Krooninen sairaus

tiivistelmä

Annonaceous asetogeniinit, suuri perhe luonnossa esiintyviä polyketidien eristetty eri lajien kasvien suvun

annonakasvit

, on havaittu olevan merkittävää sytotoksisuutta erilaisia ​​syöpäsoluja. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että nämä yhdisteet voivat toimia mitokondriot monimutkainen-I ja estää vastaavan elektroninsiirtoketju ja lopettaa ATP tuotantoa. Kuitenkin enemmän yksityiskohtia vaikutusmekanismeja epäselviksi. Tässä tutkimuksessa testasimme vaikutuksia joukko mimeettejä annonaceous acetogenin joitakin syöpäsolulinjoilla, ja raportoivat, että niiden joukossa AA005 osoittaa voimakkain antituumorivaikutus. AA005 kuluttaa ATP, aktivoi AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) ja estää mTOR monimutkainen 1 (mTORC1) signaalireitin, mikä johtaa kasvun estäminen ja autophagy paksusuolen syöpäsoluissa. AMPK estäjät yhdiste C ja inosiini repressoivat, kun taas AMPK aktivaattori AICAR parantaa, AA005-aiheutti leviämisen tukahduttaminen ja myöhemmin autophagy paksusuolen syöpäsoluissa. AA005 parantaa ATP ehtyminen ja AMPK aktivaation aiheuttamia 2-deoksiglukoosi, estäjä mitokondrion hengitystä ja glykolyysin. AA005 estää myös kemoterapeuttista ainetta sisplatiini-laukaisi säätely ylöspäin mTOR ja synergizes tätä lääkettä tukahduttamiseen leviämisen ja apoptoosin induktion paksusuolen syöpäsoluissa. Nämä tiedot osoittavat, että AA005 on uusi aineenvaihdunnan inhibiittori, jolla on terapeuttisia mahdollisuuksia paksusuolen syövän.

Citation: Liu Y-Q, Cheng X, Guo L-X, Mao C, Chen Y-J, Liu H-X, et al. (2012) tunnistaminen Käytetty Annonaceous Acetogenin Mimeettien, AA005, kuin AMPK Activator ja Autophagy induktori in koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 7 (10): e47049. doi: 10,1371 /journal.pone.0047049

Editor: Xiaolin Zi, University of California Irvine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 tammikuu 2012; Hyväksytty: 11 syyskuu 2012; Julkaistu: 08 lokakuu 2012

Copyright: © Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Key Program for Basic Research (2012CB910800, 2010CB833200 ja 2009CB940900), National Natural Science Foundation (nro 81071930, 81171925, 20972160 ja 21172220), Special Foundation presidentti ja Key Project tiedon Innovation Program Kiinan Academy of Sciences (KSCX1-YW-R-26 ja KSCX2-YW-R-235), ja National Major tieteellistä ja teknologista ohjelma Drug Discovery (2009ZX09103-101). Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvainsoluja on suurentunut glykolyyttisiä reitin entsyymejä ja glukoositransporttereita jopa läsnäollessa korkean O

2-pitoisuus, johtaa lopulta kohonnut ATP tuotantonopeus [1]. Kliinistä näyttöä on yhdistetty solujen aineenvaihduntaa syövän tuloksia, ja uudelleenohjelmointi energia-aineenvaihdunta on hyväksytty olevan syntymässä tunnusmerkki syövän [2]. Nämä havainnot ovat herättäneet kiinnostusta kohdistaminen energia-aineenvaihduntaan syöpähoitoa sekä hypoksinen (glykolyyttisiä) ja oksidatiivisen kasvainten [1], joskin se koskee myös tätä näitä hoitoja olisi kohtuuttomia vaikutuksia normaaleihin soluihin. Kiehtovan, jotkut ensimmäisistä syöpähoitojen kohdentamista tiettyihin aineenvaihdunnan tarpeisiin syöpäsolujen edelleen tehokas klinikalla tänään uudelleen herättävä pyrkimys käsitellä metabolisen riippuvuuksia syöpäsolujen selektiivisenä syövän vastaista strategiaa [3].

AMP- aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK), joka esiintyy soluissa, kuten heterotrimeeristen kompleksi koostuu katalyyttisen kinaasialayksikön (α) ja kaksi säätelyalayksiköt (β ja γ), on anturi energian tilan, joka ylläpitää solun energiaa homeostaasin. Se aktivoituu lasku ATP (samanaikainen nousu ADP ja AMP) tai ärsykkeitä, jotka lisäävät solujen AMP /ATP-suhde, jolloin aktivointi catabolic reittejä ja esto anabolisten polkuja [4], [5]. Olennaista aktivointi AMPK on sen fosforylaatio Thr-172 ylävirran AMPK kinaasien (AMPKKs) [6], ja kasvaimia estävä LKB1 [7], joka on seriini /treoniini-kinaasi liittyy maha-polyposis ja syöpään [8] ja keuhkosyöpä [ ,,,0],9]. AMPK fosforyloi kaksi nopeutta rajoittavaa entsyymien rasvahappojen ja kolesterolin synteesi: asetyyli-CoA karboksylaasi (ACC) ja HMG-CoA-reduktaasin, sekä muita loppupään tavoitteita, huipentui eston anabolisia reittejä ja aktivointi catabolic reittejä [5] . AMPK aktivointi suoraan rajoittaa translaation aloitus- ja proteiinisynteesiä [10], estämällä translaation pidennystekijä 2 (EF2) [11], ja epäsuorasti TSC2, mikä tukahduttaminen nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) [12], jotka voivat fosforyloivat ja aktivoida p70 S6-kinaasi ja 4E-sitovan proteiinin (4EBP) [13].

AMPK aktivoitumisen AMP analoginen 5-aminoimidatsoli-4-karboksamidi ribonukleaasire- (AICAR) kertyy sykliiniriippuvaiset estäjät p21 ja p27 ja alas-säätelee sykliini D1 ihmisen maksasyövän soluja, mikä johtaa solusyklin pysähtymisen G1-vaiheessa [14]. Väestön tutkimukset antavat viitteitä siitä, että metformiinin, joka on AMPK aktivaattori, voi liittyä heikentynyt esiintyvyys ja parantaa ennustetta tiettyjen syöpien [15], [16]. Rintasyövän, metformiini kykenee estovaikutusta kautta mTOR-riippuvaisen translaation aloitus- [17], [18]. Metformiini estää proliferaatiota, vähentää solujen elinkelpoisuus ja estää solusyklin G1 vaiheessa eturauhasen syöpäsoluja, ja in vivo metformiinin johtaa huomattavaan vähenemiseen kasvaimen kasvu hiirillä ksenografteissa eturauhassyöpäsolujen [19]. Metformiini ja AICAR indusoida apoptoosia ja estää kasvaimen kasvua paksusuolen syöpä HCT116 p53 (- /-) ksenografteja, ja käynnistää autophagy ja HCT116 p53 (+ /+) soluihin [20]. AICAR ja proteiini taitto estäjä 17-AAG, varsinkin yhdistettynä, osoittavat tehon vastaan ​​aneuploidi ihmisen syövän solulinjoissa [21]. Nämä tulokset osoittavat, että AMPK voisi olla järkevä lääkkeen tavoite ja lyijy-yhdisteet pitäisi tunnistaa tai jotka on suunniteltu kehittämään hoitokeinoja syövissä.

Annonaceous asetogeniinit ovat luokka luonnollisesti esiintyviä polyketidien eristetty eri lajien kasvien suvun

annonakasvit

[22]. Näillä yhdisteillä on monipuolinen bioaktiivisuuksiin, kuten lupaava cytotoxicites ja Loisten toimintaa [23]. Vaikka tutkimukset osoittavat, että annonaceous asetogeniinit voivat häiritä mitokondrioiden toimintaa läpi estämällä mitokondrioissa kompleksi I ja ubikinonin sidottu NADH oksidaasi [23], ja sitoa kolmas matriisi puolella silmukan ND1 alayksikön mitokondrioiden NADH-ubikinonia oksidoreduktaasi [23], [24], mekanismien toimintaa näiden yhdisteiden syöpien edelleen suureksi osaksi tuntemattomia. Kemia ryhmä tiimimme oli suunniteltiin ja syntetisoitiin sarja annonaceous acetogenin jäljittelijät [25] – [28]. Tässä työssä testattiin biologinen aktiivisuus joitakin uusia analogeja ja tutkittu taustalla olevat mekanismit annonaceous asetogeniinit ”cytotoxicities, ja on raportoitu, että mimeetti AA005 joka osoitti voimakas ja selektiivinen estävä toiminta vastaan ​​erilaisia ​​syöpäsoluja, pystyi aktivoimaan AMPK ja indusoida solu syklin pidätys seurasi autophagy, mikä osoittaa sen terapeuttinen potentiaaleja.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Annonaceous acetogenin jäljittelijät (taulukko 1) liuotettiin DMSO: hon ja varastoidaan – 20 ° C: ssa. 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) hankittiin Amresco Inc: ltä (Solon, OH). Yhdiste C, rapamysiini, rotenoni, inosiini, rodamiini 123, 2-DG ja AICAR hankittiin Sigmalta. MitoTracker Deep Red FM ostettiin Invitrogen. ATP Assay Kit ostettiin Beyotime Biotekniikan instituutti (Haimen, Jiangsu, Kiina).

Vasta

käytetyt vasta-aineet tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: anti-β-Actin ( Sigma); anti-p-AMPKα1, anti-p-ACC, anti-p-mTOR, anti-p-S6K, anti-AMPKα1, anti-ACC, anti-mTOR, anti-S6K, anti-PARP, vuohen anti-kani IgG- HRP ja vuohen anti-hiiri-IgG-HRP-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology); anti-CyclinD1 (Abcam), anti-CDK4 (Santa Cruz Biotechnology), ja anti-LC3 (Sigma).

Soluviljely ja transfektio

keuhkosyövän A549, rintasyöpä solu MCF-7, kohdunkaulan syövän solulinja HeLa, koolonsyöpäsolulinjoissa LOVO, SW480, HCT116 ja HT29, ja ihmisen alkion munuaisen HEK-293T-solut saatiin American Tissue Culture Collection (ATCC). Ihmisalkion keuhko- fibroblasti MRC-5, mahasyöpä solulinja SGC7901, ja maksan syöpäsolun linja BEL7402 ostettiin Cell Resource Center, Kiina Academy of Medical Sciences (Beijing). Ihmisen normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa (HBEpiC) ostettiin ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, Kalifornia). 293T, A549, BEL7402, HeLa, MCF-7, SGC7901 ja ihmisen normaalia keuhkoputken epiteelisoluissa BEAS-2B [29]-soluja viljeltiin Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Gibco /BRL , Grand Island, NY), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. LOVO, SW480, HCT116 ja HT29-soluja viljeltiin DMEM /F12, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. MRC-5-soluja viljeltiin MEM /EBSS väliaineessa, johon on lisätty ei-välttämättömiä aminohappoja, 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. HBEpiC soluja viljeltiin seerumivapaassa keuhkoputken epiteelisolujen väliaineessa (ScienCell Research Laboratories), joka sisälsi keuhkoputken epiteelisolujen kasvun täydennysosa (ScienCell Research Laboratories). PQCXIP-GFP-LC3 ja pQCXIP-GFP plasmidit [30] transfektoitiin LOVO-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Qiagen) mukaisesti suositeltava protokolla-valmistajan.

elinkykyyn, Cell Proliferation ja klonogeeninen määritykset

Syöpäsolut (5 x 10

3) ympättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Coaster, Charlotte, NC) ja käsiteltiin annonaceous acetogenin jäljittelijät 48 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. MTT-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [31], ja IC

50-arvot laskettiin käyttäen CalcuSyn-ohjelmistoa (versio 2.0, Biosoft, Cambridge, UK). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinivärin syrjäytymistä. Mahdollinen synergistisiä, lisäaineen tai antagonistinen vaikutus välillä AA005 ja 2-PO tai sisplatiini arvioitava huolellisesti käyttäen CalcuSyn Software (Biosoft, Cambridge, UK), kuten on kuvattu [32]. Annos-käyrät yksittäisten tai yhdistetty huumehoidon analysoitiin mediaani-vaikutus menetelmällä [33], jossa yhdistelmä indeksit (CI) alle, yhtä suuri, ja yli 1 osoittavat synergistisiä, lisäaine, ja antagonistisia vaikutuksia, vastaavasti .

pesäkkeitä muodostumista, HT29, LOVO tai HCT116 käsitelty AA005 ympättiin kolmena kappaleena 35 mm levyille (200 solua per levy). Sen jälkeen, kun 8 päivää viljelyn, solut värjättiin Giemsa ja klooneja, joissa on enemmän kuin 50 solusta, laskettiin [29].

Analyysi Cell Cycle ja apoptoosi

havaita solusyklin jakautumisen, paksusuolen syövän solut synkronoitu G1 /S rajan kaksinkertaisella tymidiinin lohko [31], ja sitten altistettiin AA005 on ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Solut kerättiin, kiinnitettiin 70% kylmällä etanolilla 4 ° C: ssa yön yli. Solut sentrifugoitiin ja pestiin PBS: llä, mitä seurasi inkubointi RNaasi ja propidiumjodidilla (PI) (Sigma-Aldrich). Solusyklin jakelu analysoitiin virtaussytometrialla (BD FACS Vantage Diva, USA). Solujen apoptoosi mitattiin käyttämällä PE anneksiini V /PI Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA) valmistajan ohjeiden.

Analyysi solujen GFP-LC3 Rakkuloilta

Solut transfektoitiin jossa pQCX-IP-GFP-LC3 ja pQCX-IP-GFP-proteiinia ekspressoivien plasmidien 24 h, ja käsiteltiin sitten erilaisilla pitoisuuksilla AA005 vielä 24 tuntia. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä /PBS: ssä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla 63-kertaisella suurennuksella. Prosenttiosuus GFP-positiivisten vesikkelien solut arvioitiin [30].

mittaus mitokondrio-transmembraanisten Potential, ATP sisältö ja NAD

+ /NADH-suhde

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla annonaceous acetogenin jäljittelijät 24 tuntia. Mitokondrioiden transmembraaninen potentiaali tutkittiin, kuten on kuvattu [34], ATP-pitoisuus mitattiin käyttämällä ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotekniikan instituutti), ja NAD

+ /NADH-suhde mitattiin käyttäen Amplite ™ Kolorimetrinen NAD /NADH Assay Kit ( AAT Bioquest, Inc., Sunnyvale, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

konfokaalimikroskopia Analyysit

Solut kasvatettiin coverslip ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydi. Kun lyhyt pesu PBS: ssä, johon oli lisätty 100 mM glysiiniä, kalvot estettiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA, Sigma) ja 0,3% Triton X-100 PBS: ssä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja värjättiin fluoresenssimikroskopiaan, kuten on kuvattu [ ,,,0],31]. Solut upon AA005-flunssa tutkittiin käyttämällä Zeiss LSM 510 META mikroskooppi varustettu 63 × öljy-immersio-objektiivi. Kuvankäsittely ja analysointi tehtiin Zeiss LSM 510 ohjelmistoversio 3.2, ImageJ versio 1,42 (National Institutes of Health), ja Adobe Photoshop versio 7.0 (Adobe Systems).

Western-blottaus

Solusakat lyysattiin RIPA-puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% deoksikolaattia, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 5 mM NaF, 1 mM natriumvanadaattia, ja proteaasi-inhibiittoreita cocktail ( Sigma). Solut lyysattiin jäillä 30 min RIPA-puskurissa, lysaatit sentrifugoitiin, proteiini uutteet kvantitoitiin ja ladattiin 10%: sta 15% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelillä, elektroforeesi ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Whatman). Kalvo inkuboitiin primaarisen vasta-aineen, pestiin, ja niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Detektio suoritettiin käyttäen kemiluminesenssi Länsi havaitseminen kit (Cell Signaling Technology) [35].

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa ja tulokset esitetään keskiarvona ± SD, ellei muuta mainita. Erot tietoryhmät arvioitiin merkitys käyttäen Student

t

-testin parittomien tietoja tai yksisuuntaisen varianssianalyysin ja Bonferronin post-testi.

P

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

rakenne-aktiivisuussuhde (SAR) analyysi Annonaceous Acetogenin mimetiikka

serial annonaceous acetogenin jäljittelijät oli syntetisoitu korvaamalla sekä tetrahydrofuraani (THF) renkaat luonnon bullatacin yksinkertainen dieteeniglykolieetteri yksikössä kemian ryhmä tiimin [25] – [28]. Yhdeksän novel analogit syntetisoitiin tässä työssä, ja huomasimme, että jäljittelijät AA005 [25] ja AA093, yhdiste ottamalla käyttöön 10-hydroksiryhmän päälle AA005, edusti kaksi yhdistettä, joka oli alhaisimmat IC50-arvot tässä asetelmassa ( Pöytä 1). Havainto, että yhdiste AA090 ja AA091 puuttuu oikea laktoni yksikön ja jätti 11-hiilen hännän osoitti 17 170 kertaa pienempi sytotoksisuus syöpäsoluissa ehdotti, että nämä ryhmät ovat välttämättömiä sytotoksisuuden AA005. AA101 ylimääräisellä laktonin yksikkö upotettu vasemmassa hiilivetyketjun osa näytteillä 23-142 kertaa alhaisempi sytotoksisuus syöpäsoluissa, edelleen vahvistaa, kuinka tärkeää on pitkä hydrofobinen häntä ja oikea terminaali laktonin matkiminen. Lisäämällä keskellä eetteri yksikkö jäljittelijät (yhdisteet AA102-105) hieman parantaa niiden anti-proliferatiivista aktiivisuutta verrattuna AA101, viittaa siihen, että dieteeniglykolieetteri yksikkö on tärkeää anti-proliferatiivista aktiivisuutta. Monipuolinen biologinen aktiivisuus näiden jäljittelijät osoittaa, että rakenteelliset analogit eivät ehkä toimi analogit.

estovaikutus AA005 syöpäsoluihin

Koska AA005 oli kaikkein voimakas sytotoksinen lääkeaine Näistä jäljittelijät, me testattiin edelleen sen vaikutuksia 11 ihmisen syöpäsolujen linjat ja 4 noncancerous solulinjoissa (HBEpiC, MRC5 HLF ja 293T), ja totesi, että AA005 osoitti erilaisia ​​vaikutuksia syöpäsolujen että sillä oli voimakas estävä vaikutus paksusuolen (HCT116, HT29, LOVO ja SW480), mahalaukun (SGC7901), maksan (BEL7402), keuhkojen (A549) ja rintojen (MCF7) syöpä linjat, ja heikko vaikutus kohdunkaulan (HeLa) syöpäsolujen (kuvio 1A). AA005 näytteillä estovaikutusta HCT116 (kuvio 1 B), HT29 (kuvio 1 C) ja LOVO (kuvio 1 D) solut ja ajasta riippuvalla tavalla. Mielenkiintoista on, että AA005 osoitti vielä heikompi aktiivisuus noncancerous (HBEpiC, MRC5, HLF, BEAS-2B ja 293T-solut) (kuva 1A ja taulukko 1). Nämä tulokset osoittavat, että suhteellinen selektiivinen estovaikutus AA005 syöpäsoluihin aihetta jatkotutkimuksiin.

(A) IC

50-arvot AA005 (48 h) eri ihmisen syövän ja noncancerous solulinjoissa. IC

50-arvot (keskiarvo ± SD, uM) laskettiin 3 itsenäisestä kokeesta. (B-D) MTT määrityksissä HCT116 (B), HT29 (C) ja LOVO (D) solut upon AA005 ilmoitetuilla pitoisuus ja ajankohtina.

AA005 vaimentaa solun lisääntymis- ja pesäkkeitä muodostavien aktiivisuus koolonkarsinoomasoluissa

analysoitava tarkemmin vaikutukset AA005 paksusuolen syöpäsoluissa. Käyttämällä trypaanisiniekskluusiolla analyysit, olemme osoittaneet, että hoito AA005 on 50-200 nM 24-48 h inhiboi merkittävästi leviämisen HT29, LOVO ja HCT116, mutta ei HBEpiC tai BEAS-2B-soluja (kuvio 2, A ja B) . Foci muodostumisen testi osoitti AA005 n voimakas estävä vaikutus pesäkkeenmuodostuskyvyn aktiivisuuteen koolonkarsinoomasoluissa (kuvio 2C). Analysoimme vaikutukset AA005 solusyklin ja totesi, että AA005 aiheutti huomattavaa lisäystä prosenttiosuuden koolonkarsinoomasoluissa in G1 vaiheessa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2D).

(A, B) Indikoitu soluja käsiteltiin tai ei AA005: ssa 48 tuntia tai osoitettu ajankohtina ja analysoitiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. (C) Pesäkkeenmuodostusta analyysiä klonogeeniset aktiivisuuden koolonkarsinoomasoluissa käsitelty tai ilman AA005. (D) Colon syövän soluja käsiteltiin AA005 on ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Solusyklin jakautuminen määritettiin virtaussytometrialla.

AA005 Tavoitteet mitokondrioissa kuluttaa ATP ja aktivoi AMPK in koolonkarsinoomasoluissa

fluoreseiinileimattua AA005 (AA005-flunssa, kuvio 3A) oli onnistuneesti jonka biologinen aktiivisuus arvioidaan tukeman protokollan tutkittuaan useita mahdollisia johdannaispositioiden rinnakkain [36]. AA005-flunssa havaittiin olevan samanlainen soluun selektiivisyys sen vanhempien molekyyliin, ja kertyvät mitokondrioissa maksasyöpä, mutta ei normaaleissa soluissa [36]. Käyttämällä immunof- konfokaalimikroskopia analyysi, osoitimme, että AA005-flunssa toimia samanaikaisesti paikallistaa kanssa mitokondrioiden HT29, HCT116 ja LOVO soluja (kuvio 3B). Kuitenkin AA005-flunssa-signaali oli erittäin heikko mitokondrioissa HBEpiC tai 293T-soluja (kuvio 3B). Vaikka AA005-flunssa esti leviämisen Lövön, HT29 ja HCT116-solujen annoksesta riippuvalla tavalla, sen sytotoksinen vaikutus HBEpiC oli heikko (kuvio 3C). Lisäksi kerroimme että AA005 voisi lisätä rodamiini 123-negatiivinen jakeiden HT29 ja LOVO muttei HBEpiC soluja (kuvio 3D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että AA005 voi kohdistaa mitokondrioiden molekyylejä ja näin ollen häiritse energinen reitin syöpäsoluja.

(A) kemiallinen rakenne AA005-fluoreseiini. (B) solunsisäinen lokalisaatio AA005. Soluja co-inkuboitiin AA005-flunssa 100 nM: ssa 12 h, ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla käyttämällä mitotracker (punainen) torjumaan-tahra mitokondrioita. (C) MTT-määritystä LOVO, HT29, HCT116 ja HBEpiC solujen päälle AA005-flunssa ilmoitettuina pitoisuuksina 48 tuntia. (D) AA005 vähentää mitokondrioiden transmembraaninen potentiaali koolonkarsinoomasoluissa paljastaa kasvu rodamiini 123-negatiivisia soluja. Solut käsiteltiin AA005 ilmoitetuilla pitoisuus 24 tuntia ja analysoitiin rodamiini 123 värjäyksellä ja virtaussytometrialla. (E) Soluja käsiteltiin tai ei AA005 ilmoitetuilla pitoisuus 24 h, NAD

+ /NADH-suhde mitattiin käyttäen AmpliteTM Kolorimetrinen NAD /NADH Assay Kit. (F) Soluja käsiteltiin tai ei AA005 ilmoitetuilla pitoisuus 24 tuntia, ja ATP-pitoisuus mitattiin käyttämällä ATP Bioluminescence Assay Kit. (G) Soluja käsiteltiin AA005 ilmoitetuilla pitoisuus ja ajankohtina, hajotettiin, ja Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen osoitti vasta-aineita.

mitokondrioissa kohdistaminen aineet (mitocans) ovat alttiita häiritseviä hapettumista fosforylaatioreitti ja vähentämällä NAD

+ /NADH-suhde, ja estää siten ATP tuotannon ja aktivointi AMPK joka heijastuu fosforylaation ja inaktivaation asetyyli-CoA Carboxylase (ACC) (Ser79), joka on indikaattori AMPK toimintaa [37]. Testasimme vaikutus AA005 solu- NAD

+ /NADH-suhde ja ATP sisältöä, ja totesi, että HT29 ja LOVO solujen käsittely AA005 lämpötilassa 50 200 nm: ssa 24 tuntia alennetaan NAD

+ /NADH-suhde ( Kuvio 3E) ja köyhdytettyä ATP annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3F), kun taas mielenkiintoisesti, AA005 ei merkittävästi vähentää NAD

+ /NADH-suhde ja ATP-sisältöä HBEpiC soluissa (kuvio 3E ja F). Lisäksi AA005 selvästi säädelty p-AMPK ja p-ACC annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla (kuvio 3G). Nämä ilmiöt eivät täyttyneet HBEpiC soluissa (kuvio 3G).

Osoitimme, että AA005 sekä mitocans AICAR ja rotenone aiheutti ATP ehtyminen HT29 ja LOVO soluja, kun taas AMPK inhibiittorit yhdiste C ja inosiini heikennettyjä tämä vaikutus (kuvio 4A). AA005, AICAR ja rotenone sääteli p-AMPK ja p-ACC, kun taas yhdiste C ja inosiini vähensi AA005 laukaisema säätely ylöspäin kahden molekyylin (kuva 4B). Lisäksi, kun taas AA005 esti leviämisen HT29 ja LOVO-solut, yhdiste C ja inosiini vähentää tätä vaikutusta (kuvio 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että AMPK aktivoitumista tarvitaan AA005 aiheuttama sytotoksisuuden paksusuolen syöpäsoluja.

(A) Ilmoitettu Solut käsiteltiin joko yksin tai kombinaatio- kanssa AA005 (100 nM), AICAR (AA, 1 mM), retenone (1 uM), yhdiste C (CC, 10 uM), tai inosiini (20 mM) 24 tunnin ajan, ja ATP-pitoisuus mitattiin. (B) HT29 ja LOVO-soluja käsiteltiin osoitetulla protokollan, hajotettiin, ja Western-blottaus suoritettiin käyttäen osoitti vasta-aineita. (C) HT29 ja LOVO-soluja käsiteltiin eri hoito-ohjelmat 48 h, ja solujen elinkyky havaittiin MTT-määrityksellä.

AMPK aktivointi sovittelee AA005 aiheuttama mTOR Complex 1 (mTORC1) inhibitio in vitro

Aktivoidut AMPK fosforyloi TSC2 at Thr-1227 ja Ser-1345 ja lisää toiminnan TSC1-TSC2 kompleksi estää mTOR [12]. Testasimme vaikutukset AA005 on mTORC1, ja ilmoitti, että AA005 laski p-mTOR ja p-S6K (p85 ja p70 S6K) LoVo ja HT29 muttei HBEpiC soluja (kuvio 3G). AICAR ja rotenone myös alassäädetty p-mTOR in HT29 ja LOVO soluja (kuvio 4B). Kuitenkin AA005 aiheuttama p-mTOR alassäätöä voi osittain tukahdutettu inosiini ja yhdiste C (kuva 4B). Yhdiste C ja inosiini myös osittain heikennettyjä sykliini D1 alassäätöä aiheuttama AA005 (kuva 4B).

AMPK /mTOR Merkinanto on sekaantunut AA005 aiheuttama Autophagy in vitro

AMPK aktivointi voi aiheuttaa autophagy kautta mTOR (49). Testasimme AA005 voivat aiheuttaa autophagy paksusuolen syöpäsoluissa tai havaitsemalla muutokset sytosolin muodossa (LC3-I) ja lipidoitu muodossa (LC3-II) autophagy markkerin LC3. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että AA005 indusoi kertyminen LC3-II LOVO solut ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 5A). PQCXIP-GFP-LC3 plasmidi transfektoitiin LOVO-solut, jotka sitten käsiteltiin AA005 100 nM: ssa 24 tuntia, minkä jälkeen konfokaalimikroskopialla arviointi. Osoitimme, että vaikka ohjaus soluilla hajanainen värjäys, LOVO soluja kun AA005 tai mTOR-estäjä rapamysiini (100 nM) osoitti pilkullinen fluoresenssivärjäys kuvio, joka osoittaa uudelleenjako LC3 on autophagosomes (kuvio 5B). Mielenkiintoista on, inosiini heikennettyjä AA005 aiheuttaman muodostumisen LC3 autophagosomes (kuvio 5B) ja kertyminen LC3-II (kuvio 5C). Nämä tulokset osoittavat, että AA005 indusoi autophagy paksusuolen syövän solujen kautta AMPK /mTOR-signalointireitin. Kuitenkin hoito AA005 50-200 nM 24 h tai 100 nM 12-48 h ei johtanut selvästi apoptoosin Lövön solujen, heijastuu anneksiini V /PI-värjäys ja virtaussytometria arviointi (kuvio 5D) tai Western blot-analyysi katkaisun PARP, substraatin aktivoitujen Casp-3 (kuvio 5E).

(A) immunoblot-analyysi LC3-I ja LC3-II tasot LOVO-solut käsiteltiin AA005. (B) LOVO-solut, jotka on transfektoitu pQCXIP-GFP tai pQCXIP-GFP-LC3 plasmidi käsiteltiin 24 h ajan AA005 (100 nM) ja /tai inosiini (20 mM), ja rapamysiini (100 nM), ja arvioidaan immunofluoresenssilla analyysit. (C) LOVO-soluja käsiteltiin osoitetulla protokollia, hajotettiin, ja Western blot -määritys suoritettiin käyttäen osoitti vasta-aineita. (D) LOVO-soluja käsiteltiin AA005 tai sisplatiinin (20 uM) 24 tunnin ajan, tai AA005 100 nM ilmoitettuina ajankohtina. Sitten solut analysoitiin anneksiini V /PI-värjäyksen ja virtaussytometrialla. (E) Western blot analyysit lysaatit Lövön käsiteltyjen solujen AA005 tai sisplatiinin (20 uM 24 h).

AA005 synergistisesti 2-deoksiglukoosilla ja sisplatiinin Inhiboivaa Colon Cancer Cell Proliferation by muuttaminen AMPK ja mTOR

2-deoksiglukoosi (2-PO) on synteettinen glukoosianalogi, joka pystyy estämään glykolyysin ja ATP-tuotannon [38]. Testasimme yhdessä vaikutukset AA005 ja 2-DG LoVo soluissa, ja totesi, että yhdistettyä käyttöä kahden aineen kohdistama synergistisyyttä soluproliferaation inhibointi (kuvio 6A ja B) ja tukahduttamiseksi ATP sukupolven (kuvio 6C). AA005 yhdistelmänä 2-DG johti tehostettu säätely ylöspäin p-AMPK ja p-ACC, ja alas-säätely p-mTOR ja CDK4 (kuvio 6D).

(A, B) LOVO-solut käsiteltiin ilmoitettu protokollia 48 h, analysoitiin MTT-määrityksellä (A), ja yhdistetyt vaikutukset arvioitiin Chou-Talay menetelmä ja CalcuSyn-ohjelmisto (B). Yhdistelmä indeksit (CI) alle, yhtä suuri, ja yli 1 osoittavat synergistisiä, lisäaine, ja antagonistisia vaikutuksia, vastaavasti. (C) LOVO-solut käsiteltiin 50 nM AA005 ja /tai 5 mM 2-DG: ssa 24 tuntia, ja ATP-pitoisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla. (D) Western blot analyysit lysaatit Lövön käsiteltyjen solujen AA005 tai /ja 2-DG käyttäen osoitti vasta-aineita. (E, F) LOVO-solut käsiteltiin ilmoitettu protokollia 48 h, analysoitiin MTT-määrityksellä (E), ja yhdistetyt vaikutukset arvioitiin Chou-Talay menetelmä ja CalcuSyn-ohjelmisto (F). (G) Western blot analyysit lysaatit Lövön käsiteltyjen solujen AA005 tai /ja sisplatiiniin käyttäen osoitti vasta-aineita. (H) LOVO-solut käsiteltiin AA005 ja /tai sisplatiinin ja analysoitiin anneksiini V /PI-värjäyksen ja virtaussytometrialla. (I) Soluja käsiteltiin AA005 ja /tai sisplatiinin 24 tuntia, ja ATP-pitoisuus mitattiin käyttämällä ATP Bioluminescence Assay Kit. (J) LOVO-solut käsiteltiin AA005 ja /tai sisplatiinin 24 tuntia, ja solusyklin jakautuminen määritettiin virtaussytometrialla.

kemoterapeuttisia sisplatiinia voidaan säätää ylös mTOR selviytymisreittiin joka antaa lääkeresistenssin syöpäsoluja [39]. Osoitimme, että vaikka AA005 ja sisplatiinin aiheuttama synergistinen inhiboiva vaikutus LOVO soluproliferaatioon (kuva 6 E ja F), AA005 vähentynyt sisplatiini-laukaisi säätely ylöspäin mTOR ja S6K (kuvio 6G). Yhdistetty käyttö AA005 ja sisplatiinin johti tehostetun apoptoottista vaikutusta LOVO soluihin, heijastuu anneksiini V /PI-värjäys ja virtaussytometria arviointi (kuvio 6H) tai Western blot-analyysi lohkaisemalla PARP (kuvio 6G). Kuitenkin näiden kahden agentit eivät aiheuttaneet synergiaa ehtymiseen ATP sisältöä (kuvio 6I), solusyklin pysähtymisen (kuvio 6J) tai autophagy (heijastuu ilmaisu LC3-II, kuva 6G) LoVo soluissa.

keskustelu

Annonaceous asetogeniinit edustavat useita C-35 /C-37 luonnontuotteet hydroksyloitu THF ja γ-laktoni renkaat rakenteita [25], [26], [28]. Monet tämän perheen jäseniä näytön sytotoksisen aktiivisuuden häiriön terminaalin elektronin siirto askel monimutkainen I mitokondrioita [40]. AA005 on mimeettinä annonaceous acetogenin, jossa sekä THF: renkaat on korvattu etyleeniglykolieetteri yksikkö. AA005 säilyttää olennaiset toiminnot luonnon asetogeniinit osoittaa tehokkaampi biologinen aktiivisuus [41]. Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että AA005 pystyy aktivoimaan AMPK ja estävät mTOR siksi pidättää solusyklin G1-vaiheessa ja aiheuttaa autophagy paksusuolen syöpäsoluissa. AA005 synergiaa Glykolyysivaiheen estäjän 2-DG merkittyjä ATP sukupolven saarto, ja antagonisoi sisplatiinin aiheuttama säätely ylöspäin p-mTOR, joka parantaa leviämisen estäminen ja apoptoosin induktioon koolonkarsinoomasoluissa. Nämä tulokset osoittavat, että AA005 kantaa terapeuttisia mahdollisuuksia ainakaan tällaista pahanlaatuinen kasvain.

Kohdistaminen syöpä solujen aineenvaihduntaa, erityisesti Glykolyysivaiheen esto, on tullut uusi lupaava strategia taistelemaan syöpää [42] – [44]. Mitokondriot paitsi hallinnoi energiantuotannon kautta sitruunahappokierron (trikarboksyylihapposyklin, TCA-sykli), mutta myös keskeinen rooli apoptoosin sääntelyn kautta vapauttamaan sytokromi C. Vaikka on paljon keskustelua siitä, onko mitokondriot on puutteita oksidatiivisen fosforylaatioreitti, se voisi olla potentiaalinen kohde syövän hoidossa [42], [45]. Jotkut mitocans kuten metaformin ja E-vitamiini analogeja, jotka estävät kompleksin I ja II osoittavat, tehokas ja selektiivinen syövän vastainen vaikutus. Nämä aineet aiheuttaa syöpää solukuoleman kautta sukupolven superoksidi ja mitokondrioiden epävakautta [46]. ATP voi myös olla tyhjentynyt jossakin määrin hoidossa mitocans [42], [45]. Mitokondriot-I: n on osoitettu olevan kohteena annonaceous acetogenin [40]. Me raportoimme, että AA005 voivat toimia paikallistaa kanssa mitokondriot paksusuolen syöpä, mutta ei HBEpiC tai 293T-soluja (kuvio 3A), viittaa siihen, että AA005 voi vähentää NAD

+ /NADH-suhde ja ATP-tuotannon syöpäsoluissa. Tämä mahdollisuus on vahvistettu LOVO, HT29 ja HCT116-solut (kuvio 3C). Kuitenkin miksi mitokondriot syöpäsoluissa ovat alttiimpia on kohdistettu AA005 edelleen avoin kysymys. Esto mitokondrioita mukaan metaformin ja rotenone voi johtaa aktivoitumiseen AMPK [42]. Osoitamme, että AA005 voi myös estää mitokondrioissa ja aktivoi AMPK (kuvio 3).