Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka eturauhassyöpä (PCA) on hidasta etenemistä, hormoni tulenkestävät (HRCP) ja metastaattista yhteisöt ovat oleellisesti tappavia ja puuttuu tehokkaita hoitoja. Transkriptiotekijä Slug on kriittinen säätelyssä etäpesäkkeitä erilaisten kasvainten kuten PCa. Täällä tutkimme täsmähoitoihin vastaan ​​Slug käyttämällä yhdistelmää 3 huumeita kohdistaminen 3 väyliä vastaavasti lähentyvät kautta Slug ja edelleen säännellä PCa etäpesäke. Käyttämällä

in vitro

määrityksissä olemme vahvistaneet Slug ylössäätöä aiheutuneet estäminen E-kadheriinin, joka oli antimetastaattisia, ja esti Bim säädelty solujen apoptoosin PCA. Upstream PTEN /Akt, mTOR, Erk, ja AR /Hsp90 väyliä vastasivat Slug ylössäätöä ja jokainen näistä voitaisiin kohdistaa rapamysiini, CI-1040, ja 17-AAG vastaavasti. 4 PCa solulinjoissa eri piirteitä kannalta PTEN menetys ja androgeenin herkkyys testasimme tehoa mono- ja yhdistetty hoito lääkkeet. Olemme havainneet, että metastaattinen kapasiteetti solujen maksimaalisesti esti vain silloin, kun kaikki 3 lääkkeet yhdistettiin, koska välistä ylikuulumista polkuja. 17-AAG pienenee Slug ilmentymisen eston kautta HSP90 riippuvaisten AR vakautta. Yhdistelmä rapamysiinin ja CI-1040 vähentää invasiivisuus voimakkaammin PCA solut, jotka ovat androgeenireseptorin tunteeton ja PTEN menetys. Slug esti Bim välittämää apoptoosia, jotka voitaisiin pelastaa mTOR /Erk /HSP90 estäjiä. Hiirellä malleja kierrättämiseksi PCa DNA: n kvantifiointiin, huomasimme, että yhdistelmä mTOR /Erk /HSP90 estäjien vähensi verenkierrossa PCa solujen

in vivo

huomattavasti voimakkaammin kuin yhdistelmä 2 tai monoterapiana. Lopullisesti, yhdistelmä mTOR /Erk /Hsp90 estää metastaattinen kapasiteetti eturauhassyövän kautta Slug eston.

Citation: Ding G, Feng C, Jiang H, Ding Q, Zhang L, Na R, et al. (2013) yhdistelmä Rapamysiini, CI 1040, ja 17-AAG Antimikrobiainetta Metastasoitunut Kapasiteetti Eturauhassyöpä kautta Slug esto. PLoS ONE 8 (10): e77400. doi: 10,1371 /journal.pone.0077400

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 02 syyskuu 2013; Julkaistu: 10 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Ding et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Nuorten Elites Scientific rahoitus Fudanin yliopiston (No.144) ja Nuorten tieteellinen rahoitus National Natural Science Foundation of China (NSFC-81202002). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleinen kasvain, joka yltää jopa johtava kuolinsyy urologiset maligniteetteja ja pysyy toinen johtava syy syöpäkuolemista miehillä [1]. Vaikka varhainen havaitseminen Eturauhassyövän on parantunut kliininen tulos, metastaattisen PCa ja hormoniresistentti eturauhassyöpä (HRPC) edelleen yksi haastavimmista kliinisiä ongelmia, mikä johtaa myöhäisvaiheen tapahtuma huonoon ennusteeseen. Eturauhassyövän on silmiinpistävä taipumus etäpesäkkeitä luuhun. 5 vuoden pysyvyys ensiarvoisen eturauhassyövän lähestyy 100%, ja kuitenkin laskee 33% jos luumetastaasipotilailla diagnosoidaan [2]. Androgeenipuutteen terapia (ADT) on tällä hetkellä ehdotettu miehille, jotka ovat diagnosoitu tai kehittää levinnyt tai metastaattinen PCa jälkeen paikallinen hoito [3]. Valitettavasti vastustuskykyä ADT lopulta nousee, tavallisesti ilmenevät kasvaimeen regrowth liittyy lisääntymiseen seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) tasot, ja kun kyseessä on HRPC, kuolemantapausriskin liittyy yleensä [4,5]. Perinteiset hoitostrategioita (kemoterapiaa ja sädehoitoa) liittyy usein epätyydyttävä tuloksia tässä potilasryhmässä. Siksi täsmähoitoihin on tullut lupaava vaihtoehto toimintatavat metastasoituneen PCa tai HRPC. Kehittäminen tehokkaampi hoitointerventioiden perustuu molekyylitason tutkimukset, jotka kasvaimet kehittävät vastustuskykyä lääkeaineet on siis kiireesti. Viimeaikainen työ on tavoitteena on määrittää avainmolekyylejä mukana etäpesäke terapeuttisina kohteina.

Slug (Snai2) on jäsen Snail perheen, joka on sinkki-sormen transkriptiotekijä. Se on myös yksi selkärankaisen-geenit liittyvät Snail. Se on confimred useissa in vitro tutkimuksissa, Slug on kriittinen etäpesäke ja hyökkäys kyky syöpäsolujen [6,7]. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että Slug ilmaisua voidaan lisätä tiettyihin elimiin (rinta- ja vatsa kasvainkudoksen), mutta, pienenee toisissa (kuten paksusuolen, munasarja ja ruokatorven normaaleissa kudoksissa). Edellisessä tutkimus osoittaa, että Slug proteiini ilmentyy suuresti eturauhassyöpäkudoksille, ja että Slug proteiini ekspressoituu PC-3, LNCaP, DU-145, ja 22RV1 PCa solulinjat. Sen ilmentyminen voi joutua sääntelyn transkription tai translaation jälkeinen muutos. Olemme myös havainneet, että Slug-proteiini ilmentyy voimakkaasti kasvaimen näytteissä, mutta ei normaalissa eturauhasessa kudoksessa [8]. Siksi nykyisessä tutkimuksessa pyrimme tutkimalla miten Slug on sekaantunut metastaattisen kapasiteetti Eturauhassyövän ja tehokkuuden testaamiseksi täsmähoitoihin vastaan ​​Slug liittyviä reittejä.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

Rapamysiini, CI 1040, 17-AAG, DHT (0,1 mg /ml) ja ensisijainen vasta-aineita Slug (kani), PS6 (pSer235 /236, kaniini), Pakt (pSer473, kani), PTEN ( kani), HIF-1α (hiiri), HSP90 (kani), AR (kani), ja β-aktiini (hiiri) ostettiin Sigma-Aldrich, Munchen, Saksa. Vasta-aineita Perk (pThr202 /pTyr204, kani), ja Erk (kani) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Toissijainen vasta ostettiin Santa Cruz, USA. SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla Kit (Thermo Scientific, IL) käytettiin. Ihmisen Slug ja ohjaus siRNA ostettiin Santa Cruz.

Soluviljely

Ihmisen DU145, PC-3, LNCap ja 22RV1 eturauhasen adenokarsinooma solulinjat olivat kaupallisia ja ostettiin Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). LNCap ja 22RV1 soluja viljeltiin RPMI 1640 media (PAA, Saksa), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (PAA). DU145 ja PC-3-soluja viljeltiin Hamin F-12 Media (Gibco, NY) ja L-glutamiinia (300 mg /l, NaHCO

3 1,5 g /l) ja 10% FBS: ää. Soluja inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Western blotting

Yhteensä proteiinin lysaatit eristettiin ja puhdistettiin. Yhtä suuri kuin proteiinin määrä 25 ug ladattiin 10% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelillä elektroforeesia varten. Geelit siirrettiin tämän jälkeen nitroselluloosakalvolle. Kalvot saarroksiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta maitoa. Primaarisilla vasta-aineilla on Slug, PS6, Pakt, PTEN, Perk, Erk, HIF-1α, HSP90, AR, ja β-aktiini Sitten lisättiin ja membraaneja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Johdetun vasta levitettiin seurasi piparjuuriperoksidaasiin sovellus.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

In vitro muuttoliike määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu. Lyhyesti, solut ympättiin ylä- kammioon 8.0μm huokoskoko soluviljelmässä inserttejä, jotka olivat joko päällystettyjä tai päällystämättömiä, jossa matrigeelin maahanmuutto- ja invaasio määrityksissä, vastaavasti. Sitten insertit laitettiin 24-kuoppalevylle täynnä väliainetta, jossa 5% naudan sikiön seerumia. Solut, jotka tunkeutuivat alapuolelle pinnat insertit kiinnitettiin ja värjättiin Diff-Quick (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) menetelmällä ja laskettiin mikroskoopin alla. Keskimääräinen Kolmen HPF kunkin kunnossa ajaa kolmena rinnakkaisena laskettiin.

Realtime PCR

Yhteensä-RNA uutettiin RNAiso reagenssilla (TaKaRa, Dalian, Kiina). Sen jälkeen kun konsentraatio määritettiin Thermo Nanodrop 1000 spektrofotometrillä, RNA: t muunnettiin cDNA kanssa PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa) olosuhteissa, joissa oli 37 ° C, 15 min; 85 ° C, 5 sekuntia. Eteen ja taakse alukkeita Slug, E-kadheriinin ja sisäisen valvonnan GAPDH (glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi) syntetisoitiin (Invitrogen) (Tab. 1) seuraavasti sekvenssit: ihmisen E-kadheriinin, sense, 5′-ACA GCC CCG CCT TAT GAT T-3 ’ja antisense, 5′-TCG GAA CCG CTT CCT TCA-3′; BIM, sense, 5’-GGT CCT CCA GTG GGT ATT TCT CTT-3 ’ja antisense, 5′-ACT GAG ATA GTG GTT GAA GGC CTG G-3′; kaspaasi-3, sense, 5’-GAC AGA CAG TGG TGT TGA TGA TGA C-3 ’ja antisense, 5′-GCA TGG CAC AAA GCG ACT GGA T-3′; ja Slug, sense, 5’-TTC GGA CCCACA CAT TAC CT-3 ’ja antisense, 5′-GCA GTG AGG GCA AGA AAA AG-3′; GAPDH, sense, 5’-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3 ’ja antisense, 5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3’. Näytteet prosessoidaan SYBR Green Esiseos Ex Taq (Takara) in 20 pl järjestelmässä ABI 7500n (Applied Biosystem, Forster City, CA). Näytteet ajettiin 95 ° C: ssa, 30 s ja monistettiin 40 sykliä (95 ° C, 5 sekuntia; 60 ° C, 34 s). Kunkin näytteen keskimääräinen arvo kynnyssyklistä normalisoitiin GAPDH tasolle kaavalla, 2

-ΔΔCt. Tulokset siis esittämä ilmaisullisella taittuu yli ohjaus.

Vieraslajisiirteen ja laskimoon kasvainmuoto

Male BALB /c kateenkorvattomia nude-hiiriin 6 viikon iässä (Vital River, Peking, Kiina) oli kasvatettu lisensoitu SPF (erityinen patogeenittomassa) luokka laboratorio. Kaikki hiiret tehtiin orkiektomia varten androgeenien puute. Yhteensä 2 x 10

6 solua (DU145, PC-3, LNCap, 22RV1 vastaavasti) 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin subkutaanisti molempiin kylkiin kunkin hiiren. Ajoneuvon Kontrolliryhmälle annettiin 100 ui PBS: ää. Kasvaimen kasvua seurattiin ja ääreisverenkierron kerättiin 1 mo. Suonensisäisiä injektioita, 2 x 10

5-soluja injisoitiin sivusuunnassa häntälaskimoon ja ääreisverenkierron kerättiin 24 h. Kaikki protokollat ​​hyväksyttiin Fudanin yliopiston eläinten eettinen komitea.

Solukuolemaan havaitseminen

Solukuolemaan havaittiin käyttäen MTT-määritystä, menetelmää, joka oli vakiintunut. Lyhyesti, solut ensin annettu erilaisia ​​hoitoja, ja altistetaan sitten 400 uM H

2O

2: ssa 4 tuntia. Vuonna kontrolliryhmää, RIN-mβ soluja vain hoidettiin 400 uM H

2O

2 ja vastaavien huumeiden, tässä järjestyksessä. Lopussa hoitoja, media poistettiin ja solut värjättiin ja mitattiin 495 nm: ssä käyttäen Autoplate lukijaa (Bio-Tek, USA). Käsittely 400 uM H

2O

2 4 h voisi indusoida noin puolet Eturauhassyövän soluja (~ 50%) ja annos oli siis valittiin optimaaliseksi.

Kiertävä kasvain DNA havaitseminen

hiiri veri (0,5 ml) kerättiin ilmoitetuilla aikoina silmän verenvuoto, ja punasolut hajotettiin ennen DNA: n uuttaminen. Quick-gDNA miniprep Kit (Epigenetiikka, USA). Lyhyesti, 400 ui lyysipuskuria lisättiin 100 ui plasmaa. Voimakkaan pyörre, kaikki sisältö siirrettiin pylväät ja sentrifugoitiin. Pre-pesupuskurilla lisättiin sitten seurasi toinen sentrifugi ja lisäämällä pesupuskuria. DNA: t lopulta eluoitiin DNA eluutiopuskurilla ja kvantitoitiin käyttäen TaqMan-kemiaa pohjainen reaaliaikainen PCR-määrityksissä kuten edellä mainittu ihmisen Slug ja E-kadheriinin ilmaisuja.

Tilastollinen

One-näyte ja kaksi -sample t-testejä, ja Mann-Whitneyn testiä käytettiin in vitro ja in vivo tutkimuksissa. P-arvo tai 0,05 hyväksyttiin tilastollista merkittävyyttä. Tulokset esitettiin keskiarvo ± keskihajonta (SD).

Tulokset

Androgeenien edistää metastaattisen potentiaalin Eturauhassyövän kautta lisäävä säätely Slug

Eturauhassyöpä ruokittava androgeenin suurin osa tapauksista ja siirtyminen hormoniresistentti fenotyyppi (HRPC) tarvitaan yleensä pitkäaikainen androgeenien puute hoitoa. Meillä on siis tässä tutkituista onko Slug oli mukana androgeenin välittämän metastaattinen reitin eturauhassyövässä. Soveltamalla dihydrotestosteroni (DHT) 1 nM 4 PCa solulinjoihin eri piirteitä, huomasimme, että solut olivat erilaiset synnynnäisen vaeltavat kapasiteetti eri herkkyys androgen (kuvio 1A). PC-3-solut olivat eniten luonnostaan ​​invasiivisia, ja LNCaP ja 22RV1 olivat herkempiä androgeenistimulaation merkittävään kasvuun metastaattisen profiilin. Samanlaisia ​​muutoskuvio invaasiokyvyn havaittiin myös, että invaasiomääritys, vahvistaen profiilit edellä mainittu (kuvio 1 B). Selvittämään onko Slug oli osallisena hormonaalisia metastaasi /invaasio lisälaite, selvitimme mRNA ja proteiini tasoilla näissä soluissa. Vastaavasti ilmaus Slug oli merkittävästi lisääntynyt merkittävästi LNCaP ja 22RV1 soluja, jotka olivat hormoni herkkä vastauksena DHT (kuvio 1 C). Ilmaisu muutos mRNA myös vastasi muutoksia proteiinien tasolla, mikä käy ilmi immunoblottaus (kuvio 1 D). E-kadheriinin, proteiini ratkaisevaa solu-adheesio on perustettu aikaan alas-virta Slug, estämällä epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja myöhemmät solujen kiertämisen. Olemme lisäksi tutkineet onko aktivointi Slug androgeenien aiheutuneiden esto E-kadheriinin edistää solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Aiempien määrityksiä sekä mRNA ja proteiini tasoilla E-kadheriinin pienenivät seuraavat DHT lisäksi soluissa herkkiä androgeenireseptorin (kuvio 1 E, F). Lopullisesti, tässä osoitimme erot androgen herkkyyden 4 PCa solulinjojen ja paljasti, että solut herkkiä androgeenireseptorin kannustanut oli kasvanut kyky muuttoliikkeen ja invaasion kautta kohonnut Slug ja laski E-kadheriinin aktiivisuutta. Siten solujen herkkä androgen, joka piti olla hormoni puutteen kestävä, olisi reittejä, joihin maahanmuuttoa vedonnut ja johon hyökkäyksen voitaisiin kohdistaa.

Migration (A) ja invaasio (B ) määritykset suoritettiin 4 PCa solulinjoissa käsitelty dihydrotestosteroni (DHT) ja valvonta. MRNA (C) ja proteiini (D) Slug PCA solulinjoissa käsitelty DHT tai ohjaus. MRNA (E) ja proteiini (F) E-kadheriinin PCA solulinjoissa käsitelty DHT tai PBS: llä (kontrolli). (Error bar = keskihajonta, n = 3 kullekin ryhmälle; * p 0,05; ** p 0,01).

Yhdistelmä rapamysiinin ja CI-1040 vähentää invasiivisuus Eturauhassyövän

yliaktiivisuus PTEN /Akt /mTOR-reitin on osoittautunut pro-tuumorigeenisiä eri syöpien kuten tuumorigeneesiä Eturauhassyövän, jossa Slug tiedettiin olevan alas-stream efektori hypoksian indusoima tekijä-1α ( HIF-1α). Sitten tutkittiin, onko mTOR pienensi metastaattisen potentiaalin Eturauhassyövän kautta Slug. Olemme havainneet merkittäviä menetyksiä PTEN vuonna DU145 ja PC-3-solut, vähäinen menetys LNCaP solussa verrattuna 22RV1 soluun. Alavirran korvikkeita Akt, mTOR ja HIF-1α toiminta olivat kaikki kasvanut PTEN-null-soluissa, mikä osoittaa kytkin mTOR koulutusjakson androgeenista tunteeton fenotyypit (kuvio 2A). Lisäksi rapamysiinin klo 10 nM laski Slug tasoa kaikissa solulinjoissa, mutta pohjapinta taso etana esiintyi korkeampi DU145 ja PC-3-solut (kuvio 2B). Rapamysiini samalla annoksella esti migraation ja invaasion solujen PTEN menetys by ~ 30% ja ei vaikuttanut 22RV1 (kuvio 2C, D). Koska mTOR esto voisi johtaa palautteita, jotka olivat päinvastoin pro-tuumorigeenisiä selvitimme aktiivisuus ERK1 /2, joka oli raportoitu pelata vaihtoehtoisia rooli sääntelyn etana ilmaisun PCA aiemmin. Silmiinpistävän, ERK1 /2 aktiivisuus kohosi kaikissa 3 solulinjoissa PTEN menetys seuraavien rapamysiini sovellus, joka osoittaa ohittaminen nykyisten kiertämisen mTOR kohti Slug (kuvio 2E). Meillä on siis testattu onko yhdistelmä rapamysiinin ja CI-1046, joka on ERK1 /2-estäjä, joka on kliinisessä tutkimuksessa voisi entisestään vähentää metastaattisen profiilin näissä soluissa. Western blotting osoitti, että lääkeaineiden yhdistelmä vähensi olennaisesti Slug tasolla kaikissa PCa solulinjoissa (kuvio 2F). Sitten testataan onko rapamysiini toteutettu eston kautta mTORC1 ja aiheutti sen loppupään vaikutus kautta ERK ja Slug. Hoitoon DU145-soluja, joilla on erilaiset yhdistelmät, rapamysiini, Raptor ja Rictor siRNA: t, olemme huomanneet, että, vaikka täydellinen salpaus sekä mTOC-1 ja -2 osia johti maksimaalisen eston ERK ja Slug, inhiboiva vaikutus rapamysiinin oli mahdollisesti kautta mTORC1- ERK-Slug reitin (kuvio 2G). Synergistisen vaikutuksen yhdistelmän 1 nM rapamysiinin ja 0,5 uM CI-1040 on esitetty kuvioissa 2 H, I oli suurempi esto maahanmuutto- ja invaasion kapasiteetin solujen PTEN menetys saavuttaa ~ 50% verrattuna monoterapiaan rapamysiinin. Lopuksi androgeenireseptorin erottelua PCa olivat yleensä mTOR hyperaktiivinen takia PTEN menetys. Monoterapia rapamysiini kuitenkin aiheutti ERK aktivointi, joka aktivoituu Slug kuin ohitus. Yhdistelmä mTOR ja ERK estäjät siirrettävä paremmat kuin monoterapiaan.

Basal tasoja PTEN, fosforyloidun Akt ja S6 sekä HIF1α PCA solulinjoissa merkitty Western blot (A). Muutos Slug tason PCA käsitellyissä soluissa rapamysiini yli (B). Migration (C) ja invaasiota (D) määritykset PCA solulinjoissa tai ilman rapamysiiniä hoitoa. Aktivointi Erk 1/2 reitin PCA soluissa vastata rapamysiinin hoitoon (E). Yhdistelmä hoidot rapamysiinin (R) ja CI-1040 (CI) PCA solulinjoissa ja vaikutus Slug (F). Yhdistelmät rapamysiinin ja Raptor /Rictor siRNA: t sekä vaikutukset ERK ja Slug in DU145 soluissa (G). Migration (H) ja invaasiota (I) määritykset PCA solulinjoissa tai ilman yhdistelmällä käsittelemällä rapamysiiniä ja CI-1040. (Error bar = keskihajonta, n = 3 kullekin ryhmälle; * p 0,05; ** p 0,01).

17-AAG pienenee Slug ilmentymisen eston kautta HSP90 riippuvaisten AR vakaus

Vaikkakin hormonin puutteesta oli pitkäkestoinen vaikutus PCA se voisi seurata useita systeemisiä haittavaikutuksia. Androgeeni- kohdistuu sen vaikutuksia sitoutumalla sen reseptorin (AR), joka indusoi Slug aktivointia, testasimme onko täsmähoitoihin vastaan ​​Slug reitti voitaisiin joilla pyritään AR. On todettu, että lämpösokkiproteiini 90 (Hsp90) tarvitaan proteiinien stabiilisuuteen, kuten AR. Sitten tutkittiin, onko käyttö Hsp90 inhibiittoripastojen 17-AAG voisi vähentää vaikutusta androgeeni on metastaattisen profiileja Eturauhassyövän eston kautta Slug. Soluja käsiteltiin joko DHT yksin tai yhdistelmänä 300 nM 17-AAG. Kuten odotettua, yhdistelmä 17-AAG saarroksiin Slug aktiivisuus lisää ilmeisesti hormoniherkkien solulinjoissa (kuvio 3A). Lisäksi esto siirtolaisuuden ja invaasion ei havaittu vain androgeenireseptorin herkillä solulinjoissa mutta PC-3-solut sekä (kuvio 3B, C). Yhteenvetona voidaan todeta, saarto Hsp90 epävakaiksi AR johtaa tehon heikkenemiseen androgen edistämisessä solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Päällepuhuminen vaikutus 17-AAG voisi esiintyä myös kohdistama vaikutus androgeenien tunteeton soluissa.

Slug tasoilla PCA käsitellyissä soluissa DHT tai yhdistelmällä DHT ja 17-AAG (A). Migration (B) ja invaasiota (C) määritykset PCA solulinjoissa tai ilman yhdistelmällä käsitelty DHT tai yhdistelmällä DHT ja 17-AAG. (Error bar = keskihajonta, n = 3 kullekin ryhmälle; * p 0,05; ** p 0,01).

Slug estää Bim välittämää apoptoosia, jotka voidaan pelastaa mTOR /Erk /HSP90 estäjien

toistaiseksi olemme laatineet vaikutukset kohdistuvat 3 Slug liittyviä reittejä syvällisiä vaikutuksia estämällä metastaattista profiileja. Kuten Slug vastasi myös sen alavirtaan antiapoptooppinen vaikutuksia tuumorisoluissa, tutkimme onko yhdistelmä Slug kohdistaminen huumeita siirrettävä proapoptoottisten vaikutuksia. Ensin mimicked reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) käyttäen H

2O

2, ja havaitsivat, että solut androgeenireseptorin välinpitämättömyys olivat vastustuskykyisempiä ROS ja androgeenireseptorin voisi pelastaa apoptoosin hormoniherkkien solulinjoissa (kuvio 4A). Kuten Bim oli vastuussa Slug-välitteisen anti-apoptoosin, olemme edelleen määrittää ilmaus Bim kaikissa soluissa, joita käsiteltiin DHT. Expression of Bim pysyivät ennallaan androgeenireseptorin tunteeton solussa ja väheni merkittävästi androgeenien herkkien solujen (kuvio 4B). Paremmin luonnehtivat roolin Slug anti-apoptoosin, haimme siRNA vastaan ​​Slug ilmentymistä kaikissa solulinjoissa (kuvio 4C). Estovaikutus oli merkittävä paitsi 22RV1 solu, jossa Slug aktiivisuus oli olennaisesti alhainen osuus alimmillaan luontainen metastaattinen kapasiteetti (kuvio 1A). Testasimme lisäksi kaspaasin 3 seuranneesta Slug knockdown. Expression of Caspase-3 oli merkittävästi vähentynyt 3 solulinjoissa hyperaktiivinen Slug ja pysyi ennallaan 22RV1 soluissa (kuvio 4E). Sitten käytetään yhdistelmä rapamysiini, CI-1040, ja 17-AAG on transfektoidut solut testata synergistisiä vaikutuksia. Huomiota herättävää on, yhdistelmä pelastettiin anti-apoptoottisen vaikutuksen Slug aloitetaan androgen ja ROS kaikissa solulinjoissa, jossa tilastolliset merkitykset saatiin DU145, PC-3 ja LNCaP-soluja (kuvio 4F). Kaikkiaan Slug myönnetty antiapoptoottisia vaikutuksia PCa soluissa estämällä Bim, koulutusjakson todennäköisemmin aktivoitava hormoni herkkien solujen läsnäolo androgen. Yleiseurooppalainen saarto mTOR /ERK /Hsp90 näytti olevan estossa Slug sekä se s alas-stream toimintaa.

solukuoleman PCa käsitellyissä soluissa DHT vastauksena ROS simuloida H

2O

2 (A). Expression taso Bim PCA käsitellyissä soluissa DHT (B). Knockdovvn Slug kanssa siRNA (C) ja mRNA taso Bim PCA solulinjoissa seuraavat Slug taintumisen (D). Muutos kaspaasi 3 mRNA-tasolla PCA soluissa Slug taintumisen (E). Vaikutus Yhdistelmä rapamysiinin, 17-AAG, ja CI1040 solukuolemaan Eturauhassyövän soluja käsiteltiin DHT ja H

2O

2. (Error bar = keskihajonta, n = 3 kullekin ryhmälle; * p 0,05; ** p 0,01).

Yhdistelmä mTOR /Erk /HSP90 estäjät vähentää verenkierrossa PCa soluja

in vivo

PCa ovat paljon alttiimpia luumetastaasipotilailla kuin muut elimet, joille hematogenous etäpesäkkeitä on edellytys. Olemme näin perustettu eläinmalleissa vaikutuksen testaamiseksi lääkeyhdistelmä in vivo. Sijasta perustamisesta luun metastaattinen malli, joka oli vaikea seurata minimaalisesti etäpesäkeleesioita, pyrimme tunnistamaan verenkierrossa olevia kasvainsoluja, profilointi metastaattinen kapasiteetti primaarikasvaimen. Me ensin ksenograftimalleja kanssa 4 solulinjojen vastaavasti. Jotta mahdollisimman normalisoida androgen tasolla, suoritimme orkiektomia kaikkien hiirten ja ruiskutettiin 200 ug DHT seesamiöljyä-etanoli ihon alle joka toinen päivä. -Hiiriin injektoitiin 200 ul: a 1,2 mg /ml liuosta, jossa oli rapamysiiniä päivittäin (5 päivää viikossa). Myös hiiriä hoidettiin kahdesti päivässä injektiona vatsaonteloon (IP) 100 mg /kg CI-1040 taas 17-AAG (80 mg /kg /vrk steriilissä maissiöljyyn) toimitti 1 IP injektiona päivässä. Hoidon aikana, ruumiin paino kaikkien Hiiriä tarkkailtiin myrkyllisyyden seurantaa. Kuviot 5A, B, C, D osoitti painot hiirten implaneed eri PCa solulinjojen erilaisia ​​hoitoja. Ei tapahtunut merkittäviä muutoksia hoitojen välillä ja kontrolliryhmää, joka osoittaa myrkytön vaikutukset hoitoja. Kun veri oli korjattu määrälliseen reaaliaikainen PCR osoitti, että LNCaP olivat voimakkaimpia metastaattisessa kapasiteettia samalla 22RV1 soluja tuskin etäpesäkkeitä. Kolmoishoitotutkimuksessa tehokkaasti hillitä kasvain kiertämisen osaksi kiertävä järjestelmä muualla 3 solulinjoissa verrattuna joko 2 huumeiden tai hormonin puute yksinään (kontrolli) (kuvio 5E). Me seuraavaksi pyrittiin tutkimaan, onko yhdistelmä kärsineisiin ankkurointi kapasiteetti verenkierrossa olevia kasvainsoluja, ja olemme siis injektoitiin kasvainsoluja hiiren liikkeeseen. Sen jälkeen hoitoa jatketaan antamalla yksi annos rapamysiiniä ja 17-AAG, ja kahdesti injektio CI-1040 edellä mainitun, veri kerättiin säädettyyn aikaan vaiheessa. Kuten kuviossa 5B on esitetty, kolmoishoitotutkimuksessa merkittävästi vähentää verenkierrossa olevia kasvainsoluja. Yhdistelmä rapamysiinin ja CI-1040 saavutettu samanlaisia ​​vaikutuksia kuin androgeenien puute. Yhdessä emme ainoastaan ​​osoittaneet, että kolminkertainen lääkitys mTOR /ERK /Hsp90 esto vähensi metastaattinen kapasiteetti kasvain, mutta osoitti myös, että tällaiset täsmähoitoihin hukkua herkkyyttä androgeenin solujen. Inhiboiva oli yhdenmukainen soluissa tai ilman hormonia herkkyyttä ja riippumatta läsnäolo androgeenireseptorin (kuvio 5F).

Trend painon muutos hoitojakson aikana kaikki 4 PCa solu ksenograftin hiiriä (A-D). Kiertävä PCa DNA: n kvantifiointiin vierassiirrekokeissa hiiren malleissa istutettiin 4 PCa solulinjojen ja käsiteltiin erilaisilla lääkeyhdistelmää (E). Kiertävä PCa DNA: n kvantifiointiin 24 h kuluttua laskimoiden injektion Eturauhassyövän soluja hiirissä, jotka saavat yhden hoito lääkkeen yhdistelmiä (F). (Error bar = keskihajonta, n = 6 kussakin ryhmässä; * p 0,05; ** p 0,01).

Keskustelu

torjunta PCa edelleen merkittävä terveydellinen ongelma, erityisesti potilaille myöhäisvaiheen tauti, joille täsmähoitoihin saattaa tuoda toivoa. Tässä olemme osoittaneet, että yhdistetty täsmähoitoihin vastaan ​​Slug on tehokas metastaattisessa PCa malleissa. Perustuu aiempiin kirjallisuudesta ja tuloksemme, voimme päätellä eri piirteet PCA soluja, jotka voivat hyötyä tulevien tutkimusten asianmukaista mallin laitoksia (kuvio 6A). Vielä tärkeämpää on, voimme ehdottaa, että Slug sijaitsee lähentyminen mTOR /Erk /HSP90-AR-reitin ja siksi vastaa enemmän yhdistelmän sijaan monoterapiassa (kuvio 6B). Vuoteen saarto vastavirran of Slug, eston metastaattisen kapasiteetti olisi suoraan hyötyä E-kadheriinin aktivointia. E-kadheriinin on kalsiumista riippuvan solu-solu-adheesion proteiinia ja toimii tuumorisuppressorina. Menetys E-kadheriinin ilmentymisen tai toiminnan on yleinen tapahtuma kasvaimen etenemistä [9]. Down-regulation of E-kadheriinin on keskeinen tavoite epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) modulaattorit, jonka tiedetään purkaa kadheriinin Lääkeaineita solu-solu risteyksissä ja välttämättömiä sikiön kehityksen, syövän etenemiseen, ja kemoterapiaa vastus [10,11] . Koska sen keskeinen asema EMT, E-kadheriinin edellyttää tiukkaa valvontaa syöpä. Niinpä useimmissa skenaarioissa syövän, E-kadheriinin ilmentyminen tukahdutetaan transkriptionaalisella tasolla. Erilaisia ​​pro-syntyreitit, kuten MAPK /Erk, PI3K /Akt /mTOR ja Hsp90 /AR, osallistua EMT asetuksessa [12,13], ja on yhteinen päätepiste: aktivoinnin sarjan transkriptiotekijöiden että suoraan tukahduttaa E-kadheriinin. Useat transkriptiotekijät on tunnistettu, että tukahduttaa E-kadheriinin kuten Snail, Slug, Twist ja ZEB1 kautta niiden vuorovaikutusta E-box sitoutumiskohta E-kadheriinipromoottorin [14,15].

profilointi on Eturauhassyövän soluja perustuu tämän tutkimuksen perustuvat tuloksiin ja kirjallisuus raportit (A). Kaavamaisen kuvio esittää kuinka lääkeaineiden yhdistelmä vaikutuksen kautta kohdistuvat Slug liittyvän reitin jossa Slug sijaitsee navan (B).

PI3K /Akt /mTOR signalointireitille on hyvin dokumentoitu olevan usein vapautettu ja toimii onkogeenisessä väylän monenlaisia ​​karsinoomien [16]. On hyvin osoitettu, että mTOR-signalointireitin säätelee proteiinisynteesiä vastauksena erilaisia ​​kasvutekijöitä ja siten vaikuttaa sekä solujen eloonjäämistä ja solujen lisääntymistä [17]. Esillä olevassa tutkimuksessa, estyminen PI3K /Akt /mTOR signalointi, jonka rapamysiini, osittain luovuttu HIF-1α aiheuttama Snail ja Slug ilmaisun tasoilla lyhytkestoinen, mikä viittaa Slug ilmaisua voidaan säädellä PI3K /Akt /mTOR signalointi [18, 19]. Aktivoituminen PI3K /Akt signalointi on havaittu stimuloivan Snail ja Slug ilmaisun kautta GSK-3β /β-kateniinin signalointi ja tämän jälkeen alas-säädellä E-kadheriinin eri solujen yhteyksissä [20]. Nykyinen data tukee keskeinen rooli HIF-1α /PI3K /Akt /mTOR signalointireitille välittämisessä Slug-sääntely E-kadheriinin PCA. Kuitenkin pitkäaikainen mTOR rapamysiinillä näytetä vähentynyt alas-säätely Slug, joka on osoitus kestävästä reitin aktivoinnin.

Koska uusilla todisteet viittaavat siihen, että sekä MAPK /ERK ja PI3K /Akt reittejä osallistuvat säätelyyn E-kadheriinin, tarkastelimme Erk aktivointi ja ovat hämmästyneitä, että ohitus Erk tilit resistenssin mTOR eston varten Slug. Eturauhasen syöpäsoluja, Slug riippuva ylössäätöä on osoitettu alas-säädellä E-kadheriinin ilmentymisen kautta MAPK /ERK signalointireitille [21]. Tunnettu Nisäkkäiden Aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) reitin jäsenet jaettu kolmeen alaperheiksi; Ekstrasellulaarinen signaali-säädelty Kinase 1/2 (ERK 1/2), p38 MAPK, ja c-Jun N-terminaalinen kinaasi-(JNK); Konservoitunut läpi evoluution, ERK 1/2 signalointireitin on jaettu kolmen kinaasin fosforylaatiota Cascade liittyy Raf (tai MAPK-kinaasin kinaasi), MEK (tai MAPK-kinaasin), ja ERK 1/2 (tai MAPK) [22,23] . Aktivointi ERK 1/2 vastauksissa joukko ulkoisia ärsykkeitä voi edistää spesifisten geenien kautta fosforylaation monien transkriptiotekijöiden kuten Elk-1 [24]. Koska läheisyys mTOR polku, Erk on hyvin todennäköisesti ajanut kun mTOR toiminta estyy, kuten tutkimuksessamme. Tämän vuoksi inhibitio MAPK /ERK reittejä, jonka Cl-1040 voivat molemmat käyttää erillisenä hoito ja sen herkistävä rapamysiini.

Lämpöshokkiproteiinit 90 (Hsp90) koostuvat erittäin konservoitunut perheen proteiineja, joita tarvitaan stressin toleranssia elävissä soluissa. Hsp90 on läsnä molekyyli- kaperonin, havaittiin yli-ilmentynyt useissa eri syövissä, mukaan lukien eturauhassyöpä, joka on ainutlaatuinen molekyylipaino chaperoneiksi koska suurin osa sen tunnetun substraatit ovat signaalitransduktion proteiinit [25]. Joukossa sen asiakas proteiinit ovat transkriptiotekijöitä, solusyklin sääntelyviranomaisten, signalointikinaasit, välittäjiä apoptoosin sekä steroidihormonireseptoreihin, kuten androgeenireseptorin (AR), joka on kriittinen rooli eturauhasen karsinogeneesin ja Eteneminen HRPC [26] . Lisäksi AR ajaa kasvua HRPC läpi useita mekanismeja, jotka läheisesti riippuvaisia ​​Hsp90 solun selviytymisen, erityisesti AR yli-ilmentyminen ja saada-of-function AR geenimutaatioita [27]. Siksi kohdistaminen Hsp90 on erityisen houkutteleva syövän vastaisen lähestymistavan eturauhassyöpään. Laaja estävä vaikutus Hsp90 estäjien näyttää olevan tehokas soluissa, jotka ilmentävät saumattu variantteja AR, jotka ovat vailla ligandia sitovan domeenin ja sen vuoksi resistenttejä tavanomaisille AR-antagonistit [28]. Ensimmäinen luokka Hsp90 estäjien tutki oli geldanamysiinistä analogit, erityisesti 17-allyyliamino-17-demetoksi-geldanamysiini (17-AAG).