Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia on ollut pitkään tunnustettu tärkeimmistä syöpään edistää microenvironment. Tällaisessa energiaa rajoittava ehto, transkription jälkeisiin mekanismit tärkeämmäksi yli energiaa kallis geenin transkriptio koneita. Tässä osoitamme, että puhkeamista hypoksian aiheuttama syöpä kantasolu piirteet edellyttää beeta-kateniinin riippuvaisen transkription jälkeinen säätely ylöspäin CA9 ja SNAI2 geeniekspressiota. Vastauksena hypoksia, beeta-kateniini siirtyy solukalvon sytoplasmaan, missä se sitoutuu ja stabiloi SNAI2 ja CA9 mRNA: t, yhdessä mRNA stabiloivan proteiinin Hur. Tarjoamme myös näyttöä siitä, että post-transkriptionaalista aktiivisuutta sytoplasman beeta-kateniinin toimii normoksia basaali kaltainen /triple-negatiivinen rintasyöpä soluja, jossa beeta-kateniinin Knockdown estää kantasolujen fenotyyppi

in vitro

ja kasvaimen kasvua

in vivo

. Tällaisissa soluissa, me purkaa yleisen osallistumista beeta-kateniinin perustuva koneen vakauttamiseen EGF-indusoidun mRNA: t, mukaan lukien syövän kantasolujen säädin IL6. Tutkimuksemme korostaa ratkaisevaa roolia posttranskriptionaalisella mekanismeja huolto /hankinta syövän kantasolujen ominaisuuksia ja ehdottaa, että este sytoplasman beeta-kateniinin toiminto voi edustaa ennennäkemättömän strategia kohdistaminen rintasyövän varsi /pohjapinta kaltaisia ​​soluja.

Citation: D’Uva G, Bertoni S, Lauriola M, De Carolis S, Pacilli A, D’Anello L, et al. (2013) Beta-kateniinin /Hur posttranskriptionaalisella Machinery säätelevän Cancer Stem Cell ominaisuudet vastauksena Hypoksia. PLoS ONE 8 (11): e80742. doi: 10,1371 /journal.pone.0080742

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 07 lokakuu 2013; Julkaistu: 15 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 D’Uva et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ ovat tukeneet: Italian opetus-, yliopistot ja tieteellinen tutkimus apurahan PRIN 2008KTRN38 ”Clinical, diagnostiset ja terapeuttiset vaikutukset tutkimuksia rintasyövän kantasoluja” MT ja MB; Cassa di Risparmio Bologna Foundation ”Ruolo della regolazione della Sintesi proteica nelle cellule staminali del cancro” (n. 135 /2010-0102) ja LM ja MB. RFO varat ex 60%, Cornelia ja Roberto Pallotti Foundation (n. 2011-110512) MB. Kirjoittajat kiittää Fondazione Cassa di Risparmio Bolognassa ja Fondazione Banca del Monte e Ravenna tukemiseen Center for Applied Biomedical Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kantasolut ovat kanna erikoistuneissa sektoreihin, joilla alhainen happipitoisuus jännitys (hypoksia) edistää sääntely itseuudistumisen ja erilaistuminen [1-3]. Itse asiassa, hypoksia säilyttää erilaistumattoman tilan alkion, hematopoieettisten, mesenkymaalisten ja hermoston kantasolujen /esisolujen [2]. Hypoksia tuumoreissa liittyy huonoon ennusteeseen [4]. Solut hypoksinen kasvaimen alueilla vakauttaa hypoksia-indusoituvaa-tekijöiden (HIFs) ja aktivoi mukautuva geeniekspression syöpään johtavista aggressiivisuus kautta solujen eloonjäämistä ja erilaistamattomuuden [1,5]. Lisäksi HIF aktiivisuus harvinainen osajoukko hypoksisia kasvainsolujen antaa kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia [1-3].

Beta-kateniinin on tärkeä säätelijä normaali ja syövän kantasoluja itseuudistumisen [6,7 ]. Vasteena erilaisiin ärsykkeisiin, beeta-kateniini indusoi ilmentymistä kohde- geenien shuttling tumaan, jossa se on vuorovaikutuksessa TCF /LEF perheen transkriptiotekijöiden [6].

Fyysinen vuorovaikutusta HIF-1-alfa, merkittävä toimija hypoksiavaste, ja beeta-kateniinin on kuvattu [8]. Lisäksi beeta-kateniinin ja HIF-1-alfa synergistisesti helpottaa hypoksia hengissä koolonkarsinoomasoluissa ja itseuudistumisen hermostoputken kantasoluja [8,9].

Hypoksia on energiaa rajoittava ehto, joka selvästi vähentää kokonaiskolesterolin

de novo

transkription ja edistää energiansäästöä posttranskriptionaalisella sääntely ennestään mRNA: t [10-12]. Viimeaikaiset tutkimukset raportoivat, että beeta-kateniinin moduloi puoliintumisaika sytoplasman mRNA: iden [13-17]. Nämä tiedot johtavat meidät otaksua, että post-transkriptionaalista aktiivisuutta beta-kateniinin tärkeä rooli mukauttaminen syöpäsolujen hypoksia. Tässä olemme analysoineet rooli beeta-kateniinin mRNA: iden tuotannon ja vakauttamiseen kaksi tärkeää rintasyövän kantasolujen säätelygeenit eli hiilihappoanhydraasi 9 (CA9) ja SNAI2. Ilmentyminen CA9 ja SNAI2 geenien aiheuttama hypoksia, kautta HIF1-alfa-välitteisen transkription ylössäätöä [18-20]. CA9 ilmaisu säätelee pH: n hypoksinen mikroympäristössä edistää selviytymistä ja proliferaatiota syövän kantasolujen [21,22]. Näin ollen CA9 on ehdotettu kuin syöpähoidon kohde [23,24]. SNAI2, joka tunnetaan myös nimellä SLUG, on tärkeä toiminnallinen vaimennin ihmisen rinta- kantasolujen linjaa sitoutumista ja erilaistumista, edistää normaali ja kasvaimen maitorauhasen varsi /esisolujen valtio [25,26].

täällä kertoa, että sytoplasmisen kertyminen beeta-kateniinin vastauksena hypoksia aktivoi transkription jälkeinen de-erilaistumista ja selviytymisen ohjelma, joka parantaa kantasolujen ominaisuuksia rintasyöpäsoluissa. Ilmiö vetoaa kykyä sytoplasmisen beta-kateniinin sitomaan ja stabiloimaan SNAI2 ja CA9 mRNA: t. Tarjoamme myös näyttöä siitä, että post-transkriptionaalista aktiivisuutta sytoplasman beeta-kateniinin toimii normoksia basaali kaltainen /triple-negatiivinen rintasyöpä soluja. Pohjapinta-like /triple-negatiivinen rintasyöpä on huonosti eriytetty ja aggressiivinen rintasyöpä alatyyppi, jolle on ominaista ilmaus kantasolun kaltainen geeni profile [27,28], jonka sytoplasman lokalisaatio beeta-kateniinin [29-31 ] sekä CA9 ja SNAI2 geenin yli-ilmentyminen [32,33]. Tällaisissa soluissa, beeta-kateniinin Knockdown dramaattisesti vähentynyt vakautta ja ilmaus CA9 ja SNAI2 mRNA: t ja pilaa kantasolujen fenotyyppi

in vitro

ja ksenograftissa-perustamisesta valmiudet

in vivo

. Lisäksi beeta-kateniinin beeta-kateniinin pystyi säätelemään mRNA: n stabiilisuuteen useita EGF-indusoidun mRNA: ita, joista pro-inflammatoristen sytokiinien interleukiini 6 (IL6), acknowledged syövän varsi kasvutekijä [21,34]. Tiedot tästä ilmoitetaan korostavat roolia transkription jälkeisen mekanismeja säätelyssä syövän kantasolujen ominaisuuksia, ja tunnistaa beeta-kateniinin niin keskeinen transkription jälkeinen toimija rintasyövän kantasolujen fenotyyppiä. Ehdotamme, että este beeta-kateniinin posttranskriptionaalisella aktiivisuus tässä kuvatun edustaa ole vielä tutkittu strategiaa kohdistaa rintasyövän varsi /pohjapinta kaltaisia ​​soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, kemikaalit ja hypoksia altistuminen

Käytimme MCF7-solujen mallina hyvin erilaistunut luminaalisen rintasyöpä ja MDA-MB-468 ja MDA-MB-231-solujen mallina huonosti eriytetty perus-kuin rintasyöpä [35 ]. Kaikki solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MCF7, MDA-MB-468 ja MDA-MB-231, kasvatettiin RPMI-1640, DMEM /F12 ja DMEM vastaavasti. Kaikki alustat täydennettiin 10% FBS: ää, 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä ja 1% glutamiinia Euroclone (Milano-Italia). Kaikki normoxic soluviljelmät pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-kostutetussa atmosfäärissä. Hypoksia (1% pO

2, 5% pCO

2, 94% PN

2) saatiin käytettäessä

Invivo

300 hypoksian kaappi (Ruskinn Technology, Bridgend, UK) 48 h. Solukuolemaa arvioitiin Trypan blue -värjäyksellä.

Generation MS primaarisista rintasyöpä kudoksissa ja solulinjoissa

MS ihmisen rintarauhasen kudokset saatiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [21]. Lyhyesti, kudosnäytteet pantiin steriiliin Epicult media (StemCell Technologies, Vancouver, Kanada), jauhettu steriileillä leikkausveitsiä, ja inkuboitiin 6-12 tuntia läsnäollessa 1000 U Kollagenaasia /hyaluronidaasientsyymi mix (StemCell Technologies) ja suodatetaan 40 pm nylon mesh (Becton Dickinson), suspendoitiin uudelleen täydelliseen MEGM ja maljataan 1cm

2 alhainen kiinnityslevyjä. Toissijainen MS sukupolvi saatiin inkuboimalla ensisijainen tai peräkkäisen MS 1 × Trypsiini-EDTA-liuosta (Cambrex) 3 minuuttia, suodatus koko 40 pm nylon mesh ja yksisoluisia resuspension täydellisessä MEGM. MS pisteytettiin 7. päivänä Maavara saatiin S.Orsola-Malpighi Hospital eettisen komitean, University of Bologna (Prot. N. 75/2011 LM ja MB ja MT). Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin potilailta, joiden kudoksia käytettiin tutkimuksessa. MCF7-MS kertyi kylvö 5000 MCF7-solujen alhainen kiinnitys 24 hyvin ja teki päivänä 5.

Stable Beta-kateniinin ja SNAI2 knockdown MCF7, MDA-MB-468 ja MDA-MB-231-solujen

Stable beeta-kateniini pudotus MCF7, MDA-MB-468 ja MDA-MB-231-soluja saatiin aikaan transdusoimalla pCtoGMB-GFP retrovirusvektori kuljettaa ihmisen beeta-kateniinin erityisiä 19nt koodaavan sekvenssin (GAGCCTCTATACCACCCAC) PCR -pohjainen kloonausstrategia, kuten aiemmin on kuvattu shSNAI2 vektori [20]. shBeta ja shSNAI2-infektoidut solut valitaan GFP sy- tofluorimetrisillä lajittelu, kuten aiemmin on kuvattu [20].

Immunofluorescence ja Konfokaalimikroskopia analyysi

Viljellyt solut ympättiin lasipeitinlevyille 60% konfluenssiin, kun taas MS viljeltiin BD vähentää Matrigel

TM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Solut kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä, ja läpäiseviksi 0,2% Triton X-100. Soluja inkuboitiin anti-beeta-kateniini primaarista vasta-ainetta (klooni E5, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) ja toisen anti-hiiri-FITC konjugoitu vasta-aine (Dako Cytomation, Glostrup, DK). Tumat vastapäivään värjätään propidiumjodidilla ja asennettu antihäipyminen Pro-pitkä reagenssia kiinnitysväliaine (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Kuvat otettiin käyttäen Zeiss LSM 710 Zeiss Observer Z1 tai Leica DMI 6000B käänteismikroskooppi (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Saksa).

Ohimenevä transfektio siRNA ja ekspressiovektoreita

CA9-, kii-, ja SNAI2-spesifisiä siRNA: t ja ei-spesifistä siRNA ohjaus (siSCR) oligonukleotidit (Stealth

TM-teknologia), jossa on Hyväksytty GC-pitoisuus ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Plasmideja, jotka koodaavat villityypin beeta-kateniini (beta-WT, pCI-neo), dominantti negatiivinen pcDNA4-TCF4DN (TCF4DN), ja PTER + shBeta-kateniini (shBeta) koodaava vektori saatiin tri Marc Van De Wetering (Hubrecht Institute, Utrecht, Alankomaat) ja Bert Vogelsteinin (Johns Hopkins University, MD, USA). Plasmidi koodaus HIF1-alfa saatiin Eric Huang (Neurokirurgian, University of Utah, Salt Lake City, Utah). Villityypin EGFR koodaava vektori saatiin Pier Paolo di Fiore (European Institute of Oncology, Milano, Italia); siRNA: t tai plasmidit transfektoitiin MCF7-soluja (10

5-soluja 3 cm

2 kuoppa) konsentraatiossa 1 ug /kuoppa 72 h tai 24 h vastaavasti lipofektamiinia 2000 (Life Technologies, Gran Island, NY ), tai Jet-Pei (Polyplus, Illkirch, Ranska), kun kyseessä on MS. MCF7-solut stabiilisti transdusoitu retrovirusvektorilla, joka koodaa p53: n määräävän inaktivoiva mini-proteiinia (p53D) on aiemmin kuvattu [36].

Gene-promoottori ja mRNA: n 3’UTR-lusiferaasireportteri- määrityksissä

Hiilihappoanhydraasin -9 lusiferaasi-plasmidia (CA9-Luc, joka ulottuu -170-34 alueella CA9-promoottori), oli ystävällisesti toimittanut Dott. Jaromir Pastorek; HIF1alpha vastaamisen lusiferaasiplasmidin, HRE-Luc, luovutti ystävällisesti Dr. Giovanni Melillo (Kasvain hypoksia laboratorio, National Cancer Institute, Frederick, MD, USA). SNAI2-Luc plasmidi ystävällisesti Dr. Togo Ikuta (Saitama Cancer Center, Saitama, Japani); TopFlash, oli lahja Dr. Rolf Kemler (Max Planck Institute, Heidelberg, Saksa); Estrogeeni Response Element (ERE-Luc) toimittaja tarjosi Rakesh Kumar (Department of Molecular and Cellular Oncology, MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas); Tymidiinikinaasi Renilla lusiferaasireportteriplasmidin (Promega, Madison, WI) käytettiin kontrollina lusiferaasianalyysissä 24 tunnin kuluttua käyttäen Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tiedot ilmaistaan ​​kertaiseksi muutoksia tulikärpäsen yli Renillan lusiferaasiaktiivisuus. CA9 ja SNAI2 3’UTR lusiferaasianalyysissä konstruktit saatiin Genecopoeia (Rockwell, Maryland, USA). Kukin solulinja transfektoitiin 3’UTR-CA9 /SNAI2 vektori tai ohjaus pEZX-MT01 tyhjän vektorin. Tulokset on esitetty suhteessa 3′-UTR-CA9 /SNAI2 haltuunsa vektori, valmistajan ohjeiden mukaisesti.

RNA: n uutto ja cDNA: n monistaminen

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen TRIzol® mukainen reagenssi valmistajan protokollan (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alukkeita ja PCR-olosuhteet on esitetty taulukossa S1.

Real-Time PCR-analyysi

Real-Time PCR-analyysi suoritettiin TaqMan lähestymistapa aiCycler iQ ™ Real-Time PCR DetectionSystem (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Alukejoukkoa ja fluorogeenisen koettimien spesifisiä CA9, SNAI2, ESR1, IL6- ja CD44 mRNA: t ostettiin Applied Biosystems. Reaktioita inkuboitiin 50 ° C: ssa 2 min; 95 ° C: ssa 15 min, mitä seurasi 45 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Suhteellinen määrä kohde-mRNA laskettiin yhtä suuri kuin 2

– (Δ

C

t tavoite mRNA- Δ

C

t-ohjattu), käyttäen ihmisen beeta-glukuronidaasi mRNA kontrollina, lukuun ottamatta mRNA immuunisaostustesti, mRNA vakautta määritys, ja sytoplasman fraktiointi määritys.

korkea suoritusteho Gene Expression mittaus Real Time PCR: Mikrofluidistiikan Dynamic Array (Fluidigm® Real-Time PCR) B

RNA eristettiin käyttäen PerfectPure RNA viljelty solu Kit DNAasi-1 ruoansulatus (5 Prime, Hampuri, Saksa). cDNA syntetisoitiin käyttäen SuperScriptII ensimmäisen juosteen synteesiin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sillä qPCR valmiiksi mRNA ja mRNA vastaavasti eteenpäin alukkeet sijoitettu toiseen intronin ja eksonin, ja yhteinen reverse-alukkeen (tässä nimeltään universaali) oli sijoitettu kolmanteen konstitutiivisen eksoni. Geenejä, joissa yleinen alukkeiden sekvenssit eivät olleet saatavissa, 2 alukeparia suunniteltiin, jotta monistamaan vastaavasti introni ja eksonisekvenssit. Kukin cDNA näyte sekoitettiin altaan alukkeiden ennalta monistusreaktio 14 sykliä reagenssilla (Fluidigm PN 85000735) ja TaqMan Esivahvistustaso Master Mix, mukaan valmistajan ohjeiden. Esivahvistetun cDNA laimennettiin 1: 100. Modifioitu 2x TaqMan Universal Master Mix lisättiin laimennettua cDNA: ta, jotta saatiin lopullinen konsentraatio Master Mix 1x näytteissä. Siru oli pohjustettu vuonna NanoFlexTM 4-IFC Controller ennen lastausta näytteitä ja määritysreagenssit osaksi läpiviennit. Tiedot analysoitiin käyttäen Ct-arvoja ja ΔΔCt arvot. Kukin näyte oli kolmena rinnakkaisena ja normalisoitu joko GAPDH, B2M ja TBP. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S2.

Western Blot ja samanaikainen immunosaostus määrityksessä

Yhteensä proteiinit uutettiin RIPA-puskuria (25 mM Tris-HCl, pH 7,6, 145 mM NaCl, 1% NP -40, SDS 0,1%, Na-Deoxycolate 0,5%) lisättiin proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Basel, Sveitsi). Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen seuraavia vasta-aineita: Laminin, Beta-tubuliinin, anti-beeta-kateniini (E5), anti-Actin (C4) ostettiin Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA); anti-Hur (Molecular antureista, Invitrogen) ostettiin Molecular Probes; anti-CA9 (AF2188) ostettiin R cat. # 560890) ja CD24 (PE-CY7; cat. # 561646) tai niiden isotyyppikontrolleja lisättiin solususpensioon pitoisuuksina valmistajan suosittelemaa ja inkuboitiin 4 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan. Leimatut solut pestiin pesupuskurilla ja sitten analysoitiin LSR II Flow Cytometer (BD Biosciences).

Foci muodostava määritys

kyvyn testaamiseksi valittujen solulinjojen muodostamiseksi pesäkkeitä solut maljattiin kuuden kuoppalevyillä, pidettiin con fl uence, korvaamalla väliaineessa kunkin 3-4 päivää. Pesäkkeitä pisteytettiin päivänä 14

th.

Vieraslajisiirteen määritys ja kudosten immunohistokemia

2 * 10

6 MDA-M6B-468-soluja injektoitiin utarerasvaa-tyynyn naispuolinen nude-hiirissä. Kasvaimen kasvua seurattiin viikoittain ja sitten poistettiin 10 viikon jälkeen (Weizmann Institute Animal Care ja Käytä hyväksyi eläinkokeen, IACUC n. 01990412-2). 1 * 10

6 MDA-MB-231-solut injektoidaan subkutaani- kylkeen nude-hiirten. Kasvaimen kasvua seurattiin viikoittain ja sitten poistetaan 4 viikon kuluttua. (Animal eettinen komitea Bolognan yliopiston hyväksyi eläinkoe, prot. N. 8134-X /10). Formaliinifiksoidusta /Paraffine upotetut kudokset värjättiin hematoksyliinillä-eosiini, ja arvioi immunonistochemistry, seuraavilla vasta-aineilla: anti-ESR1 (klooni ID5, DakoCytomation, Glostrub, Tanska); anti-CDH1 (klooni NCH38, Dako Cytomation), anti-SNAI2 (L40C6, Cell Signalling, Beverly, MA), anti-CA9 (klooni M-75, ystävällisesti J. Pastorek, slovakki Academy of Sciences, Bratislava).

tilastot ja bioinformatiikan

bioinformatiikan analyysi AU-Rich alkuaineita sisältävän mRNA suoritettiin kuulemisen verkkotietokantaan AREsite [38] (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi -bin /AREsite.cgi). Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-ohjelmistolla. Tiedot esitetään keskiarvona +/- S.D .; p-arvot viittaavat

t

testistä on, ellei toisin mainita (n = 3).

Tulokset

Hypoksia nostattaa rintasyövän solujen erilaistamattomuuden ja selviytymistä /lisääntymiseen laukaisemalla CA9 ja SNAI2 ilme

in vitro

, rintasyöpä varsi /kantaisä ominaisuudet ovat yliedustettuina mammospheres (MS) [39]. Meidän tutkimuksen taustalla oli havainto, että altistuminen tai ennalta altistuminen hypoksia (1% pO

2) lisäsivät MS muodostava kyky MCF7-solujen (kuvio 1A), ja ductal rintasyöpä kudoksia peräisin olevia soluja (T-MS , kuvio 1 B). Sitten havaittiin, että MCF7-soluissa, sekä T-MS, hypoksia lisäsi mRNA: n ilmentymisen kahta keskeistä rintasyövän kantasolujen säätelygeenejä, eli hiilihappoanhydraasi 9 (CA9) ja SNAI2 (kuvio 1C) kautta,

de novo

mRNA tuotannon (kuvio S1A). Tärkeää on, SNAI2 shRNA knockdown pienentää normoxic MS pystyy muodostamaan sekä pyöristettyjä hypoksia MS laajennus (kuvio 1 D). Johdonmukaisesti, siRNA-välitteinen SNAI2 pudotus peukaloitu hypoksinen T-MS muodostumiseen (kuvio S1B). Lisäksi shRNA välittämä SNAI2 Knockdown pysähtyi hypoksian aiheuttaman alassäätöä epiteelin Differentiaatiomarkkerien estrogeenireseptori alfa (ESR1), keratiinin 18 (KRT18) ja e-kadheriinin (CDH1) (Kuva 1 E ja kuvio S1C) ja hypoxia- aiheuttama säätely ylöspäin CD44 ilmentymisen (kuvio 1 F), merkkiaine rintasyövän kantasolujen /esisolujen [21,40]. Lopuksi mukaisesti pro-eloonjäämisen /proliferatiivisia rooli CA9 [21,22], siRNA-välitteinen CA9 hiljentäminen lisäsi solukuolemaa ja haitannut MS muodostumista hypoksinen MCF7-soluissa (kuvio 1G). Nämä tiedot osoittavat, että hypoksia indusoi SNAI2 riippuvainen de-erilaistumisprosessia ja CA9-riippuvaa eloonjäämistä /lisääntymiseen ohjelma, joka johtaa lisääntymiseen varren /esisolujen alaryhmän (kuvio 1 H).

A, Mammosphere (MS) muodostuminen määrityksessä MCF7-soluissa reaktiona hypoksia altistusta (1% pO

2) tai sen jälkeen esialtistus kiinnittyneet solut 1% pO

2 (pre-1% pO

2) ; MS muodostavat kyky MCF7 solujen normoksia (Nor) raportoidaan perusarvo; B, kasvain MS muodostuminen määrityksessä (T-MS) Nor /1% pO

2 ductal rintasyöpä- kudoksia peräisin olevia soluja, n = 5; edustava kuvia mukana; C, CA9 ja SNAI2 mRNA Nor /1% pO

2 MCF7-solujen ja T-MS; D, MS muodostumisen määritys Ctrl /SNAI2 erityisiä shRNA retrovirusvektorin (shSNAI2) -transfected MCF7-solut altistettiin Nor /1% pO

2; E, Real-Time PCR-analyysi ESR1 ja KRT18 mRNA tasot Ctrl /shSNAI2 MCF7-solut altistettiin Nor /1% pO

2; F, Real-Time PCR-analyysi CD44 mRNA tasojen Ctrl /shSNAI2 MCF7-solut altistettiin Nor /1% pO

2; G, solukuoleman ja MS määritystä ryntäily (Ctrl) ja CA9 siRNA (siCA9) transfektoidut MCF7-solut altistettiin Nor /1% pO

2; H, Kaavioesitys roolin CA9 ja SNAI2 säätelyssä syövän kantasolujen ominaisuuksia vastauksena hypoksinen microenvironment. Tiedot esitetään keskiarvona +/- S.D .; p-arvot viittaa t-testiä. n = 3, ellei toisin mainita.

Beta-kateniinin lisää rintasyövän kantasolujen fenotyyppi vastauksena hypoksia riippumatta sen ydin- transkriptionaalisen aktiivisuuden

Sitten tutkittiin miten beta kateniinia sääntelyssä on CA9 ja SNAI2 riippuvan rintasyövän kantasolujen fenotyyppiä. MCF7-solut kuljettavat beeta-kateniinin erityisiä shRNA retrovirusvektorin (shBeta) näytetään dramaattinen väheneminen SNAI2 ja CA9-proteiinin ilmentymistä (kuvio 2A), joka on kytketty, joilla on alentunut normoxic MS muodostuminen ja alentunut hypoksinen MS laajennus (kuvio 2B). Rintasyöpä varsi /esisolujen ovat myös yliedustettuina CD44

korkea /CD24

alhainen väestöryhmästä [40]. Yhdenmukainen tiedot MS, MCF7-shBeta soluista tuotu esille supistettu osuus CD44

korkea /CD24

alhainen solujen normoksia, ja pyöristettyjä CD44

korkea /CD24

harvaan laajennus hypoksiaolosuhteissa (kuvio 2C ). Pitkäaikaisessa hypoksia-alttiina MCF7-shBeta soluihin, meillä on myös havaittu heikentymisen pesäkkeitä (kuvio S2A). Lisäksi shRNA välittämä beeta-kateniinin Knockdown vähensi huomattavasti pehmeä agar pesäkkeiden muodostumisen ominaisuus (kuvio S3A), tämä viimeksi mainittu on tiukat

in vitro

määrityksessä havaitsemiseksi solun pahanlaatuisiin. Nämä tiedot johtivat meidät ajattelemaan, että beeta-kateniinin Knockdown vaikeuttaa varsi /kantasolujen itseuudistumisen. Mielenkiintoista, beeta-kateniinin Knockdown vaikeuttaneet myös hypoksian aiheuttaman alas-säätely ESR1 (kuvio 2D), paljastaa kyky beeta-kateniinin olla keskeinen rooli hypoksian aiheuttaman dedifferentiaation ohjelma rinnasteinen voitto kantasolujen ominaisuudet rintasyöpäsoluissa. Sitten havaittiin, että hypoksia sai aikaan huomattavia siirtyy muualle beeta-kateniinin solukalvon sytoplasmaan, tämä on samankaltaista kuin väheneminen solu-solu-kontaktien (kuvio 2E). Mielenkiintoista, hypoksia laukaisee kumpikaan beeta-kateniinin tumaanohjaussignaali eikä beeta-kateniinin /TCF transkriptionaalista aktiivisuutta MCF7-soluissa ja T-MS (kuvio 2F, G). Nämä tiedot johtivat meidät kuvitella, että beeta-kateniinin helpottaa CA9 ja SNAI2 ilmaisun ja sitä seurannut kantasolujen fenotyyppi hypoksian alttiina rintasyövän soluja, riippumatta sen ydin- transkriptionaalisen aktiivisuuden.

, Western-analyysi (WB) ja beeta-kateniinin, SNAI2 ja CA9 proteiinin tasot Ctrl /shBeta MCF7-soluissa, kun Nor /1% pO

2 olosuhteissa; B, MS muodostaen määritys vakaissa beeta-kateniinin vaiennetaan (shBeta) MCF7-soluissa, kun Nor /1% pO

2 olosuhteissa; C, sy- tofluorimetrisillä analyysi CD44

korkea /CD24

pieni varsi /progenitoripopulaation in ctrl /shBeta MCF7-soluissa, kun Nor /1% pO

2 olosuhteissa; D, Real-Time PCR-analyysi ESR1 mRNA taso Ctrl /shBeta MCF7-soluissa, kun Nor /1% pO

2 olosuhteissa; E, immunofluoresenssi (IF) analyysi beeta-kateniinin Nor /1% pO

2 MCF7-soluissa; F, WB analyysi beeta-kateniinin Nor /1% pO

2 MCF7-solujen soluliman ja ydin- jakeet (lamiinivektori B ja beeta-tubuliinin käytettiin fraktiointiin valvonta); G, beeta-kateniinin /TCF transkription toimittaja (TOPFLASH) määritys MCF7-soluissa ja T-MS alle Nor /1% pO

2. Tiedot esitetään keskiarvona +/- S.D .; p-arvot viittaa t-testiä. n = 3, ellei toisin mainita.

Hypoksia indusoi CA9 ja SNAI2 ilmaisun kautta HIF1-alfa riippuvainen mRNA transkriptio ja beeta-kateniinin riippuvainen mRNA vakauttaminen

CA9 ja SNAI2 ovat hypoksia-indusoituvaa -kerroin-1-alfa (HIF-1-alfa) transkription tavoitteet [8,20]. Viime aikoina on ehdotettu, että beeta-kateniinin edistää CA9 ilmaisu, toimimalla HIF-1-alfan transkription co-tekijä paksusuolen syöpäsoluissa [8]. Taustalla näitä tietoja, pyrimme vaikutuksen tutkimiseksi beeta-kateniinin on HIF-1-alfan-riippuvaista transkriptiota, samoin kuin CA9 ja SNAI2 promoottorin aktiivisuutta. Yllättäen, lusiferaasi ajettu reagoiva toimittaja määrityksessä osoitti, että beeta-kateniinin yli-ilmentyminen haittaa HIF1-alfa-transkriptionaalisen aktiivisuuden, kun hypoksian altistumista tai sen jälkeen HIF1-alfa ohimenevä yli-ilmentyminen (kuvio 3A). Johdonmukaisesti, beeta-kateniini pudotus laukaisi HIF1-alfa-transkriptionaalista aktiivisuutta (kuvio 3B). Vastaavasti beeta-kateniinin tukahdutti hypoksian aiheuttaman CA9 ja SNAI2 geenien promoottorin aktiivisuutta (kuvio 3C). Nämä havainnot viittaavat siihen, puhkeamista antagonistinen aktiivisuus välillä beeta-kateniinin ja HIF1-alfa-välitteisen transkription hypoksia-alttiina rintasyövän soluissa. Mukaisesti nämä tulokset, transfektio vallitsevan negatiivisen isoformin TCF4 (TCF4-DN), joka pysäyttää beeta-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta [6], ei pystynyt vähentämään CA9 ja SNAI2 mRNA: n ekspression hypoksia-alttiina MCF7-soluja (kuvio S3B). Näyttö siitä, että beeta-kateniinin paradoksaalisesti vähentää CA9 ja SNAI2 promoottorin aktiivisuutta, mutta lisää ekspressiotasot sukulais-mRNA, sai meidät tutkimaan mRNA vakauden uusi kerros beta-kateniinin riippuva toiminto. Todistaa tämän hypoteesin, käytimme aktinomysiini D, estäjä polymeraasia 2 (Pol2), joka huonontaa

de novo

mRNA transkriptio. Mukaisesti hypoteesia, vakaa beeta-kateniinin hiljentäminen lyhennetty CA9 ja SNAI2 mRNA puoliintumisaika hypoksia alttiina MCF7-solut (kuvio 3D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että hypoksian indusoima de-erilaistumiseen /kantasolujen ohjelman rintasyöpäsoluissa tukeutuu HIF1alpha riippuvainen tuotannon CA9 ja SNAI2 mRNA, jonka jälkeen beeta-kateniinin riippuvainen vakauttaminen näiden mRNA: iden (kuvio 3E).

, HIF-1-alfa transkription toimittaja (HRE-Luc) määritys MCF7-soluissa, jotka on transfektoitu villin tyypin beeta-kateniinin (Beta-wt) nojalla Nor /1% pO

2 olosuhteet tai yhdessä HIF1 -alfa (HF1A) koodaus vektori; B, HRE-Luc määritys 1% pO

2-alttiina ctrl /shBeta MCF7-solut; C, CA9-Luc ja SNAI2-Luc määritystä ctrl /beta-wt transfektoitu sekä ctrl /shBeta MCF7 soluja Nor /1% pO

2 olosuhteissa; D, CA9 ja SNAI2 mRNA: n stabiilisuuteen määritys eston Polymeraasi 2 transkriptionaalisen aktiivisuuden aktinomysiini D (100 ng /ml) ctrl /shBeta MCF7-soluja altistettiin 1% pO

2; E, Kaaviokuva HIF1-alfa /beeta-kateniinin vuorovaikutus rintasyöpäsoluissa vastauksena hypoksia: HIF1-alfa edistää transkriptiota ja sytoplasminen beeta-kateniinin tehostaa vakauttamista SNAI2 ja CA9 mRNA: t; negatiivinen vaikutus beeta-kateniinin on HIF-1-alfan aiheuttama transkriptio myös kuvattu. Tiedot esitetään keskiarvona +/- S.D .; p-arvot viittaa t-testiä. n = 3, ellei toisin mainita.

konstitutiivisesti aktiivista beta-kateniinin post-transkriptionaalista aktiivisuutta pohjapinta-like /triple-rintasyöpäsolujen

Kun verrataan MCF7 johdettu MS sukulais tarttuneet solut varten CA9 ja SNAI2 ilmaisun, huomasimme korkeampi CA9 ja SNAI2 promoottorin aktiivisuutta ja mRNA: n ilmentymisen, joka keskeytettiin shBeta normoxic MS (kuva 4A-B). Vaikkakin ilmiö rinnastettiin kasvu beeta-kateniinin sytoplasman lokalisointi (kuvio 4C), samalla tasolla koko beeta-kateniinin proteiinin ja transkriptioaktiviteettia oli läsnä tarttuu ja MCF7 johdettu MS (kuvio 4D). Nämä tiedot korostavat, että post-transkriptionaalista aktiivisuutta beta-kateniinin saattaa olla mukana ylläpitoon varren /esisolujen tila, vaikka normoksia.