Krooninen sairaus

tiivistelmä

stroomakasvaimet osatekijöitä kasvain vuorovaikutuksessa syöpäsolujen luoda mikroympäristölle joka tukee kasvaimen kasvua ja selviytymistä. Adrenomedulliini (ADM) on autokriininen /parakriininen tuotetun tekijän sekä strooman solujen ja syöpäsolujen luoda sellainen mikroympäristön. Aikana eriyttäminen makrofagien, ADM tuotetaan vastauksena tulehdusta edistävät ja hypoksiaa. Tässä tutkimuksessa tutkittiin miten ADM kasvutekijänä munasarjasyöpä soluja ja modulaattorin makrofagien. Analysoimme myös ADM ekspressiotasot Retrospektiivisessä kliinisessä tutkimuksessa käyttäen nanofluidic teknologiaa ja arviointi ADM: n geenin tasolla 220 munasarjasyöpä potilaille. Vaikutusten tutkimiseksi ADM, munasarjasyövän solulinjoissa A2780, OVCAR-3, ja hei ja niiden lääkkeille vastustuskykyisiä kollegansa käytettiin lisääntymismäärityksissä, kun taas monosyytit terveistä luovuttajista eriytetty in vitro. ADM oli heikko kasvutekijää, joka käy ilmi proliferaatiomäärityksillä ja solusyklin analyysi. Kun on viljelty syöpäsolujen mukaisesti korostetaan olosuhteissa, kuten seerumin nälkään ja /tai hypoksia, ADM havaittiin olevan selviytymisen tekijä HEI, mutta ei muissa solulinjoissa. Makrofageissa, ADM oli toimintaa lisäkasvu /erilaistumiseen, pääasiassa tyypin 2 makrofageissa (M2). Yllättäen kliininen tutkimus osoitti, että korkea ilmentyminen ADM liittyi myönteisen tuloksen ja syövän alhainen CA125. Yhteenvetona voidaan todeta, että vaikka in vitro ADM oli mahdollinen tekijä biologisen aggressiivisuus, tätä mahdollisuutta ei ole vahvistettu potilailla. Siksi käyttämällä ADM antagonisti olisi epätarkoituksenmukaista hallinnassa munasarjasyöpää sairastavilla potilailla.

Citation: Baranello C, Mariani M, Andreoli M, Fanelli M, Martinelli E, Ferrandina G, et al. (2012) Adrenomedulliini munasarjasyövässä: Foe In vitro ja Friend in vivo? PLoS ONE 7 (7): e40678. doi: 10,1371 /journal.pone.0040678

Editor: Konradin Metze, University of Campinas, Brasilia

vastaanotettu: 19 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 30 heinäkuu 2012

Copyright: © Baranello et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukee Grant Associazione Oppo e le sue stanze ONLUS (www.oppostanze.it), jonka Ruth C. Donovan Cancer Research Program ja antelias lahjoitus herra ja rouva Ruggles. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä mikroympäristölle on aihe, joka on viime aikoina alkanut kiinnostusta tutkijoita. Vuosia tutkimus keskittyi syöpäsolujen, vaan se on kiinteä kasvain sisältää myös ei-pahanlaatuisten peruskudoselementeistä, mukaan lukien makrofagit, lymfosyytit, syöttösolut, endoteelisolujen, fibroblastien, myofibroblasteissa perisyyteissä ja mesenkymaaliset kantasolut, jotka kaikki ovat vuorovaikutuksessa syöpäsolujen luoda mikroympäristö, joka tukee kasvaimen kasvua ja selviytymistä [1], [2]. Ymmärtäminen tarkka koostumus kasvaimen mikroympäris- voisi olla hyötyä kehittämiseen järkevä terapeuttisia lähestymistapoja.

Epiteelin munasarjasyöpä osoittaa kompleksin sytokiini-kemokiini-verkon [3]. Reseptorit kemokiinit ilmentyvät eri infiltroituvat solut, mukaan lukien makrofagit, jotka rekrytoidaan kemokiinien [4]. Tämä vuorovaikutus on 2-prosessi: munasarjasyöpä solut ovat myös kykenevät moduloimaan makrofagien fenotyyppi, koska sytokiinien ja solun pinnan reseptoreita, jotka indusoituvat viljeltiin yh- makrofagien in vitro havaitaan myös ihmisen munasarjasyöpä [5]. ADM pystyy edistämään angiogeneesiä ja melanooman kasvuun [6] sekä kautta paracrine vaikutus, jota välittää endoteelisolujen typpioksidisyntaasia signalointireitin ja autokriininen vaikutus, joka stimuloi polarisaatio makrofagien kohti vaihtoehtoisesti aktivoitu fenotyyppi (M2).

ADM on 52 aminohapon liukeneva peptidi, joka puhdistettiin ensimmäisen kerran alkaen feokromosytooma [7] ja ajatellaan tuotetaan pääasiassa lisämunuaisytimessä. Nykyään kuitenkin tiedetään hyvin, että ADM on lähes kaikkialla, jolla on laajoja jakautumista kudoksiin, joka osoittaa sen useita biologisia vaikutuksia [8]. ADM on tuotettu sekä strooman (eli endoteelin, verisuonten sileän lihaksen, sydänlihaksen ja keskushermoston) ja kasvainsolujen kriinisenä /parakriininen tekijä. Se on myös tuotettu erilaistumisen makrofagien vasteena tulehdusta edistävät ja hypoksia, ja se on pääasiassa anti-inflammatorisia vaikutuksia, sillä ADM inhiboi TNF-α tuotannon aktivoitujen makrofagien, vähentää verisuonten läpäisevyyttä, ja downregulates Th1-välitteisen sairauden puhkeamista [ ,,,0],9].

A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, ja OVCAR-EPO10 soluja käsiteltiin ADM 1, 10, ja 100 nM 72 tuntia ja laskettiin. Solulaskennat esitetään absoluuttinen määrä soluja. Vaatimaton vaikutus solujen kasvuun havaittiin joissakin solulinjoissa, kuten A2780 (A), TC1 (B), ja OVCAR-3 (D) soluja.

Rakenteellisesti ADM on ominaista tyypillinen 6-aminohapon rengas, koska disulfidi- siltana kysteiinien 16 ja 21, ja se on amidoitu C-terminaalissa. Sekä disulfidisidos ja amidointi ovat välttämättömiä sen toiminnan. ADM on homologinen kalsitoniinigeeniin liittyvä peptidi (CGRP) ja amyliini, molemmat jäsenet kalsitoniinin /CGRP /amyliini-superperheen [10]. Tämä homologia mahdollistaa merkittäviä ristireaktiivisuutta reseptorien näiden muiden peptidien, samoin kuin kalsitoniini itse. Kaksi reseptorit on tunnistettu ADM: ADM-R1 ja ADM-R2, molemmat muodostettu yhteinen tärkein alayksikkö ja lisävarusteena proteiinia. Tärkein alayksikkö on Kalsitoniinireseptorien kuten reseptori (CRLR); lisävarusteen proteiini on reseptori aktiivisuuden modifioiva proteiini 2 (RAMP2) ADM-R1 ja RAMP3 ADM-R2 [11].

Koska munasarjasyöpä on sairaus, joka leviää ympäristössä runsaasti makrofageissa, joka uskotaan olevan tärkein ADM tuotannon, tässä tutkimuksessa tutkittiin miten ADM kasvutekijänä syöpäsoluja ja moduloiva tekijä makrofageissa. Vaikka in vitro huomasimme sen osittaisen toiminnan edistävänä tekijänä kasvua syöpäsoluissa, on retrospektiivinen kliinisessä tutkimuksessa havaitsimme, että korkea ADM liittyvät myönteiseen tulokseen ja syövän alhainen CA125 ilme.

solut nälässä 36 tunnin ajan lisäyksen kanssa tai ilman ADM 100 nM, korjattu jälkeen 0 (T1), 4 (T2), 8 (T3), ja 24 tuntia (T4), kiinteä, värjättiin propidiumjodidilla ja hankittu käyttäen cytofluorimeter . Tiedot analysoitiin histogrammit. Piirtämällä solujen lukumäärä verrattuna propidiumjodidi (PI) fluoresenssi, solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa arvioitiin. Tiedot A2780 ja OVCAR-3 soluja yksinään esitetty prosentteina G1 + S + G2 (A-B). Solukuolemaa arvioitiin myös analysoimalla DNA: n fragmentoituminen sisältyvät osa-G

0/1 huippu (C-D). Vaikutus ADM solusyklin ja solu- kuolema ei ole havaittavissa. Tämä koe toistettiin kahdesti samanlaisin tuloksin.

Tulokset

ADM on heikko kasvutekijä munasarjasyöpä Solulinjat

Jotta voitaisiin arvioida vaikutuksia ADM kasvuun munasarjasyövän solulinjoissa, OVCAR-3, OVCAR-EPO10, ja A2780 ja sen paklitakseli-resistenttejä kollegansa TC1 ja TC3 soluja käsiteltiin ihmisen rekombinantti-ADM 1, 10, ja 100 nM pitoisuus 72 tunnin ajan. Sadonkorjuun jälkeen solut laskettiin. Vaatimaton vaikutus solujen kasvuun havaittiin joissakin solulinjoissa, kuten A2780, TC1 ja OVCAR-3-soluissa (kuvio. 1). Tämän jälkeen vaikutus solusyklin analysoitiin upon lisäravinteen eksogeenisen ADM ja samanaikainen seerumistarvaatio. Solut siirrostettiin 24-kuoppalevyille ja ilman seerumia 36 tuntia lisäyksen kanssa tai ilman ADM 100 nM. Sen jälkeen kun 36 tuntia (T1), 5 x 10

5-solut kustakin kunnossa kerättiin ja DNA-analyysi suoritettiin. Mitata elpyminen solujen muissa kuoppiin elatusaine korvattiin FBS sisältävää väliainetta. Solut kerättiin talteen sen jälkeen, kun 4 (T2), 8 (T3), ja 24 tuntia (T4), ja taas DNA-analyysi suoritettiin. Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa arvioitiin ja edustavia tietoja on esitetty A2780 ja OVCAR-3-soluissa (kuvio. 2A-B) ja niiden lääkkeille vastustuskykyisiä kollegansa A2780CIS ja OVCAR-EPO (Fig. 3 A-B), jotka ovat resistenttejä sisplatiinille ja patupilone, vastaavasti. Vaatimaton kasvu S-vaiheessa huomattiin käsitellyt näytteet ADM. DNA pirstoutuminen, myös osa-G

0/1 huippu, arvioitiin myös indikaattorina solukuoleman (kuviot. 2 C-D, 3C-D). Vaikutus ADM solukuolema ei ollut havaittavissa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että ADM on vaatimaton rooli kasvun ja eloonjäämisen tekijä munasarjasyövän solulinjoissa analysoitiin.

Soluja käsiteltiin kuten on kuvattu kuviossa 2. Mitään merkittäviä vaikutuksia ei havaittu näissä 2 solussa linjat modulaation solusykliä ja kuoleman aiheuttama ADM. Tämä koe toistettiin kahdesti samanlaisin tuloksin.

A2780 ja OVCAR-3 soluja viljeltiin hypoksisissa olosuhteissa 72 tuntia ja ilman lisäämällä ADM 100 nM. RNA uutetaan solukasaumista analysoitiin qPCR. A2780-soluja, jotka ovat herkkiä hypoksia, ADM: n ja ADM reseptorit vaimentua in hypoksisissa olosuhteissa. In OVCAR-3-solut, jotka ovat vähemmän herkkiä hypoksia, ADM ja ADM reseptorit voimistunut (A). A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, ja OVCAR EPO 10-soluja viljeltiin, kuten on kuvattu edellä ja laskettiin. Hoito ADM ei moduloida munasarjasyövän solujen kasvua joko normaali tai hypoksinen olosuhteet, paitsi että OVCAR EPO 10 linja oli 2,4-kertainen kasvu lisäävät hypoksisissa olosuhteissa. Vanhempien OVCAR-3 soluja herkistyneet hypoksia ADM. Verrattuna normoxic ohjaus, hypoksia vähensi solujen noin 50%. Bar ja virhepalkkeja viittaavat keskiarvo ja SD 2 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

ADM on Selective Survival Factor

vaikutusta hypoksia tutkittiin A2780 ja OVCAR-3 solut (Fig. 4A). A2780-soluja, jotka ovat herkkiä hypoksia, ADM: n ja ADM reseptorit vaimentua in hypoksisissa olosuhteissa. In OVCAR-3, jotka ovat vastustuskykyisiä hypoksia, ADM: n ja ADM-reseptorien ilmentyminen lisääntyy. A2780, TC1, TC3, OVCAR-3, ja OVCAR EPO 10 viljeltiin hypoksinen olosuhteissa tai ilman täydentämistä ADM 100 nM (kuvio. 4B). Niistä analysoitiin solulinjoja, huomasimme, että vain OVCAR EPO 10 oli 2,4-kertaiseen hypoksinen olosuhteissa yhdessä ADM, eri käyttäytymistä emosolulinjassa OVCAR-3, joka ADM näytti herkistää hypoksia, koska vain puolet solujen lukumäärä havaittiin verrattuna määrä löytyy näyte altistetaan hypoksia ilman ADM. Ei merkittäviä muutoksia olivat havaittavissa muissa malleissa.

OVCAR-3 (A), OVCAR EPO10 (B), HEI (C), ja hei-EPO8 (D) soluja viljeltiin seerumistarvaatio olosuhteissa (ilman FBS) sopivan välin (jolloin vain noin 50% soluista lisääntymään), lisäyksen kanssa tai ilman ADM 50 nM, 100 nM ja 500 nM. Solujen määrä on esitetty kokonaismäärä soluja. Merkillistä, läsnäolo ADM ei havaittavasti vaikuttaa solujen kasvuun. Jokainen tietokohtaan ja virhepalkin viittaa keskiarvo ja SD 2 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

OVCAR-3 (A), OVCAR EPO10 (B), HEI (C), ja hei-EPO8 ( D) solususpensiot päässä seerumistarvaatio kokeen laimennettiin ja maljattiin petrimaljoihin 3 eri solussa seedings maljaa kohti. Vaikutus ADM klonogeenisten kapasiteetin jälkeen 14 päivää on esitetty pesäkkeiden lukumäärä. Vain HEI solut osoittivat mitään johdonmukaista vaikutusta suojaa seerumistarvaatio jälkeen ADM hoidon tässä testissä, kun taas niiden epotiloni kestävästä kollegansa näytteillä päinvastainen vaikutus. Bar ja virhepalkkeja viittaavat keskiarvo ja SD 2 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

Jotta vaikutuksen tutkimiseen ADM hoitoja eri stressin malli, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja seerumia. Itämisaika perustettiin alustavan määritykset (36 tuntia HEI ja OVCAR EPO10, 48 tuntia HEI EPO8, ja 60 tuntia OVCAR-3). Seerumistarvaatio olosuhteissa yksin, ilman ADM, indusoi vähintään 50% kasvun inhibitio. ADM lisättiin 3 eri pitoisuuksina (50 nM, 100 nM ja 500 nM). Tietoja lisääntymismäärityksissä seerumin nälkään olosuhteissa on esitetty kuvassa 5A-D. Soluja kutakin määritystä maljattiin sitten petrimaljoille 3 eri solun kylvö tiheydet maljaa kohden (90, 180, ja 360-solut ympättiin kuhunkin maljaan ja HEI EPO 8, OVCAR-3, ja OVCAR EPO10, 150, 300, ja 600 solua /astia HEI) ja pesäkkeet laskettiin sen jälkeen, kun 14 päivää. Kuten hypoksia, seerumistarvaatio oli tehokas vähentämään solujen määrä lyhyellä aikavälillä 3 päivän kasvun määrityksissä. Vaatimaton, ei tilastollisesti merkittävä kasvu todettiin jolloin ADM lisättiin pienin pitoisuus. Jotta voidaan arvioida, että läsnä on suojaava vaikutus ADM että klonogeeniset osastoon, altistumisen jälkeen seerumin nälkään, solut maljattiin rajoittavan laimennoksilla ja pesäkkeiden 10-14 päivää (Fig. 6A-D). Tässä määrityksessä vain HEI soluissa jatkuvasti suojaava vaikutus seerumistarvaatio todettiin ADM hoitoon, kun taas muissa solutyypeissä mitään muutoksia ei kirjata. Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että vain joissakin solulinjoissa oli ADM kykenevät välittämään kasvua tai selviytymistä tekijät.

Tyyppi 1 (A) ja tyypin 2 (B) makrofagit käsiteltiin ADM 1 nM, 10 nM, ja 100 nM 72 tuntia ja laskettiin. Solujen määrä on esitetty absoluuttinen määrä soluja. Tyypin 2 soluja viljeltiin ADM saavuttivat jopa 3,8 kertaa suurempi kuin määrä käsittelemättömien solujen, kun taas kasvanut vähemmän voidaan havaita tyypin 1 makrofageissa (1,3-kertainen ADM 10 nM). Endogeenistä ADM, IL1B, IL6, IL8, IL12, TNFa, IFNγR, CCL22, TGFli, IL10, ja IL13Rα arvioitiin qPCR (C) jälkeen hoidettaessa tyypin 1 ja tyypin 2 makrofagien rhADM 100 nM 24 tuntia. Molemmissa soluissa, endogeenisen ADM, IL-12, ja TNF-α on voimistunut. IL1B ja IL8 olivat vaimentua samalla CCL22 ylössäädellään tyypin 2 makrofageissa verrattuna tyyppi 1. Mikään muu merkittäviä eroja ilmaus muiden sytokiinien, kemokiinien, ja reseptorit havaittiin. Bar ja virhepalkkeja viittaavat keskiarvo ja SD 2 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

Kaplan-Meier analyysi 220 munasarjasyöpä potilasta (A) paljasti, että korkeat ekspressiotasot ADM liittyivät positiivisesti tuloksiin, koska OS, vaikka ero ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä (

p

= 0,07). Sama analyysi, jonka lopullinen päätepiste PFS, paljasti saman suuntauksen (B), eli potilaat, joilla on alhaisempi ilmaus ADM uusiutuneen aikaisemmin kuin korkeasti (

p

= 0,01). Monimuuttuja-analyysi osoitti, että ikä, kliininen vaihe, histotype, ja luokittelu eivät olleet merkitsevästi yhteydessä ADM ilmaisua, vaikka oli voimakas vastakkainen vaikutus (

p

0,001) tasojen välillä CA125 ja ADM lauseke (C ). Myös tasot PLK1 geeni, joka liittyy solujen määrä M vaiheessa vähensi merkittävästi ryhmän alhaisen ADM ilme (D).

ADM Vaikuttaa monosyyttien /Macrophage leviämisen ja erilaistuminen

Koska makrofagit ovat keskeisiä tuotannon ADM strooman, tyypin 1 (M1) ja tyypin 2 (M2) makrofagit hoidettiin 3 eri pitoisuuksia ADM (1 nM, 10 nM ja 100 nM ) 72 tuntia. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja laskettiin. M2 viljeltiin ADM pääsivät count jopa 3,8 kertaa suurempi kuin määrä käsittelemättömien solujen, kun taas alempi kasvu havaittiin M1 (1,3 ADM 10 nM), mikä osoittaa, että jotenkin ADM kykeni muuntamaan makrofagien erilaistumista ja leviämisen (Fig. 7A). Vahvistuksena kapasiteetin ADM moduloida makrofagien erilaistumista, M1 ja M2 käsiteltiin ADM 100 nM 24 tuntia. Geenien ilmentyminen ADM, IL1B, IL6, IL8, IL12, TNFa, IFNR, CCL22, TGFli, IL10, ja IL13R arvioitiin kautta qPCR. Säätelyä endogeenisen ADM havaittiin M1 ja M2, sekä ilmentymisen lisääntyminen IL-12 ja TNF-α (Fig. 7B), mikä osoittaa, että ADM pystyi säätelemään ilmentymistä makrofageissa autokriinisellä tavalla. Ainoat erot totesi sytokiinien /kemokiinin ilmentymistä vastauksena ADM olivat downregulation IL1B ja IL8 ja säätelyä CCL22 M2 vs. M1.

korkea eksressoitumistasojen ADM oli positiivinen Prognostiset Factor munasarjasyöpää sairastavilla potilailla

jotta saadaan käsitys roolista ADM munasarjasyövän, kliininen kohortin 220 munasarjasyöpä potilaat analysoitiin takautuvasti käyttämällä nanofluidic geneettinen analysaattorin ja 48.48 siru. CA125 analysointi ja potilaan näytteitä kerättiin aluksi leikkauksen, ennen mitään käsittelyä. GAPDH toimi taloudenhoito geeni ja tulokset normalisoitiin ekspressiotasot havaittiin OVCAR-3-soluissa. Kuvauksen potilaiden tähän tutkimukseen rekisteröidyt on yhteenveto taulukossa 1. Alustava tulos analyysi tehtiin käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmällä. Korkea ekspressiotasot ADM näyttävät olevan yhteydessä paremmin selviytymisen, vaikka ero ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä (

p

= 0,07) (Fig. 8A). Sama analyysi, jossa sen lopullinen päätepiste ilman taudin etenemistä (PFS), paljasti saman suuntauksen (kuvio. 8B), jossa potilaat, joilla on alhaisempi ilmaus ADM relapsoivan aikaisemmin kuin korkeasti (

p

= 0,01 ). Jotta saadaan käsitys näistä havainnoista, käytimme monimuuttujamenetelmin arvioida niitä kliinisiä parametrejä, jotka liittyivät ADM ilme. Spearmans korrelaatio käytettiin arvioimaan välisiä suhteita ADM, CA125, ja ikä otetaan jatkuvia muuttujia. Mitään merkittäviä korrelaatioita havaittu ADM: n ja iän (

ρ

= -0,008,

p

= 0,91) ja CA125 ja ikä

(ρ

= -0,139,

p

= 0,17), kun taas merkittävä käänteinen korrelaatio löytyi CA125 ja ADM (

ρ

= -0,23,

p

= 0,003). ADM arvot analysoitiin myös histologinen tyyppi ja taudin vaiheeseen käyttäen Kruskal-Wallisin testiä. ADM ilme ei muuttunut kun verrataan histotypes (χ

2 = 5.14,

p

= 0,39) tai kliinisessä vaiheessa (χ

2 = 3,94,

p

= 0,14) . Kun potilaat stratifioitiin korkean ja matalan ekspressiotasot oli jälleen vastakkainen vaikutus (χ

2 = 10,7,

p

0,01) tasojen välillä CA125 ja ADM ilmaisun (Fig. 8C) . Nämä tiedot viittaavat siihen, että kasvaimia pienemmillä ilmaus ADM on suurempi massa kuin ne, joilla on korkeampi ADM ilme. Pitäen tämän hypoteesin, tasot PLK1-tekijä liittyy solujen määrä M vaiheittain vähenivät merkittävästi (χ

2 = 4,6,

p

= 0,03) ryhmässä kanssa alhainen ADM ilme (Fig. 8D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että korkea ilmentyminen ADM kiinnostavuus kasvua heikentävän vaikutuksen munasarjasyöpäsoluja ja liittyy myönteinen tulos. Arvioida Tämän hypoteesin, Cox yhden muuttujan analyysiin, jossa otettiin huomioon kliiniseen vaiheeseen, histotype, ikä, CA125, ADM, ja PLK1 (jälkimmäinen 4 parametrit otettiin jatkuvia muuttujia) suoritettiin käyttäen sekä käyttöjärjestelmän ja PFS kuin muuttujia tulos (taulukko 2). Muuttujat kykenevät ennustaa in yhden muuttujan analyysiin valittiin suorittamaan Cox monimuuttujamenetelmin. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin [12], kliinisessä vaiheessa oli tärkein muuttuja ennustaa riski kuolla munasarjasyöpä potilaille. Tämä seikka oli nähtävissä etenkin OS ja PFS analyysi yhden ja usean analyysi. Histotype endomet- oli ominaista ne potilaat, joilla on parempi käyttöjärjestelmä ja ilman taudin etenemistä univariate analyysin vaikutusta ylläpidetään monimuuttujamenetelmin OS. Korkea ekspressiotasoja ADM liittyi paremmin käyttöjärjestelmän ja PFS. Tämä vaikutus, vaikka vaatimaton kannalta riskin, säilyi sekä yhden ja usean analyysi, tukee oletusta, että korkeat ekspressiotasot ADM ennustavat myönteisen tuloksen munasarjasyöpää sairastavilla potilailla.

Keskustelu

Strong prekliinisissä ja käännöstiede tukevat oletusta, että peruskudoskomponentit on keskeinen rooli ajo aggressiivinen kasvain fenotyyppi. Tässä yhteydessä ADM on kaikkialla säätelypeptidi useita biologisia toimintoja, kuten verisuonten toimintaa, kasvua stimuloiva vaikutus, ja immuuni-moduloiva aktiivisuus. ADM ilmentyy erittäin monissa eri maligniteetteja, kuten glioblastooma [13], kirkas-cell munuaissyöpä [14] ja haimasyövän [15]. Kaikki nämä sairaudet ADM on pidetty biomarkkeri huono tulos. Tämä ominaisuus ADM on johtuvan pääasiassa sen mitogeenisesta ominaisuuksia ja sen kyvystä toimia eloonjäämistekijänä aiheuttama hypoksia. Yhdessä sen suoria vaikutuksia syöpäsolujen ”selviytymisen, ylimääräinen tekijä kasvaimen aggressiivisuus koostuu kapasiteetin ADM stimuloida angiogeneesiä sisällä kasvain. Tämä mekanismi on erityisen merkityksellistä clear-solujen munuaissyöpä, sairaus, johon liittyy tehostettu vascularization sisällä kasvain [16]. Harvat raportit ovat käytettävissä, onko tämä ilmiö esiintyy munasarjasyövän ja suunnilleen tarkkaa vaikutusta ADM tässä sairaudessa. Pienessä hoitopaikassa 60 munasarjasyöpä potilaat käyttävät nonquantitative PCR-analyysi, vuonna 2000 Hata ja kollegat ilmoitti, että ADM oli tekijä ennustava huono tulos [17]. Tämän kertomuksen lisäksi, mikään muu käännöstiede osoitettu rooli ADM munasarjasyöpä. Vaikutukset ADM munasarjasyövän solujen in vitro kulttuureissa on kiistanalainen. Giacalone ja kollegat ilmoitti, että ADM ei kyennyt stimuloimaan solujen kasvua BG-1, PEO4, ja PEO14 munasarjasyöpäsoluja [18]. Kääntäen, tuoreessa tutkimuksessa raportoitiin, että hiljentäminen ADM geenin HO8910 munasarjasyöpäsoluja liittyi kasvun hidastumisen ja Chemosensiti- kautta downregulation ERK ja Bcl-2: n ilmentymisen [19]. Nämä havainnot sai meidät tutkimaan, onko ADM mitogeenisen selviytymisen tekijä paneeli syöpäsolujen näytteille eriasteisia lääkeresistenssin. In vitro-analyysi osoitti, että ADM oli minimaaliset aktiivisuutta kasvutekijä, vaikutus, joka vaihteli solulinja, jossa on hieman kasvanut solujen S-vaiheen solusyklin. Aktiivisuus ADM eloonjäämistekijänä oli jyrkästi eriytetään solulinjaan. Hey-soluissa, sen jälkeen kun seerumistarvaatio oli johdonmukainen lisääntyminen solujen, jotka kykenevät elossa ja muodostavat pesäkkeitä, kun taas muiden solun mallien tällainen vaikutus oli tuskin havaittavissa. Äärimmäinen vaihtelu havaittiin myös kannalta vastaus hypoksia. Tässä vasteessa totesimme vähentää ilmentymistä ADM: n ja sen reseptorien solujen herkkiä hypoksia, kuten A2780, kun taas OVCAR-3 vastakkaiseen suuntaus havaittiin. Yhdistämällä tulokset raportoitu kirjallisuudessa ja omien havaintojen me päätellä, että ADM kiinnostavuus vaatimaton vaikutus kuin kasvua ja selviytymistä tekijä munasarjasyöpäsoluja, äärimmäistä vaihtelua riippuen solumallin analysoitu.

Tuoreessa raportissa melanooman ehdotti, että pääasiallinen lähde ADM on makrofagien [6]. Jotta voidaan tarkistaa tällaista hypoteesia, tarkastelimme kykyä ADM stimuloida kasvua polarisoitunut M1 ja M2 makrofagit. ADM pystyi säätelemään tuotantoaan autokriinisellä tavalla ja selektiivisesti parantaa leviämisen M2, jolla on alhainen IL-12 /korkea IL-10 fenotyyppi, ja jolla oli heikentynyt ilmentymä reaktiivisen typen välituotteiden, alempi antigeenin esittelyä ja kasvaimia tuhoavaa kapasiteettia, ja korkea ilmentyminen angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGF: n, EGF: n, ja semaforiini 4D [20]. Korkea ekspressio M2 on siksi yleensä liittyy immuunijärjestelmän ympäristössä, joka tekee syöpää aggressiivinen.

Näistä tulokset in vitro, myös translaation Tutkimus osoitti yllättäen, että potilailla, joilla on korkeampi ekspressio ADM-geenin yleensä on pidempi PFS ja parempaan lopputulokseen. Totesimme, erityisesti käänteinen korrelaatio ekspressiotasot ADM ja CA125 mitattuna ajankohtana ensimmäisen leikkauksen. On yleisesti hyväksytty, että CA125 on merkkiaine kasvaimen tilavuus. Munasarjasyövän, joka vastaa hoitoon, vähentää ilmentymistä CA125 on merkittävä. Kasvaimet ominaista alhainen ADM myös esiintyy enemmän ilmaus PLK1, merkkiaine mitoosi toimintaa. Siksi näyttää todennäköiseltä, että potilaat, ADM kohdistaa suoraan tai välillisesti, kasvuun estävä vaikutus, alentamalla soluja M vaiheessa solusyklin ehdotti ilmaus PLK1. Monissa tutkimuksissa, suurin vaikutus nähdään in vivo ADM-stimuloidut solut oli nousua cAMP (katsaus [8]). Aineita, jotka lisäävät cAMP syöpäsoluissa on usein liittynyt soluproliferaation inhibointi [21], ja useita lääkkeitä, jotka kykenevät jäljittelemään cAMP ovat kliinisessä kehittämisessä syövän vastaisina aineina [22]. Yhdessä suoraa vaikutusta syöpäsoluihin kautta cAMP, on myös mahdollista, että potilailla, joilla on korkeampi ADM näytteille kasvainten paremmin vascularization, kuten on osoitettu selkeitä solun munuaissyöpä [16]. Koska munasarjasyöpä on chemosensitive tauti useimmilla potilailla [12] voimme spekuloida, että kudos pitoisuus kemoterapeuttisten lisääntyy, kun tasot ADM ovat koholla, mikä johtaa parempaan valvontaan taudin ja pidempi tautivapaa välein.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoitti, että vaikka ADM voi käyttäytyä kuin kasvu /eloonjäämisen tekijä in vitro, ja välittäjänä kykenee selektiivisesti stimuloivia M2 polarisaatio, nämä ominaisuudet ei ole vahvistettu potilailla. Siksi tämä tutkimus ei tue ADM antagonistien välineenä hallinnon parantaminen munasarjasyöpä potilaille.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

A2780 ja OVCAR-3 solujen linjat saatiin ATCC: ltä. A2780 on ihmisen munasarjasyövän solulinja on peräisin kasvainkudoksen käsittelemättömän potilaalle. A2780 TC1 ja A2780 TC3 ovat paklitakseli-resistenttejä saatujen solulinjojen A2780 pitkittyneen siklosporiinihoito ja paklitakselin (ystävällisesti Indena). OVCAR EPO10 ja HEI EPO8 ovat epotiloni B (EpoB) -kestävät saatujen solulinjojen OVCAR-3 ja HEI vastaavasti pitkittyneen hoidon kanssa EpoB. Kaikki nämä solulinjat on kuvattu aiemmin [23]. Solulinjoja viljeltiin vakio-olosuhteissa (37 ° C, 5% CO

2) RPMI 1640 yhdessä glutamiinin kanssa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 0,1 mM MEM ei-välttämättömiä aminohappoja ja 0,1 mg /ml kanamysiiniä. Kaikki reagenssit hankittiin Sigma-Aldrich, jos muut toimittajat ei määritetty. Kokeita hypoksia suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24].

valmistaminen Macrophage Primary Cultures

Lymphomonocytes eristettiin buffy coat terveen luovuttajan tiheyssentrifugaatiolla gradientilla käyttäen Histopaque-1077 (Sigma -Aldrich) ja suspendoitiin uudelleen RPMI 1640, johon oli lisätty 10% ihmisen AB-seerumia (Sigma-Aldrich), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (GIBCO). Noin 10

7 lymphomonocytes kuoppaa kohti siemennettiin 6-kuoppaisiin primaariviljelmän levyjen (BD Falcon) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 2 tuntia, jotta monosyyttien (10% ja 30%) noudattaa pohjaan kuoppien. Tuoreella viljelyalustalla, joka sisälsi joko 50 ng /ml ihmisen rekombinantti-GM-CSF: n tai 50 ng /ml ihmisen rekombinantti M-CSF: ää (R A2780, A2780 TC1, A2780 TC3, ja OVCAR EPO10: 8 x 10

4 /kuoppa; OVCAR-3 ja HEI EPO8: 10

5 /kuoppa). Rekombinantti ihmisen ADM lisättiin väliaineeseen jälkeen solujen tarttuminen pohjaan kuoppiin. 72 tunnin jälkeen, kelluvat solut supernatantista otettiin talteen. Kiinnittyneet solut käsitellään trypsiinillä-EDTA: lla ja kerättiin, ja niiden vastaavat supernatanteista. Yhteensä solumäärät suoritettiin hemosytometrillä (Burker kammio, Nalgene). Hypoksinen olosuhteet tehtiin inkuboimalla soluja Billrop kammiossa.

Joissakin kokeissa, hei, hei EPO8, OVCAR, ja OVCAR EPO10 soluja viljeltiin nälkään olosuhteissa (ilman FBS) varten ennalta määrättyinä aikoina, tai lisäämättä ADM: lle. Positiivinen kontrolli koostui soluja viljellään täydellisessä elatusaineessa.

tyypin 1 ja tyypin 2 makrofagit hoidettiin rhADM 72 tuntia, sitten talteen käsittelyn jälkeen trypsiini-EDTA: lla ja laskettiin Burker-kammiossa.

klonogeeninen määritykset

Kun laskurin OVCAR-3, OVCAR EPO10, hei, ja HEI EPO8 soluja seerumistarvaatio kokeissa kukin solususpensio laimennettiin FBS sisältävässä väliaineessa hyvin alhainen solutiheyksiin.