Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Anti antimitoottisten yhdisteiden (mikrotubulia de-stabilointiaineet), kuten vinkristiinin ja vinblastiinin on osoitettu kliinisesti onnistunut hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä. Kuitenkin kehitys lääkeresistenssideterminantit solujen rajoittaa niiden tehoja kliinisissä tilanteissa. Siksi suoritettiin kokeita esitetään mahdolliset lääkeresistenssimekanismien soveltamiseen liittyviä antimitoottisten syövän hoitoon.

Keskeiset havainnot

KB-johdettu mikrotubulia de-stabilointiaine-resistenttejä KB-

L30

syövän solulinja tätä tutkimusta varten. KB-

L30

solut osoittivat ristiresistenssiä eri mikrotubulia de-stabilointi kuten BPR0L075, vinkristiini ja kolkisiini läpi useita-(MDR) riippumattomien mekanismien kautta. Yllättäen KB-

L30

solut osoittivat hyper-herkkyys mikrotubuleihin stabilointiaine, paklitakseli. Tulokset RT-PCR-analyysi paljasti, että ilmentyminen sekä luokan II ja III β-tubuliinia säädellä vähentävästi KB-

L30

soluja verrattuna sen vanhempien KB syöpäsoluja. Lisäksi DNA-sekvenssianalyysi paljasti kuusi uuden mutaation sivustoja läsnä eksonissa neljä βI-tubuliinia geeni. Tietokonemallintaminen osoitti, että välillä kiinteä βI-tubuliinia mutaatioiden ja muutoksen mikrotubulusverkoston kokoonpanoon ja dynaaminen epävakautta KB-

L30

solut ja tämä ennustettu mallia tukivat lisääntynyt mikrotubulusten kokoonpanoa ja vähentää mikrotubulusten dynamiikan epävakaus KB-

L30

soluja, kuten Western blot -analyysillä.

päätelmät ja merkitys

tutkimus osoitti, että nämä uudet mutaatiot eksonissa neljä βI-tubuliinia aiheuttama vastus että mikrotubulusten de-stabilointi ja hyper-herkkyys mikrotubulusten stabilointiaine läpi muutoksen mikrotubulusverkoston kokoonpanoon ja dynamiikka syöpäsoluissa. Tärkeää on, että nykyinen tutkimus osoittaa, että syöpäsolut voivat hankkia lääkeresistenssin kyky antimitoottisesta yhdisteiden läpi useita muutoksia mikroputkiverkostoa. Tämä tutkimus lisäksi varustettu molekyyli tietoa lääkkeen valinta potilaille, joilla on erityisiä tubuliinin mutaatioita.

Citation: Cheung CHA, Wu S-Y, Lee T-R, Chang C-Y, Wu J-S, Hsieh H-P, et ai. (2010) Cancer Cells hankkia Mitoottista Drug Resistance Properties kautta Beta I-Tubulin Mutaatiot ja Muutokset Expression Beta-Tubulin Iso- tyyppien. PLoS ONE 5 (9): e12564. doi: 10,1371 /journal.pone.0012564

Editor: Wen-Liang Zhou, Sun Yat-Senin yliopistossa, Kiina

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2010 Hyväksytty: 12 elokuu 2010; Julkaistu: 03 syyskuu 2010

Copyright: © 2010 Cheung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat sisäiset apurahat NSC98-3114-M-006-002 ja NSC98-2323-B-400-004 National Science neuvosto, Taiwan, Kiina, DOH99-TD-C-111-004 päässä Department of Health , Taiwan, Kiina ja CA-097-PP-02 National Health Research Institutes, Taiwan, Kiina. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mikrotubulukset ovat proteiini säikeet solun tukirangan koostuu α-tubuliinin ja β-tubuliinia molekyylejä. Soluissa, mikrotubulusten säikeet nopeasti vuorotellen vaiheiden kasvun ja kutistuminen (dynaaminen epävakaus) aikana solusyklin [1]. Koska mikrotubulusten keskeisessä asemassa ovat säätelyssä mitoosilaitteen, häiriöitä mikrotubulusten voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen M vaiheessa muodostumista epänormaalien mitoosi karat, ja lopulta liipaisu signaalien apoptoosin. Havainto, että sytotoksinen aktiivisuus erilaisia ​​yhdisteitä on kautta häiriöitä sukkularihmaston laite on saanut paljon huomiota kahden viime vuosikymmenen aikana, ja mikrotubulusten on tullut houkutteleva farmakologinen kohde syöpälääkkeen löytö. Antimitoottinen yhdisteet, kuten vinkristiini, vinblastiini (mikrotubuluksiin epävakautta

Vinca

alkaloidi) ja paklitakselin (mikrotubuluksia stabiloivia taksaanin) on kehitetty kohdistaa syöpien kliinisesti [2], [3]. Vaikka taksaanit ja

Vinka

alkaloidit ovat tehokkaita hallintaan eri pahanlaatuisia kasvaimia, niiden potentiaali rajoittaa kehitystä monilääkeresistenssin (MDR) [4], [5]. MDR on monitekijäinen, yksi polku, joka johtaa resistenssin välittämien yli-ilmentyminen transmembraanisen effluksipumppujen, nimittäin

M

r 170000 P-glykoproteiinin (P-gp170 /MDR) ja monilääkeresistenssi proteiinin (MRP) [5], [6]. Lisäksi ilmaus MDR, muita mekanismeja vastustuskyky antimitoottinen lääkkeet on myös kuvattu aikaisemmin. Näihin kuuluvat muutokset tubuliinia isotyypin ilmaisun ja mutaatioita tubuliinia geenissä [7], [8]. Solut, jotka sisältävät mutaatioita, kuten D45Y, S172A, D197N, D224N, S234N, L240I ja K350N luokan I beta-tubuliinia on havaittu resistenttejä kolkisiini ja

Vinca

alkaloidi [7]. Toisaalta, soluja, jotka sisältävät mutaatioita, kuten P173A, Q292E ja Y422C luokan I beta-tubuliinia on havaittu resistenttejä epotiloni (mikrotubulusten stabilointiainetta) [9]. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen βIII-tubuliinin on esitetty paklitakselin-resistenttien solujen [10], [11], [12]. Kuitenkin yhdessä muuttuvat (vaihtelussa in tubuliinia isotyypin ilmaisun ja mutaatiot β-tubuliinin geeni) on mikroputkiverkostoa harvoin osoitettu antimitoottisena lääkeresistenssi syöpäsoluja.

Tässä tutkimuksessa mikroputkeen de -stabilizer kestävä syövän solulinjaa käytettiin tutkimaan uusia muutoksia läsnä soluissa, jotka kykenivät indusoimaan vastustuskyky antimitoottisia yhdisteitä. KB-

L30

on KB-johdettu BPR0L075 (mikrotubulia de-stabilointiaine) -kestävät tasyöpäsolulinja. Meidän julkaistu tutkimus osoitti, että KB-

L30

solut yli-ilmaisivat surviviini, mikä vakauttamiseen mikroputkiverkostoa ja johtaen vastustuskyvyn mikrotubulia de stabiloivia yhdisteitä [13]. Kuitenkin alassäätöä surviviinispesifisten vain osittain palautti huumeiden herkkyys mikrotubulusten de-stabilointi kolkisiini ja BPR0L075, mikä viittaa siihen, että ylimääräinen lääkeresistenttiä mekanismi on läsnä tässä solulinjassa [13]. Täällä tutkimme muita mekanismeja, jotka voivat olla vastuussa lääkeaineen vastustuskykyä mikrotubulusten de-stabilointi KB-

L30

soluja.

Tulokset

KB-

L30

soluilla lääkeaineen vastustuskykyä mikrotubulusten de-stabilointi ja hyper-herkkyys mikrotubulusten stabilointiaine

KB-johdettu BPR0L075 kestävä tasyöpäsolulinja, KB-

L30

, kertyi laboratoriossamme. Lyhyesti, KB-

L30

oli monoklonaalinen solulinja valitaan vastus, jonka jatkuva altistuminen vanhempien syövän solulinja, KB, on kasvavia pitoisuuksia mikrotubulia de-stabiloivan yhdisteen, BPR0L075. KB-

L30

soluja viljellään väliaineessa, jossa on 30 nM BPR0L075 säilyttää lääkkeen ominaispiirre. Tämä erityinen lääkeresistentti syöpä solulinja on 6-kertaisesti enemmän resistenttejä BPR0L075 verrattuna sen emosoluista (taulukko 1) (kuvio 1A). Lisäksi, KB-

L30

soluilla ristiresistenssiä toisen mikrotubulia de-stabiloivia aineita, kolkisiinin (7-kertaisesti resistentti) ja vinkristiinin (7-kertaisesti resistentti) (taulukko 1) (kuvio 1 B ja C) . Yllättäen tämä lääkeresistenttiä syöpä solulinja on 5-kertainen herkempiä mikrotubulusten stabilointiaine paklitakseli kuin verrata KB soluja (taulukko 1) (kuvio 1 D).

KB ja KB-

L30

soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla BPR0L075 (A), kolkisiini (B), vinkristiini (C) ja paklitakselin (D) 3 päivää ja solujen elinkyky mitattiin MTT-solunelinkykyisyysmääritys.

Multiple lääkkeille resistentti proteiinin (MDR) ei ole läsnä KB-

L30

solujen

Edellinen tutkimus osoitti, että mikrotubuleihin de-stabiloivan yhdisteen BPR0L075 oli yhtä tehokas sekä MDR /MRP negatiiviset ja positiiviset syöpäsolut [14], epäsuorasti viittaa siihen, että BPR0L075-vastus KB-

L30

soluilla lääkeresistensseihin ominaisuudet kautta MDR /MRP-riippumaton mekanismi. Tukeakseen edelleen Edellä esitettyjen havaintojen RT-PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, KB-

L30

solut yli-ilmentynyt MDR-1. RT-PCR-analyysi paljasti, että ei ole KB tai KB-

L30

solut ilmentävät MDR-1 (kuvio 2A). Sen sijaan, MDR-1 ilmentyi vinkristiini kestävä syövän solulinja, KB-VIN10 (positiivinen kontrolli) (kuvio 2A). Lisäksi tulokset kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR osoitti, että toinen tärkeä lääke effluksipumpun, MPR-1, ei ollut yli-ilmentynyt KB-

L30

soluja verrattuna sen vanhempien KB-soluja (kuvio 2B). Sen sijaan, MRP-1 yli-ilmentyy positiivinen kontrolli solulinja, KB-20a (kuvio 2B). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että KB-

L30

solujen aiheuttama vastus mikrotubulia de-stabilointi kautta MDR-riippumattomien mekanismien.

ilmentymistä MDR-1 Kt, KB-

L30

ja KB-VIN10 solut analysoitiin RT-PCR: llä (A). Ilmaisu MRP-1 Kt, KB-

L30

ja KB-20a solut analysoitiin reaaliaikaisella PCR (B). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina sekä RT-PCR ja reaaliaikainen PCR-analyysit.

KB-

L30

solut osoittavat muutoksia beta tubuliinin isotyypin ilmaisu

koska KB-

L30

solujen aiheuttama BPR0L075 ja kokkisiini vastus kautta MDR /MRP-riippumaton mekanismi, muiden huumeisiin resistenssimekanismeja on tutkittu. Se on laajalti osoitettu, että muutokset ilmentymisen β-tubuliinin isotyyppien mRNA-tasolla liittyvät induktion mitoosi lääkeresistenssideterminantit syöpäsoluissa [15], [16]. Tässä ilmaus β-tubuliinin isotyypit in KB ja KB-

L30

solut analysoitiin RT-PCR. MRNA-tasolla, ilmentymistä luokan II ja III β-tubuliinia isotyyppien pienennettiin KB-

L30

soluja verrattuna mikrotubulusten de-stabilisaattoreita herkkien KB-soluja (kuvio 3A). Määrä luokan II ja III β-tubuliinin isotyyppien ilmaistu KB-

L30

solujen väheni 35% ja 40% verrattuna sen vanhempien soluihin. Sen sijaan ei ollut merkittävää eroa ilmaisun luokan I, IV

A ja IV

b β-tubuliinin isotyyppien kahden solulinjoista (kuvio 3A).

ilmentäminen β-tubuliinin isotyypit in KB ja KB-

L30

solut analysoitiin RT-PCR. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina (A). RT-PCR ja nested-PCR analyysejä eksonien 1, 2, 3 ja 4 luokan III β-tubuliinin geenin KB ja KB-

L30

soluja. Ensimmäinen kaista, KB-solujen ja toinen kaista, KB-

L30

soluja (B). PCR-SSCP-analyysit eksonien 1, 2, 3 ja 4 luokan III β-tubuliinin geenin KB ja KB-

L30

soluja. Ensimmäinen kaista, KB-solut ja toinen kaista, KB-

L30

soluja (C).

KB-

L30

soluilla useita mutaatioita eksonin neljässä βI-tubuliinin geeni

panos β-tubuliinin pistemutaatioiden asiakkuutta huumeiden vastustuskykyä erilaisia ​​antimitoottisena yhdisteitä myös kuvattu aiemmin [7], [8], [17]. Koska luokan I p-tubuliinin edustaa ~90% koko solunsisäisen allas soluissa, geenin sekvenssi βI-tubuliinin KB-

L30

solut analysoitiin. Ensimmäinen, RT-PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, onko mitään suuren mittakaavan sekvenssin insertio tai deleetio oli läsnä eksonissa 1, 2, 3 ja 4 βI-tubuliinin geenin KB-

L30

soluja. Tulokset RT-PCR ja geelielektroforeesi ei paljastanut mitään merkittäviä eroja molekyyli- koko (pituus) minkä tahansa eksonien βI-tubuliinin geenin välillä KB-

L30

ja KB-soluja (kuvio 3B). Tämä tulos osoitti, että suuren mittakaavan sekvenssin insertio tai deleetio ei ollut läsnä βI-tubuliinin geenin KB-

L30

soluja. Olemme edelleen määritelty läsnäolon yhden pisteen mutaation KB-

L30

solujen suorittamalla Yksijuoste konformaatiopolymorfismi- (SSCP) analyysiä. SSCP on elektroforeettisen erotuksen yksijuosteisten nukleiinihappojen perusteella hienoisia eroja sekvenssissä (usein yhden emäsparin), ja tuloksena on erilainen sekundäärisen rakenteen ja mitattavissa ero liikkuvuuteen geeli. Tässä tulokset SSCP analyysin βI-tubuliinin genomisen DNA: n ei osoittanut liikkuvuutta kaistan siirtyminen eksonin 1, 2 ja 3 KB-

L30

, verrattuna, että KB-soluja (kuvio 3C). Yllättäen, SSCP-analyysi paljasti kuvio muutosta eksonissa 4 βI-tubuliinin KB-

L30

soluja.

DNA: n sekvensointi suoritettiin uudelleen vahvistaa edellä esitetyt tulokset. Vastaa tuloksia, sekä RT-PCR ja SSCP-analyysi, DNA-sekvensointi βI-tubuliinin KB-

L30

soluja ei paljastanut mitään mutaatiota läsnä sen eksonin 1, 2 ja 3 alueet (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista, DNA sekvensointi paljasti useita mutaatioita läsnä eksonissa 4 βI-tubuliinin KB-

L30

soluja. Sekvensointi tiedot ovat tuloksia vähintään kahdesta kokeesta. Kuusi pistemutaatiot havaittiin nukleotidin 947 T: stä A (sense), 1114 A: sta T, 1145 C: stä T, 1213 G: stä A, 1294 G: stä A: n ja 1310 G: stä T (kuvio 4A). Nämä mutaatiot vastaavat aminohappojen mutaatiot V316D, T372S, S382L, E405K, E432K ja G437K (kuvio 4B).

DNA-sekvensointi βI-tubuliinin genomisen DNA paljastaa kuusi pistemutaatiot läsnä eksonissa 4 (A) . Käännetty aminohapon sekvenssi mutatoitunut eksonin 4 βI-tubuliinin geenin (B). Ekspression mutatoidun βI-tubuliinia proteiinin ja sen sisällyttäminen mikroputkiverkostoa paljastettiin immuno-fluoresenssimikroskopialla. Solut tutkittiin anti-βI-tubuliinin vasta-ainetta (C). Transfektio mutatoidun βI-tubuliinin geeni KB soluihin vähensi lääkkeen herkkyys BPR0L075 in vitro (D).

immunofluoresenssi suoritettiin sen määrittämiseksi, onko mutatoidun βI-tubuliinin geeni ei kääntää proteiineja, jotka myöhemmin sisällytetty mikroputkiverkostoa sisään KB-

L30

soluja. KB-

L30

solut värjättiin anti-βI-tubuliinia vasta-ainetta ja FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Tulokset immunofluoresenssimikroskopian avulla paljasti, että mutatoitu βI-tubuliinin proteiinia oli läsnä osana mikroputkiverkostoa (kuvio 4C). Sen osoittamiseksi, että tubuliinin mutaatiot olivat todellakin aiheuttavan BPR0L075 kestävä fenotyyppi,-geenin transfektion ja yli-ilmentyminen βI-tubuliinin mutantti, joka sisältää edellä mainitut mutaatiot tehtiin KB-soluissa. MTT solunelinkykyisyysmääritys paljasti, että KB-soluja, jotka on transfektoitu mutatoidun βI-tubuliinin osoitti lisääntyneen resistenssin BPR0L075 (IC

50 11 nM), verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus tyhjällä plasmidilla (IC

50 7 nM) ja villityypin βI-tubuliinia (IC

50 7 nM) (kuvio 4D). Siten ilmaisu mutatoidun βI-tubuliinin teki osansa huumeiden herkkyys BPR0L075 sisään KB-soluissa.

Tietokonemallinnus tutkimuksia βI-tubuliinin mutaatiot BPR0L075 vastus

Tubulin mutaatiot voivat olla liittyy joko muuttunut lääkeainetta sitovan sivuston tai muutoksia mikrotubulusten vakautta. Täällä tietokonemallintaminen käytettiin antamaan rakenteellinen oivalluksia. Kolmiulotteinen tubuliinin rakenne (PDB-koodi: 1SA0) käytettiin [18] ja ohjelman Discovery Studio 2.1 (Accelrys, Inc.) levitettiin rakentaa mallin muta- tähteet ja suorittamalla energian minimointi. Tässä mallissa V318D jäännös (vastaa V316D in KB-

L30

) sijaitsee kolkisiinin-sitoutumiskohdan βI-tubuliinia (kuvio 5A). Val318 (villityyppi) muodostettu hydrofobinen vuorovaikutus kolkisiinia. Kuitenkin mutatoitu tähde (V mutatoitu D) siirtyy pois kolkisiini muodostamaan vetysidoksen, jossa jäännös R320, jolloin menetys hydrofobisen vuorovaikutuksen kolkisiinin (kuvio 5A) mallinnus tutkimuksessa. Tämä tulos osoittaa, että V318D saattaa heikentää sitoutumisaffiniteetti kolkisiinin ja p-tubuliinia. Toisaalta, mutaatiot jäännöksen 392 (sijaitseva Helix 11) ja tähteen 382 (sijaitsevat silmukka lähellä Helix 11) muuttaa konformaatiota Helix 11, mikä saattaa lisätä pituus- vuorovaikutusta ja näin ollen muuttaa vakautta mikrotubulusten (kuva 5B ) [19]. E415K (vastaten E405K sisään KB-

L30

) sijaitsee H11-H12 alue lähellä dimeeri käyttöliittymä, joka on mukana pituus- kontakteja. Jäännös 415, mutatoitiin Glu Lys, rikkoo vety-sidos vuorovaikutus tähteen K402 ja näin ollen johtaa siihen, että liikkeen K402 lähempänä α-tubuliinin. Muutos on K402 jäännös (kuvio 5C) johtaa sulkemaan yhteydet jäämiä? V260, Y262 ja W346 että α-tubuliinin lisääminen vuorovaikutukset β-tubuliinia ja α-tubuliinin. Helix 11 sijaitsee rajapinnassa α-tubuliinin ja β-tubuliinidimeereistä. Lopuksi tietokonemallintaminen tutkimus osoittaa, että tubuliinin mutaatiot KB-

L30

solut voivat lisääntyä mikrotubulusten kokoonpanoa ja vakautta.

KB-

L30

soluilla lisääntynyt mikrotubulusten kokoonpanoa ja pienentää mikrotubulusdynamiikan

Voit selvittää vakautta ja dynamiikka mikrotubulusten vuonna KB-

L30

solut vaikuttivat mutaatiot βI-tubuliinin kuten lähdettävä mukaan laskennallisen analyysin, Western blot-analyysi esitettiin. Tässä, Western blot-analyysi osoitti, että määrä sekä α- ja β-tubuliinia pelletit läsnä KB-

L30

solut kasvoivat verrattuna sen vanhempien KB-soluja (kuva 6A). Sitä vastoin liukoisella muodolla β-tubuliinia on läsnä KB-

L30

solut laskettiin verrattuna KB-soluja (kuva 6A). Immunofluoresenssivärjäyksen käytettiin myös edelleen tukevat edellä tuloksen. Mikrotubulusten leimattiin rodamine-konjugoitu anti-β-tubuliinia vasta-ainetta ja soluja mikroskoopilla katsottuna. KB-

L30

solut näyttävät olevan suurempi mikrotubulusten pitoisuus verrattuna KB-solut (kuvio 6B). Lisäksi käyttö mikrotubulusten de-stabilointiaine, BPR0L075, pystyi vähentämään mikrotubulusten sisällön KB-

L30

solut (kuvio 6B). Yhdessä tuloksemme ehdotti, että KB-

L30

solujen näytteillä lisääntynyt mikrotubulusten kokoonpanoa.

määrä liukeneva ja liukenematon α- ja β-tubuliinia in KB ja KB-

L30

solut analysoitiin Western-blottauksella. Aktiini käytettiin latauskontrollina (A). Eheyden mikroputkiverkostoa kt ja KB-

L30

soluissa osoitti immuno-fluoresenssimikroskopialla. Solut tutkittiin anti-β-tubuliinia vasta-ainetta (B). Mikrotubulusdynamiikan soluissa analysoitiin western blot -analyysillä. Asetyloitu-α-tubuliinin käytettiin epäsuorana indikaattorina mikrotubulusdynamiikan ja määrä asetyloitu-α-tubuliinin analysoitiin BPR0L075 ja paciltaxel käsiteltyjen KB-soluissa Western-blottauksella. Alfa-tubuliinin (yhteensä muoto) käytettiin lastaus ohjaus (C). Määrä endogeenisesti asetyloitu-α-tubuliinin in KB ja KB-

L30

solut analysoitiin Western-blottauksella. Alfa-tubuliinin (yhteensä muoto) käytettiin latauskontrollina (D).

Microtubule dynaaminen epävakaus on ominaista äkillinen stokastista siirtymät vaiheiden laajennuksen ja lyhentäminen. Molekyylitasolla, lisääntynyt α-tubuliinin asetylointi pidetään merkkiaine alennetun dynaamisen mikrotubulusten. Täällä, Western blot-analyysi osoitti, että määrä asetyloitu α-tubuliinin aleni BPR0L075-inkuboitu KB solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 6C). Sen sijaan, määrä asetyloitu α-tubuliinin lisääntyi paklitakseli-inkuboitiin solujen (kuvio 6C). Mikrotubu- de-stabilointiaine todettiin toimivan indusoimisessa mikrotubulusten dynamiikan epävakaus ja mikrotubulusten stabilointiaine todettiin toimivan vähentämisessä mikrotubulusten dynamiikan epävakaus [20], [21]. Näin ollen, määrä asetyloitu α-tubuliinin läsnä soluissa voi liittyä solujen herkkyys eri antimitoottisia yhdisteitä. Sen määrittämiseksi, onko KB-

L30

solut osoittivat vähennetään mikrotubulusdynamiikan, Western blot-analyysiä käytettiin tason määrittämiseksi α-tubuliinin asetylointi läsnä lääkkeille vastustuskykyisten soluissa. Tässä, Western blot-analyysi osoitti, että määrä asetyloitu α-tubuliinin lisääntyi KB-

L30

soluja, verrattuna KB-soluja (kuvio 6D). Yhdenmukainen ennakoinnin laskennallinen malli, meidän tulokset osoittivat, että KB-

L30

solut osoittivat sekä parannettu mikrotubulusten vakauttamista ja vähentää mikrotubulusdynamiikan. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että muutos mikrotubulusten vakauden ja dynaaminen KB-

L30

solut voidaan läsnäolon aiheuttama mutatoitujen βI-tubuliinin, jolloin vastus mikrotubulusten de-stabilisaattoreita ja hyper-herkkyys mikrotubuluksen stabilointi.

keskustelu

Anti-mitoottisiin yhdisteiden on osoitettu onnistuneesti hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä. Kuitenkin kehitys lääkeresistenssideterminantit solujen rajoittaa niiden tehoja kliinisissä tilanteissa. Siksi on tärkeää määrittää mahdollisen lääkeresistenssin mekanismin soveltamiseen liittyviä antimitoottisten syövän hoidossa. Positiivinen korrelaatio ekspression monilääkeaineresistenssi proteiinien MDR-1, MRP-1 ja induktio lääkeresistenssin antimitoottisesta yhdisteiden syöpien on laajalti raportoitu aiemmin [4], [5]. Kuitenkin lääkeresistenssin antimitoottisesta yhdisteet syöpäsoluissa on ajateltu olevan monitekijäinen. Täällä, osoitimme että BPR0L075 kestävä KB-

L30

solut eivät ilmennä MDR-1 ja MRP-1. Tärkeää on, että nykyinen tutkimus tunnistettua uusia mutaatiokohtia eksoni 4 βI-tubuliinin, jotka voivat aiheuttaa sekä lääkeaineen vastustuskyvyn mikrotubulusten de-stabilisaattoreita ja hyper-herkkyys mikrotubulusten-stabilointiaineita kautta sekä muutoksia lääkkeen sitoutumiskohdan ja mikrotubulusten vakautta.

BPR0L075 kestävä KB-

L30

soluja käytettiin tässä tutkimuksessa näyttäisi hankkia lääkeresistenttiä ominaisuuksien avulla MDR /MRP-riippumattomien mekanismien. Ensinnäkin, KB-

L30

solut eivät ilmaista kaksi yleisin huume effluksipumppujen, MDR-1 ja MRP-1. Lisäksi, toisin kuin perinteiset mikrotubulusten estäjiä, kuten vinkristiini, ja paklitakseli, BPR0L075 on tehokas tukahduttamaan solujen kasvua sekä MDR /MRP-positiivinen ja -negatiivinen kasvainsolulinjoissa [14].

In vivo

, BPR0L075 osoitti voimakasta aktiivisuutta kasvua vastaan ​​ksenograftikasvaimissa mahalaukun karsinooma MKN-45, ihmisen kohdunkaulansyövän KB, ja KB-johdettu P-gp170 /MDR -overexpressing KB-VIN10 soluja nude-hiirissä [14]. Kuitenkin BPR0L075 oli tehoton indusoimaan kuolemaan KB-

L30

soluja tässä tutkimuksessa. Siksi tutkimuksemme osoitti, että MDR /MRP ei tärkeä rooli vastustuskyvyn mikrotubulusten de-stabilisaattoreita, kuten BPR0L075, kolkisiini ja vinkristiini sisään KB-

L30

soluja.

Koska MDR ja MRP ei tärkeä rooli induktioon lääkeresistenssin KB-

L30

soluja, muut lääkeresistenssimekanismien oltava läsnä soluissa. Tubuliinia sitovat yhdisteet, kuten vinkristiini, kolkisiini ja paklitakseli, estää etenemistä solun mitoosin kautta estämällä dynaamisen muodostumista sukkularihmaston aikana G

2 /M vaihe. Näin ollen mutaatiot lääkkeen kohde, tubuliinin, voi haitata tehokkuutta antimitoottisia yhdisteitä. Itse asiassa, mutaatiot sekä α- ja β-tubuliinia kiinalaisen hamsterin munasarjasoluissa on osoitettu johtavan vastustuskyky kolkisiini ja vinblastiini [8]. Lisäksi mutaatiot β-tubuliinia munasarjasyövän solujen on osoitettu aiheuttavan resistenssiä epotilonin ja taksaanien [22]. Tässä tutkimuksessa kuusi uuden mutaation löytynyt sivustoja läsnä βI-tubuliinin geenin KB-

L30

soluja. Nämä mutaatiot vastaavat aminohappojen mutaatiot V316D, T372S, S382L, E405K, E432K ja G437K. Nämä mutaatiokohdat on esitetty eksoni neljällä alueella sen sijaan, että eksonin yksi, kaksi ja kolme, jotka on aiemmin tunnistettu [7]. Tämä on erityisen tärkeää, koska mutaatioita eksonissa neljä aiheuttaa antimitoottisena lääkeresistenssi ovat varsinkaan osoittaneet verrattuna eksonin 1, 2 ja 3. Tässä tutkimuksessa yli-ilmentyminen mutantti tubuliinit (sisälsi useita mutatoitunut-sivustot) in KB soluissa vähensi lääkkeen herkkyys mikrotubuleihin de-stabiloivan yhdisteen BPR0L075 verrattuna soluihin transfektoitu tyhjällä vektorilla tai villityypin tubuliinia. Pieniä eroja, jotka on transfektoitu mutatoidun-tubuliinia ja villityypin tubuliinin olivat luultavasti koska suuri määrä endogeenisesti ilmaistu villityypin tubuliinin läsnä transfektoiduissa KB-soluja. Transfektio konstruktit, jotka sisältävät β-tubuliinia eri single-site-mutaatio KB-soluissa suoritettiin myös sen määrittämiseksi, onko tietty single-site-geenin mutaatio oli todellakin riittää aiheuttamaan lääkeresistenssin BPR0L075 (tietoja ei esitetty). Kuitenkin Tutkimuksemme tuloksia ei paljastanut mitään merkittävää eroa huumeiden herkkyyden välillä transfektoitu mutantti (single site mutaatio) ja villityypin βI-tubuliinia (tuloksia ei ole esitetty). Tämä tulos voidaan mahdollisesti selittää seuraavista: 1) mutaatio sivustot eivät suoraan sijaitsee tiettyä lääkettä sitoutumiskohdat ja 2) kolmiulotteisen rakenteen βI-tubuliinia ei merkittävästi muuttunut mikään yksittäinen mutaatio, joka paljastui tässä tutkimus. Sen sijaan kaikki kuusi mutaatioiden läsnä eksonissa 4 voisi yhdessä edistää muuttaminen βI-tubuliinin n kolmiulotteisen rakenteita, jolloin muutokset huumeiden herkkyyden KB-

L30

soluja.

käyttö tietokonemallintaminen, mutantti alueiden laskennallinen malli jota ennustettiin analysoitiin verrata lisäämisen tai vähentämisen vuorovaikutuksen ennen ja jälkeen mutaatioita. Mallissa, sijainnit βI-tubuliinin mutaatioita tunnistettiin ja tuloksena konformaation muutokset βI-tubuliinin proteiinia lähdettävä kanssa mahdolliset vaikutukset mikrotubulusten kokoonpanoa ja vakautta. Yhteisymmärryksessä laskennallinen malli, lisääntynyt tubuliinin polymeeri tasot havaittiin BPR0L075 kestävä KB-

L30

soluja verrattuna sen lääkkeen herkkä vanhempien soluja (kuva 6A ja 6B). Lisäksi taso asetyloitu α-tubuliinin lisääntyi myös KB-

L30

soluissa (kuvio 6D), mikä osoittaa, että vähennetään mikrotubulusten dynamiikan epävakaus oli läsnä tässä erityisessä solulinjassa. Rooli for muuttunut mikrotubulusten polymeerin pitoisuuksia vinkristiini vastus akuutti lymfaattinen leukemia on osoitettu

in vivo

aiemmin [23]. Lisäksi vinkristiini kestävä ksenografti, joilla on korkea polymeroida tubuliinia esitetty suhteellisen herkkä mikrotubuleihin polymeroimalla lääkeaineen paklitakselin [23]. Lisäksi tutkimus kertoi myös, että dynaaminen epävakaus mikrotubulushaarojen paklitakselin vastustuskykyisten A549-T12 syöpäsolujen lisääntyi merkitsevästi verrattuna sen vanhempien soluihin [24]. Siten parannettu mikrotubulusten polymeroitumisen ja alhaisen dynaamisen epätasapainoa tubuliiniin mutaatiot voivat edustaa selviytymismekanismi vastaan ​​mikrotubulia de stabiloivia yhdisteitä. Toisaalta, parannettu mikrotubulusten polymeroitumisen ja alhaisen dynaamisen epävakaus saattaa parantaa tehokkuutta mikrotubulia stabiloivia yhdisteitä, kuten paklitakselin. Itse asiassa, meidän julkaistu tutkimus osoitti, että alas-säätely surviviiniperäisten (IAP: t) indusoi mikrotubulusten de-polymerointi, mikä lisää huumeiden herkkyys KB solujen kolkisiinia ja BPR0L075 [13]. Lisäksi saman kohtelun palautti osittain herkkyydestä KB-

L30

solujen BPR0L075 läpi mikrotubulusten de-polymerointi [13]. Kuitenkin alassäätöä surviviinispesifisten ei vaikuttanut aktiivisuuteen caspases [13]. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että tasapaino polymeroitunut ja ei-polymeroitunut tubuliinin voi olla tärkeä tekijä vastauksena antimitoottisena kemoterapiaan.

On myös syytä huomata, että alas-säätely βII- ja βIII-tubuliinia isotyyppien havaittiin KB-

L30

soluja. Kirjallisuus paljasti, että yli-ilmentyminen βIII-tubuliinin aiheuttama paclitaxel- ja dosetakseli-resistenssi syöpäsoluissa [7], [10], [16]. Korkea βIII-tubuliinin ilmentyminen osoitettiin myös liittyvän vastuksen paklitakselille ja laski eloonjäämisen potilailla, joilla on syöpä [25]. Mielenkiintoista, tuore tutkimus päässä Tseng

et al.

On tarjonnut mahdollinen selitys tälle ilmiölle. Matemaattiset ja laskennallisia malleja niiden tutkimus osoittaa, että mikrotubulia de-stabilointiaineet, colchincine ja sen johdannaiset, sitoutuvat vahvin on βIII-tubuliinin kuin verrata muihin β-tubuliinin isotyyppien [26]. Näin ollen muutokset ilmentymisen βIII-tubuliinin voi muuttaa herkkyyttä kolkisiinijohdannaisia, jotka estävät polymeroinnin mikrotubulusten. Siksi alas-sääntely βIII-tubuliinin voi myös edistää herkempiä paklitakselille ja alennetun herkkyys kolkisiinia /BPR0L075 sisään KB-

L30

soluja.

Yhteenvetona osoitimme että uudet mutaatiot eksonin 4 βI-tubuliinin aiheuttama vastus mikrotubulia de-stabilointi ja hyper-herkkyys mikrotubulusten stabilointiaine läpi muutoksen mikrotubulusverkoston kokoonpanoon ja dynamiikka syöpäsoluissa. Tämä raportti ilmaisee lisäksi, että syöpäsolut voivat muuttaa vakautta ja dynamiikka mikroputkiverkostoa läpi useita mekanismeja, kuten tubuliinia mutaatioiden ja ero isotyypin ilmaisuja samanaikaisesti, jolloin vastustuskykyisiä antimitoottisia syövän hoidossa. Tulokset Tämän tutkimuksen antaa molekyylitason tietoa lääkkeen valinta potilaille, joilla on erityisiä tubuliinia mutaatioita ja myös merkittäviä vaikutuksia kehittämässä tulevaisuuden antimitoottisena yhdisteitä, jotka pystyvät kohdistamaan lääkeresistenttiä syöpäsoluja. Tästä huolimatta lisätutkimukset ovat tarpeen sen määrittämiseksi, onko nämä erityiset βI-tubuliinin mutaatiot löytyvät kliinisissä näytteissä (jälkikäsittely) ja sen korrelaatio lääkeresistenssi.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat , vasta-aineet ja reagenssit

Ihmisen suun karsinoomasolut (KB) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Tämä erityinen syövän solulinja kuvataan myös HeLa epäpuhtautena ATCC. KB ja KB-johdettu KB-

L30

soluja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa (Gibco, Grand Island, NY), johon oli lisätty 5% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja L-glutamiinia (0,29 mg /ml), 37 ° C: ssa. Vasta-aineet, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat: hiiren anti-αtubulin-vasta-ainetta (Upstate Soluviestintä, Lake Placid, NY), hiiren anti-βtubulin-vasta-ainetta (BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ) ja hiiren anti-aktiini-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

perustaminen KB-johdettu BPR0L075-resistentti solulinja

Ihmisen suun karsinoomasolut (KB) viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, kuten aiemmin on kuvattu.