Krooninen sairaus

tiivistelmä

HEPARANASE (HPA), endo-HD-glucuronidase että pilkkoo heparaanisulfaattiproteoglykaani ketju heparan sulfaatti proteoglykaaneille yliekspressoituu useimmissa ihmisen syövissä. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että Sirna (siRNA) indusoi transkription geenien (TGS) ihmisen soluissa. Tässä tutkimuksessa transfektoimalla siRNA vastaan ​​-9 /+ 10 bp (siH3), mutta ei -174 /-155 bp (siH1) tai -134 /-115 bp (siH2) alue suhteessa transkription aloituskohdasta (TSS) paikantaminen 101 bp ylävirtaan translaation aloituspaikasta, johti TGS on heparanaasin ihmisen eturauhassyöpä, virtsarakon syöpä, ja mahalaukun syövän solujen sekvenssi-spesifisellä tavalla. Metylaatiospesifinen PCR ja bisulfiitti sekvensointi ei paljastanut mitään DNA: n metylaatio CpG saarten heparanaasin promoottorin siH3-transfektoiduissa soluissa. TGS on HEPARANASE ei aiheuta muutoksia epigeneettiset merkkiaineiden histoni H3 lysiinin 9 dimetyloimalla (H3K9me2), histoni H3 lysiinin 27 trimethylation (H3K27me3) tai aktiivinen chromatin markkeri asetyloitua histoni H3 (AcH3). Sääntely vaihtoehtoisen silmukoinnin ei ollut mukana siH3 välittämän TGS. Sen sijaan, siH3 häiritsi transkription aloittamisen kautta vähentää sitoutumista sekä RNA-polymeraasi II: n ja transkriptiotekijä II B (TFIIB), mutta ei sido transkriptiotekijöiden SP1 tai varhaisen kasvun vastetta 1, on heparanaasin promoottori. Lisäksi Argonaute 1 ja Argonaute 2 helpottanut laski RNA-polymeraasin sitoutumisen II ja TFIIB on heparanaasin promoottorin, ja oli tarpeen, siH3 aiheuttama TGS of heparanaasin. Vakaa transfektio lyhyt hiusneula-RNA konstruktio kohdistaminen heparanaasin TSS (-9 /+ 10 bp) otetaan syöpäsoluja, johti vähentynyt proliferaatio, invaasio, etäpesäke ja angiogeneesiä syöpäsolujen

in vitro

ja kateenkorvattomissa hiirissä malleissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että pienet RNA: t kohdistaminen TSS voi aiheuttaa TGS of heparanaasin kautta häiriöitä transkription aloitusta, ja merkittävästi tukahduttaa kasvaimen kasvua, invaasio, etäpesäke ja angiogeneesiä syöpäsolujen.

Citation: Jiang G, Zheng L, Pu J, Mei H, Zhao J, Huang K, et ai. (2012) Pieni RNA: iden kohdistaminen transkription aloituskohdasta Pakotettava HEPARANASE hiljentäminen häiritsemällä transkription aloitus- Human Cancer Cells. PLoS ONE 7 (2): e31379. doi: 10,1371 /journal.pone.0031379

Editor: Sebastien Pfeffer, Ranskan National Center for Scientific Research – Institut de biologie Moleculaire et Cellulaire, Ranska

vastaanotettu: toukokuu 23, 2011; Hyväksytty: 06 tammikuu 2012; Julkaistu: 20 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30200284, No. 30600278, No. 30772359, No. 30972980, No. 81071997, nro 81072073), Program New Century Excellent Talents in University (NCET-06-0641) , Scientific Research Foundation varten Palautettu Overseas Chinese Scholars (2008-889), ja perustutkimus rahastoja Keski yliopistot (2010JC025). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

HEPARANASE on endo-HD-glukuronidaasia, jolla on kyky pilkkoa heparaanisulfaattiproteoglykaani ketjun heparaanisulfaattiproteoglykaanit [1], ja helpottaa ja metastaasit tuumorisolujen huononi tyvikalvon (BM) ja soluväliaineen esteet [2]. Heparanaasin edistää myös angiogeneesiä vapauttamalla ja aktivoimalla erilaisia ​​heparaanisulfaatista sitovat kasvutekijät [3], [4]. Lisäksi korkea ilmentyminen heparanaasin havaitaan usein yhä useamman ensisijaisen ihmisen kasvaimissa, kuten eturauhasen, virtsarakon syöpä ja mahasyöpä, ja HEPARANASE-helpotti invaasiota ja etäpesäkkeiden aiheuttaa huono tuloksia syöpäpotilailla [5] – [8] . Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että heparanaasin voidaan toimi molekyylikohteena syövän hoidossa.

hiljentäminen geenin ilmentymisen käyttäen pieniä häiritseviä RNA: n (siRNA) on potentiaalinen strategia terapeuttisen tuotteen kehittämiseen [9]. Lisäksi posttranskriptionaalisella geenien monenlaisia ​​organismeja, siRNA voi olla vuorovaikutuksessa DNA-metyylitransferaasin 3A (DNMT3A) ja suora transkription geenien (TGS) ihmisen soluissa [10]. Promoottori kohdistetut siRNA indusoi CpG-saarekkeen metylaation ubikitiinipromoottori C-geenin [11], ihmisen immuunikatovirus tyyppi 1 pitkää terminaalista toistoa [12], Ras yhdistys domain perhe 1A [13], ja interleukiini-2 [14] ihmisen soluissa. Lisäksi eksogeeniset siRNA laukaista TGS ihmissoluissa kautta heterochromatin muodostumisen kohdepromoottorin, joihin rekrytointi kromatiinin-modifioivia entsyymejä johtavan dimetyloimalla histoni H3 lysiinin 9, trimethylation histoni H3 lysiinin 27, ja histoni deasetylaatiolla [10], [11], [12]. Lisäksi, siRNA: t kohdistuvat introni tai eksonisekvenssit lähellä vaihtoehtoista eksoni voi lisätä dimetylaatio histoni H3 lysiinin 9 ja trimethylation histoni H3 lysiinin 27 kohdepaikassa, jolloin erilaisesta silmukoitumisesta, että eksonin [15]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että siRNA vaikuta ainoastaan ​​transkriptio vaan myös silmukoinnin prosessi kohdegeenin, mikä toteuttamiskelpoinen lähestymistapa kehittää geenispesifisiin terapeuttisia.

transkription aloituspaikkoja (TSS) ovat välttämättömiä kytkimiä muuntaa tunnustamista DNA genomin aktiivinen synteesi RNA-kopioiden [16]. Vlodavsky

et al

. tunnistettu TSS on heparanaasin geenin nukleotidiasemaa 99 bp ylävirtaan translaation aloituspaikasta (ATG) perinteisen nopean cDNA-päiden monistamisen (RACE) määritys [17]. Käyttämällä modifioitua RLM-RACE-menetelmää selektiivisesti monistaa DNA-fragmentti rajattu täyspitkä mRNA, Jiang

et ai

. raportoitiin tarkka TSS 101 bp ylävirtaan ATG [18]. Vaihtoehtoinen suurempi HEPARANASE transkriptio on myös todettu ihmisen immuunijärjestelmä kuitenkin tarkka sijainti ja ylävirran promoottori sen TSS edelleen suureksi osaksi tuntemattomia [19] – [21]. Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, että pieni RNA: t kohdistaminen heparanaasin TSS paikantaminen on 101 emäsparia ylävirtaan translaation aloituspaikasta [18], mukaan lukien siRNA ja lyhyt hiusneula-RNA (shRNA), indusoi TGS on heparanaasin kautta häiritsee transkription aloitusta, mutta ei läpi asiakkuutta heterochromatin muodostumista tai epigeneettiset muutokset, ja heikennettyjä leviämisen, invaasio, etäpesäke ja angiogeneesiä erilaisten syöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

.

tulokset

siRNA aiheuttama TGS of heparanaasin

tutkia siRNA voi aiheuttaa TGS of heparanaasin, me suunniteltiin ja syntetisoitiin kolme siRNA kohdistaminen TSS (paikantaminen on 101 bp ylävirtaan ATG) tai useampi ylävirran alueiden heparanaasin promoottori, -174 /-155 (siH1), -134 /-115 (siH2), ja -9 /+ 10 bp (siH3) (Fig. 1A ja kuvio. S1). SiRNA kohdistaminen koodaavan alueen + 1496 /+ 1515 ep (SiH4) levitettiin kontrollina (Fig. 1A). Solulinjat yleisimpien ihmisen syövissä, mukaan lukien eturauhassyöpä (PC-3), virtsarakon syöpä (EJ) ja mahasyövän (SGC-7901), valittiin malleina tässä tutkimuksessa. Transfektio siH3 ja SiH4, mutta eivät siH1, siH2 tai negatiivinen kontrolli siRNA (sinc), heikennetty HEPARANASE ilmentymistä PC-3, EJ ja SGC-7901-soluissa (kuvio. 1 B). Lisäksi transfektio siH3, mutta ei sinc tai salattu siRNA (siSCb), poistettiin transkription ja translaation tasoja heparanaasin annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1C). SiH3 aiheuttama vaiennettu heparanaasin kesti 5 vrk, ja osittain talteen päivänä 7 (Fig. 1 D). Transfektio siM31 ja siM32 kaksi paritonta siRNA: t ja siH3, ei poistaa heparanaasin ilmentymistä (Fig. 1 E), jotka osoittavat, että häiriö toteutettiin siH3 sekvenssissä-riippuvaisella tavalla. Epäonnistuminen siM32 estävän transkription ilmoitti myös, että osittaista komplementaarisuutta 5′-päähän mRNA ei riittänyt heparanaasin hiljentäminen (Fig. 1 E). DNA-dupleksit analoginen siH3 ei estänyt ilmaisua, mikä osoittaa, että tunnustus on välittämä RNA (Fig. 1 E). Promoottori reportteri-lusiferaasi testi osoitti, että transfektion siH3, mutta ei siScb, siM31 tai siM32, tukahdutti heparanaasin promoottorin aktiivisuutta ja transkription (Fig. 1 F), mikä viittaa siihen, että alennettu heparanaasin ilmaisu johtui transkription inhibition siH3. Lisäksi ilmaisu ei-alavirran geenien heparanaasin, proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA) ja sykliini D1, ei vaikuttanut transfektoimalla siH3 (Fig. S2). Nämä tulokset osoittivat, että siH3 valikoivasti kohdennettua TSS ja aiheuttama TGS of heparanaasin sarjana-erityisellä tavalla ihmisen syöpäsoluja.

, järjestelmä siRNA: iden kohdistaminen TSS (paikantaminen on 101 emäsparia ylävirtaan translaation aloituspaikasta) ylävirtaan promoottori ja koodaus alueilla heparanaasin, kuten siH1 (-174 /-155 ep), siH2 (-134 /-115 ep), siH3 (-9 /+ 10 emäsparia) ja SiH4 (+ 1496 /+ 1515 ep). Automatisoitu nukleotidin perus paikallinen linjaus hakuvälineenä (BLAST) haut osoittivat, ettei järjestyksessä samanlainen siH1, siH2 tai siH3 transkriboidussa sekvenssi heparanaasin. B, 72 tuntia transfektion siRNA: iden kohdalla PC-3, EJ ja SGC-7901-solut, 100 nmol /l siH3 tai SiH4, mutta ei siH1, siH2 tai sinc, vaimensi heparanaasin ilmentymistä syöpäsoluissa. C, 72 tuntia transfektion jälkeen ja siH3, mutta ei sinc tai siScb, johti poistetun heparanaasin ilmentymistä syöpäsoluissa annoksesta riippuvalla tavalla. D, siH3 (100 nmol /l) aiheuttaman geenien of heparanaasin syöpäsoluissa kesti enintään 5 päivää, ja osittain kunnostettu 7. päivänä E, 72 tuntia transfektion 100 nmol /l DNA-dupleksit analogisia siH3, siM31 tai siM32 (kaksi paritonta siRNA of siH3), ei poistanut HEPARANASE ilmentymistä syöpäsoluissa. F, dual-lusiferaasireportteri määritys osoitti, että 72 tuntia transfektion jälkeen ja siH3, mutta ei siScb, siM31 tai siM32, tukahdutti heparanaasin promoottorin aktiivisuutta ja transkription syöpäsoluissa. Symbolit (# ja Δ) osoittavat merkittävää vähenemistä transfektoimattomista ohjaus (mock) ja merkittävä kasvu pGL3 /Basic, vastaavasti.

siRNA inhiboivan transkription aloittamisesta heparanaasin

koska TGS liittyy epigeneettisellä muutoksia promoottori, kuten DNA: n metylaatio, histoni metylaatio, ja histoni deasetylaatiolla [10], [11], [12], ensin analysoidaan epigeneettisenä aseman ylävirran alueiden heparanaasin promoottori. CpG-saaret olivat metyloitumattomia transfektoimattomissa PC-3, EJ ja SGC-7901-solujen (vale), ja ne, jotka on transfektoitu sinc (tuloksia ei ole esitetty). Transfektion siH1, siH2 tai siH3, ei indusoinut metylaatio CpG-saarekkeiden ja heparanaasin promoottorin syöpäsoluissa (Fig. 2A ja Fig. 2B). Ilmaisu ja DNA: ta sitova histoni H3 lysiinin 9 dimetyloimalla (H3K9me2) ja histoni H3 lysiinin 27 trimethylation (H3K27me3) on HEPARANASE promoottori, kaksi tukahduttavaa epigeneettiset merkkien mukana TGS [10], ei muuttanut heti transfektion siH2, siH3, SiH4 tai siScb (Fig. S3 ja Fig. 2C). Lisäksi sitova asetyloitua histoni H3 (AcH3), merkkiaine transkriptionaalisesti aktiivisen kromatiinin [22], ei ollut vaikutusta transfektoimalla nämä siRNA (Fig. 2C). Samaan aikaan, ei ollut PCR-tuotteiden ”ei-vasta-aine” ohjaus kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) määritys (Fig. 2C). Sitoutuminen H3K9me2 ja H3K27me3 rikastettiin sen promoottorin transkriptionaalisesti vaiennettu geenien p16 ja retiinihapporeseptorin beeta-2 (RARβ2) [23], verrattuna, että heparanaasin promoottorin PC-3-solut (Fig. 2D), ja sitova of AcH3 on HEPARANASE promoottori huomattavasti sen jälkeen, kun pannu histonideasetylaaseja (HDAC) estäjä trikostatiini A (TSA) käsittely (Kuva. 2E), vahvistaa riittävyyttä siru määritysolosuhteissa. Lisäksi hoidossa syöpäsolujen kanssa DNMT estäjän 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-CDR) tai TSA ei vaikuttanut heparanaasin vaiennettu, mikä osoittaa, että DNMTs ja HDAC oli todennäköisesti mukana tässä prosessissa (Fig. 2F). Lisäksi ChIP määritys paljasti mitään muutoksia sitoutumiseen transkriptiotekijöiden varhaisen kasvun vaste 1 (EGR1) ja SP1 HEPARANASE promoottorialueen ympäröivä siH3 kohdistetun sivuston, sulkee pois niiden potentiaali roolit siH3 aiheuttama TGS of heparanaasin (Fig. 2G). Kuitenkin, vähentynyt RNA-polymeraasin sitoutumisen II (RNA Pol II) on heparanaasin promoottorin todettiin siH3-transfektoiduissa soluissa, mutta ei siH2-, siH4- tai siScb-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 2H). Lisäksi sitova transkriptiotekijä II B (TFIIB), joka ohjaa RNA Pol II ytimen promoottori, on myös pienentynyt siH3-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 2H). Sirudata RNA Pol II tai TFIIB sitoutuminen varmistettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR (qPCR) alukkeilla ulottuu TSS (Fig. 2 H). Vähentynyt RNA Pol II tai TFIIB sitoutuminen nähtiin jopa 7 päivää transfektion jälkeen (kuvio. 2I). Lisäksi, suhteellinen osallisuus-to-syrjäytymisen suhde ensimmäisen eksonin heparanaasin, joka oli vaihtoehtoinen eksoni lähellä siH3 kohdistetun päällä, ei muuttanut transfektion jälkeen siH2, siH3, SiH4 tai siScb syöpäsoluissa (Fig. 2J ), mikä viittaa siihen, että sääntely vaihtoehtoisen silmukoinnin ei ollut mukana siH3 välittämän TGS. Nämä tulokset osoittivat, että transkription aloittamisesta heparanaasin oli häirityiksi siH3 kohdentamalla TSS.

A ja B, bisulfiitti sekvensointi ja MSP paljasti, että transfektio siRNA: iden (100 nmol /l), siH1, siH2 ja siH3, ei indusoivat metylaatio CpG saarten heparanaasin promoottorin syöpäsoluissa. C, 72 tuntia transfektion, siru erilliset alukesarjoista osoitti, että ei ollut PCR-tuotteiden ”ei-vasta-aine” (nro Ab) ohjaus, ja sitoutuminen H3K9me2, H3K27me3 ja AcH3 päälle HEPARANASE promoottori ei muuttunut transfektion jälkeen of siH2, siH3, SiH4 tai siScb syöpäsoluissa. D, The sitoutuminen H3K9me2 ja H3K27me3 rikastettiin on promoottori p16 ja RARβ2 verrattuna, että heparanaasin promoottorin PC-3-soluissa, vastaavasti. E, hoito siH3- tai siScb transfektoitiin syöpäsolujen TSA (200 nmol /l), johti merkittävään kasvuun sitoutuminen AcH3 on heparanaasin promoottorin, verrattuna niihin, käsiteltiin DMSO liuotinta ohjaus. F, syövän solut transfektoitiin siRNA: illa ja käsiteltiin 5-atsa-CDR (5 umol /l) tai TSA (200 nmol /l), mikä ei muutoksia siH3 aiheuttama heparanaasin hiljentäminen. G, 72 tuntia transfektion jälkeen, ChIP määritys osoitti, että sitoutuminen SP1 ja EGR1 on heparanaasin promoottori, ei muuttanut transfektion jälkeen siH2, siH3, SiH4 tai siScb syöpäsoluissa. H, ChIP määrityksessä erilliset alukesarjat osoitti laski sitoutumisen RNA Pol II ja TFIIB on heparanaasin promoottorin siH3-transfektoiduissa syöpäsolut, mutta ei siH2- tai SiH4-transfektoiduissa soluissa. I, siru määritys osoitti, että vähentynyt RNA Pol II tai TFIIB sitoutuminen nähtiin toistettavasti ja korkeintaan 7 vuorokautta transfektion of siH3 syöpäsoluissa. J, qRT-PCR havaitseminen osoitti, että suhteellinen sisällyttäminen-to-syrjäytymisen suhde ensimmäisen eksonia heparanaasin ei muuttanut transfektion jälkeen siH2, siH3, SiH4 tai siScb syöpäsoluissa. Symboli (#) todetaan merkittävä lasku transfektoimattomista ohjaus (mock) tai siScb. Symboli (▴) osoittaa merkittävää kasvua päässä sitovia heparanaasin promoottori. Symboli (Δ) osoittaa merkittävää kasvua DMSO ohjaus.

osallistuminen Ago1 ja Ago2 in siH3 aiheuttaman transkription inhibition heparanaasin

Koska aikaisemmissa tutkimuksissa osoitettu osallistuminen RNA interferenssin (RNAi) koneita TGS, olemme edelleen tutkitaan vaikutuksen Argonaute 1 (Ago1) ja Argonaute 2 (Ago2), kaksi erottamaton osa RNAi-reitin [24], [25], on siH3 aiheuttama TGS of heparanaasin. Kuten on esitetty kuviossa. 3A ja kuvio. 3B, kaatamalla ja Ago1 tai Ago2 tukahdutti siH3 aiheuttama TGS of heparanaasin. Lisäksi transfektoimiseksi siH3, mutta ei siScb, lisäsi yhdistys Ago1 ja Ago2 päälle HEPARANASE promoottori, joka oli vastaavasti kumottu kaatamalla of Ago1 ja Ago2 (Fig. 3C ja kuvio. 3D). Lisäksi, Ago1 tai Ago2 hiljentäminen lisäsi sitovat RNA Pol II ja TFIIB on heparanaasin promoottorin, kun taas transfektio sinc ei ollut mitään vaikutusta (kuvio. 3E). Nuclear run-on määrityksessä osoitti lisäksi, että alkupään puhtaaksi mRNA (joka sisältää eksoni 1) esitteli alhaisella tasolla verrattuna koko heparanaasin mRNA, ja transfektointi siH3 vaimenee orastavan transkriptio yhteensä heparanaasin mRNA, mutta ei mRNA aloitetaan alkupään vaihtoehtoisia TSS , joka palautti myös lakkauttamalla on Ago1 tai Ago2, mikä osoittaa, että alennettu heparanaasin ilmaus johtui estoa transkriptio aloitetaan loppupään TSS (Fig. 3F). Nämä tulokset osoittivat, että Ago1 ja Ago2 olivat välttämättömiä siH3 aiheuttaman transkription inhibition heparanaasin ihmisen syöpäsoluja.

A ja B, kaatamalla ja Ago1 tai Ago2 palautti siH3 aiheuttama TGS ja heparanaasin syöpäsoluissa, vastaavasti. C ja D, siru määritys osoitti, että 72 tuntia transfektion of siH3, mutta ei siScb, yhdistyksen Ago1 ja Ago2 päälle HEPARANASE promoottori kasvoi syöpäsoluissa, mikä poisti kaatamalla of Ago1 ja Ago2, vastaavasti. E, ChIP määritys osoitti, että hiljentäminen Ago1 tai Ago2 palautettu sitoutumisen RNA Pol II ja TFIIB on heparanaasin promoottorin syöpäsoluja. F, ydin- run-on määritys osoitti, että alkupään puhtaaksi mRNA (joka sisältää eksoni 1) esitteli alhaisella tasolla verrattuna koko heparanaasin mRNA, ja orastavaa transkriptio yhteensä heparanaasin mRNA, mutta ei mRNA aloitetaan alkupään vaihtoehtoisia TSS, väheni jälkeen transfektointi siH3 osaksi syöpäsolujen 72 tuntia, joka palautettiin kaatamalla of Ago1 tai Ago2. Symbolit (# ja Δ) osoittavat merkittävää vähenemistä ja merkittävään kasvuun päässä siScb vastaavasti. Symboli (*) todetaan merkittävä laskua SINC.

RNAi koneet vuorovaikutuksessa epäsuorasti transkriptio preinitiation monimutkainen siH3 aiheuttama TGS of heparanaasin

Koska viime näyttöä monimutkainen vuorovaikutus RNAi koneet ja RNA Pol II heterochromatic hiljentämisen

Drosophila

[26], oletamme, että Ago1 tai Ago2 voi suoraan vuorovaikutuksessa RNA Pol II tai TFIIB osallistua siH3 aiheuttama TGS of heparanaasin. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [27], [28], samanaikainen immunosaostus analyysi osoitti, että RNA Pol II vuorovaikutuksessa TFIIB viljellyissä soluissa. Transfektio siH3 ei vaimentanut vuorovaikutus RNA Pol II ja TFIIB (Fig. 4A). Kuitenkin, anti-RNA Pol II tai anti-TFIIB vasta-aineet eivät co-immunoprecipite Ago1 tai Ago2 peräisin siH3-transfektoiduista soluista (kuvio. 4A), joka edelleen osoittaa samanaikainen immunosaostus analyysi avattavasta anti-Ago1 tai anti -Ago2 vasta-aineita (Fig. 4B). Yhdistämällä edellä näyttöä siitä Ago1 ja Ago2 vaikutti sitovan RNA Pol II ja TFIIB on heparanaasin promoottori, nämä tulokset osoittivat, että RNAi koneet ja transkriptio preinitiation monimutkainen liittyi, mutta ei suoraan vuorovaikutteisia, in siH3 aiheuttama TGS of heparanaasin ihmisen syöpäsoluissa .

A, samanaikainen immunosaostus analyysi avattavasta anti-RNA Pol II tai anti-TFIIB vasta osoittivat, että siH3 tai siScb ei vaimentanut vuorovaikutusta RNA Pol II ja TFIIB syöpäsoluissa. Lisäksi, Ago1 tai Ago2 ei suoraan vuorovaikutuksessa joko RNA Pol II tai TFIIB in siScb- ja siH3-transfektoitujen syöpäsoluja. B, samanaikainen immunosaostus analyysi avattavasta anti-Ago1 tai anti-Ago2 vasta-aineet eivät yhteistyössä immunoprecipite RNA Pol II tai TFIIB peräisin siScb- ja siH3-transfektoitujen syöpäsoluja.

HEPARANASE TSS -targeted shRNA heikennetty leviämisen, tarttuvuus, invaasion ja angiogeneesin syöpäsolujen

in vitro

Koska viimeaikaiset tutkimukset osoittavat mahdollisuutta shRNA välittämää TGS nisäkässoluissa [29], [30] , jotta edelleen vaikutusten tutkiminen heparanaasin TSS kohdistettujen siRNA syövän solujen shRNA konstruktit perustettiin ja transfektoitiin PC-3, EJ ja SGC-7901-soluissa (kuvio. S4A). Stabiili transfektio shP3 (-9 /+ 10 bp) ja shCd (+ 1496 /+ 1515 bp), mutta ei shP2 (-134 /-115 bp) tai salattu shRNA (shScb), johti heikennetyn mRNA: ta ja proteiinia tasot heparanaasin (Fig. S4b, ja Fig. S4C), ja laski

in vitro

syöpäsolujen lisääntymistä (Fig. 5A, Fig. 5B ja kuvio. 5C). Transwell-analyysi osoitti, että transfektoiduissa soluissa shP3 tai shCd, mutta ei shP2 tai shScb, esitti heikentynyt hyökkäyksen kapasiteetti (Fig. 5D ja kuviossa. 5E). Lisäksi syöpäsoluja, jotka on transfektoitu shP3 tai shCd, mutta ei shP2 tai shScb, osoittivat huomattavasti pienempi kyvyt tarttuvuus esipäällystetty Matrigel (Fig. 5F). Putken muodostuminen endoteelisolujen tukahdutettiin käsittelemällä väliaineen esikäsitellään stabiili transfektio syöpäsolujen kanssa shP3 tai shCd, mutta ei shScb (Fig. 5G ja Fig. 5H). Lisäksi vapautumisen emäksinen fibroblastikasvutekijä (bFGF) syöpäsoluista on heikennetty sen jälkeen, kun stabiili transfektio shP3 tai shCd, mutta ei shScb (Fig. 5I). Nämä tulokset osoittivat, että stabiili transfektointi heparanaasin TSS kohdistettujen shRNA huomattavasti vähentynyt leviämisen, tarttuvuus, invaasion ja angiogeneesin syöpäsolujen

in vitro

.

, MTT kolorimetrisesti osoitti, että stabiili transfektointi shP3 tai shCd, mutta ei shP2 tai shScb, heikennettyjä leviämisen PC-3, EJ ja SGC-7901-soluja. B ja C, pesäkemuodostusta määritys osoitti, että transfektion shP3 ja shCd, mutta ei shP2 tai shScb, heikennettyjä

in vitro

leviämisen PC-3, EJ ja SGC-7901-soluja. D ja E, siirtokuoppaan analyysi osoitti, että PC-3, EJ ja SGC-7901 transfektoitujen solujen shP3 tai shCd, mutta ei shP2 tai shScb, hallussaan heikentynyt hyökkäyksen kapasiteettia. F, että adheesiomääritystä, PC-3, EJ ja SGC-7901-soluja transfektoitiin shP3 tai shCd, mutta ei shP2 tai shScb, osoittivat merkittävästi alentunut kyky tarttumisessa esipäällystetty matrigeeliä. G ja H, endoteelisoluja käsiteltiin väliaineen esikäsitellään stabiili transfektio PC-3, EJ ja SGC-7901-solujen shP3 tai shCd, mutta ei shScb, mikä vaimentaa putken muodostumiseen on matrigeeliä. I bFGF: n vapautumista PC-3, EJ ja SGC-7901-soluissa on heikennetty transfektion jälkeen shP3 tai shCd, mutta ei shScb. Symboli (#) todetaan merkittävä lasku tyhjästä vektori-transfektoiduissa soluissa (mock).

HEPARANASE TSS kohdistetut shRNA esti kasvua, etäpesäke ja angiogeneesiä syöpäsolujen

in vivo

vieressä tutkittiin tehoa shP3 vastaan ​​kasvaimen kasvua, etäpesäke ja angiogeneesiä

in vivo

. Vakaa transfektointi shP3 tai shCd osaksi PC-3-solut, alensivat kasvua ja painon ihonalaisen ksenograftikasvaimina atyymisissä nude-hiirissä (Fig. 6A). Lisäksi vakaa transfektoimalla shP3 tai shCd johti lasku CD31-positiivisten pienten verisuonten ja tarkoittaa suonitiheys kasvaimiin (Fig. 6B). Lisäksi ilmaus heparanaasin alavirran geenien kasvaimia, verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ja matriisin metallopeptidaasi 9 (MMP-9), pienensi myös stabiili transfektio shP3 tai shCd (Fig. 6C ja kuvio. 6D).

, hypodermic injektio PC-3-solujen kateenkorvattomissa nude-hiirissä perustettu ihonalainen ksenograftikasvaimissa. Kuukautta myöhemmin hiiret (n = 6) kustakin ryhmästä lopetettiin. Stabiili transfektio syöpäsolujen kanssa shP3 tai shCd alensivat kasvaimen koon, ja keskimääräinen tuumorin paino muodostettu shP3- tai shCd-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi vähentynyt. B, CD31 ilmaisun ja keskimääräinen suonitiheys kasvaimiin jälkeen vähentynyt vakaa transfektion shP3 tai shCd. C, HE ja immunohistokemiallisella värjäyksellä osoitti, että stabiili transfektio shP3 tai shCd alensivat ilmentymisen heparanaasin, VEGF: n ja MMP-9: kasvaimiin. D: n ilmentyminen heparanaasin alavirran geenien kasvaimia, VEGF: n ja MMP-9, väheni stabiili transfektio shP3 tai shCd. E, 3 x 10

6 PC-3-soluja injektoitiin vatsaonteloon 2 kuukauden ikäisiä urospuolisia nude-hiirten (n = 5 kussakin ryhmässä). Nude-hiirissä, jotka saivat injektion syöpäsolujen stabiilisti transfektoitu shCd tai shP3 osoitti suhteellisen vähemmän kyhmyt. F, PC-3-soluja injektoitiin häntälaskimoon Kateenkorvattomien nude-hiirten (0,4 x 10

6 solua hiirtä kohti, n = 5 kussakin ryhmässä). Syöpäsolut stabiilisti transfektoitu shP3 tai shCd perustettu huomattavasti vähemmän metastaattisen pesäkkeitä. Symboli (#) todetaan merkittävä vähemmän kuin tyhjän vektorin (vale).

vatsakalvon etäpesäke tutkimukset nude-hiiret, jotka saivat injektion PC-3-solut transfektoitiin stabiilisti shCd tai shP3 osoittivat verrattain vähemmän kyhmyt (22 ± 9 ja 17 ± 7, vastaavasti) kuin tyhjän vektorin (vale) ryhmä (106 ± 31) (Fig. 6E). Kokeellisessa etäpesäke tutkimukset, PC-3-solut transfektoitiin stabiilisti shP3 tai shCd perustettu tilastollisesti vähemmän keuhkojen metastaattinen pesäkkeitä kuin mock ryhmä (Fig. 6F). Yhdessä samanlaisia ​​havaintoja EJ ja SGC-7901-soluissa (tietoja ei ole esitetty), nämä tulokset viittaavat siihen, että heparanaasin TSS kohdistetut shRNA voisi estää kasvun, metastaasin ja angiogeneesiä syöpäsolujen

in vivo

.

keskustelu

TGS polku alun perin raportoitu tupakan kasveja, kuten valtion metylaation ja geenien ilmentymisen osoitettiin vaikuttaa RNA: t [31]. Viime aikoina RNA: t on raportoitu välittävän TGS nisäkässoluissa DNA: n kautta CpG-metylaation ja heterokromatiinin muodostumisen [10], [11], [12], [32]. Hiljainen-tilassa epigeneettiset muutokset aiheuttaa menetyksiä transkriptiotekijöiden rekrytointi [12], [33]. Samaan aikaan, siRNA: t kohdistaminen sisäinen geenin alueet ihmisen fibronektiinin 1 voi estää sisäisen venymään ja sen jälkeen vaikuttaa silmu- valinta [15]. Ihmisen heparanaasin promoottori koostui minimaalinen emäksinen alue, joka ulottuu 300-700 bp proksimaalisesti TSS paikantaminen on 101 bp ylävirtaan ATG, jolle on ominaista korkea GC sisällön, havaittu /odotettu CpG-suhde, ja sitoutumiskohdat useita ryhmiä transkriptiotekijöiden [18]. Transkriptiotekijä EGR1 liittyy indusoituvan transkription heparanaasin geenin T-soluissa [34], kun taas arjen transkriptiotekijä SP1 liittyy sen pohjapinta transkriptio [18]. Tässä tutkimuksessa, suunnittelimme kolme siRNA kohdistaminen HEPARANASE promoottorialueen sisältävä CpG loci ja SP1 sitoutumiskohta, kun taas siH3-kohdealueen (-9 /+ 10 emäsparin ympäröivän heparanaasin TSS paikantaminen on 101 emäsparia ylävirtaan ATG) oli myös vieressä sitovaan kohtaan EGR1. Kuitenkin meidän näyttö osoittaa, että transfektio näistä siRNA: iden aiheuttamaa kumpikaan metylaation CpG eikä heterochromatin muodostumista heparanaasin promoottori. ChIP analyysi edelleen sulkea pois muutoksia sitoutumisen SP1 ja EGR1 on heparanaasin promoottori, ja silmukointivariantti analyysi poissuljettu ero silmukoinnin lähimmän eksonin.

Itse asiassa, siRNA: t kohdistaminen promoottorialueita ole aiheuttamatta TGS vuonna tietyt esimerkiksi [35]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että antigene RNA: t (agRNAs) kohdistaminen TSS voi estää geenin transkription ihmisen progesteroni reseptorin (PR) [36], [37], androgeenireseptorin (AR) [37], ja huntingtin [37], mikä viittaa siihen, että TSS vuonna kromosomi-DNA tarjoaa ennustettavissa tavoitteita geeniekspression inhiboimiseen kanssa RNA: iden. Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, että siRNA ja shRNA kohdistaminen TSS aiheuttama TGS of heparanaasin ihmisen syöpäsoluja, kun taas pieni RNA: iden kohdistaminen ylävirran promoottorialue, joka sisältää CpG loci ei tukahduttaa ilmaisun heparanaasin, mikä viittaa siihen, että loci he kohdennettua voimin ei olla herkkiä TGS. Lisäksi huomasimme myös samanlainen hyötysuhteet siH3 ja koodaavan alueen kohdistetun SiH4 vaimentamiseen ilmentymistä ja toimintaa heparanaasin. Nämä tulokset osoittavat arvokas rooli TSS kohdistettujen pieniä RNA: iden säätelyssä geenin ilmentymisen TGS, varsinkin kun RNA: iden kohdistaminen ylävirran promoottorialue eivät tuota merkittävä vaikutus.

mekanismia sen sijaan geneettiset ja epigeneettiset sääntelyn korostaa TGS on heparanaasin aiheuttama TSS-kohdistettuja siRNA ihmisen syöpäsoluja. Vastaavasti, ei metylaatio havaita ympäröivän TSS AR ja PR [34], ja agRNAs-välitteisen TGS tapahtuu riippumatta siitä, onko promoottori sisältää TATA [36], [37]. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että TFIIB sitoo ytimen promoottori DNA ja ohjaa RNA Pol II TSS, edistää kokoonpano toiminnallista transkription preinitiation kompleksi (PIC) [38]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että siRNA kohdistettu TSS paikantaminen on 101 bp ylävirtaan ATG häiritsi transkription aloittamisen heparanaasin, ja samanaikainen menetys TFIIB ja RNA Pol II ehdotti, että siRNA: t vähensi kokoonpanossa PIC muodostumisen tällä TSS. On todettu, että kun nisäkkään RNA-polymeraasi sitoutuu DNA at TSS, se muodostaa avoimen kompleksin, jossa perustaa -9-2 pääsee kemiallisille aineille, jotka muokkaavat yksijuosteisen DNA, viittaa siihen, että TSS voivat olla saatavilla hybridisaatioon [36 ], [37]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet läsnäolo ei-koodaava promoottori liittyvän RNA (pRNA) ja seurauksista kohdistamista siRNA ihmisen soluissa [39], [40]. Low-kopio pRNAs tunnistaa antisense-juosteen siRNA ja toimivat tunnustuksena motiivi suoralle epigeneettiset hiljentäminen komplekseja vastaavaan kohdistettu promoottorit välittäjäksi TGS ihmisen soluissa [39]. Lisäksi, muodostumista siRNA-pRNA monimutkainen osuus Ago2 vastaa vähentää kokoonpanon toiminnallisen PIC ja salpaus transkription aloittamista c-myc-promoottori [40]. Siten joko pRNA olemassa ohjaamaan siH3 aiheuttama TGS of heparanaasin optio meidän lisätutkimuksia. Koska avoimen kompleksin aikana muodostuu transkription jokaisen geenin, on mahdollista suoraan suunnitella agRNAs on mikä tahansa geeni, joka on tunnettu siitä, TSS [41]. Siksi uskomme, että TGS strategian kautta TSS kohdistetut siRNA voidaan soveltaa myös muihin geeneihin, mikä oikeuttaa meidän lisätutkimuksia.

Ago proteiinia sisältävät kompleksit yksijuosteiset pieniä RNA: t ovat nimeltään kypsä RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC) [42]. Sitten proteiinit ovat positiivisesti varautuneet pinnat, jotka soveltuvat hyvin sitova siRNA ja mukauttamaan komplementaaristen kohdesekvenssin, mikä viittaa siihen, että sitten proteiinit voivat olla keskeinen rooli muodostumista RNA aiheuttama aloittamista TGS monimutkaisia, joka aloittaa heterochromatin muodostumista [37] .