Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että eturauhasen kantasoluantigeeni (PSCA) on houkutteleva kohde immunoterapialle, joka perustuu sen yli-ilmentyminen eturauhassyövän kudoksen, erityisesti joissakin metastaattisen kudoksissa. Tässä tutkimuksessa arvioimme dendriittisolujen (DC) ohjatussa lentivirusvektorilla (DCLV), joka koodaa hiiren PSCA (DCLV-PSCA) uutena kasvaimen rokotteen eturauhassyövän hiirimalleissa. Olemme osoittaneet, että DCLV-PSCA voi edullisesti toimittaa PSCA-antigeenin geenin DC-SIGN-ilmentävien 293T-soluihin ja luuytimestä peräisin olevia DC: itä (BMDCs). Suora immunisaatio DCLV-PSCA C57BL /6-hiirten esiin vankka PSCA-reagoiva CD8

+ ja CD4

+ T-solujen

in vivo

. Siirtogeenisessä adenokarsinooma hiiren eturauhasen solulinja (TRAMP, C1) synergisen tuumorin malli, olemme edelleen osoittaneet, että DCLV-PSCA–rokotetuista hiiristä voidaan suojata tappava kasvain haaste profylaktisena malli, kun taas hitaampi kasvaimen kasvua havaittiin terapeuttisessa mallissa. Tämä DCLV-PSCA rokotteen osoitti myös teho tuumorin etäpesäkkeiden käyttäen PSCA-ilmentävien B16-F10 malli. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että DCLV on voimakas rokote kantaja-PSCA toteutettaessa anti-eturauhasen syöpä immuniteetin.

Citation: Xiao L, Joo KI, Lim M, Wang P (2012) dendriittisolujen-Directed Rokotus joiden Lentivector Encoding PSCA eturauhassyövän hiirissä. PLoS ONE 7 (11): e48866. doi: 10,1371 /journal.pone.0048866

Editor: Lucia Gabriele, Instituto Superiore di Sanità, Italia

vastaanotettu: 15 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 02 lokakuu 2012; Julkaistu: 06 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Xiao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health (R01AI68978 ja P01CA132681) ja translaation kiihtyvyys avustusta yhteisen Center for Translational Medicine. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vuonna 2011 FDA hyväksyi ensimmäisen terapeuttinen syövän rokote hoitoon oireettomia tai hieman oireenmukaista hormoniresistentti eturauhassyöpä [1], [2], suuri rohkaisua sekä eturauhassyövän potilaiden ja tutkijat työskentelevät syövän immunoterapiaa . Immunologiset hoitoja voi ohjeistaa immuunijärjestelmä tunnistaa ja eliminoida kasvainsoluja, joka normaaleissa olosuhteissa, yleensä paeta immuuni valvontaa vähen- tämisessä kasvain antigeenin esittelyä [3] tai aloittamalla siedätyshoitoa [4], [5]. Tällä hetkellä useat antigeenejä on tunnistettu mahdollisiksi immunoterapia ehdokkaita eturauhassyövän rokotteita. Niihin kuuluvat prostataspesifisen antigeenin (PSA) [6], eturauhasen kantasolun antigeeni (PSCA) [7] – [10], eturauhasspesifinen membraani (PSMA) [11], eturauhasen hapan fosfataasi (PAP) [2] , musiini 1 (MUC1) [12], gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH) [13], ja NY-ESO-1-rokote [14], muiden muassa. PSCA on 123 aminohapon glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI) -sidoksellisia solupinnan proteiinia kuuluvat Ly-6-perheen [15]. PSCA on houkutteleva immunoterapeuttisen tavoite perustuu sen yliekspressio useimmissa eturauhassyöpäsolujen, kun taas sen ilmaisunvapautta muissa somaattisten kudosten on erittäin rajoitettu [16]. Vaikka erityinen mekanismi taustalla osuus PSCA kasvaimen kasvua määrittelemätön, PSCA on todettu korreloivan positiivisesti kasvaimen pahanlaatuisuuden, patologian luokan ja androgeenista itsenäisyyttä [16], [17]. Ehdotettiin, että PSCA voi olla merkitystä torjuttaessa luonnon immuunivasteen [18]. Lisäksi PSCA ilmentyminen säädeltiin metastaattisessa kudoksissa [16], [19]. Tällä hetkellä vasta-aineella suunnattuna PSCA on testattu estävän eturauhassyövän kasvaimen kasvua ja estää etäpesäkkeiden muodostumisen [20], kun taas toiset ovat tutkineet kimeerisiä antigeenireseptoreita (CAR) -pohjaisen otto- T-solujen hoidon kohdistaminen PSCA sen potentiaali eturauhassyövän hoitoon [21 ]. Kokeet ovat myös suoritettu testata PSCA rokotteena antigeeni, ja se on selvästi osoitettu eläinmalleissa, että PSCA-kohdennettuja rokotteita voidaan hidastaa eturauhassyövän etenemiseen [22], [23].

Lentivirusvektorit ( LVS) ovat lupaavia vektoreita syövän immunoterapiassa [24], [25], ja niitä arvioidaan parhaillaan monissa kliinisissä tutkimuksissa monenlaisia ​​ihmisen sairauksien [26]. Yksi haluttu piirre LVS on niiden kyky transduce sekä jako- ja jakautumattomia soluja [27], kuten perifeeristä DC [28], [29]. Koska rokote kantaja, LVS voi samanaikaisesti toimittaa antigeenejä kehitysmaille [24] ja aktivoi DC kautta toll-like reseptorit (TLR) [30] – [36]. Parantaakseen edelleen LVS paljon ponnisteluja on suunnattu kohti kohdistaminen LVS antigeenin esittelevien solujen (APC: t)

in vivo

saavuttaa parempia spesifisyys ja turvallisuus [37] – [40]. Olemme aiemmin raportoitu DC-suunnattu LV (DCLV), joka voi spesifisesti kohdentamaan DC: ita ilmentävät DC-spesifisten solujen välinen adheesiomolekyyli tarttumalla ei-integriini (DC-SIGN) ja toimittaa antigeeni geenejä niitä. Suora

in vivo

rokotus DCLV koodausta kanan ovalbumiinin (OVA) sai aikaan korkean taajuuden OVA-spesifisten CD8

+ ja CD4

+ T-soluvasteiden [41] – [43].

tässä raportissa selvitettiin DCLV välittämää syöpärokotteisiin entistä kliinisesti liittyvät asetukset ja tutkitaan teho tämän vektoroida immunisoinnin voittaa immuuni sietokyky itse kasvain antigeenin PSCA ja tuottaa suojaavan immuniteetin eturauhassyöpää. Olemme osoittaneet, että DCLV koodaus PSCA (DCLV-PSCA) voitaisiin kohdistaa DC-SIGN-ilmentäviä solulinjoja ja luuytimestä peräisin olevia DC: itä (BMDCs). Suora immunisaatio juuressa hännän mieleen vahvaa PSCA-spesifisiä T-soluvasteita in hiiren eturauhasen syöpä malli. Lisäksi rokotus voi merkittävästi estää kasvaimen kasvua haasteen jälkeen TRAMP-C1 tuumorisoluja hiirillä. Kun tämä rokote käytettiin terapeuttisessa ympäristössä, se voi tukahduttaa kasvua vakiintuneiden TRAMP-C1 kasvaimia. Tuloksemme osoittivat, että anti-eturauhasen kasvain immuniteetin myönnetty DCLV-PSCA riippuu läsnäolo sekä CD8

+ ja CD4

+ T-soluja. Lopuksi osoitettiin, että immunisaatio DCLV-PSCA voisi tehokkaasti estää etäpesäkkeiden B16-PSCA-soluissa keuhkokudoksessa.

Tulokset

Generation of DCLV-PSCA, ja sen kyky kohdistaa DC-SIGN ilmentävillä soluissa in vitro

rakennettu lentiviruksen selkäranka, joka koodaa täyspitkää hiiren PSCA ja testattu PSCA: n ekspressio 293T-soluissa. 293T-solut transfektoitiin ohimenevästi FUW-Null tai FUW-PSCA vektori. Kaksi päivää transfektion jälkeen solut kerättiin ekspression PSCA fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelija (FACS). 293T-soluissa, jotka on transfektoitu FUW-PSCA-plasmidin positiivisesti PSCA: n ekspressio (22,5%), kun taas solut, jotka oli transfektoitu FUW-Null plasmidi oli vain tausta-värjäyksellä (kuvio 1A).

(A) 293T-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti plasmideilla FUW-Null (mock-ohjaus, sininen viiva) tai FUW-PSCA (punainen viiva). Kaksi päivää myöhemmin, solut kerättiin ja värjättiin PSCA-ekspressio analysoitiin virtaussytometrillä. 293T-solut värjättiin isotyypin vasta-aine sisällytettiin kontrollina (harmaa sävy alue). (B) 293T-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti plasmideilla FUW-PSCA, SVGmu, ja muut tarvittavat lentiviruksen pakkaus plasmidien tuottamiseksi DCLV-PSCA vektoreita. Tuore virus supernatanttia käytettiin transdusoimaan 293T-solut (sininen viiva) tai 293T.hDC-SIGN-solut (punainen viiva) ja MOI = 10. PSCA-ekspressio analysoitiin virtaussytometrillä 3 päivää transduktion jälkeen. (C) Luuytimen johdettu DC: itä on transdusoitu mock vektorin DC-LV-Null tai DC-LV-PSCA vektori. Viisi päivää myöhemmin, CD11c ja PSCA-ekspressio arvioitiin virtaussytometrianalyysillä. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa, ja edustavia tietoja on esitetty.

hyödynnetään sitten aiemmin raportoitu 293T.DC-SIGN-solujen [41] tutkia kykyä DCLV ilmaista PSCA. Kuten kuviossa 1B on esitetty, noin 60% 293T.DC-SIGN-solut näytetään PSCA-ekspression jälkeisiä DCLV-PSCA transduktion, kun taas vain 6,79% oli PSCA-positiivisia 293T-soluihin. Spesifisyys havaittiin tässä on yhdenmukainen aikaisempien raporttien kanssa, joissa esitetään DCLV on edullisesti transdusoida DC-SIGN-ilmentäviä soluja [41], [44]. Tutkimme lisäksi onko DCLV-PSCA voisi kohdentaa ja välittää PSCA ilmaisun luuytimestä peräisin DC (BMDCs). Kehittymätön BMDCs olivat peräisin hiiren luuytimestä kulttuurin ja vahvistettiin virtaussytometrianalyysin solupinnan CD11 c (kuvio 1C). Kun altistuu LVS, DC: muokataan selektiivisesti DCLV-PSCA ilmaista PSCA (3,65% vuonna CD 11 c

+ soluja vs. 0,11% vuonna CD 11 c

– soluja, kuvio 1C). Tuloksemme osoittivat, että DCLV-PSCA voisi kohdentaa DC-SIGN-ilmentävien solujen ja toimittaa PSCA antigeenin DC

in vitro

.

induktio PSCA CD8

+ ja CD4

+ T-solu-immuunivasteita in vivo

sen määrittämiseksi, onko tämä rekombinantti- DCLV-PSCA vektori voi tehokkaasti toimittaa antigeeni DC: iden ja asentaa antigeenispesifisten T-soluvasteiden

in vivo

teimme rokotus DCLV-PSCA suoraan C57BL /6-hiiristä. Koska vaihtelu DC jakelu, immunisointi toteutetaan eri antoreittejä voivat johtaa eri määrä DC: iden voidaan kohdentaa, mikä johtaa eri antigeenin esittelyä. Sinänsä vertailu immunogeenistä vastetta läpi eri reittejä on tarpeen vahvistaa optimaalisen immunisointiprotokollaa. Näin ollen, naiivi C57BL /6-hiiret immunisoitiin yhden annoksen DCLV-PSCA (6 x 10

7 TU) on intradermaalista alue (id, juurella tail), polkuanturan alue (fp), lihakseen alue ( im), ihonalainen alue (sc) tai vatsaonteloon (ip). Aikaisemmin raportoitiin CD8

+ epitooppipeptidin PSCA [23], käytettiin luonnehtimaan PSCA-CD8

+ T-solu-vasteet pernan kautta IFN-γ solunsisäisen sytokiinin värjäystä (ICCS). Kuten on esitetty kuviossa 2A ja 2B i.d. ja F.P. antoreittejä johti vahvin PSCA-CD8

+ T-soluvasteen (~ 2%) Kaksi viikkoa immunisaation jälkeen. Olen. antoreittejä oli saavuttanut kohtalaisen vasteen (~1.2%), kun taas s.c. ja i.p. injektiot johti paljon alhaisempi vaste ( 0,5%). Tämä vastaus suuntaus on yhdenmukainen tulosten kanssa immunisaatio DCLV koodaavat HIV-1 Gag [45] tai ihmisen gp100 [44]. Perustuu i.d. antoreitti, joka tuotti korkeimman CD8

+ T-soluvaste, erilaisten annosten DCLV-PSCA (2~80 × 10

6 TU) annettiin. Kuten kuviossa 2C on esitetty, CD8

+ T-solujen vaste oli annoksesta riippuvaa, lisäämällä 0,5%: sta 2%. Siten optimaalinen immunisaatio-ohjelma on i.d. injektio DCLV-PSCA 80 × 10

6 TU se käytettiin seuraavissa tutkimuksissa. Arvioidaan tarkemmin antigeenispesifisen CD8

+ T-solujen aikaansaamia vasteita i.d. immunisointi, ELISPOT-koe mittaamalla IFN-γ eritystä T-solujen sekä perna ja imusolmukkeet imusolmuke tehtiin. Out of 1 miljoona solua, noin 800 ja 300 solut vastasivat CD8

+ epitooppipeptidillä pernassa ja imusolmukkeet imusolmuke, vastaavasti (kuvio 2D).

(A) C57BL /6 hiiret immunisoitiin 6 x 10

7 TU DCLV-PSCA läpi eri antoreittejä: vatsaonteloon (ip), ihonalainen pinta-ala (sc), lihakseen alue (im), polkuanturan (fp), tai ihonsisäistä (pohjan tail, id). Yksi immunisointiryhmää sisällytettiin negatiivisena kontrollina. Kaksi viikkoa immunisaation jälkeen pernasoluja hiiristä otettiin talteen ja niistä analysoitiin PSCA-CD8

+ T-solujen uudelleen käynnistämiseksi pernasoluja PSCA-peptidiä (PSCA

83-91), jonka jälkeen solunsisäinen värjäys IFN- y ja pinta värjäys CD8. Prosenttiosuus IFN-γ-erittävien CD8

+ T-solujen on osoitettu. (B) tilastollinen vertailu immunisaation esiin antamalla DCLV-PSCA eri antoreittejä. (C) C57BL /6-hiiriä immunisoitiin eri annoksilla DCLV-PSCA-vektorit (0, 2, 10, 40 ja 80000000 TU) juuressa hännän. Kaksi viikkoa rokotuksen jälkeen, PSCA-CD8

+ T-solut pernassa analysoitiin uudelleen käynnistämiseksi peptidin kanssa PSCA

83-91, jonka jälkeen solunsisäinen värjäys IFN-γ. (D) valmistus PSCA-spesifisiä IFN-γ-erittävien solujen sekä pernassa (SP) ja imusolmukkeet imusolmuke (LN) arvioitiin -uudelleenstimulaation kanssa PSCA

83-91-peptidi, jonka jälkeen ELISPOT-analyysi IFN-γ . (E) valmistus PSCA-spesifisiä IL-2 pernasoluista (CD8

+ T-solujen köyhdytettyä) mitattiin -uudelleenstimulaation kanssa 293T-solujen lysaatin transfektoitu ilmaista PSCA, jonka jälkeen ELISPOT-analyysi IL-2. (**:

P

0,01; *:

P

0,05, yksisuuntainen ANOVA seurasi Bonferronin monivertailutestillä. Virhepalkit edustavat SD.) Kaikki kokeet toistettiin kolme ajat ja edustavia tietoja näytetään.

Kun otetaan huomioon tärkeä rooli CD4

+ kasvaimen immunoterapiaa, IL-2-ELISPOT-määritys käytettiin tutkimaan CD4

+ T-soluvasteen laukaisee tämän immunisaatiostrategia. Olemme havainneet, noin 250 CD4

+ T-solut per miljoona pernasolua, jotka kykenevät erittämään IL-2 vasteena lysaatit 293T-soluihin transfektoitu FUW-PSCA-plasmidi (kuvio 2E). Tuloksemme osoittivat, että DCLV-PSCA oli tehokas rokotteena kantaja stimuloimaan sekä CD8

+ ja CD4

+ T-soluvasteita hiirillä.

Generation anti-eturauhasen kasvain immuniteetin sekä profylaktinen ja terapeuttiset mallit

Kun otetaan huomioon PSCA-CD8

+ ja CD4

+ T-soluvaste havaittiin, se oli tarpeen arvioida tuumorin vastaista tehokkuutta myönnetty DCLV-PSCA immunisaation. Siirretyn hiiri kasvainmuoto kanssa siirtogeenisten adenokarsinooma hiiren eturauhasen solulinja (TRAMP, C1) [46] käytettiin tässä arvioinnissa. C57BL /6-hiiriä rokotettiin DCLV-PSCA, DCLV-Null, tai ne jätetään hoitamatta. Nämä hiiret altistettiin sitten 10 päivää myöhemmin s.c. injektio 5 x 10

5 TRAMP-C1-soluja (kuvio 3A). Kasvaimen suoja havaittiin DCLV-PSCA-rokotettu ryhmän 8 ulos 12 hiirtä kasvaimettomina 44 vuorokautta kasvaimen haaste (kuvio 3B, alhaalla vasemmalla). Lisäksi muut 4 hiirtä tässä ryhmässä esiintyi paljon hitaampi kasvuvauhti kuin vuonna nollavektoria ryhmä. Erityisesti rokotus DCLV-Null ei esittänyt mitään mitattavissa olevaa tuumorisuppressiogeeneksi etu verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 3B, oikeassa yläkulmassa vasemmassa yläkulmassa). Kaiken hiiret päässä DCLV-PSCA ryhmä näkyy huomattavasti parempi eloonjäämisaste kuin hiiriä joko DCLV-Null tai kontrolliryhmään. Kaikki kasvainten DCLV-Null ja kontrolliryhmän ylittänyt kokorajoitus 55 päivän sisällä (kasvaimen koko 2000 mm

3 käytettiin korvike päätepisteen selviytymisen), kun taas DCLV-PSCA ryhmä selviytyi yli 70 päivää (kuvio 3B, alhaalla oikealla).

(A, B) C57BL /6-hiiret immunisoitiin 8 x 10

7 TU of DCLV-PSCA, mock vektori DC-LV-Null, tai puskurivertailusta juuressa hännän. Kymmenen päivää immunisaation jälkeen, nämä hiiret altistettiin subkutaanisesti 5 x 10

5 TRAMP-C1 syöpäsoluja. Kasvaimen kasvukäyrät seurattiin hieno paksuus, ja kasvaimen tilavuus laskettiin suurimpien kohtisuorien halkaisijoiden (mm

3), seuraavan kaavan mukaan

V = ab

2π /6

, jossa

ja

b

ovat suurin kohtisuorassa halkaisijat. Edustavia Kaplan Meyer selviytymisen käyrä ennaltaehkäisevään kasvainhaasteelle (n = 12). (C, D) C57BL /6-hiiriä istutettiin 5 x 10

5 TRAMP-C1 kasvainsoluja ihon alle, ja 18 päivää myöhemmin, näiden tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin 8 x 10

7 TU DCLV -PSCA (n = 12) tai DCLV-Null (n = 12) hännän tyveen. Kasvaimen tilavuus seurataan ja laskettiin kuten aiemmin on kuvattu. Edustavia Kaplan Meyer selviytymisen käyrä terapeuttista kasvain haaste. (***:

P

0,001; Log-rank (Mantel-Cox) testi. Virhepalkit edustavat SEM.) Kaikki kokeet toistettiin kahdesti ja edustavia tietoja näytetään.

tutki tarkemmin sitä DCLV-PSCA voisi olla voimakkaampi tuumorikasvun estämiseen terapeuttisessa TRAMP-C1 malli, jossa kasvain oli jo vahvistettu (kuvio 3C). Kasvainta kantavien hiirten terapeuttisesti rokotettu DCLV-PSCA osoittivat huomattavasti hitaampaa kasvaimen kasvua (kuvio 3D, ylempi ja keskimmäinen), ja keskimääräinen elinaika piteni 49,5 päivää 64 päivän kuluessa DCLV-PSCA immunisointi (kuvio 3D, alempi).

Riippuvuus rokotteen aikaansaama antituumorivaikutuksen koskemattomuuteen tunkeutunut CD8

+ ja /tai CD4

+ T-solujen

Kun pyritään edelleen ymmärtää roolit CD8

+ ja CD4

+ T-solujen tuumorin vastaisen immuniteetin, kasvain kudosnäytteitä DCLV-Null- tai DCLV-PSCA-immunisoiduista hiiristä talteen, parafiiniin upotettuja, ja alistettiin värjäys tuman ja pinnan markkereita. Kuten kuviossa 4A on esitetty, immunisaatio johti tunkeutumisen enemmän T-soluja (kuten tunnistaa CD3-värjäyksellä), mukaan lukien sekä CD4

+ ja CD8

+ T-solujen kasvaimen kudokset kerättiin DCLV-PSCA-immunisoidut hiiret, kuin DCLV-Null-käsitellyissä hiirissä. Tämä osoittaa, että sekä sytotoksiset ja auttaja-T-solut voivat tunkeutua paikalliseen kasvainkudoksen immunisoinnin. Määrittää riippuvuutta antituumorivaikutuksen näihin soluttautuneet T-soluja, joka on

in vivo

T-solujen poistamista koe suoritettiin. Neljä ryhmää hiiriä, siirrostettiin TRAMP-C1 kasvaimia, jossa kolme ryhmää sitten immunisoitiin DCLV-PSCA 14 päivää tuumorin haaste, kun taas jäljellä oleva ryhmä immunisoitiin DCLV-Null. Jotta DCLV-PSCA-immunisoitu ryhmät, yksi ryhmä käsiteltiin vasta-aineen kanssa, joka kykenee heikentävien CD4 + T-soluja, ja toinen ryhmä käsiteltiin vasta-aineen kanssa, joka kykenee heikentävien CD8

+ T-soluja (kuvio 4B). Kuten aiemmin on osoitettu, DCLV-PSCA immunisaatio voisi merkittävästi hidastaa yleistä kasvaimen kasvua. Sen sijaan kasvaimia ryhmissä ehtyminen joko CD8

+ tai CD4

+ T-solut kehitettiin nopeammin kasvaimen kasvua, vaikka kasvain-suojaava vaikutus säilyi. Erityisesti CD8

+ T-solu-köyhdytettyä ryhmällä oli selvästi suurempi kasvaimia kuin CD4

+ T-solu-köyhdytettyä ryhmä (kuvio 4C). Tuloksemme osoittavat lisäksi, että T-solut ovat vastuussa havaitusta rokotteen aiheuttaman antituumorivaikutuksen koskemattomuutta ja että CD8

+ T-solut pelata enemmän korvaamaton rooli valvoa kasvaimen kasvua.

(A) tunkeutuminen T-solujen osaksi kasvainkudoksia. TRAMP-C1 kasvainten tuumoreita kantavaa hiirtä leikattiin 3 viikkoa immunisaation jälkeen, parafiiniin upotettuja, ja värjättiin immunofluoresenssimenetelmällä-konjugoitu CD3, CD4 ja CD8-vasta-ainetta (vihreä väri kuten on osoitettu valkoisilla nuolilla) yhdessä tuman värjäytymisen (punainen väri) . Edustavat kuvat osoittavat CD4

+ ja CD8

+ T-solujen tunkeutuminen on kasvaimen kudoksia DCLV-PSCA-immunisoiduissa hiirissä verrattuna kuin DCLV-Null-immunisoiduissa hiirissä. (B) neljä ryhmää C57BL /6-hiiriä (n = 8 kullekin ryhmälle) siirrettiin yhdessä 5 x 10

5 TRAMP-C1-soluja ihon alle päivänä 0. Neljätoista päivää myöhemmin, 3 ryhmää immunisoitiin DCLV-PSCA , kun taas toinen ryhmä immunisoitiin mock vektori DCLV-Null. Kaksi ryhmää hiiriä peräisin DCLV-PSCA-immunisoiduissa ryhmissä tehtiin CD4

+ tai CD8

+ T-solujen poistamista ruiskuttamalla CD4- tai CD8-ehtyminen vasta-vatsaonteloon. (C) Tuumorin tilavuus kussakin ryhmässä hiirten seurattiin. Virhe palkit edustavat SEM. Kaikki kokeet toistettiin kahdesti, ja edustavia tietoja on esitetty.

Suojaus keuhkometastaasitestissä B16-PSCA-soluissa

yli-ilmentyminen PSCA havaittiin liittyvän eturauhassyövän etäpesäkkeiden monissa tutkimuksia, mikä tekee siitä ihanteellisen immunoterapian kohteena. Helpottamiseksi tutkimuksen kykyä DCLV-PSCA immunisointi estämään kasvaimen etäpesäkkeiden muodostumista, villityypin B16-F10-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti PSCA rakennettiin (nimetty B16-PSCA). C57BL /6-hiiriä ensin rokotettiin DCLV-PSCA tai DCLV-null negatiivisena kontrollina. Kymmenen päivää myöhemmin, syngeenisiä B16-PSCA kasvainsoluja injektoitiin suonensisäisesti eläimiä. Kun vielä 14 päivää, eläimet lopetettiin, ja keuhkojen metastasoitunut talletukset määrällisesti makroskooppisesti. Verrattuna DCLV-Null, DCLV-PSCA immunisaatio merkittävästi vähentänyt pinta keuhkometastaasitestissä muodostumiseen ( 75%, kuvio 5A ja 5C). Histologinen keuhkojen kudosnäytteitä kahden edellä ryhmää tutkittiin mikroskoopilla etäpesäke talletusten, ja samanlainen havainto havaittiin (kuvio 5B). Sitä vastoin suojaava koskemattomuuden DCLV-PSCA oli vain rajoitettu PSCA-ilmentävien melanoomasolujen, koska mitään merkittävää eroa ei havaittu, kun B16-F10-kasvainsoluja istutettiin (kuvio 5C). Nämä tulokset vahvistivat PSCA-erityisiä antituumorivaikutuksen immuniteetin myönnetty DCLV-PSCA immunisaation ja sen kykyä tukahduttaa etäpesäkkeiden muodostumista.

(A) C57BL /6-hiiret immunisoitiin DCLV-PSCA tai DCLV-null kuin mock ohjaus . Kymmenen päivää myöhemmin hiiret altistettiin 0,2 miljoonaa B10-F10-PSCA-soluissa injektiona suonensisäisesti kautta häntälaskimoon. Kaksi viikkoa myöhemmin hiiret tapettiin, ja makroskooppisen näkymät keuhkot esitetty. (B) Mikroskooppiset H samanlaisia ​​immunisointi, mutta alkuperäinen B16-F10-melanooma etäpesäkkeet mukaan kontrolliksi. (**:

P

0,01 ja n /t: ei ole tilastollisesti merkitsevä, Yksisuuntainen ANOVA seurasi Bonferronin monivertailutestillä. Virhepalkit edustavat SD, n = 4). Kaikki kokeet toistettiin kahdesti ja edustavia tietoja näytetään.

Keskustelu

DC-pohjainen hoidot ovat osoittaneet lupaavia tuloksia syövän immunoterapiassa [47], [48]. DC-suunnattu LVS ovat tehokkaita rokotevektoreina. Ne pystyvät transdusoimaan ja aktivoida DC:

in vivo

ja välittää kestävä ilmentymistä, jotka voidaan myöhemmin käsitellä DC ja esitellään T-solujen antigeeneille [49]. Lisäksi, nämä vektorit on suunniteltu olevan ei-toistettavia minimaalisella virusproteiineja on ilmaistu, ja näin ollen vähemmän anti-vektori immuniteetin havaittiin [44]. Lisäksi, koska DC-spesifisten transduktio, vähemmän turvallisuutta ja off-tavoite koskee syntyy, kun DC levitetään rokote ajoneuvot

in vivo

[41]. Aiemmissa tutkimuksissa, olemme osoittaneet, että DC-suunnattu LVS (DCLVs) voivat saada aikaan vahvoja immuunivasteita OVA [50], HIV-gag [45], ja hgp100 [44] antigeeneja. Tässä tutkimuksessa arvioimme DCLVs kuljettaa PSCA, todellinen itse kasvaimen antigeeni eturauhasen syöpä, rokotteena syngeenisille istutetut eturauhasen kasvain

in vivo

. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus käyttää DCLVs rokotteena modality vastaan ​​itsestään tuumoriantigeeni eläinmalleissa. Olemme osoittaneet, että DCLV-PSCA rokotus voi voittaa toleranssin itse antigeenin PSCA ja tuottaa kestäviä antigeenispesifisten T-soluvasteiden

in vivo

. Tämä immunisointi kiinnikkeet immuunivasteen, joka kykenee tukahduttamaan perustamisen TRAMP-C1 eturauhasen kasvaimia ja hidastaa kasvaimen kasvua terapeuttisessa mallissa.

vaippaproteiini käytetään pseudotyypin LVS on suunniteltu muoto Sindbisviruksen glykoproteiinin (SVGmu). Villityypin tämän glykoproteiinin on sitoutumisaffiniteetti sekä hepariinisulfaatti ja DC-SIGN: n; DC-SIGN on pinta-proteiini, joka ekspressoituu pääasiassa makrofagit ja tiettyjen osajoukkoja DC [51]. Saavutimme kohdentamista DC poistamalla hepariinisulfaatti- sitova ja säilyttäen DC-SIGN sitoutuminen Sindbisviruksen glykoproteiiniin. On osoitettu, että sitoutuminen SVGmu DC-SIGN on riippuvainen runsaasti mannoosia rakenne DC-SIGN. Siksi viruksen glykoproteiini voidaan edelleen suunniteltu näyttämään korkeammalla mannoosin rakenne parantaa transduktioteho [52]. Ensin vahvisti, että DCLV-PSCA voitaisiin tuottaa tehokkaasti ja selektiivisesti transdusoida DC-SIGN-ilmentäviä soluja.

in vitro

BMDC transduktio määritys perustelee havainto, että DCLV-PSCA voi suunnata toimituksen PSCA antigeenin DC.

Aiemmin on osoitettu, että iho-johdettu DC: t ovat tärkein tavoite LV-pohjainen rokotus [49]. Kuitenkin jakelun ja saatavuuden DC eri kehon osiin vaihtelevat, joten immunisointi kautta eri reittejä voi käynnistää eri immuunivasteita. Olemme aiemmin raportoitu, että F.P. reitti oli suhteellisesti suurempi vaste muihin annostamistavoissa jonkin antigeenin toimitukset [44], [45]. Tässä tutkimuksessa olemme suoraan verrata immuunivasteet erilaisten rokotuksen reittiä (i.d., F.P., i.m., s.c. ja i.p.). Kiinnostavaa kyllä, olemme huomanneet, että i.d. ja f.p injektiot syntyy paljon suurempi vasteita kuin teki i.m. ja s.c. reitti, kun taas i.p. anto alhaisin vaste. Immunisointi syntyy läpi i.d. reitti näkyy hieman suurempi vaste kuin F.P. reitti. Tämän huomioon ottamiseksi tuloksen, on spekuloitu, että DCLV-PSCA on paremmat mahdollisuudet kohdata DC kun hallinnoidaan joko i.d. tai F.P. reitti.

Yksi annos DCLV-PSCA pystyi suojelemaan näitä hiiriä eturauhasen kasvain haaste ja paransivat eloonjäämisaste. Tämä tulos on sopusoinnussa aiemman tutkimuksen käyttäen prime /boost strategia tuottaa PSCA-spesifistä immuunivastetta ennaltaehkäisevässä mallissa [22], [23], vaikka DCLV-PSCA esiin korkeamman suuruusluokan CD8

+ T-soluvasteen. Vuonna TRAMP-C1 terapeuttinen malli, meidän vectored rokote merkittävästi hidastanut kasvaimen kasvua ja laajennettu hiiri selviytymisen, kun taas edellinen prime /boost rokote menetelmä tuskin syntyy tyydyttävä kasvain suoja [22]. Tämä tulos voidaan selittää välistä aikaa tuumorin istuttamisen ja kasvaimen palpability, ajan noin 20~25 päivää. Lisäksi se kestää huomattavasti pidemmän aikaa toteuttaa prime /boost immunisointi, joka todennäköisesti johtaa puuttuu sopivimpana ajankohtana hidastaa syövän etenemistä. Siten yksi potentiaalinen etu DCLVs on niiden kyky voittaa immuuni suvaitsevaisuutta ja luoda tehokas kasvainten vastainen immuunivaste 2 viikon.

Molemmat CD8

+ ja CD4

+ T-solut tunkeutui paikalliseen tuumorikudoksia seuraavat DCLV-PSCA immunisaation. Vaikka CD8

+ ja CD4

+ T-solut ovat molemmat tarvitaan kasvain suojaus, vasta ehtyminen koe osoittaa, että CD8

+ T-solut tärkeämpi rooli valvoa kasvaimen kasvua. On hyvin tunnettua, että sytotoksiset CD8

+ T-solut voivat suoraan tappaa kasvainsoluja [53] – [55]. Mitä CD4

+ T-soluja, useita mahdollisia syitä selittää vaatimus kasvaimen suojaa. Ensiksi, CD8

+ T-solut ovat riippuvaisia ​​CD4

+ T-solujen [56], [57] herättämiseksi vankka immuunivasteita. Aiemmin havaitsimme CD4-riippuvainen CD8

+ T-soluvasteen, joka oli aikaansaama DCLVs [58]. Toiseksi, ainakin osa antituumorivaikutuksen välittävät Th1-vasteen, joka perustuu siihen, että CD4

+ T-solujen [59].

Tällä hetkellä ei ole luotettavaa hoitoa ei ole olemassa parannuskeinoa pitkälle metastaattinen eturauhassyöpä. PSCA on erittäin ilmaistaan ​​metastaattisen kudosta eturauhasen syöpä ja on siksi hyvä kohde syövän immunoterapiaa. Olemme osoittaneet tässä tutkimuksessa että DCLV-PSCA voi tuottaa immuniteetin pystyy tukahduttamaan keuhkojen etäpesäke B16-PSCA malli. Mielenkiintoista on, että kun sama määrä B16-F10 tai B16-PSCA-soluissa injektoitiin suonensisäisesti, B16-PSCA-soluissa pystyivät tuottamaan enemmän keuhkojen etäpesäkkeiden muodostumista kuin B16-F10-soluja (kuvio 5C). Tällä hetkellä suhde tuumorimetastaasin ja PSCA ilmaisua ei ole tutkittu perusteellisesti, vaikka tutkimukset viittaavat siihen, että PSCA voi olla merkitystä rajoittamisessa kasvaimen muuttoliike ja etäpesäkkeiden [60]. Kuitenkin lisää tutkimuksia tarvitaan edelleen ymmärtää, miten PSCA ilmaus vaikuttaa eturauhassyövän etäpesäkkeiden, ja B16-PSCA voisi olla sopiva malli tällaisia ​​tutkimuksia.

Yhdessä olemme raportoineet uudenlainen DCLV vektorin järjestelmä, joka voi tuottaa itse kasvaimen antigeeni PSCA antigeeniä esittelevät solut ja kiinnitä rokote-spesifisiä immuunivasteita. Tämä DCLV-PSCA voi voittaa immuunitoleranssin PSCA, tuottaa T-solu immuniteetti, joka voi suojata hiiriä TRAMP-C1 eturauhasen kasvain malleja, ja estävät merkittävästi B16-PSCA keuhkometastaasitestissä muodostumista. Nämä tulokset tarjoavat todisteita tukemaan käyttöä DCLVs toimittaa eturauhassyövän rokotteita.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret ja solulinjat

Male C57BL /6-hiiriä (6-8 viikkoa vanhoja) hankittiin Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA). Kaikki hiiret pidettiin eläimen tilat University of Southern California (USC) valvotuissa lämpötila- ja 12 tunnin valo /pimeä sykli, jossa on vapaa pääsy veteen ja standardi laboratorioruokaa. Eläinten toimenpiteitä tehtiin suuntaviivojen mukaisesti asettamat National Institutes of Health (NIH-julkaisu nro 85-23, tarkistettu 1996) ja eläin protokollan hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea USC (2010-11450) . Kasvaimen koko 2000 mm

3 käytettiin korvike päätepisteen selviytymisen, ja hiiret lopetettiin CO2 hengitettynä säiliöstä lähteestä ja seurantaa kohdunkaulan sijoiltaan. TRAMP-C1-soluja saatiin ATCC (Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin DMEM korkea glukoosi (Cellgro, Manassas, VA, USA) ja L-glutamiinia, johon oli lisätty 5% FBS: ää, 5% Nu seerumi IV (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), naudan haiman insuliinia 5 ug /ml (Sigma, St. Louis, MO, USA) ja 10 nM dehydroisoandrosterone (ChromaDex, Irvine, CA, USA). B16-F10-solut hankittiin ATCC: ltä (Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin DMEM korkea glukoosi (Cellgro, Manassas, VA, USA) ja L-glutamiinia, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. B16-F10-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti PSCA muodostettiin transduktoimalla B16-F10-solujen lentiviruksen (FUW-PSCA) pseudotyypittää vesicular stomatitis -viruksen glykoproteiinia (VSVG), ja klonaaliset solut valittiin.

rakentaminen ja tuotanto lentivirusvektorien

Lentivirusvektorit selkärangan plasmidi FUW-PSCA rakennettiin insertoimalla cDNA: n hiiren PSCA alavirtaan ubikitiinipromoottori on FUW. FUW on HIV-1-johdettu lenti- plasmidi koostuu sisäisen ihmisen ubikitiinipromoottori-C-promoottorin ilmentymistä ja woodchuck vastaava elementti parantaa vakautta RNA-transkriptin [61]. Käytimme aiemmin raportoitu menettely lyhytaikaista transfektiota 293T-solujen tuottamiseksi DCLV-PSCA vektori [41].