Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen paksusuolen syöpiin yleisesti satama toimintakyvyn menetystä mutaatiot APC, repressorin kanonisen WNT polku, mikä johtaa ja hyperaktiivinen WNT-TCF signalointi. Uudelleen perustamista Apc toiminto hiirillä, suunniteltu ehdollisesti tukahduttaa APC kautta RNAi, ratkaise suoliston kasvaimet muodostuvat johtuen hyperactivated Wnt-Tcf signalointi. Nämä ja muut tulokset ovat saaneet etsiä tietyn WNT reitin antagonisteja terapeuttisina kliinisesti ongelmallinen ihmisen paksusuolen syöpiin ja liittyy etäpesäkkeitä, jotka ovat edelleen suureksi osaksi parantumaton. Tämä yleisesti hyväksytty näkemys näyttää eroavan useiden havaintojen avulla potilaasta johdettujen materiaali: Canonical TCF tavoitteet tukahdutettu, sen sijaan, että hyperactivated, kehittyneissä paksusuolen syöpiin, ja tukahduttaminen TCF-toiminto ei yleensä johda kasvaimen taantumiseen in ksenografteissa. Tulokset useista geneettinen hiiren tutkimukset ovat myös ehdottaneet, että kanoninen WNT-TCF signalointi ajaa etäpesäkkeitä, mutta suora in vivo testeissä puuttuvat, ja yllättäen, TCF tukahduttaminen voi parantaa suoraan kylvetään metastaattista kasvua. Tässä olemme käsitelleet kykyjä tiiviimmän ja esti WNT-TCF signalointi muuttamaan kasvaimen kasvua ja etäispesäkkeitä käyttämällä ksenografteissa kehittyneen ihmisen paksusuolen syöpiin hiirillä. Huomaamme, että endogeeninen WNT-TCF signalointi on enimmäkseen antimetastaattisia koska downregulation TCF funktion dnTCF yleensä parantaa metastaaseja. Johdonmukaisesti, ylentävä taso WNT signalointi, lisäämällä tasoja WNT ligandien, ei yleensä pro-metastasoitunut. Nykyinen ja edellinen tietojen mukaan heterogeeninen vastaus moduloiva WNT-TCF signalointi ihmisen syöpäsoluja. Tuloksista ilmeni kuitenkin, että osa koolonsyöpien testattu vaativat WNT-TCF signalointi kasvaimen kasvua, mutta kaikki reagoivat tukahdutettua signalointi lisäämällä etäpesäkkeitä kerjätä arvioinnit, jollaisen tavoite estää WNT-TCF signalointi yleisesti hoitoon paksusuolen syöpiä. Tuloksemme viittaavat siihen, että WNT-TCF estäminen voi olla tehokkaita tuumorikasvun estämiseen vain osa tapauksista, mutta yleensä parantaa etäpesäkkeitä.

Citation: Seth C, Ruiz i Altaba A (2016) etäpesäkkeitä ja Colon Cancer Kasvain kasvu Näyttö Divergent Vastaukset modulaatio Canonical WNT Signaling. PLoS ONE 11 (3): e0150697. doi: 10,1371 /journal.pone.0150697

Editor: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 30 lokakuu 2015; Hyväksytty: 18 helmikuu 2016; Julkaistu: 03 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Seth, Ruiz i Altaba. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoittaa avustuksin Sveitsin National Foundation, EU-FP7 konsortio HEALING, Sveitsin Cancer League ja Département d’Instruction Publique de Genève ARA. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on olemassa suuri määrä todisteita, jotka tukevat käsitystä, että WNT signalointi on kriittinen ihmisen paksusuolen syövissä, joka on ehkä parhaiten esimerkkinä kaksi keskeistä havainnot i- valtaosa paksusuolen syövistä satama mutaatioita tuumorisuppressorigeenin APC, avain WNT-TCF-reitin antagonisti [1], ja II- palauttaminen APC toiminnon

APC

vaarantunut hiirillä johtaa menetys suoliston kasvaimet [2]. Nämä ja muut tulokset ovat edistäneet etsiä terapeuttinen WNT-TCF salpaajien yleismaailmallisesti hoitoon ihmisen paksusuolen syöpiä hyperaktiivinen kanonisen WNT signalointia (esim. [3]). Koska APC on toistaiseksi ei druggable, pyrkimyksiä kehittää WNT-TCF antagonisteja ovat keskittyneet vaiheet alkupään (esim Porcupine ja Tankyrase inhibiittorit [4-6] tai alavirtaan (CBP salpaajat [7], Ivermektiini [8]) APC toiminto ß-kateniinin tuhoa monimutkainen. Riippumaton vaiheen kohdennettujen, monet näyttöjen tai validointi määrityksissä on käytetty TCF-lusiferaasireport- seurata kanoninen WNT koulutusjakson vastaukset [9].

linjat todisteiden edellä yhteenvetona viittaavat vankka toiminnan WNT-TCF signalointi loppuvaiheen koolonsyöpien ja voi tarjota pakottavaa tarvetta kehittämistä ja käyttöä kanonisen WNT antagonisteja. kuitenkin keskeinen havainto on ristiriidassa tämän yleisesti hyväksytty näkemys: n ilmentyminen WNT-TCF tavoitteet on tukahdutettu-ei tehostetun edistyneen koolonsyöpien ja etäpesäkkeitä verrattuna alkuvaiheen kasvaimissa [10], [11].

WNT-TCF signalointi myös yleisesti uskotaan ajaa etäpesäkkeitä (esim [12]) , edistää kylvö potentiaalia verenkierrossa olevia kasvainsoluja ja parantaa ligandi-välitteisen signaloinnin metastaattisen kapealla [13], [14]. On kuitenkin syytä panna merkille, että suoria testejä varten hyväksyttyjen kyky tehostetun kanoninen WNT-TCF signalointi edistää etäpesäkkeiden ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa on raportoitu. Paras todiste roolin kanoninen WNT signaloinnin paksusuolen syövän etäpesäkkeiden peräisin tutkimuksista hiirillä [13], [14] tai in vitro analyysit (esim [15], [16]), ja muut tutkimukset merkitsevät osoittautunut rooli tehostettu WNT signalointi etäpesäkkeitä (esim [17]). Jos kuitenkin oletetaan, in vivo toiminnon in vitro -tiedot, tai ihmisen biologian hiiren tiedot, voi olla ongelmallista, sillä hiiret ja ihmiset ovat melko kaukainen lajeja, ja in vitro olosuhteissa voi määrätä WNT-riippuvuus ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [10].

Kokeellisesti tukahduttaminen kanoninen WNT signalointi on yritetty estämällä TCF-toiminto, joka on viimeinen vaihe kanonisen WNT signalointi. Tukahduttaminen WNT-TCF signalointia pan dominanttinegatiivivaikutus TCF (dnTCF4), osoitettu olevan tehokas in vitro ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa (esim [18]), on paradoksaalisesti yleensä tehoton tukahduttaa kasvaimen kasvua kuluttua siirtämisestä kehittyneen ihmisen paksusuolen syöpiin ; Sen sijaan se voi lisätä metastaattista kasvua jälkeen suorakylvö syöpäsolujen keuhkoissa [10], [11], [19-21]. Nämä havainnot esiin mahdollisuuden, että saarto aktiivisen WNT-TCF signalointi ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa ei yleensä ole terapeuttisesti suotuisa, toisin kuin on väitetty (esim. [2], [18]). Tästä huolimatta lähestymistavat ja mallia ovat erilaisia ​​ja siellä voisi olla menetelmäerojen että pohjana erilaisia ​​tuloksia. Esimerkiksi suoraan ympättiin etäpesäkkeitä häntälaskimoinjektiona ihmisen syöpäsoluja [10] ei ole täysin toisteta etäispesäkkeitä. Lisäksi hyväksytty ajatus, että WNT ligandit edistävät metastaattista kasvua peräisin geeniteknisesti hiiristä [13], [14], vielä testaamatta suoraan käyttämällä potilaasta johdettujen koolonsyöpäsoluihin.

Tässä on verrata voitto ja saarto toiminto lähestymistapoja käsitellä suoraan vaikutuksia moduloiva WNT-TCF signalointi ihmisen paksusuolen syövän ksenograftin kasvua hiirillä ja kaukana urut etäpesäkkeitä in vivo, käyttäen sekä potilaasta peräisin ensisijainen paksusuolen syöpäsoluissa ja kaksi vakiintuneet solulinjat. Huomaamme, että vain pieni osa kasvainsolujen testattujen reagoivat TCF saarto vähentämällä kasvaimen kasvua, vaan päinvastoin kaikkien solujen testattu vastasi tehostamalla kaukainen elin etäpesäkkeitä. Lisäksi kohonnut WNT signalointi tehostamalla ligandin tasojen syöpäsoluissa ei lisätä kasvaimen kasvua joka tapauksessa. Sen sijaan se johti heterogeeninen metastaattinen vastaus: tehostettu WNT signalointi tukahdutettu metastaattista kasvua yhdessä tapauksessa kolmesta tapauksesta olivat tilastollisesti muuttumattomana, ja se parantaa etäpesäkkeitä toisessa tapauksessa. Edelleen analyysi tehostamista etäpesäkkeitä mCC11 soluissa paljasti, että tämä tapahtui vain yksi kolmesta immunokompetentteja hiiren kantoja, huomautetaan, ettei asia ole kasvainsolu luontainen reaktio.

Kaiken nykyisen ja aiemmat tiedot [10] viittaavat siihen, että saarto WNT-TCF signalointi potilailla, joilla on paksusuolen syöpä on todennäköisesti haitallista kaikissa tapauksissa tämä johtaa kasvuun etäpesäkkeitä, riippumaton mahdollinen väheneminen primäärikasvain koko osajoukko tapauksia. Sen sijaan tulokset raportoimme täällä viittaavat siihen, että palauttaminen WNT-TCF-reitin aktiivisuutta ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa voisi sen sijaan olla terapeuttista arvoa osajoukko metastaattisen syöpien.

Materiaalit ja menetelmät

Human paksusuolensyöpä näytteitä ja soluviljelmissä

Ensisijainen ihmisen paksusuolen syöpä (CC) näytteet CC36 (TNM3), CC14 (TNM4) ja mCC11 (maksa etäpesäke maasta CC potilas) käytettiin tässä tutkimuksessa olivat viitejulkaisuissa [10], [21], [22], [23]. Ihmisen CC HT29 ja T84 solulinjat, jälkimmäinen on peräisin keuhkojen etäpesäkkeiden saatiin Cell Line Services. Kaikki ensisijainen CC soluja käytettiin varhaisessa in vitro passage vakio viljelyolosuhteissa (DMEM-F12 10% FBS, 5% CO

2).

Lentivirusvektorikonstruktit työkaluja ja infektio ihmisen sertiä

Stable käyttöön beeta-galaktosidaasin (ßGal) ilmentävää (

lacZ

+) reportteri-konstrukteja käytetään lentiviruksen hiukkasten infektiokertoimella (MOI) 2. Kaikki tartunnan viljelmät tarkistettiin ßGal ilmentymistä in vitro X-Gal-värjäys. Soluviljely erissä 90% homogeeninen ilmentymisen ßGal valittiin edelleen infektiot (MOI = 2), jossa GFP

+ lentivectors kanssa tai ilman dnTCF4, Wnt1 tai Wnt3a. Erissä 85% GFP

+ soluja valittiin kaikissa kokeissa.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

3-5d infektion tartunnan solut kerättiin Trizol ja mRNA uutettu (Life Technologies). Standardi PCR-reaktiot suoritettiin cDNA: seuraavilla alukkeilla:

Human-spesifisiä alukkeita:

TBP F: CCACAGCTCTTCCACTCACA

TBP R: GGATTATATTCGGCGTTTCG

HPRT F: GCCAGACTTTGTTGGATTTG

HPRT R: CTCTCATCTTAGGCTTTGTATTTTG

AXIN2 F: AGTGTGAGGTCCACGGAA AC

AXIN2 R: ACTGCCCACACGATAAGGAG

LGR5 F: GGAGCATTCACTGGCCTTTA

LGR5 R: CTGGACGGGGATTTCTGTTA

ASCL2 F: GCGTTCCGCCTACTCGT

ASCL2 R: GGCTTCCGGGGCTGAG

hiiri-spesifisiä alukkeita:

Wnt1 F: GACGGATTCCAAGAGTCTGC

Wnt1 R: ATTGCGAAGATGAACGCTGT

Wnt3a F: GCACCACCGTGGACGACAG

Wnt3a R: CCTCGCTACAGCCACCCCAC

häntälaskimoon injektion NSG hiirillä: Pure

lacZ

+ solupopulaation

10

6 ihmisen CC solut HBSS injektoitiin häntälaskimoon 6-viikkoisen naaras-immuunipuutteisilla NSG hiiriä (puuttuu kypsät T, B ja NK-solujen) nojalla sallittua menettelyjä eläin laitoksen UNIGE. Eläinten painoi 20-25 g alkaessa kokeen. Eläimiä rutiininomaisesti tarkistettiin epämiellyttäviä oireita ja kerättiin 4 viikkoa istuttamisen jälkeen seuraava hyväksyttyjen käytäntöjen. Keuhkot kerättiin PBS avauksen jälkeen.

ihonalainen vierassiirrännäiset NSG, Nude ja SHO hiiret: lacZ

+ solujen

5×10

5 CC solua HBSS injektoitiin ihon alle kerros 6-viikkoisen naaras-Nude-hiiriä (NMRI-Foxn1nu /Foxn1nu, puuttuu kypsät T-solut) tai SHO-hiiriä (SHO-PkrdcscidHrhr, josta puuttuu kypsät T-solut ja B-solut) tai heikentyneisiin NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ). Kukin hiiri kuljettaa 3 vierassiirrännäiset kyljissä. Nude ja NSG hiiriä ostettiin Janvier Labs (Ranska) ja SHO hiiret Charles River (Ranska). Kaikki eläimet olivat 20-25 g alkaessa kokeen ja sittemmin rutiininomaisesti tarkistettiin epämiellyttäviä oireita aikaan kasvaimen mittauksen. Eläimet lopetettiin lopussa 4 viikon kuluttua varttaminen ja ksenografteissa ja elimet kerättiin PBS avauksen jälkeen. -ksenografteja Hienonnettu ja varastoitu Trizol liuottamisen jälkeen ja myöhemmin käsitellään geenien ilmentymisen analyyseja reaaliaikaisesti kvantitatiivinen PCR.

Subkutaanisella

lacZ

+/-

vierassiirrännäiset NSG hiirillä

mCC11

lacZ

+ solut infektoitiin lentivector at 90% hyötysuhde. Samanaikaisesti, mCC11 paino- (

lacZ

-) solut infektoitiin GFP

+ lentivectors ilmentävät Wnt1. mCC11-

lacZ

+ sekoitettiin sitten 1: 1 mCC11-

lacZ

– /Wnt1

+ solujen ja yhteensä 5×10

5 solua injektoitiin kussakin kolme paikkaa per 6-viikkoisen naaras-immuunipuutteisilla NSG hiirillä hyväksytyissä olosuhteissa. Eläimiä pidettiin rutiininomaisesti tarkastaa epämiellyttäviä oireita päivittäin aikaan kasvaimen kasvun mittauksia. Kaikki eläimet tapettiin lopussa 4 viikkoa post-oksastuksen ja kasvainten ja elinten kerättiin PBS lopussa kokeissa.

beeta-galaktosidaasin X-Gal-värjäys

Kaikki elimet pestiin kylmä PBS keräämisen jälkeen ja kiinnitettiin 4% PFA 4 ° C: ssa 2-12h. Värjäys tehtiin 4-8h X-Gal. Stained näytteitä pestiin sitten steriilillä PBS: llä ja tarkastaa näkyvien etäpesäkkeiden alle preparointimikroskooppia.

lacZ

+ etäpesäkkeitä laskettiin ja valokuvattiin.

Exome sekvensointi APC

Exome sekvensointi DNA paksusuolen syövän ensisijaisen käytetyt solut oli suoritetaan Genomics Facility Geneven yliopiston Medical School. Vain APC analysoitiin yksityiskohtaisesti tätä tutkimusta varten. Ainoa tunnettu APC mutaatiot johtavat lakkaa toimimasta raportoidaan tässä.

Eläinten hoito

Kaikki hiiret käytettiin hyväksyttyjen protokollien Office Cantonale de Vétérinaire de Genève (OVC). Eläimiä seurattiin useita kertoja viikossa hyvinvoinnin alle eläinlääkärin ohjeiden. Hiiret lopetettiin lopussa kokeiden ja ennen kasvaimia saavuttanut paikallisen sallitun rajan kautta injektion ketazol /ksylatsiinin tai CO

2 hengitettynä.

Tulokset

modulaatio kanonisen WNT signaloinnin ihmisen paksusuolen syöpä hiirissä ei yleensä muuta kasvaimen kasvua

Ensisijainen ihmisen paksusuolen syövän soluja (CC14 ja CC36) sekä metastaattisessa paksusuolen syövän soluja (mCC11) ja metastaattinen solulinja (T84) oli stabiilisti transdusoitiin GFP

+ dominanttinegatiivivaikutus TCF4 (dnTCF), Wnt1, tai kontrolli lentivectors. Ihonalainen köynnöksen osaksi immuunipuolustus NSG hiiret valittiin, koska ihon paksusuolensyöpä etäpesäkkeitä esiintyä potilailla ja koska ei prefekti potilaalle tehdä köynnöksen ovat mahdollisia hiirissä: jopa injektiona peräsuolen seinään johtaa astian vuotoa, kun otetaan huomioon sen ohuus ja määrät ja paineet mukana pistoksen , mikä johtaa järjestelmälliseen levittämiseen. Lisäksi ihon alle siirteet ovat yksinkertaisia ​​ja hyvin toistettavissa.

ekspressiotasot bona fide paksusuolisyövän WNT-TCF aktiviteetti biomarkkereiden

AXIN2

, sekä WNT-säännellyn kantasolujen merkkiaineita

LGR5

ja

ASCL2

(esim [2]), määritettiin RT-qPCR transdusoiduissa soluissa in vitro ja in ihonalaisen ksenografteissa (kuvio 1A). Kaikki solut in vitro ja in vivo vastasi tukahdutettu tai parannettu WNT-TCF signalointi osoituksena endogeeniset tasot

AXIN2

mRNA; kaikki solut tukahdutettu

AXIN2

mRNA-tasot vastauksena polkuun salpauksesta dnTCF, ja kaikki solut kasvoivat

AXIN2

mRNA-tasot vastauksena polkuun aktivaatio Wnt1 (kuvio 1A).

LGR5

ja

ASCL2

oli säännellään vastaavasti vaikkakin solutyypin eroja (kuvio 1A).

(A) kvantifiointi tasot

AXIN2

,

LGR5

ja

ASCL2

RT-qPCR in vitro ja in vivo vierassiirrännäiset neljää solutyyppejä tässä tutkimuksessa käytetyt, jossa WNT-TCF downregulation kautta dnTCF4 tai säätelyä kautta Wnt1 misexpression. Numerot ovat suhteet kokeellisen haltuunsa Ct-arvoja, kun normalisointi kanssa taloudenhoito geenien

TBP

ja

HPRT

. Huomaa, että kaikissa tapauksissa kanoninen WNT-TCF tavoite ja toiminta toimittaja

AXIN2

indusoi Wnt1 (vihreät laatikot) ja tukahdutettu dnTCF4 (punainen laatikot). (B) GFP + fluoresoiva kuvia dissekoitujen kasvainten mCC11 (ylärivi) ja T84 (alarivissä) soluja. Modulointi WNT-TCF signalointi in vivo aiheuttavat pieniä muutoksia kasvavilla kasvaimia. Mittaviivat = 0.6cm. (C) Histogrammi kvantifiointia kasvaimen painon avauksen jälkeen, kunkin neljän koolonkarsinoomasoluissa käyttää. Katso teksti yksityiskohtia. p-arvot määritettiin kaksisuuntaisella Studentin t testeissä.

Kasvaimen kasvua seurattiin joka toinen päivä mittaamalla tilavuuden ennen kasvaimet saavuttivat lainmukaiset rajat. Lopussa kokeen, kaikki GFP

+ kasvaimet kerättiin samaan aikaan ja valokuvattiin. Missään tapauksessa olivat kokeellisia kasvaimia suurempi kuin kontrolleilla (kuvio 1 B ja 1 C). Sen sijaan, 4/8 T84 ksenograftit ilmentävien dnTCF (T84

dnTCF) ei kasvanut ja ne, jotka tekivät olivat alueella valvontaa. Lisäksi oli pieni väheneminen kasvaimen painoa mCC11

Wnt1 verrattuna kontrolleihin (Kuva 1 B ja 1 C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ylös tai alas modulaatio kanoninen WNT signalointi voi olla kontekstisidonnaisia ​​ja erilaiset vaikutukset in vivo. Ei kuitenkaan missään tapauksessa ollut parannettu WNT signalointi johtanut suurempien kasvaimia ja saarto WNT-TCF signalointi ei ole universaali antituumorivaikutuksia.

piirityksen TCF toiminta johtaa yleinen kasvu kaukaisilla elimessä etäpesäkkeitä

selvästi seurata metastaattisen pesäkkeitä kaukaisilla elimissä, me oksastettu syöpäsolut integroidulla

lacZ

ilmentävää lentivectors mahdollistaa tunnistamisen ihmisen ßGalactosidase

+ (ßGal

+) solujen hiiri kudoksiin Xgal reaktion (kuvio 2A; [10], [24]). Varttaminen

lacZ

+ CC14

dnTCF, CC36

dnTCF tai mCC11

dnTCF (kuvio 2B) johti nettolisäys etäpesäkkeitä keuhkoissa NSG hiiret ja niiden metastaattinen indeksi (lukumäärä

lacZ

+ metastaattinen pesäkkeet jaettuna kasvaimen paino grammoina koska jokainen hiiret suorittaa 2-3 ihonalainen kylki ksenografteja) (kuvio 2C). Tämä osoittaa, että alaspäin modulaatio WNT-TCF aktiivisuus (noin 50% ehdottivat

AXIN2

tasoja (kuvio 1A) parantaa koko kokeellisen metastaattisen fenotyypin. Koska dnTCF toiminta esti kasvua kolmannes (4 /12) T84

dnTCF kasvaimia (kuvio 1C), joka on yleinen metastaattinen vastauksen tässä solutyypissä ei ollut täysin mielekästä määrittää. kuitenkin metastaattisen indeksi T84

dnTCF hiiriä, jotka on kehitetty kasvaimia oli samanlainen kuin T84

ohjaus (ei esitetty).

(A) kaavio menettelyn avulla analysoidaan vaikutuksen downregulation of WNT signaloinnin kaukana etäpesäkkeitä in vivo. Vartetut solut ovat

lacZ

+, joka mahdollistaa visualisoinnin suuria pesäkkeitä ja jopa yhden metastaattisen solujen kaukaisilla elimet, erityisesti keuhkot (alhaalla upotus). Insertti oikealla näkyy korkea suurennus

lacZ +

etäpesäkkeet erikokoisia jälkeen in toto XGAL värjäys paljastaa

lacZ

+ metastaattinen soluja (tummansininen täplät). (B) edustavat kuvat vasen keuhko lohkoa hiiristä oksastettu subkutaanisesti säätökennoja tai joilla estetään WNT-TCF signalointi ilmaus dnTCF4 kuten on osoitettu. (C) määrän määrittäminen keuhko- metastaasien lukumäärä eläintä kohden näkyvät Metastasoituneessa indeksin (lukumäärä etäpesäkkeiden yli kasvaimen paino) (ylärivi) ja kasvaimen paino (alin rivi) kuin erikseen ilmoitetaan. (D) kvantifiointi koko keuhkojen metastaattisen pesäkkeiden kuten per tälle keuhkolohko puolella. Kaikissa kuvioissa virhepalkkeja ovat s.e.m. ja p-arvot ovat peräisin parittomia, kaksisuuntainen Studentin t testeissä. Asteikko bar = 7mm varten (A); 25mm for (B).

kvantifiointi koosta

lacZ

+ metastaattinen pesäkkeitä keuhkoissa paljasti, että oli johdonmukainen nousu useita suuria ( 100 solua per pesäke) metastaasit jälkeen tukahduttaminen WNT-TCF signalointi hiirillä CC36

dnTCF, CC14

dnTCF ja mCC11

dnTCF ksenograftien verrattuna kontrolleihin (Kuva 2D). Lisäksi sekä CC36

dnTCF ja mCC11

dnTCF kasvainta kantavissa hiirissä näytetään myös suuremman määrän mikrometastaasien ( 10 solua per pesäke) kontrolleihin verrattuna (kuvio 2D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että downregulation kanonisen WNT signalointi voi johtaa sekä kasvuun määrän metastaattisen solujen päästä kaukainen urut sekä kasvua koon metastaattisen pesäkkeiden.

tehostaminen WNT ligandin tasoilla tekee ei yleensä lisätä määrää kaukaisten elimen etäpesäkkeitä

testaamiseksi etäispesäkkeitä ensisijaisesta kasvainpaikkaa kaukainen elimeen, keuhkoihin tässä tapauksessa ohjaus ja Wnt1 ilmentäviä

lacZ

+ soluja ei siirretty osaksi täysin immuunipuutteisilla NSG hiirille ihon alle (kuvio 3A). Kun taas CC14

Wnt1 tai CC36

Wnt1 kasvaimia, ei ollut merkittävästi muuttunut taso keuhkojen etäpesäkkeet verrattuna kontrolleihin (Kuva 3B ja 3D), T84

Wnt1 kasvaimia tuotettiin vähemmän ja mCC11

Wnt1 kasvaimia tuottaa enemmän etäpesäkkeitä ja oli muuttunut metastasoitunut indeksin ja pesäkkeiden kokojakauma (kuvio 3C ja 3D). Tämä osoittaa, että metastaattisen tulos WNT signalointi laukaisee ligandi toiminta voi olla kontekstisidonnaisia ​​mutta tehostettu WNT signalointi ei yleisesti pro-metastasoitunut.

(A) Kaavio menettelyn avulla analysoidaan vaikutuksen ylösajon Wnt signalointia etäispesäkkeitä in vivo. (B) Edustavia esimerkkejä vasen keuhko lohkoa hiirillä ihonalainen kasvaimia eri koolonkarsinoomasoluissa kuten joko kuljettaa ohjaus (ylärivi) tai Wnt1 ilmentävä (alarivissä) lentivectors, kun X-Gal-värjäys. Asteikko bar = 25mm. (C) kvantifiointi metastaattisen indeksin kussakin tapauksessa hiirtä kohti. (D) kvantifiointi koko keuhkojen metastaattisen pesäkkeiden kuten per tälle keuhkolohko puolella. Huomaa, että tarkastukset ovat samoja, joita käytetään kuvassa 2, kun Wnt1 ja dnTCF kokeet suoritettiin samanaikaisesti, mutta on esitetty erikseen selkeyden vuoksi.

Tehostettu WNT signalointi säätelee määrää suoraan kylvetään etäpesäkkeitä on konteksti- riippuvaisella tavalla

lisätuen metastaattisen fenotyypin havaittu mCC11

Wnt1 ja T84

Wnt1 solujen koko metastaattisen edellä kuvatut analyysit, me suoraan kylvetään kasvainsoluja keuhkoihin injektoimalla

lacZ

+ mCC11

Wnt1 tai

lacZ

+ T84

Wnt1 solujen verenkiertoon NSG hiirten häntälaskimoon (kuvio 4A). mCC11

Wnt1 solut muodostivat paljon enemmän ja T84

Wnt1 solujen paljon vähemmän etäpesäkkeitä verrattuna kontrolleihin (Kuva 4B ja 4C). Kvantifiointi metastaattisen pesäkettä koko paljasti muutoksia kaikkien luokkien, yksittäisestä solusta micrometastases suuriin pesäkkeet 100 solua (kuvio 4D). Nämä tulokset tukevat kaukainen etäpesäke tulokset ja katsovat, että WNT signalointi voi vaikuttaa metastaattista kasvua, riippumaton muista vaikutuksista luettuna stroomaan primaarikasvaimen. Nämä tulokset vahvistavat myös, että paradoksaalisesti parannettu WNT ligandi tasot ovat pro-metastaattinen yhdessä solutyypissä ja antimetastaattisia toisessa.

(A) Kaaviokuva protokollan testata vaikutukset tehostetun WNT signalointi on metastaattinen kasvuun jälkeen pistetään suoraan liikkeeseen injektiopullo häntälaskimoon. (B-D) Edustavia esimerkkejä (B), kokonaismäärän määritykseen (C) ja kvantifiointi metastaattisen pesäkkeen koko (C) X-Gal värjättiin keuhkojen alueilla injektion jälkeen ohjaus solujen tai solujen parantamiseksi tai WNT signalointia kuten on osoitettu. mCC11 metastaattista kasvu paranee kun taas of T84 tukahdutetaan (C, D). Huomaa, että kokonaismäärä metastaattisen pesäkkeiden edustettuina (C) mCC11 on kohti vasen keuhko koru, kun taas koska niiden niukkuus, että T84 on koko keuhkoihin. Asteikko bar = 7mm varten (B).

puute korrelaatio APC asemasta ja WNT-TCF modulaatio fenotyyppi

Voidaan väittää, että olemme valinneet soluja, jotka voivat olla mutantti APC, mikä tekee tuloksemme ei tavallisesti sovelleta useimmat ihmisen paksusuolen syövät. Kuitenkin toteamme, että T84 satamissa

APC

mutaatioita ja että exome sekvensointi

APC

in CC14 tuloksista käy ilmi toiminnan menetys mutaatioiden (CHR5 112173848 G- T, Cosmic id 18566, E

853- STOP; CHR5 112175951 G- A, E

1554- kehyksenvaihdon).

ulottaa nämä havainnot me toisti kokeiluja dnTCF ja Wnt1 käyttämällä hyvin -known

APC

mutantti koolonisyöpäsolulinja HT29 (kuvio 5A). Näissä soluissa Wnt1 ja dnTCF4 säännellään TCF tavoitteet odotetusti (kuvio 5B). Ilmentävien kasvainten HT29

dnTCF olivat hieman, mutta huomattavasti pienempiä, mutta tämä oli myös kohdalla HT29

Wnt1 kasvaimia (kuvio 5C), mikä viittaa siihen, että ei ole olemassa selkeää kasvaimen kasvua vastauksena modulaatioon WNT signalointi. Lisäksi ei ollut merkitystä eroa määrä

lacZ

+ etäpesäkkeiden HT29

Wnt1 kasvaimissa verrattuna HT29

ohjaimet (kuvio 5D ja 5E). Sen sijaan, kasvu HT29

dnTCF oli merkittävä (kuvio 5D ja 5E). Analyysit metastasoituneen pesäkkeen koko vahvisti nousu mikro- ja macrometastases alkaen HT29

dnTCF, mutta ei HT29

Wnt1, kasvaimet verrattuna HT29

ohjaimet (kuvio 5F).

(A) strategia käyttää ihonalaista keuhkojen etäpesäkkeet. (B) Heat kartta normalisoitua mRNA ekspressiotasoja kontrolleihin (ja yli siivous-geenejä) korostetun geenien HT29 viljeltiin in vitro tai in vierassiirrännäisten vivo. Kaikki luvut ovat suhteet kontrolleihin. (C, D) vaikutukset modulaation WNT signalointia dnTCF tai Wnt1 ilme ihonalaisen kasvaimen kasvu (C) ja metastaattinen indeksi (Met-indeksi) (D). (E) Edustavia esimerkkejä vasen keuhko kuvia kussakin tapauksessa kuten edellä. Etäpesäkkeitä väritetään tummansininen jälkeen Xgal- reaktion johtuen niiden solu-luontainen ilmaus

lacZ

. (F) kvantifiointi

lacZ

+ metastaattisen pesäkkeen koko kolmeen ryhmään, kuten on esitetty. Asteikko bar = 20 mm (E).

Yhdessä nämä tulokset tukevat yleistä käsitystä, että solun sisäinen vähentäminen kanoninen WNT signaloinnin vasteita syöpäsoluissa on pro-metastasoituneen, ja väittävät, että tilan APC ei yksinkertaisesti korreloi tulosten modulaation WNT-TCF signalointi.

Eri kanoninen WNT ligandeja parantaa määrä kaukaisten mCC11 etäpesäkkeitä

sulkea pois mahdollisuutta, että vaikutukset lisääntyneen metastaaseja tehostettu Wnt1 johtuivat spesifisyys käytetyn ligandin, me toistetaan koko metastaattisen protokollan mCC11 soluja, jotka ilmentävät Wnt3a tai Wnt1, jotka molemmat aktivoivat kanoninen WNT-TCF signalointi ja, kuten odotettua, parantaa tasot WNT-TCF tavoite

AXIN2

ja WNT säädelty paksusuolen kantasolu merkki

LGR5

yli kuin kontrolli-soluissa (kuvio 6A). mCC11

Wnt3a

lacZ

+ solujen kasvaimia vertailuryhmän kaltainen kooltaan mutta jäljentää parantamiseksi kaukaisten keuhkojen etäpesäkkeiden mCC11

Wnt1 kasvaimia samanlaisia ​​pesäkkeen kokojakauma (kuvio 6B ja 6C ja ei ole esitetty).

(A) Tehostettu Wnt1 ja Wnt3a samanlaisia ​​muutoksia kohdegeenin ilmentymisen toimenpiteitä rt-qPCR. (B) Edustavia esimerkkejä X-Gal stained vasen keuhko lohkoa, joilla on metastaattinen pesäkkeitä, kuten on kuvattu. (C) kvantifiointi metastaattisen indeksin ja paino mCC11 paino, mCC11

Wnt1 ja mCC11

Wnt3a. Sekä Wnt1 ja Wnt3a parantaa etäpesäkkeitä kontrolleihin mutta vain Wnt1 kasvaimet ovat hieman pienempiä. Asteikko bar = 20 mm (B).

mCC11

Wnt1 solujen edistää etäpesäkkeiden Sisarusten kuin Wnt1 ilmentävien solujen

Sen varmistamiseksi, että WNT ligandeja mCC11

Wnt1 solut aiheuttavat ei-solun autonomisen signaloinnin in vivo,

lacZ

-negatiivinen mCC11

Wnt1 solut sekoitettiin

lacZ

+ paino- Sisarusten mCC11 solujen ja co-ruiskutetaan muodostaen ihonalainen kasvain ( kuvio 7A). Sen jälkeen kasvaimen kasvu testasimme parannetun läsnäolon ßGal

+ mCC11 p- solujen keuhkoihin. mCC11

Wnt1 soluissa merkittävästi edistänyt metastaattisen käyttäytymistä sisaruksen mCC11 p- soluissa (kuvio 7B ja 7C), mikä osoittaa, että Wnt1 ligandit voivat toimia myös ei-itsenäisesti tässä yhteydessä.

(A) Kaavio protokollan testata epäitsenäisiä vaikutukset yli-ilmentynyt Wnt ligandien sisarus, ei yli-ilmentäviä mCC11 solujen oksastettu samaan aikaan. Vain

lacZ

+

Wnt1

– soluja seurataan jälkeen XGAL reaktion. (B) edustavat kuvat X-Gal stained vasen keuhko lohkoa alla kuvatuissa olosuhteissa. (C) kvantifiointi metastaattisen indeksin ja kasvaimen painoa kohti kunnossa. Asteikko bar = 25 mm varten (B).

mCC11

Wnt1 solut eivät näytä lisääntynyt etäpesäkkeitä kontrolleihin nude tai SHO hiirillä

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että kanoninen WNT signalointi on pro-etäpesäkkeitä mCC11 soluissa, ja että Wnt ligandit toimivat sekä autocrinely ja ei-itsenäisesti in vivo, mikä viittaa siihen, että primaarikasvaimen strooman tuskin on ainoa tavoite pro etäpesäkkeitä WNT signalointi. Olemme kuitenkin myös todeta, että solu-autonominen tukahduttamisesta TCF funktion dnTCF johtaa huomattavaan kasvoi kaukaisessa elimessä etäpesäkkeitä tällaisia ​​soluja, kuten kaikkien muiden solujen testattu. Olemme siis arveltu, että saarto WNT-TCF signalointi mCC11 soluissa voisi olla luontaisesti ja yleensä pro-metastaattinen (mukaisesti tuloksia muiden testattujen solut), mutta tehostettu WNT signalointi voi parantaa etäpesäkkeiden mCC11 soluihin ei-solu autonominen, mCC11-mekanismin avulla.

Testataksesi parannetun metastaattisen fenotyypin mCC11

Wnt1 riippui miljöö, me muuttaneet radikaalisti ympäristöä oksastetun kasvainsolujen muuttamalla kanta hiiren isännät ( kuvio 8A). mCC11

Wnt1 ihonalainen kasvaimet kasvoivat kontrolleina teki nude tai SHO hiiriä (kuvio 8B ja 8C), mutta, toisin kuin voimakas metastaattisen fenotyypin mCC11

Wnt1 solujen NSG hiirissä on kuvattu edellä, mCC11

Wnt1 kasvaimia ei havaittu lisääntyneen määrän etäpesäkkeitä verrattuna tarkastusten oksastetun NUDE tai SHO hiiriä (kuvio 8B ja 8C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että mCC11 solut eivät näy solu luontainen metastaattinen lisälaite vastauksena lisääntyneeseen WNT signalointi.

(A) Kaavio menettelystä käytetään ympätä mCC11 soluja ihon alle, ja analyysien tuloksena kaukaisten keuhkometastaaseista. (B) kvantifiointi kasvainten painot ja metastasoituneen indeksit osoittavat puute edistämisestä metastaaseja mCC11

Wnt1 solujen vartetaan NUDE tai SHO hiiren isäntiä.

Keskustelu

Ninety kolme prosenttia ihmisen paksusuolen syövistä satama hyperactivation kanonisen WNT koulutusjakson, useimmiten kautta lakkaa toimimasta APC (https://cancergenome.nih.gov/). Tämä, yhdessä tulosten kanssa geneettisen hiiri malleja, on tukenut toiminnallisen roolin hyperaktiivinen Wnt-Tcf signaloinnin aloittamisen ja kehittämisen suoliston kasvainten soluviljelytutkimuksista in vitro ja hiiren malleissa in vivo (esim [2], [18], [25], [26]). Useat linjat saadut todisteet myös työstä siirtogeenisillä hiirillä ovat osoittaneet ehdottaneet, että tehostaminen Wnt toiminnan Metastasoituneessa kapealla toiminnan kautta Periostin [13] tai edistämällä muuttolintujen käyttäytymiseen kiertävien tuumorisolujen [14], ajaa etäpesäkkeitä eri syöpätyyppejä. Nämä ja muut tiedot on otettu siitä, että korkea kanoninen WNT signalointi eri ihmisen syövissä, mukaan lukien paksusuolen, on olennaista kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden potilailla, väittäen kehittämiseen terapeuttisten WNT-TCF-reitin antagonistit (esim [3 ]).