Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvava luettelo MikroRNA (miRNA) osoittavat poikkeava ekspressiokuvioita maksasolukarsinoomassa (HCC ), mutta sääntelymekanismeja pääosin jää epäselväksi. RNA muokkaus katalysoivat jäsenet adenosiinideaminaasigeenin vaikuttamalla RNA (ADAR) perhe voisi kohdistaa miRNA esiasteiden ja vaikuttaa biogeneesin prosessi. Siksi tutkimme onko RNA editointi voisi olla yksi mekanismi edistää vapauttamisen erityisiä miRNA HCC. Yli-ilmentyminen yksittäisten ADARs vuonna hepatoomasolujen, RNA editointi esiasteita 16 miRNA usein vapautettiin HCC seulottiin herkkä korkean resoluution sulava alustalla. Tulokset tunnistettu RNA esiasteita miR-214 ja miR-122 mahdollisina kohteina muokannut ADAR2. Osajoukko HCC josta esitetään koholla ADAR2 todentaa suuret editings tunnistettu ARAR2 yli-ilmennetään maksasoluja, joko A-to-I tai U-to-C muutokset. Epätavallinen U-to-C editointi tiettyinä tähteiden osoitettiin olevan johtuvan A-to-I editointi on RNA-transkriptien komplementaarinen pri-miRNA. Editointi tapahtuma aiheutti laskua RNA-transkriptin täydentävät pri-miR-214, joka johti laskua pri-miR-214 ja miR-214 ja johti lisääntyneeseen proteiinin taso tämän uuden kohdegeenin Rab15. Lopuksi nykyisessä tutkimuksessa havaittiin ADAR2 välittämää editointi täydentävän antisense selostukset uutena säätelevä mekanismi biogeneesin erityisten miRNA aikana hepatokarsinogeneesin.

Citation: Liu WH, Chen CH, Yeh KH, Li CL, Wu YJ, Chen DS, et al. (2013) ADAR2 välittämää muokkaus miR-214 ja miR-122 esiasteet ja Antisense-RNA-transkriptien maksasyöpien. PLoS ONE 8 (12): e81922. doi: 10,1371 /journal.pone.0081922

Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 31 heinäkuu 2013; Hyväksytty 17. lokakuuta 2013 Julkaistu: 27 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Research Program for Biolääkkeiden, National Science Council, Taiwan (NSC102-2325-B-002-032-), ja National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX100-9832BI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisiä Koodaamattomat RNA: t tunnistettiin posttranskriptionaalisella sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen. Yhä useammat miRNA todettiin usein olevan vapautettu vuonna HCC, ja jotkut ovat osallistuneet karsinogeenisia prosessiin kohdistaminen spesifisten solujen geenien mukana kasvaimen leviäminen, apoptoosin, ja etäpesäkkeiden [1], [2].

erilaisia ​​mekanismeja on raportoitu myötävaikuttaa poikkeava ekspressio miRNA kasvaimissa. Sen lisäksi, että genomista tai epigeneettiset muutokset, viat miRNA biogeneesiä prosessi nähtiin myös mukana dysregulation joko transkriptionaalisesti erityisillä transkriptiotekijät tai posttranscriptionally jalostamalla tekijät [3]. Kasvava joukko tekijöitä osallistuvien posttranskriptionaalisella biogeneesissä vaiheet on tunnistettu, mukaan lukien yleisiä tekijöitä kaikkien miRNA (esimerkiksi Drosha, DGCR8, ja Dicer) [4], ja erityisiä tekijöitä osajoukon miRNA (kuten P53, TRBP2, KSRP, p68 /p72, Lin28B, ja muut) [5], [6]. Lisäksi nämä tekijät, on katsottu, että RNA: n muokkaus voisi olla toinen mekanismi posttranscriptionally säätelevä miRNA tasolla kasvaimissa.

RNA muokkaus johtaa muutokseen RNA-sekvenssin, joka on erilainen kuin koodaama genomin ja monipuolisuuteen vaikuttavan proteiinin tuotteet [7]. Ihmisillä tämä tapahtuma välittyy ADAR entsyymien, mukaan lukien ADAR1 ja ADAR2, jotka katalysoivat Deaminoimalla adenosiini inosiini (A-to-I) in kaksijuosteinen RNA [8]. Kaksi ADAR1 isoformien promoottorin vaihtoehtoinen käyttö tunnistettiin, jotka koodaavat ADAR1S ja ADAR1L [7], [8].

lisäksi proteiinia koodaavan geenien ADARs voisi myös kohdistaa miRNA esiasteita, joko yksi- tai pre-miRNA, jotka sisältävät varsi-silmukka rakenteita yhtä edullisia substraatteja muokkausta koneita. Apunaan suurikapasiteettisten Sekvensointianalyysin on arvioitu, että ~ 20% ihmisen pri-miRNA muokataan [9]. Tällainen muokkaus tapahtumia on mahdollista vaikuttaa toiminnan miRNA, mukaan lukien stabiilisuus lähtöaineiden käsittely teho aikana biogeneesin, tai jopa kohdegeenin valinta [10], [11]. Tällainen mahdollisuus on jo hyvin osoitettu useissa erityisiä miRNA. Esimerkiksi pri-miR-142 todettiin muokannut ADAR1 ja ADAR2

in vitro

, joka johti tukahduttaminen sen käsittelyä Drosha. Toinen esimerkki tuli muokkaamisen pri-miR-151 by ADAR1, joka estää ennalta kypsyä-miR-151 käsittely estämällä sen katkaisun Dicer [12].

Tässä tutkimuksessa yritimme tutkia, onko RNA muokkausta ADARs tapahtuu säätelemiseksi käsittelyä HCC liittyvien miRNA. Koska pilottitutkimus, odotamme tuloksia voisi auttaa ymmärtämään, jos RNA editointi tapahtumia edistää vapautuneilla spesifisten miRNA vuonna hepatokarsinogeneesin.

Materiaalit ja menetelmät

plasmidikonstrukteja

cDNA-kloonit ihmisen ADAR1L ja ADAR2 ostettiin Mammalian Gene Collection (MGC, NIH, USA), ja ADAR1S subkloonattiin ADAR1L klooni. Nämä cDNA-fragmentit vaihdettiin pCMV.SPORT6 vektoriin ja sitten vielä edelleen kloonata osaksi lentivirusvektorilla on pLenti6 /V5-DEST käyttämällä Gateway Technology ™ System (Invitrogen Life Technologies Inc.).

pLKO.1 -siLuc ja pLKO-1-siGFP konstruktioita ohjaa U6 promoottori saatiin RNAi Core Facility Academia Sinica, Taiwan (Taipei, Taiwan). Lisäksi useat pLKO.1 vektori-siRNA plasmidit konstruoitiin insertoimalla erityisen siRNA-sekvenssin osaksi pLKO.1-siLuc-vektorin restriktiokohtien AgeI ja EcoRI. Sekvenssit Kunkin siRNA insertit vastaan ​​sense ja antisense selostukset miR-214 ja miR-122 listattiin seurasi. siRNA Mir-214: 5′-CCTTTGCTCATAGACAGATAC-3 ’; siRNA AS-miR-214: 5’-GTATCTGTCTATGAGCAAAGG-3 ’; siRNA Mir-122: 5’-CCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ’, siRNA AS-miR-122: 5’-TGCCAAGACATTTATCGAGGG -3 ”. Yksityiskohdat valmistamiseksi lentivirusten ilmentävien ADARs tai erityisiä siRNA olivat kuten aiemmin on kuvattu [13].

rakentamiseksi ilmentävien plasmidien joko sense tai täydentävää antisense selostukset pri-miR214 ja pri-miR122 viljelmässä soluissa, olemme kloonattiin PCR-tuotteet monistettiin genomisesta DNA: Huh-7-soluissa osaksi pCMV.SPORT6 vektoriin. Alukesarjat oli suunniteltu käsittää esiaste miRNA kanssa noin 200 emästä, joka ulottuu sekä 5 ’ja 3’ reunustavan sekvenssin kunkin miRNA. Mutaatiot spesifisten tähteiden Näiden rakenteiden, kuten A-34G ja A-27G varten pri-AS-miR-214 ja A-7G varten pri-miR-122, otettiin käyttöön mutageneesillä käyttäen QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Cedar Creek, TX), seuraamalla valmistajan ohjeen.

reportteri rakentaa pGL3-Rab15-3’UTR, joka sisälsi 3’UTR Rab15 geenin, rakennettiin insertoimalla DNA-fragmentti, joka kattaa nt. 1~714 ja 3’UTR Rab15 geenin (nt. 1 3’UTR kuin ensimmäisen nukleotidin jälkeen lopetuskodonista Rab15, nt. Asema 709 Rab15 transkriptin, NM_198686) osaksi pGL3-promoottori-vektoriin (Promega, Madison, WI). DNA-insertti monistettiin PCR: llä genomisesta DNA: Huh-7-soluissa käyttäen alukkeita 5′-GGTCCGTCTAGACAGAGCTGGTGCTGCAGGCCCAT-3 ’ja 5′-GAAGGCTCTAGACGAGGCAGGGTGGAG GGTTCTTC-3’.

korkean resoluution Sulamispiste (HRM) Analyysi

HRM on tehokas työkalu kehitetty herkälle sekvenssivariantti seulonta hyödyntäen DNA omaisuutta lämmön erottaminen läsnäollessa kyllästyminen fluoresenssivärejä, kuten High Resolution Melting Dye (Roche Diagnostics Applied Science, Mannheim, Saksa) tässä tutkimuksessa käytetyt. Heterodupleksin DNA-fragmentit voidaan erottaa homotsygoottisia niistä esittämällä eri muotoinen sulamiskäyrä [14]. Tämä mahdollistaa havaitsemisen yhden emäsparin muutoksia DNA-fragmentit aina 400 bp sulamiskäyräanalyysillä. HRM analyysi on siten sopiva meidän tunnistamiseksi nukleotidin aiheuttamia muutoksia muokkaamalla tapahtumien ennalta miRNA (-100 bps keskimäärin).

Alukkeet suunniteltiin jokaiselle miRNA käyttäen LightCycler Probe Design Software, jossa sekvenssit yhteenvetona taulukossa S1. Pituudet kunkin amplikonin oli noin 200 bps, mikä kattaa koko pre-miRNA vähintään 50 bps, joka ulottuu 5 ’ja 3’-päät. PCR vahvistusta ja HRM analyysi suoritettiin LightCycler® 480 (Roche Diagnostics Applied Science), yksityiskohdat kuten kuvattu [15].

PCR-tuotteet, jotka sisältävät heterodupleksin fragmentit tunnistettiin näyttämällä suhteellinen signaali ero sulaminen käyrät verrattuna monistettiin genomisesta DNA: Huh-7-soluissa (kuten tavallinen ilman muokkausta), käyttämällä Gene Scanning Software (Roche Diagnostics Applied Science). Jotta vältettäisiin väärät positiiviset tulokset aiheuttama analyysivariaatiot, olemme asettaneet raja-arvot kullekin amplikonin analysoimalla signaalin suhteellisen eron joukossa PCR-tuotteiden 12 toistoa PCR-reaktiossa Hu-7 genomista DNA: ta templaattina, joka oli 3.5 kaikissa tapauksissa. Siksi raja-arvot suhteellisen signaalin ero asetettiin 5. analyysimme.

Tutkimus aiheet

maksakudoksissa 20 HBV liittyvistä mies- HCC potilasta kerätään Taiwan Maksasyöpä Network (TLCN) on mukana tässä tutkimuksessa. DNA ja RNA: n pariksi tuumori- ja viereisen nontumorous maksakudoksissa kunkin potilaan käytettiin käänteistranskriptio ja PCR-reaktiot. Sitten PCR-tuote jalostettu varten Sekvensointianalyysin pyritään tunnistamaan jäämät otaksuttu editointi tapahtumia. Resektoidun kirurgisista näytteistä olivat nopeasti pidettiin nestemäisessä typessä, kunnes DNA: n ja RNA. Institutionaalinen Review Board of National Taiwan University Hospital luvan käyttää näitä arkistoituja kudosten, ja kaikki potilaat antoivat kirjallisen tietoon perustuva suostumus ennen tutkimukseen.

kvantifiointi Pri-miRNA ja Mature miRNA

Yhteensä-RNA eristettiin solujen Trizol-reagenssia (Rezol C T, Protech, Taipei, Taiwan) ja käsiteltiin sitten käänteistranskriptio käyttäen Superscript III One-Step RT-PCR System (SuperScript® III ensimmäisen Strand Synthesis System, Invitrogen, Carlsbad, CA), myöhemmän kvantifiointiin pri-miRNA. Seoksia varten Käänteistranskriptioreaktio sisälsi 1 ug RNA: ta, 10 uM aluketta, 5′-ATATCAGATGAACCTTCTTGCTC-3 ’varten pri-miR122 ja 5’-GGTTGTAGCTCTTGGTGTAGATG-3 pri-miR-214, jossa reaktio yksityiskohdat kuvatulla [ ,,,0],13].

qPCR suoritti LightCyclerTM FastStart DNA Master SYBR Green I Kit (Roche, Mannheim, Saksa) LightCycler PCR kone yksityiskohdat kuvatulla [13]. Käytetyt alukkeet spesifisen monistamisen pri-miR214 ja pri-miR122 on lueteltu sen jälkeen. Pri-miR-214: 5′-GTATCTGTCTATGAGCAAAGGAAACC-3 ’ja 5′-GGTGTAGATGCTATGGTGTGAGGGC-3′; pri-miR-122: 5’-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ’ja 5′-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3’.

kvantifiointi kypsän miR-214 ja miR-122 suoritettiin käyttäen TaqMan-miRNA Assay Kit (TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeita. U6 RNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina määrittämiseksi suhteellisen miRNA ilmentymistaso yksityiskohdat kuvatulla [13].

Strand Erityisiä qRT-PCR-analyysi

juostespesifisen qRT-PCR ensisijaisen transkriptio pri-miR-122 ja pri-miR-214, ja myös niiden täydentävät antisense selostukset, tehtiin seuraamalla protokollaa, kuten on kuvannut Ho

et al

[16]. Lyhyesti, 2,5 ug RNA: ta soluista tai kudoksista prosessoitiin käänteistranskriptio (RT) reaktio juosteen spesifinen aluke; ja sitten juostespesifisen RT tuotetta käytettiin qPCR analyysiä. Juostespesifisen alukkeet on suunniteltu pri-miR-122 ja pri-miR-214 ovat miR-122S: 5′-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 ’ja miR-214S: 5′-GTCTGCCTGTCTACACTTGCTG-3′; ja niitä, jotka täydentävän transkriptien ovat miR-122AS: 5’-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3 ’ja miR-214AS: 5′-AGGCTGGGTTGTCATGTGACTG-3’. Samoja alukkeita juostespesifisen RT reaktiota käytettiin myöhemmin qPCR analyysin yksityiskohdat kuvatulla [13].

TA Cloning ja Sekvensointianalyysin

RT-PCR tuotteet Lenti -ADAR2-tartunnan solut puhdistettiin geelillä uuttamalla ja kloonattiin yT vektori (Yeastern Biotech Co. Ltd., Taipei, Taiwan) TA kloonaus. Positiivisten kloonien inserttejä sisältäville prosessoitiin sekvenssianalyysi havaita nukleotidin muutokset verrattuna sekvenssin kontrollinäytteistä ilman ADAR2 yliekspressio.

Cell Culture, transfektio, Luciferase Reporter Assay, ja Western blot -analyysi

Kaksi hepatoomasolulinjassa linjat, HepG2 ja Huh-7-soluissa, ostettiin BCRC (Bioresource kerääminen ja Research Center, Taiwan, https://www.bcrc.firdi.org.tw). Genotyyppi Näiden kahden solulinjoista on todennettu by BCRC käyttämällä AmpFI STR Identifiler PCR -monistustarvikesarjaa of Applied Biosystems laajojen STR PCR DNA-analyysi, jossa profiilit identtinen ATCC tiedot. Yksityiskohdat solujen ylläpitoon, transfektio, lusiferaasireportterigeenin määritys, ja Western blot -analyysi tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Vasta-aineet, joita käytetään Western blot-analyysi sisältyy anti-ADAR2, anti-GUTL1, anti-IGF-1 R, ja anti-Rab15 (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-ADAR1 (Abnova, Taoyuan), ja anti-β-aktiini (Sigma, St. Louis, MO).

tulokset

muokkaus miR-214 ja miR-122 esiasteiden Huh-7-soluihin yliekspressio ADAR2

tarkastella jos RNA muokkaus myötävaikuttaa poikkeava spesifisten miRNA vuonna hepatokarsinogeneesin, 16 miRNA toistettavasti raportoidaan vapautettiin HCC (taulukko S1) valittiin meidän testausta, jos ne olisivat alustoille muokannut ADARs. Otimme lähestymistavan yliekspressiolla yksittäisten lenti-ADARs in Huh-7-soluissa, kuten ADAR1S, ADAR1L, ja ADAR2, ja sitten tutkitaan, onko RNA muokkausta aiheuttanut nukleotidin muutoksia esiasteita näiden miRNA. Lisääntynyt proteiinin ilmentyminen yksittäisten ADARs ensin varmistettiin Western blot -analyysillä (kuvio. 1A). RNA uutettiin soluista, jotka yli-ilmentävät yksittäisiä ADARs RT-PCR ja sen jälkeen HRM analyysi.

(A) Soluja infektoimattomia (mock), infektoitiin lenti-sh-luc (negatiivinen kontrolli), tai jotka ovat saaneet Lenti-ADAR1S, ADAR1L, ja ADAR2 yksilöllisesti. Solulysaatit käsiteltiin Western blotting käyttämällä koettimena Abs kuten alareunassa kunkin paneelin. HRM tulokset miR-214 (B) ja miR-122 (C). Raakadata suhteellinen signaalit esitetään ylemmässä paneelissa; ja ero suhteellisen signaalin vertaamalla ”ei editointi” standard näkyvät alemmassa paneelissa. Varsi toistorakenteet valmiiksi miR-214 (D) ja pre-miR-122 (E) on esitetty kaavamaisesti, jossa nukleotidit vastaavat kypsyä MIRS merkitty vihreällä. Asennot nukleotidin muuttaa yliekspressio ADAR2 on merkitty punaisella, numeroarvot osoittavat niiden sijainti suhteessa ensimmäisen nukleotidin kypsän Mirs (kuten asento ei. 1). Yhteenveto tuloksista nukleotidin muutosten lähtöaineiden näiden kahden miRNA näkyvät oikeassa paneelissa, sekvensoimalla 100 kloonia TA kloonaus RT-PCR-tuotteet monistettiin RNA lenti-ADAR2 infektoiduista soluista.

PCR-tuote monistettiin genomisesta DNA: Huh-7-solujen, joka ilmeisesti ei ole tavoite ADARs, toimi ”ei muokkaus” standardi HRM analyysiä. Vertaamalla tällaista standardia, suhteellinen signaalin tulokset kullekin 16 miRNA infektoitujen solujen yksittäisiä lenti-ADARs laskettiin, ja tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa S2. Poikkeava sulamiskäyriin osoittaa suhteellinen signaali pisteet 5, tunnistettiin RT-PCR-tuotteet monistettiin pri-miR-214 ja pri-miR-122 esiaste-RNA: t uutetaan lenti-ADAR2 infektoituneissa soluissa (Kuva. 1B miR -214 ja Fig. 1C miR-122). Tulokset osoittivat, että ADAR2 yliekspressio voi tehdä joitakin kohtaanto selostukset pri-miR-214 ja pri-miR-122, mikä viittaa esiasteita voisi olla substraatteina ADAR2.

tunnistamaan muita erityisiä jäämiä ensisijainen selostukset näiden kahden miRNA muokannut ADAR2, RT-PCR tuotteet lenti-ADAR2-tartunnan soluja käsitellään TA-kloonausta, ja myöhemmin Sekvensointianalyysin tehtiin 100 klooneja kunkin pri-miRNA. Useita toistuvia nukleotidin muutoksia havaittiin olevan erilainen sekvenssi näytteiden ilman ADAR2 yliekspressio. Kuva. 1D (PRI-miR-214) ja Fig. 1E (PRI-miR-122) kaavamaisesti niiden sijainti suhteessa kypsään Mirs, joka myös tiivistää prosenttiosuus näistä nukleotidin muutokset sekvensoitiin kloonit. Yleisimmät muutokset tapahtuivat kanssa haplotyyppi U-28C /U-37C varten pri-miR-214 (in -50% kloonien) sekä haplotyyppi A-7G varten pri-miR-122 (in -30% of kloonit).

ADAR2 Korkeus korreloi nukleotidi- spesifeissä jäämiä Pri-miRNA HCC kudokset

Seuraavaksi tutkimme jos ADAR2-meditated toistuvia nukleotidin muutoksia tunnistettu Huh-7-soluissa tapahtui myös kliinisistä näytteistä. CDNA: 20 paria HCCs ja niiden vastaavat viereisen nontumorous kudosta analysoitiin suoralla sekvensoinnilla niiden RT-PCR-tuotetta ensisijainen selostukset pri-miR-122 ja pri-miR-214. Kolme HCC kudosten osoitti selkeän nukleotidin muutokset (Fig. 2, potilas ei. 11, 13, ja 20), jossa on U-to-C muutokset -37 ja -28 sekä pri-miR-214 (Fig. 2A, paljastuu to-G muutokset sekvensointi käänteinen aluke), ja A-to-G muutos -7 pri-miR-122 (Fig. 2B, paljasti A-to-G muutokset sekvensointi eteenpäin aluke) . Tällaisia ​​muutoksia ei esiintynyt PCR-tuotetta genomisen DNA: n saman HCC kudokset (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista on, että nämä nukleotidin muutokset olivat samat kuin suurimpien tunnistettu ADAR2-yli-ilmentyy Huh-7-solut (Fig. 1 D, 1 E), joka tukee näitä muokkaus tapahtumat voivat esiintyä myös kliinisistä näytteistä. Huomionarvoista oli se, että nämä erityiset nukleotidin muutokset tapahtui pääasiassa kasvaimissa, mutta vähän viereisen nontumorous kudosten näistä potilaista (kuvio. 2A ja 2B, NT vs. T), mikä viittaa siihen, tämä tapahtuma edullisesti esiintyy kasvaimia.

edustaja sekvensointi tulokset miR-214 (A) ja miR-122 (B), RT-PCR-tuotteiden neljä paria HCC kudosten kuten on osoitettu. Nukelotiditähteet muutosten kanssa tumorous (T) kudokset, verrattuna niihin vastaaviin nontumorous (NT) kudokset, on merkitty punaisella nuolilla. Kantoja suhteessa, että kypsän miRNA on merkitty yllä nuolilla. (C) suhteellinen ilmentymistaso ADAR2 mRNA näissä HCC kudoksissa määritettiin qPCR-analyysi, jossa määrällisten tulosten esitetty suhteessa tasoon NT osa potilaalla ei. 8. (D) proteiini ilmentymistä ADAR2 ja ADAR1 nämä neljä paria HCC kudoksissa tutkittiin Western-blottauksella.

Koska meidän

in vitro

tutkimukset osoittivat, että nämä nukleotidin muutokset voi johtua ADAR2 yli-ilmentyminen, tutkimme mikäli ADAR2 kohosi HCC esittävät tiettyjä nukleotidin muutoksia. Ilmaus tasot RNA ja proteiini ADAR2 näissä kolme paria HCCs tutkittiin qPCR ja Western blot, jossa on yksi pari HCCs ilman nukleotidi muuttuu, kun ohjaus (potilas ei. 8). Sekä RNA: n ja proteiinin tasot ADAR2 olivat koholla merkittävästi HCC kudoksissa nämä kolme potilasta, mutta ei kontrolli tapauksessa (Fig. 2C, 2D). Tulokset viittasivat siihen, että ADAR2-välitteisen RNA: n editointia tapahtumia voi ilmetä myös osajoukko HCC, joka on hyvin liittyy lisääntyneen ilmentymisen ADAR2.

muokkaus RNA-transkriptien täydentävät RNA-transkriptit Pri-asennuspalveli- 214 ja Pri-miR-122

on hyvin dokumentoitu, että RNA muokkausta ADAR2 lähinnä aiheuttaa A-to-I /(G) muuttuu [8]; mutta useimmat nukleotidin muutosten tunnistimme varten pri-miR-214 ja pri-miR-122 esiasteiden ADAR2-yli-ilmentyy Huh-7-solut U-to-C muutokset, lukuun ottamatta yhtä paikassa -7 miR-122 (kuvio . 1D ja 1E). Koska tällaisia ​​epätavallisia U-to-C muutokset ovat komplementaarisia odotettavissa A-to-G muutoksia, ehdotimme mahdollisuutta, että ADAR2-välitteinen A-to-I muokkaus voi tapahtua RNA-transkriptien komplementaarinen nämä kaksi pri-miRNA.

tämän mahdollisuuden testaamiseksi, otimme lähestymistapa yli-ilmentävät joko pri-miR-214 /pri-miR-122 (sense) tai niiden täydentävä RNA-transkriptien (antisense) in Huh-7-solut yksinään, yhdessä yliekspressioon ADAR2. Tällainen suunnittelu voi auttaa erottamaan editointi tapahtumia joko pri-miRNA tai täydentävää antisense selostukset. Alla yli-ilmentyminen joko transkriptien sekä pri-miRNA ( 50-kertainen, paljasti qPCR-analyysi), olemme havainneet, että ADAR2 voivat aiheuttaa U-to-C muuttuu vain soluissa, jotka yliekspressoivat komplementaarinen antisense-transkriptit (Fig. 3A, -28 ja -37 AS Mir-214; Fig. 3B, +57 AS Mir-122) .Vuonna sijaan A-to-G muutoksia havaittiin vain solujen yliekspressoivat pri-miR-122 ( Fig. 3B, -7 S Mir-122). Tämä tukee että havaittu U-to-C muutokset voivat johtua ADAR2 välittämää A-to-I muokkaamalla että RNA-transkriptien komplementaarinen sekä pri-miRNA. Nämä muutokset eivät tapahdu infektoiduissa soluissa lenti-ADAR1S tai lenti-ADAR1L, mikä tukee näiden tapahtumien muokkaamista välittyvän ADAR2.

Huh-7-solut transfektoitiin plasmidi, jotka ilmentävät joko sense (S) tai täydentäviä antisense (AS) selostukset pri-miR-214 (A) ja pri-miR-122 (B), ja sen jälkeen tartunnan lenti-ADARs kuten. RNA uutettiin kustakin solusta valmistelu RT-PCR ja sen jälkeen suora sekvenssianalyysi. Tulokset kuvassa edustavat keskittyen alueisiin, jotka kattavat tähteet tunnistettiin suuret editointi sivustoja (kuten kävi ilmi kuvassa 2), kuten -37 ja -28 varten pri-miR-214 ja -7 ja +57 varten pri-miR -122 (merkitty nuolilla). Nukelotiditähteet osoittaa editointi tapahtumia on merkitty punaisella tähdellä.

Koska yleisiä RT-PCR ja sekvenssianalyysi käytimme edellä ei pysty erottamaan muokkausta tapahtumiin sense tai antisense selostukset. Olemme siis yrittäneet tarkistaa tiettyjä A-to-I editointi on antisense selostukset pri-miR-214 juostespesifisen RT-PCR ja sekvenssianalyysi. RNA uutettiin kolmesta HCC koholla ADAR2 (Fig. 2, potilaat 11, 13 ja 20) käsiteltiin ja juostespesifisen RT-PCR: llä, monistamaan ensisijainen transkriptien näiden kahden pri-miRNA sekä niiden täydentävät antisense-transkriptien sekvensointia varten. Huomattavaa on, että vuonna neuroblastoomasoluja, Loebel et al. on jo todettu, että geeni, joka koodaa miR-214 sijaitsee sisällä ei-koodaavan 7,9 kb: n transkriptin komplementaarisia introni alueelle liikkeellepaneva voima-3 (DNM3), välillä eksonin 12 ja 13 tämän geenin (Fig. 4A) [18]. Apunaan kaksi tietokantaa, GeneMark ja GENSCAN, lyhyt transkripti komplementaarinen miR-122 on ennustettu (Fig. 4B).

Kaaviokuva geenin rakenteiden RNA-transkriptien komplementaarinen (A) yksi- miR-214 ja (B) pri-miR-122. (C) Edustavat tulokset sekvensointi säikeen-erityinen RT-PCR-tuotteiden HCC jossa on mahdollinen muokkaus tapahtumia siinä mielessä (S) ja antisense (AS) selostukset pri-miR-214 ja pri-miR-122, keskittyen alueet kattavat sivustoja potentiaalisten editointi tapahtumia editointi merkitty punaisella tähdellä.

sekvensointi tulokset osoittivat, että tapahtumien muokkaamista pääasiassa tapahtui selostukset täydentävät pri-miR-214 mutta ei sense selostukset näihin HCC näytteistä (Fig. 4C, vasen paneeli, -28 ja -37 sekä pri-miR-214). Se tukee että ADAR2 välittämää U-to-C muutokset saattavat johtua A-to-I muokkaamalla täydentävistä selostukset pri-miR-214 kliinisistä näytteistä. Sen sijaan, editointi tapahtuma sivustojen A-to-G kuvion pääasiassa tapahtui mielessä transkriptio näissä HCC (Fig. 4C, oikea paneeli, -7 pri-miR-122).

ADAR2 -välitteisen muokkaaminen RNA Transcript täydennykseksi Pri-miR-214 Toiminnallisesti vaikuttaa kohdegeenin Mir-214

seuraava kysymys on tutkia toiminnallinen vaikutus ADAR2 välittämän editointi on biogeneesin näiden kahden miRNA. Ensin keskittyä miR-214, vaikutusta ADAR2 ilmentymisen vaikutus miR-214 sekä sen esiasteiden analysoitiin Huh-7-soluissa, solujen kanssa, jotka yliekspressoivat ADAR1S ja ADAR1L sisältyvät kontrolleina. Endogeeninen miR-214 aleni merkittävästi yliekspressio ADAR2 muttei ADAR1S ja ADAR1L (Fig. 5A, vasen paneeli). Sekä pri-miR-214 ja täydentävät antisense (AS) RNA-transkriptien (endogeenisiä) myös laskivat yliekspressio ADAR2 (Fig. 5A, keskimmäinen ja oikea paneeli).

(A) RNA uutetaan Huh -7 infektoidut solut yksittäisten lenti-ADARs kuten käytettiin tasojen arviointi endogeenisen miR-214 (vasemmalla), pri-miR-214 (keskellä), ja täydentäviä antisense- transkriptio miR-214 (yhd-AS-RNA ) (oikealla). (B) Yksittäiset lenti-ADARs infektoitiin ja Huh-7-soluissa, jotka oli jo transfektoitu plasmideilla eksogeenisesti ilmentävät joko pri-miR-214 tai täydentävät antisense-transkriptin (yhdiste-AS-RNA), kuten on ilmoitettu. RNA uutettiin ja kvantifiointiin molempien transkriptien tasot vastaavasti. (C) Huh-7-solut transfektoitiin plasmidilla, jotka ekspressoivat villityypin comp-AS-RNA: ta tai ne otetaan käyttöön joko yksittäinen mutaatio A (-37) G tai kahden mutaatioita A (-37 /-28 ) G. Tasot antisense-transkriptin määritettiin sitten qRT-PCR: llä. (D) Huh-7-solut eivät ole saastuneita (mock), infektoitu lenti-si-GFP (si-GFP), tai jotka ovat saaneet lenti-si-AS-214, joka on suunnattu RNA-transkriptin täydentävät pri-miR -214, arvioimiseksi vaikutuksia ekspressiotasot comp-AS-RNA (vasemmalla), pri-miR-214 (keskellä), ja miR-214 (oikealla). (E) Minkään Huh-7-solut transfektoitiin kontrollivektorilla tai ekspressoivan plasmidin comp-AS-RNA: ta, voidaan arvioida vaikutus tasot comp-AS-RNA: ta (vasemmalta), pri-miR-214 (keskellä) ja kypsä miR-214 (oikealla). (F) proteiini lysaatit uutetaan Huh-7-soluissa infektoimattomiin tai infektoitu lenti-si-Luc tai lenti-pri-miR214 analysoitiin Western blotting-analyysi (vasemmalla). Huh-7-solut transfektoitu pGL3-vektorin tai pGL3-Rab15-3’UTR reportterikonstrukteja tartutettiin lenti-si-GFP tai lenti-pri-miR214. Vaikutus reportteriaktiivisuutta havainnollistettiin suhteessa kuin pGL3-vektorin-transfektoidut solut infektoitiin lenti-si-GFP (keskellä). Proteiini lysaatit uutetaan Huh-7-soluissa joko infektoimattomia tai infektoitiin eri lentivirukset, kuten on kuvattu käsiteltiin Western blotting, koettimena vasta-aineita Rab15, ADAR1, ADAR2, ja β-aktiini (oikealla).

tutkia edelleen muokkausta vaikutukset kunkin transkriptio erikseen, PRI-miR-214 ja täydentävät antisense-transkriptit yliekspressoituvat Huh-7-solut erikseen, yhdessä yksittäisten ADARs. Vain täydentävä RNA-kopion väheni ADAR2 (Fig. 5B, vasen paneeli). Johdanto A-to-G muutokset asemissa -28 ja -37 täydentävien transkriptin vähentäessä RNA tasolla, samanlainen kuin aiheuttama yliekspressio ADAR2 (Fig. 5C). Näin ollen osoitettiin, että ADAR2 voi aiheuttaa vähentäminen RNA-transkriptin täydentävät pri-miR-214 kautta A-to-I muokkaamalla sen erityisestä jäämiä -28 ja -37 kantoja.

Kuten huomata , ei ole suoraa vaikutusta ADAR2 on yliekspressoitu pri-miR-214 (kuvio. 5B, oikea paneeli, kaista 4), mutta joka ei aiheuta laskua endogeenisen pri-miR-214 (Kuva. 5A, keskimmäinen paneeli, kaista 4). Se nosti esiin mahdollisuuden, että ADAR2 editointi aiheutti laskua täydentävän transkriptin, joka puolestaan ​​vähensi RNA-transkriptin pri-miR-214. Tilanteen korjaamiseksi, me pudotti RNA-transkriptin täydentävät pri-miR-214 Huh-7-soluissa (kuvio. 5D, vasen paneeli), mikä johti laskua pri-miR-214 (Fig. 5D, keskimmäinen paneeli) . Positiivinen sääntelyn vaikutus täydentävän transkriptio tasosta pri-miR-214 oli siten osallisena. Tämän mukaisesti, yliekspressio täydentävät antisense-RNA lisäsi sekä pri-miR-214 ja kypsä miR-214 (Kuva. 5E).

tarkastella edelleen toiminnallinen vaikutus ADAR2 välittämän editointi tapahtuma kohdegeeni miR-214, yritimme ensin tunnistaa sen otaksuttu kohdegeenin hepatosyyteissä. PicTar, TargetScan, ja Miranda algoritmit muistutti Rab15, jäsen RAS onkogeeni perhe, koska otaksuttu miR-214 kohdegeenin. Tämän testaamiseksi me yli-ilmentynyt miR-214 Huh-7-soluissa infektion lenti-pri-miR-214 lentiviruksien, joka pienensi tason Rab15 proteiinia (kuvio. 5F, vasen paneeli). Infektio Lenti-pri-miR-214 voi myös tukahduttaa pGL3-Rab15-3’UTR lusiferaasireportteri aktiivisuutta (kuvio. 5F, keskimmäinen paneeli), joka tukee että miR-214 voi tukahduttaa ilmaisun Rab15 kohdistamalla sen 3’UTR. Lisäksi yliekspressio ADAR2, mutta ei ADAR1S ja ADAR1L, aiheutti kasvua Rab15 (Fig. 5F, oikea paneeli), mikä viittaa siihen, että ADAR2 välittämä editointi tapahtuma on toiminnallinen teho kohde geenin miR-214.

RNA Transcript täydentävän Pri-miR-122 Säätelee Expression taso miR-122

samanlainen analyysi miR-214 sovellettiin myös puuttua vaikutus ADAR2-välitteisen muokkaus miR-122. Ensimmäinen vaikutus yksittäisten ADARs kypsien miR-122 arvioitiin HepG2-soluissa, mutta se ei näytä merkittäviä vaikutuksia (Fig. 6A). Johdanto A-to-G mutaation -7 asemaan pri-miR-122 transkriptio, suuret muokattu sivusto, ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia tason miR-122 (Fig. 6B). Siksi ADAR2 välittämä muokkaukseen pri-miR-122 transkriptin ei vaikuttanut sen biogeneesin prosessi.