäksi se on edelleen vähän tunnettu siitä, miten farmakologisen estoja erityisiä signalointireittien parantaa vastetta haimasyövän soluja tavanomaisen kemoterapian [5]. Siksi tulevia pyrkimyksiä kohti kehittää uusia hoidon parantamiseksi selviytymistä ja elämänlaatua potilaiden haimasyöpä tulisi sisältää uuden strategian tutkia tehokkaita syöpälääkkeiden [6].

Ras proteiinit ovat keskeisiä sääntelyn komponentteja, joissa normaalissa solujen kasvua, erilaistumista ja pahanlaatuisiksi [7]. On arvioitu, että lähes 90% haimasyövistä ole todettu epänormaali ilmentyminen tai mutaatio Ras proteiinien [8]. Onkogeeninen Ras aktivointi hyödyntää niiden laaja signalointi ulottuville vaikuttaa useiden solun prosessien, myös tukahduttaminen apoptoosin ja edistäminen leviämisen [9]. Ohjelmoidun solukuoleman tai apoptoosin, on normaali fysiologinen prosessi, jossa yksittäinen solu kuolee ja poistetaan tietyssä populaatiossa. Apoptoottisen solukuoleman aloitti luonnostaan ​​kautta mitokondrioissa välittämää reitin toimii ratkaiseva puolustusmekanismi vastaan ​​maligniteetti, ja korruptio apoptoottisen koneiston on ratkaiseva allekirjoitus syöpäsoluja [10]. Onkogeeninen Ras-ajettu eroosiota apoptoottisen reitin ja sen osuus syöpiin on hyvin dokumentoitu [11]. Niistä alavirran signalointikaskadien Ras, mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) Cascade on raportoitu tärkeitä rooleja syövän kehittyminen [12-14]. Yksi tärkeimmistä rooleista, Ras-MAPK-reitin monenlaisia ​​nisäkässoluissa, on säätely solusyklin siirtyminen [15]. Proliferatiivinen generoimat signaalit onkogeeninen Ras huipentuu säätelyn useiden transkriptiotekijöiden käynnistävät Sykliini, että attribuutin aktivoinnin Ras-MAPK-reitin. Onkogeeninen Ras voi edistää solusyklin etenemistä estämällä sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK). Suppressii- vaikutus välittyy useiden Ras efektori reittejä kuten Ras-MAPK-reitin [16,17]. Meidän ymmärrys, osuus onkogeenisten Ras näihin prosesseihin on epäilemättä jännittävä katu syöpätutkimuksen tulevina tulevaisuudessa.

On tunnettua, että pienet molekyylit ovat elintärkeitä tehtäviä syövän kemoterapiassa. Pieni-molekyyli estäjä, APY606 oli poiminut virtuaalisilla lääkeseulontamenetelmä perustuu Ras kohdistaa reseptorin tuoreessa työssä [18]. Kuitenkin sen taustalla olevan mekanismin syövän ominaisuuksia on huonosti ymmärretty. Tässä perusteellisen tutkimuksen tehtiin arvioimaan sen syöpää taistelevat luonto vastaan ​​haimasyöpä Capan-1 ja SW1990 solulinjoissa. Nämä tulokset osoittavat, että APY606 indusoiman apoptoosin johtuu aktivointi luontaisen mitokondrioiden apoptoottisen reitin ja ehkäisyyn Ras-MAPK-reitin cascade. Samanaikaisesti APY606 Lisäksi havaittiin aiheuttavan S-vaiheeseen pidätyksen ja hidastaa etäpesäke kahdessa solulinjassa huonontamalla Ras aktivointia. Näin ollen meidän tutkimus luovat perustan kohdennettujen Ras lääkekehityksen ja APY606 terapeuttinen käyttö haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), L-15 soluviljelyalustaan ​​ja naudan sikiön seerumia (FBS) saatiin Gibco (Grand island, NY). Kaikki muut reagenssit hankittiin Sigma (St. Louis, MO). APY606 oli ystävällisesti antaa NCI /DTP Open Chemical Repository (https://dtp.cancer.gov) ja sitten varmistettiin HPLC ja ESI-MS. Ensisijainen vasta-aineita ihmisen kaspaasi-3, kaspaasi-9, sytokromi

c

, Bcl-2, Bax, c-Raf, ERK, Perk, MEK, pMEK, sykliini A, sykliini E ja CDK2 ostettiin Santa Cruz ja BD Bioscience, vastaavasti. Vasta-aineet ihmisen GAPDH ja β-aktiini saatiin Santa Cruz.

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen haimasyövän Capan-1 ja SW1990 solulinjat saatiin Cell Bank of Type Culture Collection Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina) ja viljeltiin DMEM ja L-15, joka sisälsi 10% FBS, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, vastaavasti. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2-inkubaattorissa. Tässä prosessissa soluviljelmässä ei ollut mitään vaikutusta mykoplasmoihin kahteen solulinjoissa, joka vahvistettiin fluoroväriä DNA värjäys testi. APY606 liuotettiin DMSO: hon (dimetyylisulfoksidi), ja juuri laimennettua haluttuun pitoisuuteen kahteen kertaan tislatulla vedellä välittömästi ennen käyttöä. Lopullinen DMSO-konsentraatio on elatusaineet on 0,1% (v /v). Kontrollisoluihin saivat vehikkeli, joka koostui kahdesti tislattua vettä, joka sisälsi 0,1% DMSO: ta vain, joka ei merkittävästi vaikuta solujen.

kasvun inhibitiotesti

Cell Counting Kit-8 (CCK-8 ) (Dojindo, Japan) määritys suoritettiin tutkimaan vaikutusta APY606 sytotoksisuuteen. Lyhyesti, Capan-1 ja SW1990 solulinjoja siirrostettiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 solua /kuoppa tilavuudessa 100 ui. Yön yli inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla APY606 24 h ja 48 h, vastaavasti. Sitten solut altistettiin 10 ui CCK-8 reagenssia 3 h; optinen tiheys 450 nm: ssä luettiin M200 PRO NanoQuant Autoreader (TECAN, Sveitsi). Tässä määrityksessä, CCK-8 ei häiritse APY606 ja aiheuttaa positiivisen vasteen. Mittaukset tehtiin vähintään viisi kertaa.

Colony muodostavat määrityksessä

testaamiseksi solujen eloonjääntiä käsiteltiin APY606, Capan-1 ja SW1990 solulinjoja istutettiin 24-kuoppaisille levyille ( 200-300 solua per kuoppa) ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Soluja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi APY606 pitoisuuksiin 2, 4, 6, 8 ja 10 ug /ml 6 päivää. Tämän jälkeen solut kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 5% Giemsa ja pesäkkeet (yli 50 solua) laskettiin käännettyä mikroskooppia (AMG Evos, Life).

Nuclear fluoresenssi

APY606 aiheuttama ydin- tiivistyminen ja elimellisen muutoksen havaittiin käyttämällä DAPI (4,6-diamino-2-fenyyli). Capan-1 ja SW1990 solulinjoissa (5 x 10

6 solua per levy) kasvatettiin lasille-pohjalevyt 50% konfluenssiin ja viljeltiin sitten keskipitkällä läsnäollessa 6,25, 12,5 ja 25,0 ng /ml APY606 varten 24 h, vastaavasti. Solut kiinnitettiin 3,5% paraformaldehydillä ja sitten inkuboitiin nestemäisessä sisälsi 2 mg /ml DAPI 20 min. Ydin- morfologia solujen havaittiin fluoresenssimikroskopialla (AMG Evos, Life).

kvantifiointi solun apoptoosin

Varhain apoptoosin, fosfatidyyliseriini (PTS) kulkeutua ulommalle solukalvon ja voi voidaan tunnistaa sitomalla anneksiini V, ligandi PTS. Apoptoottisten Capan-1 ja SW1990-soluissa kvantitoitiin käyttämällä anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) apoptoosin detektioreagenssipakkaus (Abcam, UK) sen jälkeen, kun solut käsiteltiin APY606 eri pitoisuuksina (6,25 ja 12,5 ug /ml) 24 tuntia. Lyhyesti, solut trypsinoitiin ja pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä ja sitten solut suspendoitiin uudelleen tiheydellä 1 x 10

6 solua /ml sitomispuskuria (10 mM HEPES /NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl

2). Sen jälkeen soluja inkuboitiin 5 ui anneksiini V-FITC: tä ja 5 ui PI pimeässä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja alistettiin virtaussytometria-analyysi (FACSAria, BD Biosciences). Kaikkiaan 10.000 tapahtumaa analysoitiin kussakin näytteessä. Tietojen analysointi suoritettiin Diva 6.0 -ohjelmisto (BD Biosciences).

mittaus mitokondrion kalvon potentiaalia

Mitokondrioiden kalvon potentiaali (ΔΨm) on ominaisuus allekirjoitus apoptoosin mitokondrio liittyvän reitin . ΔΨm voidaan mitata käyttämällä fluoresoivaa koetinta JC-1. Lyhyesti, Capan-1 ja SW1990 solulinjoja istutettiin 6-kuoppaisille levyille (5 x 10

5 solua kuoppaa kohti) ja käsiteltiin APY606 pitoisuus on 6,25 ja 12,5 ug /ml 24 tuntia. Solut pestiin PBS: lla ja inkuboitiin 500 ul: aan JC-1 työliuosta 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 20 minuutin ajan. Sen jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 500 ui inkubointipuskuria, jonka jälkeen visualisointi konfokaali laserskannaus mikroskoopilla (CLSM, Leica TCS SP2). JC-1 viritettiin 488 nm laservaloa ja päästöjen vangittiin 530 nm: ssä [19]. Väheneminen punainen /vihreä fluoresenssi-intensiteetin suhde osoittaa menetys ΔΨm syöpäsoluissa.

määritys Ras-GTP

Capan-1 ja SW1990 solulinjoja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa yön yli, ravinnotta 8 tuntia alustassa, joka sisälsi 1% FBS: ää ja käsiteltiin sitten 24 tuntia erilaisilla pitoisuuksilla APY606. Lopussa hoidon, soluja stimuloitiin EGF: ää (10 ng) 10 minuutin ajan. Sen jälkeen solut hajotettiin ja solujen lysaatti prosessoidaan Ras-aktivaation määritys kit (Upstate, Millipore). Yhteensä Ras ja aktiivinen Ras-proteiinit havaittiin käyttäen Western blot-määritys, kuten on kuvattu alla.

virtaussytometrinen kvantifiointi Perk

ilmentymisen määrän fosforyloitua ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (Perk) oli lukema Ras-MAPK-reitin cascade. Inhibition mittaamiseksi missä määrin ERK aktivointi kokeellisesti, virtaussytometria-analyysiä käytettiin saadaan kvantitatiivista yksisoluiset mittaus määrän Perk. Lyhyesti, Capan-1 ja SW1990 solulinjoja käsiteltiin APY606 pitoisuus on 6,25 ja 12,5 ug /ml 24 tunnin ajan, sitten kiinteä ja permeabilisoitiin Cytofix /Cytoperm kit (Becton Dickinson, Mountain View). Sentrifugoinnin jälkeen 0,05 ug vasta-ainetta kuoppaa kohti 100 ui vasta-aineen seosta Alexa Fluor 488 konjugoitu ERK1 /2-vasta-aine (anti-fosfo-p44 /42 MAP-kinaasin, Thr202 /Tyr204, BD Bioscience) lisättiin ja inkuboitiin 1 h jäällä . Pesun jälkeen näytteet analysoitiin fluoresenssi soluerottelijaa FACSAria (BD Bioscience) ja prosenttiosuus värjättyä solua kussakin neljänneksessä kvantitoitiin käyttäen Diva 6.0 -ohjelmisto (BD Bioscience). Kaikkiaan 10.000 tapahtumaa analysoitiin kussakin näytteessä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Solusyklianalyysiä

testaamiseksi voimakas mekanismi APY606-indusoidun solun kasvun inhibitiota, vaikutus APY606 hoidon solusyklin jakautuminen on tutkittu flow cytometry. Lyhyesti, Capan-1 ja SW1990 solulinjoja siirrostettiin (1 x 10

6 solua per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle) ja käsiteltiin APY606 pitoisuus on 6,25 ja 12,5 ug /ml 24 h, vastaavasti. Solut suspendoitiin, kiinnitettiin 70% (v /v) etanolia 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää, joka sisälsi 50 ug /ml PI: n ja 1 mg /ml RNaasiA huoneenlämpötilassa pimeässä 30 minuuttia. Kaikkiaan 10.000 tapahtumaa analysoitiin välittömästi kussakin näytteessä virtaussytometrillä (FACSCalibur, BD Biosciences). Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Haavan paranemista määrityksessä

tutkia vaikutuksen APY606 on motiliteettia kykyä syöpäsoluja, haavojen määritys arvioitiin solun motiliteettia APY606 saaneista soluista. Capan-1 ja SW1990 solulinjat maljattiin 24-kuoppaisille viljelylevyille ja sitten sijoitettiin mikropipetin avulla kärki. Väliaine korvattiin 12,5 ug /ml APY606 täydellisessä väliaineessa, ja solumigraatio seurattiin CLSM 24 tuntia. Kuvat otettiin, ja haavan etäisyys (verrattuna kontrolliin 0 h) mitattiin kolmen riippumattoman haavojen ryhmää kohti. Suhteellinen soluliikkuvuus verrataan, kun haava leveyden ero 0 h ja 24 h.

Trans-Kaivokammio määritys

edelleen vaikutuksen tutkimiseksi APY606 on hyökkäyksen kykyä syöpäsoluja , Matrigel trans-kaivokammio määritys suoritettiin. Capan-1 ja SW1990 solulinjoja istutettiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10

5 solua /kuoppa ja viljeltiin 24 tuntia. Sen jälkeen kun soluja ilman ravintoa 24 tuntia, soluja käsiteltiin 12,5 ug /ml APY606. Sen jälkeen solut kerättiin ja 1 x 10

5 solut laimennettiin seerumittomalla väliaineella maljattiin laajuisten hyvin yksiköihin polykarbonaattisuodattimille (Cambridge, MA), joka sisältää 8 um huokosia. Polykarbonaattikalvon oli esipäällystetty 250 ug /ml matrigeeliin (BD Biosciences). Pohja kammiot täytettiin 600 ui alustalla, joka sisälsi 5% FBS. 24 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin metanolissa ja värjättiin akridiinioranssia (AO, Dingguo, Kiina). Yläpinta kalvon varovasti hangata pumpulipuikolla, ja solut tunkeutuvat suodattimien läpi kalvon laskettiin lasipohja kulttuuriin levyt, ja kuvia, jotka vastaavat koko kalvon pinta oli vangiksi CLSM.

Western blotting-analyysi

selkeyttämiseksi taustalla olevien mekanismien APY606 aiheuttamaa apoptoosia ja solukierron pysähtymisen molekyylitasolla, Western blotting analyysit tutkittiin. Capan-1 ja SW1990 solulinjat pestiin kylmässä PBS: ssä 24 tunnin kuluttua hoidon APY606 pitoisuus on 6,25 ja 12,5 ug /ml. Sen jälkeen, kun solun proteiinit uutettiin ja kvantitoitiin, sama määrä proteiinia, tehtiin elektroforeesi 10% SDS-PAGE-geelillä ja tämän jälkeen siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Millipore, Bedford, MA). Sen jälkeen PVDF-kalvo tutkittiin ilmoitetun primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa ja edelleen blotattiin asianmukaiset piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Visualisointi suoritettiin käyttäen kemiluminesenssi-ilmaisimen (DNR, Kiryat Anavim, Israel). Proteiini taso normalisoitiin käyttämällä GAPDH tai β-aktiini sisäisenä kontrollina.

Tilastollinen

Tulokset esitetään keskiarvona ± SD kolminkertaisten kokeiluja. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 11.5 tilasto-ohjelmalla.

Tulokset

1. APY606 estää leviämisen Capan-1 ja SW1990 solulinjoissa

tutkia mahdollisuuksia kasvun esto APY606 kahdessa syöpäsolun riviä, pitoisuudesta riippuvainen estovaikutus APY606 kasvuun Capan-1 ja SW1990 solu linjat arvioitiin, kuten on esitetty kuviossa 1A. Kun Capan-1-solut käsiteltiin APY606 pitoisuutena 12,5, 25,0 ja 50,0 ug /ml 24 h, prosenttiosuus kasvun inhibitio kontrolliin nähden soluja (100%) oli lähes 21,0 ± 2,6%, 81,3 ± 0,5% ja 93,3 ± 0,6%, vastaavasti. Näin ollen, prosenttiosuus inhiboi SW1990-soluissa yli kontrollisoluja (100%), oli 52,3 ± 1,5%, 82,3 ± 0,6% ja 90,0 ± 1,0%, vastaavasti. Kun Capan-1-solut käsiteltiin APY606 samoissa olosuhteissa 48 tuntia, prosenttiosuus kasvun inhibitio kontrolliin nähden soluja (100%), oli noin 50,0 ± 1,7%, 90,0% ja 93,0%, vastaavasti. Samaan aikaan, prosenttiosuus inhiboi SW1990-soluissa yli kontrollisoluja (100%), oli 71,7 ± 3,2%, 75,3 ± 1,5% ja 87,3 ± 2,3%, vastaavasti. IC

50 vastinetta APY606 oli 14,3 ± 1,3 mikrog /ml (24 h) ja 9,5 ± 0,6 mikrog /ml (48 h) Capan-1-soluissa sekä 10,3 ± 1,1 ug /ml (24 h) ja 6.8 ± 2.3 ng /ml (48 h) SW1990-soluissa, vastaavasti. Lisäksi olemme myös tutkineet vaikutusta APY606 on eloonjäämisaste Capan-1 ja SW1990 solulinjoissa pesäkkeitä muodostavien määrityksessä. APY606 käsittely johti merkittävään inhibitioon pesäkkeenmuodostusta kahdessa solulinjassa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1B). Yhdessä tuloksemme osoittivat, että APY606 indusoi konsentraatiosta riippuvaisen estäviä vaikutuksia kasvuun ja eloonjääminen sekä Capan-1 ja SW1990 solulinjat.

Soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla APY606 24 ja 48 tunnin ajan ja sitten arvioitiin CCK-8 (A) ja pesäkkeitä muodostavien (B) määritys, vastaavasti. Esitetty data on keskiarvo ± SD kolmen erillisen kokeen. Tumavärjäystä kuvia (C) on ottanut fluoresenssimikroskoopilla 10 × tavoite. Mittakaavapalkki oli 20 um.

Lisäksi ydinvoiman morfologia solujen havaittiin DAPI joka on sininen fluoresenssi väriaine erityisesti sitovan A-T rikkaita alueita DNA. DAPI voi kulkea ehjän solukalvon vuoksi sitä voidaan käyttää värjäämään sekä elävien ja kiinteitä soluja, vaikka se läpäisee kalvon vähemmän tehokkaasti elävissä soluissa, ja siksi tehokkuus tahra on pienempi. Sininen fluoresenssi-intensiteetti Capan-1 ja SW1990 solulinjoja käsiteltiin APY606 pitoisuutena 6,25, 12,5 ja 25,0 ug /ml 24 h oli voimakkaampi kuin että kontrolliryhmissä vehikkeliä, kuten on esitetty kuviossa 1C. Lisäksi on selvää, että kondensoitunut ja hajanaiset ytimet nousi kanssa APY606 hoidon pitoisuudesta riippuvalla tavalla.

2. APY606 indusoi apoptoosia Capan-1 ja SW1990 solulinjat

arvioimiseksi apoptoosia indusoiva vaikutus APY606 on Capan-1 ja SW1990 solulinjojen lukumäärä apoptoottisten solujen määrä määritettiin käyttämällä virtaussytometria-analyysiä. Solut värjättiin positiivisia anneksiini V-FITC ja negatiivinen PI ovat apoptoosin; solut värjättiin positiivisia sekä anneksiini V-FITC ja PI ovat joko loppuvaiheessa apoptoosin meneillään kuolion tai jo kuollut; solut värjättiin negatiivisesti sekä anneksiini V-FITC ja PI ovat elossa ilman apoptoosin [20]. Kuten on esitetty kuviossa 2A, määrä apoptoottisten solujen oli vähäinen (0,4-1,0%) kontrollisoluissa kahden solulinjojen vehikkeliä. Kun taas prosenttiosuus alussa apoptoottisten solujen nostettiin 21,3 ± 3,5% ja 50,4 ± 5,5%, kun Capan-1-solut käsiteltiin APY606 6,25 ja 12,5 ug /ml 24 h, vastaavasti. 48 h hoito, arvot nousivat 22,0 ± 2,3% ja 54,4 ± 6,2%, vastaavasti. Vastaavasti samaan olosuhteissa, arvot olivat 23,4 ± 2,4% ja 63,9 ± 7,2% sekä 49,9 ± 3,5% ja 75,1 ± 6,3%, kun SW1990 solut altistettiin APY606 24 h ja 48 h. Tulokset osoittivat selvästi, että APY606 indusoi ajasta ja pitoisuudesta riippuvaista apoptoosia in Capan-1 ja SW1990 solulinjat.

prosenttiosuudet apoptoottisen solupopulaatioiden kahdessa solulinjassa, käsiteltiin 6,25 ja 12,5 ug /ml APY606 24 ja 48 h määritettiin käyttämällä virtaussytometrillä (A). Esitetty data on keskiarvo ± SD kolmen erillisen kokeen. Vaikutus APY606 hoidon proteiinit liittyvät apoptoottista polku mitattiin käyttäen Western blotting-analyysi. Edustaja blots vastaavien proteiinien näkyviin (B). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (C): Suhteellinen tiheys kohdeproteiinin kvantitoitiin ja piirrettiin.

tutkimiseksi mekanismiin APY606 indusoiman apoptoosin, arvioimme tasoa Bax, Bcl-2, sytosolin sytokromi

c

, ja kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 Capan-1 ja SW1990 solulinjoja käsiteltiin APY606 pitoisuus on 6,25 ja 12,5 ug /ml 24 tuntia käyttäen Western blotting -analyysi. Vaikutukset APY606 hoidon ekspressiotasoja pro-apoptoottisen proteiinin Bax ja anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 kokeellisesti tutkittu. Solujen käsittely lisäsi merkittävästi ilmentymistason Bax, mutta laski, että Bcl-2: n pitoisuus-riippuvaisella tavalla (kuvio 2B). Sytokromi

c

on yksi keskeinen välittäjiä mitokondrioiden tai luontainen apoptoottista kautta. Vapautuminen Sytokromi

c myynnissä maassa mitokondrion intermembrane tila on varhainen tapahtuma apoptoottista solukuolemaa [21]. Sinänsä vaikutukset APY606 hoidon vapauttamisesta sytokromi

c

kahdessa solulinjoissa arvioitiin. Altistuminen solujen APY606 havaittiin lisäävän vapautumista sytokromi

c myynnissä maassa mitokondrioiden sytosoliin pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 2C). Kun apoptoottiset stimulaatio, sytokromi

c

julkaissut kumppaniaan prokaspaasi-9 muodostaen kompleksin käsittely kaspaasi-9 välillä toimeton proentsyymisekvenssiä sen aktiivinen muoto, lopulta liipaisu kaspaasi-3 aktivaation ja apoptoosin [21]. Kuten on esitetty kuviossa 2B ja 2C, APY606 indusoi huomattavan pitoisuudesta riippuva kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 ja lopulta johti apoptoottista kuolemaa Capan-1 ja SW1990 solulinjat.

3. APY606 indusoi ΔΨm

ehtyminen ΔΨm on varhainen ja olennaisesti apoptoottista vaste syövän hoitoon. Mitokondrion häiriöitä aloittaa prosessin apoptoosin, joka myöhemmin johtaa kasvun estäminen. Tutkimaan edelleen mekanismi APY606 aiheuttaman apoptoosin, me määritti APY606 on ΔΨm in Capan-1 ja SW1990 solulinjoissa. Kationinen väriaine JC-1 on käyttökelpoinen havaitsemaan ΔΨm esiintyy varhaisessa vaiheessa apoptoosin [22]. Elävissä soluissa, JC-1 esittelee riippuvaisen kertymistä mitokondrioissa johtaa pitoisuudesta riippuvainen muodostumista punaisen fluoresenssin J-aggregaattien [23], joka osoittaa läsnä polarisoidun mitokondrioita. On Depolarisaatio, JC-1 monomeerin sitoutumisen mitokondrion kalvon johtaa vihreän fluoresenssin ja vähentää oranssinpunainen värjäystä. Näin ollen, mitokondrion Depolarisaatio osoitetaan lasku punainen /vihreä fluoresenssi-intensiteetin suhde. Suhde punaisesta vihreään fluoresenssiin riippuu vain kalvon mahdollisia eikä muiden tekijöiden, kuten mitokondrioiden koko, muoto ja tiheys, jotka voivat vaikuttaa yhden komponentin fluoresenssisignaalien.

Tässä ohjaus ja APY606 käsiteltyjen Capan-1 ja SW1990 solulinjat värjättiin JC-1 seurattiin CLSM. Kuten kuviossa 3, punaisten-fluoresoiva J-aggregaattien väheni merkittävästi kahdessa solulinjassa, käsiteltiin 6,25 ja 12,5 ug /ml APY606 kontrolliin verrattuna soluihin. Sen sijaan, vihreä fluoresenssi oli erityisen huomattava APY606-käsitellyissä soluissa, koska JC-1 monomeerin sitovia. Suhde vihreästä punaiseksi fluoresenssi kasvoi APY606-käsiteltyjen solujen pitoisuudesta riippuvaisella tavalla, mikä viittaa siihen, että fluoresenssin muutos oli osoitus ΔΨm. Menetys ΔΨm havaittiin alle APY606 hoito, mikä viittaa siihen, että mitokondrioita vaikuttaa erityisesti aikaisessa apoptoottisen prosessin.

Ohjaus- ja APY606 käsiteltyjä soluja värjättiin JC-1 seurattiin CLSM. J-kootusti (punainen fluoresenssi) ja J-monomeeri yksinään (vihreä fluoresenssi) olivat innoissaan at 568 ja 480 nm, vastaavasti. Mittakaavapalkki oli 20 um.

4. APY606 estää Ras-MAPK-reitin indusoivan apoptoottisen vasteen

Tavoitteena arvioida mahdollisesti kohdennetun Ras terapeuttinen strategia, ensin tutkittava inhibitio Ras-GTP aktiivisuuden soluun perustuva määritys. Teoriassa APY606 toimii vähentämään Ras-GTP toiminnan tasolla. Tämän huomioon ottamiseksi ennustuksen, vaikutus APY606 haiman syöpäsoluja arvioitiin käyttämällä Raf1RBD avattavasta määrityksessä. Ennustetusti laajuudet Ras aktivaation seerumia Capan-1 ja SW1990 pieneni selvästi läsnäollessa APY606 annoksesta riippuvaisella tavalla ilman merkittävää laskua yhteensä Ras tasolla (kuvio 4).

seerumin puutteessa soluja käsiteltiin ajoneuvon tai konsentraatiot APY606 24 tuntia, ja sitten stimuloitiin EGF 10 minuutin ajan. APY606 vaimentaa solun Ras-aktivaation Capan-1 (A) ja SW1990 (B) solulinjat. GTP-sitoutunut Ras eristettiin RBD avattavan määritys ja havaita Ras-GTP aktivointi kit. Kokonaismäärä Ras havaittiin anti-Ras spesifistä vasta-ainetta. Suhteellinen tiheys kohdeproteiinin kvantitoitiin ja piirrettiin.

Raf-kinaasien ovat tunnetuimpia keskeisinä säätelijöinä Ras-MAPK cascade, ja lohkon Ras-MAPK -signalointireitistä on tärkeä rooli induktio syöpäsolujen apoptoosin [24]. Voit tarkistaa oleva mekanismi apoptoosin induktio, arvioimme vaikutus APY606 Ras-MAPK-reitin molemmissa Capan-1 ja SW1990 solulinjoissa. Käsittelemällä kahden solulinjan kanssa APY606 6,25 ja 12,5 ug /ml 24 h merkittävästi vähentynyt fosforylaatio MEK ja ERK kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 5A ja 5B). Kuitenkin altistus kahden solulinjojen APY606 ei vaikuta kokonais-tasot MEK ja ERK. Huomattavaa on, että ekspressiotaso c-Raf väheni huomattavasti konsentraation kasvaessa APY606 verrattuna kontrollisoluihin. Tämä tulos osoitti, että APY606 aiheuttaman apoptoosin estämällä Ras-MAPK -signalointireitistä.

Cellular lysaatit analysoitiin immunoblottauksella vastaaviin primaarisen vasta-aineen ja sen jälkeen toinen vasta-aine ja edustava blotit mitattiin. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Suhteellinen tiheys kohdeproteiinin kvantitoitiin ja piirrettiin. Havaitsemiseen virtaussytometrialla fosfo-ERK suoritettiin sekä Capan-1 ja SW1990 solulinjoja (C). Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Yleisesti laajuus Perk pidettiin indikaattorina Ras aktivointi [25]. Tämän perusteella, voimme suorittaa samanaikaisesti virtaussytometrianalyysin saamiseksi määrällisten yksisoluiset mittaus. Kuten on esitetty kuviossa 5C, APY606 aiheuttanut tuotannon vähemmän Perk in Capan-1 (76,7 ± 1,2%) ja SW1990 (46,3 ± 2,6%) solulinjoissa 12,5 ug /ml annoksella kuin teki apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään soluissa, vastaavasti, kanssa taipumus Western blotting-analyysi.

5. APY606 pidätyksiä solusyklin S-vaiheessa

Monet sytostaattien pidättämään solukierrossa G1, S tai G2-M-vaiheessa [26]. Arvioida mekanismi APY606-indusoidun solun kasvun inhibitiota, vaikutus APY606 solusyklin jakautuminen ensimmäisen tutkittu kvantitatiivisesti Capan-1 ja SW1990 solulinjoja käyttämällä virtaussytometria-analyysiä. Käsittelemällä kahden solulinjan kanssa APY606 6,25 ja 12,5 ug /ml 24 h merkittävästi teki vaikuttavat solujen määrä G1 ja S vaiheiden pitoisuudesta riippuvalla tavalla, mutta solujen määrä G2 faasi ei pahan kerran muuttunut verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 6A). Käsittelyn jälkeen Capan-1-solut, joissa APY606 12,5 ug /ml, solujen lukumäärä pidätettiin G1 faasi oli 62,83% kontrollisoluihin verrattuna; Tämä johti laskua 18,78% (p = 0,027). Samalla solujen prosenttiosuus pidätettiin S-vaiheessa oli 35,59%; tämä antoi lisäystä 18,09% (p = 0,043) verrattuna kontrollisoluihin vehikkeliä vain. Jakeluun SW1990 solujen G1 ja S vaiheet, altistuminen solujen APY606 aiheutti enemmän merkittävä vaikutus. Hoito SW1990 solujen APY606 12,5 ug /ml vähensi merkittävästi solujen pidätettiin G1 faasissa 32.84% (p = 0,002) ja lisäsi solujen määrä S-faasissa 33.57% (p = 0,042), tässä järjestyksessä. Nämä tulokset osoittivat, että APY606 kasvattanut-esto, joka sai aikaan merkittävä, pitkäaikainen kertyminen solujen S-vaiheessa ja vähentää solujen G1 vaiheessa niin Capan-1 ja SW1990 solulinjoissa.

Capan-1 ja SW1990 solulinjoja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla APY606 24 tuntia. Edustaja prosenttiosuudet solupopulaatioiden G1, S ja G2 vaiheet solusyklin kahdessa solulinjassa analysoitiin virtaussytometrialla (A). G1-S siirtyminen liittyvät proteiinit analysoitiin käyttäen Western-blotting-määritys (B). Samanlaisia ​​kokeita toistettiin vähintään kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla, ja edustava blotit esitetty. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. Suhteellinen tiheys kohdeproteiinin kvantitoitiin ja piirrettiin (C).

solusyklin etenemistä on tiukasti säädellään sykliinien ja CDK. Pienentynyt ilmauksia sykliini A, sykliini E ja CDK2 ovat tunnusmerkkejä solukierron pysähtymisen S-vaiheessa. Jotta laadullisesti tutkia mekanismi APY606 indusoiman solusyklin pysähtymisen, olemme keskustelleet vaikutus APY606 hoidon ekspressiotasot sykliini A, sykliini E ja CDK2 Capan-1 ja SW1990 solulinjoja käyttäen Western blot-määritystä.