Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja Tavoitteet

GLI1, välttämättömänä transkription tekijä Hedgehog signalointireitin, on tärkeä rooli kehitettäessä haimasyövän (PC). DNA metyylitransferaaseja (DNMTs) välittävät metylointi määrä kasvaimeen liittyvien geenien. Tutkimuksemme tavoitteena oli tutkia suhdetta GLI1 ja DNMTs.

Methods

ilmaisujen GLI1 ja DNMTs havaittiin kasvaimen ja viereisten normaaleissa kudoksissa PC potilaiden immunohistokemiallinen (IHC). PANC-1-soluja käsiteltiin syklopamiinilla ja GLI1-siRNA, kun taas BxPC-3-solut transfektoitiin yli-ilmentyminen-GLI1 lentivirusvekto-. Sitten GLI1 ja DNMTs ilmaisun analysoitiin qRT-PCR ja western blot (WB). Sitten otimme kromatiinin immunosaostuksella (chip) osoittaa GLI1 sitoutuvat DNMT1. Lopuksi, sisäkkäisiä MSP vietiin valuate metylaatiotasot APC ja hMLH1, kun GLI1 ilme muuttunut.

Tulokset

IHC tulos ehdotti ilmauksia GLI1, DNMT1 ja DNMT3a PC kudoksissa olivat kaikki suurempi kuin viereisten normaaleissa kudoksissa (p 0,05). Sen jälkeen GLI1 ilme tukahdutettu syklopamiinia mRNA ja proteiini taso (alassäätöä 88,1 ± 2,2%, 86,4 ± 2,2%, tässä järjestyksessä), DNMT1 ja DNMT3a mRNA ja proteiini taso laski 91,6% ± 2,2% ja 83,8 ± 4,8%, 87,4 ± 2,7% ja 84,4 ± 1,3%, vastaavasti. Kun edelleen tippuu alas ilmaus GLI1 siRNA

(

mRNA laski 88,6 ± 2,1%, proteiinia laski 63,5 ± 4,5%), DNMT1 ja DNMT3a mRNA laski 80,9 ± 2,3% ja 78,6 ± 3,8% ja proteiini laski 64,8 ± 2,8% ja 67,5 ± 5,6%, vastaavasti. Yli-ilmentyminen GLI1 mukaan GLI1 geenin transfektiolla (mRNA kasvoi 655,5 ± 85,9%, ja proteiinin määrä kasvoi 272,3 ± 14,4%.), DNMT1 ja DNMT3a mRNA: ta ja proteiinia kasvoi 293,0 ± 14,8% ja 578,3 ± 58,5%, 143,5 ± 17,4 % ja 214,0 ± 18,9%, vastaavasti. ChIP määritykset osoittivat GLI1 sitoutuneen proteiinin DNMT1 mutta ei DNMT3a. Tulokset sisäkkäisiä MSP osoitti GLI1 ilmaisu vaikutti DNA metylaatio APC-taso, mutta ei hMLH1 PC.

Johtopäätös

DNMT1 ja DNMT3a säädellään GLI1 PC, ja DNMT1 on sen suora kohdegeenin .

Citation: Hän s, Wang F, Yang L, Guo C, Wan R, Ke A, ​​et al. (2011) Expression of DNMT1 ja DNMT3a säädellään GLI1 Human Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (11): e27684. doi: 10,1371 /journal.pone.0027684

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 21 lokakuu 2011; Julkaistu: 14 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 He et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Natural Science Foundation of China (81072005, 81172312) ja Shanghai Science and Technology komitea (08411963000, 09JC1412200). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on erittäin tappava sairaus, joka diagnosoidaan yleensä pitkälle edenneessä, joille ei juurikaan ole tehokasta hoitoja. Se on pahin ennuste merkittävistä pahanlaatuisen (3% 5 vuoden pysyvyys) ja on neljänneksi yleisin syy syövän kuoleman vuosittain useissa maissa. Edistysaskelista huolimatta kirurginen ja lääketieteellinen hoito, vähän vaikutusta on tehty kuolleisuus tähän tautiin. Yksi suurimmista tunnusmerkkejä haimasyöpä on sen laaja paikallinen syövän leviämisen ja varhaisen systeeminen levittämiseen. Niin, se on kiireesti paljastaa taustalla mekanismeja, joilla haiman syöpäsoluja tulla invasiivisia ja metastaattinen.

Hedgehog signalointiryöpyn on poikkeuksellisesti aktivoitu erilaisissa ihmisen kasvaimissa kuten haimasyövän (PC) [1]. Aktivointi Hh-reitin edellyttää sitoutumista Hh ligandeja, kuten Shh, Ihh ja Dhh, Hh-reseptori Patched (Ptch), vapauttaen näin Hh signalointimolekyyli smoothened (Smo) peräisin Ptch inhiboivan. Smo puolestaan ​​käynnistää vapauttaa transkriptiotekijän GLI päässä tukirankansa monimutkainen proteiinien, mikä helpottaa sen tumaansiirtymiseen, GLI aktivaattorit sitoutuvat sitten GACCACCCA kaltainen motiivi varten transkription säätelyyn Hedgehog kohdegeenien, jotka ovat mukana solulisäkasvun säätely, solu-kohtalon määrittämiseen, solu selviytymisen, ja epiteelin-to mesenkymaalitransitioon (EMT) ja jne kalvo glykoproteiini Human Hedgehog Vuorovaikutus proteiini (HHIP) voi sitoutua kaikkiin kolmeen Hh ligandeja ja toimintoja negatiivisesti säännellään toimintaa hh-signalointireitin [2], [3].

DNA: n metylaatio muutos on keskeinen vaikuttaja ihmisen kasvaimen synnyssä [4]. Ihmisen syöpäsoluja, normaali somaattisten kuvio DNA: n metylaatio on muutettu. Nämä muutokset ovat lisääntynyt CpG-saarekkeen metylaation, joka välittää tuumorisuppressorigeeniä hiljentäminen [4], ja genominen DNA hypometylaatio, mikä voi johtaa genomin epästabiilisuuden [5], [6]. Sytosiini DNA metylaatio katalysoivat ja säätelevät pienen perheen DNA metyylitransferaaseja (DNMTs), mukaan lukien DNMT1, DNMT3a, DNMT3b ja DNMT3L [7]. Vaikka syöpää erityisiä mutaatioita DNMTs ei ole raportoitu, useat tutkimukset viittaavat siihen, että DNMT geenit yliekspressoituvat ihmisen syövän ja sen aikana solun transformaatio [8] – [11]. Useat mekanismit näyttävät osuus DNMTs yli-ilmentyminen, mukaan lukien poikkeava solusyklin kontrolli, lisääntynyt mRNA: n ja proteiinin stabiilisuuteen, ja E2F-välitteisen DNMTs promoottorin aktivaation [11] – [14].

Vaikka todisteet edellä osoittavat, että DNMTs ja aktiivinen Hh-signalointireitin ovat molemmat mukana kehittämässä haimasyövän, tiedetään vähän korrelaatiota DNMTs ja jäsenten Hh-reitin. Tässä tutkimuksessa tarkoituksena oli selvittää ilmaus GLI1 ja DNMTs, ja niiden välinen korrelaatio ihmisen haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

kudosten haimasyövän ja vastaavat ei-syöpä haima saatiin Shanghai Tenth kansan sairaalassa, jossa olemme saaneet eettisen hyväksynnän Medicine and Life Sciences eettisen komitean.

Soluviljelmät ja lääkehoito

Ihmisen haimasyövän solulinja PANC-1 ja BxPC-3 kasvatettiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), streptomysiiniä 100 ug /ml, ja penisilliiniä 100 U /ml 37 ° C: ssa 5% CO2 ja 95% ilmaa -humidified yrityshautomo. BxPC-3-soluja viljeltiin lentiviruksen transfektio yli-ilmentymisen-GLI1 lentivirusvekto-. PANC-1-solut maljattiin tiheydellä 4 x 10

4 solua /cm

2 kuuden kuoppalevyllä, Syklopamiini (Sigma, St. Louis, MO), liuotettiin 100%: ista etanolia ja sitten laimennettiin tuoretta päivänä testauksen soluviljelmäkokeita. PANC-1-soluja käsiteltiin lopullinen pitoisuus Syklopamiini 10 uM: ssa 24 tuntia.

immunohistokemia (IHC) B

Kaksikymmentä paria PC ja vastaavat ei-syöpä haima kudokset saatiin Shanghai kymmenes kansan sairaalassa. Haiman potilaiden kasvain leikkeet de-paraffinised, vedettömät, käsiteltiin 10 mM sitraattipuskurissa 95 ° C: ssa hakea antigeenejä, blokattiin 5% BSA: ta, ja inkuboitiin hiiren anti-GLI1 (1:100), kanin anti-DNMT1 ( 1:100) tai kanin anti-DNMT3a vasta-aine (1:100; kaikki Santa Cruz Biotech) yön yli. Kudos Sitten leikkeitä inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineilla ja DAB-reagenssia (Gene Tech, Shanghai, Kiina). Sitten leikkeitä vastavärjättiin hematoksyliinillä, sitten oli kuivattu ja visualisoitiin 3,3-diaminobentsidiinillä (Gene Tech, Shanghai, Kiina). Negatiiviset kontrollit tehtiin kussakin tapauksessa korvaamalla primaarisen vasta-aineen kanssa PBS: ssä.

RT-PCR: llä ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin PANC-1-soluja käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Kalifornia, USA), 1 ug RNA: ta oli käänteiskopioitiin cDNA käyttäen PrimeScript RT reagenssia Kit (Takara Bio, Shiga, Japani). Määrän määrittämiseksi mRNA, cDNA monistettiin reaaliaikaisella PCR SYBR Esisekoite Ex Taq RT-PCR (Takara Bio, Shiga, Japani), ja taloudenhoito geeni β-aktiini käytettiin sisäisen valvonnan. SYBR Green määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena on 7900HT reaaliaikainen väline (Applied Biosystems, CA, USA). Käytetyt alukkeet qRT-PCR listattiin (taulukko 1). Suhteellinen ekspressiotasoja laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCT

menetelmällä.

Western Blot (WB) B

Yhteensä solulysaattia valmistettiin 1 × natriumdodekyylisulfaattia puskuria. Proteiinit sama määrä erotettiin 6% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF). Inkubaation jälkeen spesifisten vasta-aineiden DNMT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai DNMT3a (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai GLI1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai β-aktiini (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), blotteja inkuboitiin vuohen anti-kani tai anti-hiiri-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi.

Sirna estoa GLI1 ilmaisun

Stealth pieniä häiriöitä RNA (siRNA) sekvenssit GLI1 suunniteltiin ja syntetisoitiin GenePharma kohdistaa GLI1 mRNA. Koodaavan säikeen varten GLI1 siRNA oli 5′-GGCTCAGCTTGTGTGTAAT-3 ’. Liity siRNA sekvenssiä käytettiin kontrollina. Tässä kokeessa soluja inkuboitiin 12 tunnin ajan ja transfektoitiin noin 60%: n konfluenssiin 50 nm siRNA-dupleksit käyttäen Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki kokeet suoritettiin 72 tuntia transfektion jälkeen.

Lentivirusvektorikonstruktit transfektio yliekspressio-GLI1 Lentivirusvektori

Lentivirusvektorikonstruktit transfektio yli-ilmentymisen-GLI1 lentivirusvektori PGC-FU-GLI1 suoritettiin kuten on raportoitu aikaisemmin [ ,,,0],15]. Ihmisen GLI1 cDNA hankittiin Open-Biosystemin (USA). Täydellinen cDNA-sekvenssi GLI1 tuotettiin PCR: llä ja insertoitiin PGC-FU-3FLAG Vector (GeneChem Company, Shanghai, Kiina), joka linearisoitiin

Age I

ja

Nhel

( Fig. S1, S2). Saatu 3320 bp: n fragmentti varmistettiin sekvensoimalla (Fig. S3). Lentivirusvektori tuotettiin ko-transfektoitiin 293T-soluihin, jossa auttaja-rakenne. Titterit 2-5 x 10

7 TU /ml rutiininomaisesti saavutettiin. BxPC-3-solut transfektoitiin lentivirusvektorin ja GLI1 ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä ja western blot -analyysi.

Kromatiini immunosaostus (ChIP) B

DNA-GLI1-proteiinin immuuni- kompleksien oli preparated kuten on raportoitu aiemmin [15] sen jälkeen, kun käänteisen silloitettu, DNA uutettiin fenoli /kloroformilla ja saostetaan. Läsnäolo DNMT1 ja DNMT3a promoottorin domeenin, joka sisältää GLI1 motiiveja Immunopresipitoidun-DNA tunnistettiin PCR: llä käyttäen alukkeita (taulukko 2). PCR-olosuhteet DNMT1 ja DNMT3a promoottorialueen olivat: denaturointi 30 sekuntia 94 ° C: ssa, alukkeiden 30 s, venymä 1 minuutti 72 ° C: ssa. Hehkutus lämpötilat on lueteltu taulukossa 2. monistus DNMT1 ja DNMT3a promoottorialue analysoitiin sen jälkeen, kun 40 sykliä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

DNA: n valmistus

DNA uutettiin TIANamp Genominen DNA Kit (Tiangen, Peking, Kiina). Noin 500 ng uutettu DNA olivat bisulfiitin conversed ja sarake-puhdistetaan EZ DNA Metylointi-Gold ™ Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA), jotta 10 ui näytettä.

sisäkkäisiä MSP

DNA: n metylaatio tila promoottorialueiden APC (adenomatoottisen polypoosin coli) ja hMLH1: n (ihmisen mutL homologi 1) määritettiin menetelmällä MSP edelleen modifioitu sisäkkäisen kaksivaiheista lähestymistapaa alukkeita aikaisemmin kuvatulla tavalla [16], [17 ]. Vaiheessa yksi sisäkkäisiä MSP-alukkeet suunniteltiin monistamaan sekä metyloidut ja metyloitumattomat genomialuetta. Tuotteet olivat yhtä laimennettiin 1:100 ja alistetaan vaiheeseen kaksi sisäkkäistä MSP alukkeilla suunniteltu tunnistamaan bisulfiitti aiheuttama sekvenssin väliset erot metyloituneiden ja metyloitumattomien genomialuetta. PCR-olosuhteet vaiheessa yhden olivat seuraavat: 95 ° C kuuma aloittaa x 5 min, sitten 40 toistuvaa sykliä denaturaatiota (95 ° C x 30 s), hehkutus (56 ° C x 30 s), pidennys (72 ° C x 30 s), jota seurasi lopullinen 5 minuutin pidentäminen 72 ° C: ssa. Ja että Vaihe kaksi oli: 95 ° C kuuma aloittaa × 5 min, sitten 30 toistuvat sykliä denaturointi (95 ° C x 30 s), hehkutus (59 ° C x 30 s APC, 60 ° C x 30 s hMLH1 ), pidennys (72 ° C x 30 s), jota seurasi lopullinen 5 minuutin pidentäminen 72 ° C: ssa. MSP erotettiin elektroforeettisesti 2% agaroosigeeleillä.

Tilastollinen analyysi

määrälliset tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD). Reaaliaikainen PCR analysoitiin mukaan erot kohdegeenin ilmentymisen pariksi t-testiä ja olivat 2

-ΔΔCT

muuttaneet ennen analyysiä. IHC analysoitiin käyttämällä Chi-neliö testi. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

GLI1, DNMT1 ja DNMT3a olivat säädellään ylöspäin ihmisen haimasyövän kudosten

Vahvista roolit of GLI1 ja DNMTs kehittämisessä ihmisen haimasyövän, ensin tutki niiden ilmaisuja muutettiin syövän kudoksissa. Siksi olemme tutkineet GLI1, DNMT1 ja DNMT3a ilmaisun 20 pariksi koepalan kudosten PC potilaiden IHC. Huomasimme, että GLI1, DNMT1 ja DNMT3a ilmaisun olivat kaikki korkeampia useimmissa PC verrattuna normaaleissa kudoksissa (14/20 vs. 5/20, p = 0,004; 15/20 vs. 6/20, p = 0,004; 13/20 vs. 5 /20, p = 0,011, vastaavasti, kuvio 1). 14 20 PC tapauksissa oli korkeampi ilmentyminen GLI1 proteiinia, joista 12 tapauksessa ilmaistu korkeampi DNMT1 proteiinia (p = 0,004) ja 11 tapauksessa ilmaisseet korkeampia DNMT3a proteiinia (p = 0,012).

immunohistokemiallinen tutkimus for GLI1, DNMT1, DNMT3a proteiinia tehtiin 20 paria PC ja viereisten normaaleissa kudoksissa. Edustavia kuvia näytetään. Vieressä normaalit kudokset eivät osoittaneet tai heikko värjäys GLI1, DNMT1 ja DNMT3a kuitenkin esiintyi kaikkien kolmen proteiinin ydin- immunoreaktiivisuus oli paljon suurempi PC kudoksissa. Kaikki mikrovalokuvia hankittu × 200 suurennus.

Syklopamiini ja GLI1 siRNA sekä esti DNMT1 ja DNMT3a ilmaisun

Voit selvittää Hh toiminta vaikuttaa ilmaisun DNMTs, käytimme syklopamiini, eli klassisen estäjä Hh-signalointireitin, pienentää ilmentymisen GLI1. PANC-1-solut, jotka oli aiemmin raportoitu ilmaista korkea GLI1 [15], käsiteltiin 10 uM syklopamiinilla 24 tuntia. Sen jälkeen, qRT-PCR: n ja WB vietiin ekspression analysoimiseksi GLI1 ja DNMTs. DNMT1 ja DNMT3a mRNA väheni 91.6.0 ± 2,2% ja 83,8 ± 4,8%: lla, kun GLI1 mRNA laski 88,1 ± 2,2%. DNMT1 ja DNMT3a proteiinin laski 87,4 ± 2,7% ja 84,4 ± 1,3%, kun GLI1 proteiinia laski 86,4 ± 2,2% (kuvio 2).

PANC-1-soluja käsiteltiin 10 uM syklopamiinilla 24 tuntia, sitten suhteellinen ilmentyminen GLI1, DNMT1 ja DNMT3a mRNA arvioitiin qRT-PCR: llä (A, B, C), kun taas ilmentyminen GLI1, DNMT1 ja DNMT3a proteiini analysoitiin Western blot (D). Insertti osoittaa huomattavaa laskua GLI1, DNMT1 ja DNMT3a ilme. Tulokset normalisoitiin että β-aktiinin ilmentymistä. Kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

lisäksi suunniteltiin ja syntetisoitiin GLI1 siRNA, sitten transfektoidaan PANC-1-solulinjassa. PANC-1-solut transfektoitiin liity siRNA sekvenssiä käytettiin negatiivisena kontrollina [18], ja PANC-1, jotka käsiteltiin Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), vain käytettiin nollakoe. 72 tuntia transfektion jälkeen, qRT-PCR: n ja WB vietiin ekspression määrittämiseksi GLI1 ja DNMTs. DNMT1 ja DNMT3a mRNA laski 80,9 ± 2,3% ja 78,6 ± 3,8%: lla, kun GLI1 mRNA laski 88,6 ± 2,1%. DNMT1 ja DNMT3a proteiinin laski 64,8 ± 2,8% ja 67,5 ± 5,6%, kun GLI1 proteiinia laski 63,5 ± 4,5% (kuvio 3).

PANC-1-solut transfektoitiin GLI1 siRNA, 72 tuntia transfektion jälkeen, suhteellinen ilmentyminen GLI1, DNMT1 ja DNMT3a mRNA arvioitiin qRT-PCR: llä (A, B, C), kun taas ilmentyminen GLI1, DNMT1 ja DNMT3a proteiini analysoitiin Western blot (D). Insertti osoittaa huomattavaa laskua DNMT1 ja DNMT3a ilmaisun jälkeen GLI1 häiriöitä. Tulokset normalisoitiin että β-aktiinin ilmentymistä. Kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± SD kolmen erillisen kokeen.

ilmentyminen DNMT1 ja DNMT3a oli voimistunut kanssa GLI1 yliekspressio

edelleen varmistamiseksi sääntelyä DNMT1 ja DNMT3a by GLI1, me suunniteltu ja rakennettu lentiviruksesta vektori, joka yli-ilmentyvän GLI1, ja transfektoitiin se BxPC-3, jolla on pienin GLI1 ilmentymistä PC-solulinjojen kuten edellisessä raportoitu [15]. Solut transfektoitu tyhjällä lentivirus vector käytettiin negatiivisina kontrolleina, kun taas solut, ilman transfektiota käytettiin tyhjä valvontaa. 48 tuntia transfektion jälkeen, qRT-PCR: n ja WB vietiin ekspression määrittämiseksi GLI1 ja DNMTs kolmen solulinjoissa. DNMT1 ja DNMT3a mRNA lisääntyi 293,0 ± 14,8% ja 578,3 ± 58,5%: lla, kun GLI1 mRNA lisääntyi 655,5 ± 85,9%. DNMT1 ja DNMT3a proteiinin kasvoi 143,5 ± 17,4% ja 214,0 ± 18,9%, vastaavasti, kun GLI1 proteiini kasvoi 272,3 ± 14,4% (kuvio 4).

BxPC-3-solut transfektoitiin PGC-FU-GLI1 suhteellinen ilmentyminen GLI1, DNMT1 ja DNMT3a mRNA arvioitiin qRT-PCR: llä (A, B, C), kun taas ilmentyminen GLI1, DNMT1 ja DNMT3a proteiini analysoitiin Western blot (D). Insertti osoitti huomattavasti enemmän DNMT1 ja DNMT3a ilmaisun jälkeen GLI1 yli-ilmentyminen. Tulokset normalisoitiin että β-aktiinin ilmentymistä. Kaikki tiedot esitettiin keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Vahvistus GLI1 sitoutuneen proteiinin promoottorialueen DNMT1 geenin

Olemme toistaiseksi ollut rooli GLI1 in DNMT1 ja DNMT3 ilme. Kuitenkin mekanismi taustalla sääntelyn vielä selvittämättä. Tutkitaan onko DNMTs suoraan säätelee GLI1 vai ei, me etsinyt DNMT1 ja DNMT3a promoottori mahdollisille GLI1 sitoutumiskohtia DNA konsensussekvenssin 5′-GACCACCCA-3 ’[19] tai 5′-TGGGTGGTC-3′ [20] , ja viisi korkea-pisteytys ehdokas sivustoja GLI1 tavoitteita havaittiin DNMT1 n promoottori ja kuusi DNMT3a n. Jokainen sivusto on vain kahden nukleotidi- n ero verrata 5’-GACCACCCA-3 ’tai 5′-TGGGTGGTC-3’ (kuvio 5). ChIP vietiin vahvistaa rajaavan suhdetta GLI proteiinia ja DNMT1 /3a geeniä. DNA uutetaan PANC-1-soluja sonikoitiin osaksi 100-1000 emäsparia (Fig. S4) ja siru-PCR-templaattina. Tuloksena DNA-elektroforeesilla osoitti, että ennustettu DNA bändi INPUT, GLI1-Ab ja postive kontrolliryhmiin käyttäen ihmisen DNMT1 aluke-C, eikä IgG ja negatiivisen kontrollin ryhmät (kuvio 6). Vain INPUT ja positiivinen kontrolli osoitti ennustettu kaistalla käyttäen ihmisen DNMT1 aluke-A, C-E ja DNMT3a aluketta A-E, mutta ei GLI-Ab, IgG, ja negatiivinen ryhmät (tuloksia ei ole esitetty). Positiivisena tuote monistettiin DNMT1 aluke-C sisältää ehdokas GLI1 sitoutumiskohta 2 ja 3 (taulukko 2 ja kuvio 5), kun taas tuote monistettiin DNMT1 aluke-B sisältää ehdokas GLI1 sitoutumiskohta 2 oli negatiivinen, ja tulokset sekvenssin analyysi osoitti, että sekvenssit olivat samat kuin on DNMT1-geenin promoottori-sivuston 3 (Fig. S5), ehdotti, että GLI1 sitoutui DNMT1 geenin promoottori sivuston 3 (GGCCTCCCA).

kaksi rinnakkaista päälle kuvio edustaa DNMT1 tai DNMT3a DNA, vastaavasti (A, B), jossa harmaat kehykset edusti eksonit, valkoiset kehykset edusti intronit, ja mustat kehykset edustettuina promoottori. Promoottorissa, pieni harmaa kehykset on merkitty numero 1-5 (A) tai 1-6 (B), jolla mahdolliset GLI1 sitovaa kohtaa, joissa on vain kaksi nukleotidin ero (alleviivattu) päässä GLI1 konsensus sitovan sekvenssin, GACCACCCA. Alukkeet suunniteltiin monistamaan DNMT1 (A) tai DNMT3a (B), promoottorialueen, joka sisältää otaksutun GLI1-sitoutumiskohdan. Paikka ja pituus tuotteiden amplificated kunkin aluketta esitetty.

Lysaatit PANC-1-solut altistettiin kromatiini immunosaostus anti-GLI1 vasta-aine. Sonikoitiin chromatin käytettiin INPUT DNA ohjaus (INPUT). RNA-polymeraasi II: ta käytettiin positiivisena kontrollina (PC). IgG: tä käytettiin satunnaisia ​​kontrolli (IgG) ja β-aktiini Ab käytettiin negatiivisena kontrollina (NC). Kaista ChIP-PCR-tuotteet monistettiin DNMT1 Primer-C (i) ja DNMT1 Primer-B (ii) on esitetty.

DNA metylaatiotasoilla APC, mutta ei hMLH1 promoottorialueita muuttunut GLI1 ilmaisu

määrä kasvaimeen liittyvien geenien havaittiin vaiennetaan DNA: n metylaation PC, kuten APC (adenomatoottisen polypoosin coli) ja hMLH1: n (ihmisen mutL homologi 1). Pääset myös estämällä tai kasvattamalla ilmentymistä GLI1 voisi myös johtaa hypo- tai hyper-metyloinnin APC ja hMLH1 PC, käytimme sisäkkäisiä MSP arvioimaan metylaatiostatuksen PANC-1 kanssa tai ilman GLI1 Knockdown ja BxPC-3 tai ilman GLI1 yli-ilmentyminen, vastaavasti. Tulokset osoittivat, että APC DNA metylaatio taso kasvoi BxPC-3-solut transfektoitu Yliekspressio-GLI1 Lentivirusvektori verrattuna negatiivisen kontrollin, ja estyi PANC-1-solut transfektoitu GLI1-siRNA verrattuna negatiivisen kontrollin. Kuitenkin DNA: n metylaation tason hMLH1 promoottorialueen ei muuttunut merkittävästi transfektion jälkeen (kuvio 7). Tämä luultavasti koska DNA: n metylaatio koordinoi perheen DNMTs käsittää DNMT1, 3a, -3b ja -3L, ehkä ilmaus muutoksen vain DNMT1 ja 3a säätelee GLI1 ei riittänyt vaikuta DNA metylaatiotasoilla jokaisen kasvain- liittyviä geenejä [21].

tulokset sisäkkäisiä MSP APC ja hMLH1 kuudessa eri PC-soluissa näytettiin. B edusti BxPC-3-solut; B-G + edusti BxPC-3 transfektoitu PGC-FU-GLI1 tehdä GLI1 yli-ilmentyminen, ja B-NC edusti sen negatiivinen kontrolli; P edusti PANC-1; P-G-si edusti PANC-1 transfektoitu GLI1-siRNA ja P-NC edustaa sen negatiivisen kontrollin. Positiivinen taajuusalueilla M ja U edustivat metyloitu ja metyloitumattoman DNA: n vastaavien geenien oikeassa paneelissa, vastaavasti.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että GLI1, DNMT1 ja DNMT3a on yli-ilmentynyt PC kudoksissa verrattuna vastaavaan ei-syöpä haima kudoksiin, sitten osoitti, että DNMT1 ja DNMT3a ilmentyminen muuttunut mukaan GLI1 ilmentymisen PANC-1 ja BxPC-3-solulinjojen erityisiä GLI1 häiriöitä ja geenin transfektio, sekä farmakologinen menetelmä

in vivo

. Vielä tärkeämpää on, osoitimme mitään järkevää epäilystä siitä, että GLI1 kykeni sitoutumaan DNMT1 geenin promoottori sivuston 3 (GGCCTCCCA) sirun kokeita. Lopuksi, käytimme sisäkkäisiä MSP osoittamaan, että GLI1 ilmaisu vaikutti DNA metylaatio APC-taso, mutta ei hMLH1 PC. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen raportti osoitti GLI1 transkription tekijä säännelty DNMT1 ja 3a ilmaisun sekä APC metylointi tason PC, ja DNMT1 on sen suora kohdegeenin.

GLI1, transkription tekijä Hh-signalointireitin määrä lisääntyy useimmissa ruoansulatuskanavan kasvaimet kuten PC [22], [23]. Tähän mennessä vain muutamat alavirtaan tavoitteet GLI1 on havaittu [24]. Äskettäin kerrottiin olla mukana PC invaasiota ja etäpesäkkeiden, ja on tullut uusi kohde hoitoon [25], [26]. Kuitenkin vähän tiedettiin varsinaista mekanismia hiljaista sen edistämiseksi hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden PC. Lisäksi olemme keskittyneet kertynyt todisteita, jotka osoittivat, että kohdunkaulan eri elimissä, kuten haima, liittyy poikkeava DNA: n metylaatio, jossa DNMTs on keskeinen katalysaattori korreloi merkitsevästi kertyminen metylaation kasvaimeen liittyviä geenejä, joista jotkut liittyivät withcell leviämisen kuten APC, jotkut liittyvät korjaamisen DNA vaurioita kuten hMLH1, jotkut olivat invasion- tai etäpesäkkeiden liittyviä, kuten TIMP-3, kipinä, ja CDH1 tai solukuolema liittyviä kuten DAPK-1, mikä tärkeä rooli monivaiheinen karsinogeneesissä haiman varhaisesta precancerous vaiheista pahanlaatuiseen etenemistä [27]. Äskettäin havaittiin, että kasvaimen taakkaa vähentää huomattavasti vähenee DNMT1 tasot

in vivo

, viittaa siihen, että DNMTs välitteinen DNA: n metylaation on mukana haiman karsinogeneesissä [28]. Tämän tutkimuksen perusteella ja aiemmissa raporteissa yläpuolella, on mahdollista, että GLI1-DNMTs Cascade apua invaasion tai etäpesäkkeen edistämällä metyloinnin joidenkin invasion- tai etäpesäkkeiden liittyviä geenejä, ja se voi helpottaa kasvaimen kasvua edistämällä metylaation joidenkin solukuolemaa liittyvän geenejä.

tutkimus osoitti, että DNMT3a ilmentymistä säätelee GLI1 ihmisen haimasyövän. Kuitenkin todellinen mekanismi sääntelyn DNMT3a mukaan GLI1 on vielä tuntematon. Viime vuosina monet käsikirjoituksia on raportoitu, että jotkin microRNA perheet voivat kohdistaa DNMTs monien erilaisten ihmisen syöpien [29] – [32]. Toisaalta todettiin, että jotkin microRNA kuten microRNA-29 perhettä transkription tukahdutti c-Myc, siili ja NF-kappaB [33]. Saadun näytön perusteella edellä, on mahdollista, että Hh-GLI voi säädellä DNMT3a läpi joitakin tiettyjä MikroRNA, joka jää löytäjäänsä.

Tutkimuksessamme, siru määritykset osoittivat GLI1 sitoutuvat DNMT1 muttei DNMT3a. Olemme myös huomanneet, että GLI1 kohonnut DNMT3a enemmän taittuu kuin DNMT1. Luulimme oli joitakin mahdollisia taustalla olevien mekanismien seuraavasti: Ensinnäkin, GLI1 ei ehkä säännellä DNMT3a suoraan vaan tietyn geenin, joka saattaa olla kinaasia tai activin, ja kautta Cascade vahvistusta, jotta se johtaisi korkeampaan säätelevä tehokkuus DNMT3a mukaan GLI1. Toiseksi, Hedghog-GLI1 saattaa suoraan tai epäsuorasti säädellä useita geenejä, jotka osallistuvat eri signalointireittejä, ja kahden tai useamman näiden geenien myös säätelevät DNMT3a ja on synergiavaikutuksia, niin että huolimatta GLI1 ei ehkä säännellä DNMT3a suoraan, mutta se nostaa DNMT3a useamman taitoksen, kun se yli-ilmentää. Voit ratkaista tämän kysymyksen, on tarpeen tutkia enemmän kohdegeenien Hedgehog-GLI1, ja koetin osaksi ylikuulumisen eri signalointireitteihin. Luulimme säätelystruktuurin suhdetta Hh-GLI1 ja DNMTs olisivat ole niin yksinkertainen kuin me jo vahvistettu. Lisätutkimuksia tarvitaan myös tutkimaan, onko biologinen käyttäytyminen GLI1 PC voidaan saavuttaa säätelemällä DNMTs.

Äskettäin tunnistettu GLI1 /DNMTs akseli asettaa siltana Hh-signalointireitin ja epigenetiikka, mikä auttaisi valaista kätyri molekyylitason mekanismi kehittämisessä PC, ja se voi tarjota uusia terapeuttisia kohteita tai biomarkkereita aikaisemmin diagnoosin.

tukeminen Information

Kuva S1.

Identificaton positiivisen kloonin tuotteiden yli-ilmentymiseen-GLI1 lentivirusvektorilla rakentamiseen. GLI1 cDNA tuotteet insertoitiin linearisoitu PGC-FU-3FLAG vektorin rakentamiseksi PGC-FU-GLI1 plasmidi jälkeen vahvistetaan ja puhdistettu, sitten muuttui Competent Cells. Transformantit tunnistettiin PCR ja elektroforeesi 1,5% agaroosigeelissä, transformantit-1 ja -4 oli osoitti kuin 731 emäsparin bändi, joka osoittautui olevan positiivinen klooni.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0027684.s001

(TIF)

Kuva S2.

tunnistaminen GLI1 ilmentymisen PGC-FU-GLI1 klooni WB. PGC-FU-GLI1 on muodostettu lentivirus vektori ilmaistuna GLI1, joka koekpsressoitiin FLAG. (1) WB molekyylipainomerkkiaineen, jossa 3-FLAG etiketti, sulatettu GFP-geeni (48 kDa). (5-8) Näyte jälkeen PGC-FU-GLI1 293T-soluissa. (7) GLI1-FLAG-fuusioproteiinin (122 kDa + 2 kDa = 124 kDa), sertifioitu GLI1 ilmentyminen PGC-FU-GLI1 plasmidi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0027684.s002

(TIF)

Kuva S3.

sekvenssianalyysi positiivisen kloonin tuotteiden GLI1-yliekspressio lentivirusvektorilla rakentamiseen. Saatu 3320 bp: n fragmentti varmistettiin sekvensoimalla, joka on sama sekvenssi GLI1 geenin ilmentymisen alueella GenBank (NM_005269.2).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0027684.s003

(TIF )

Kuva S4.

Electropheretogram Sonikoitujen kromatiinin liuosta. Sonikoitiin chromatin ratkaisu erilaisissa olosuhteissa (100 W, 80 W ja 60 W, vastaavasti) suoritettiin elektroforeesi 1,5% agaroosigeelissä, joka sisälsi eti- bromied.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0027684.s004

(TIF)

Kuva S5.

sekvenssianalyysi ChIP tuotteita, jotka monistettiin DNMT1 aluke-C. Tulos osoitti, että sekvenssi monistetaan DNMT1 aluke-C on sama kuin DNMT1-geenin promoottorialueen, joka sisältää GLI1-sitoutumiskohdan 2 ja 3.

doi: 10,1371 /journal.pone.0027684.s005

(TIF ) B