Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haimasyöpä on hyvin aggressiivinen tauti, jossa synkkä ennusteeseen; erikoinen on kasvain microenvironment ominaista laaja fibrotic strooman, joka suosii nopeaa syövän etenemiseen. Raportoimme aikaisemmin, että haimasyövän potilailla on selektiivinen Th2 vinossa anti-syöpä -antigeeni (CEA) CD4

+ T-solu immuniteetin, joka korreloi läsnä on vallitseva GATA-3

+ kasvain lymfaattisessa infiltraatiota. Tällä on kielteisiä vaikutuksia sekä tehokkaan kasvaimen vastaisen immuniteetin ja edelleen suosimalla fibrinogenesis. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida, onko Th2 polarisaatio CEA-spesifisten CD4

+ T-solut haiman syöpäpotilaiden on stabiili tai voidaan palautunut immuunivasteen sytokiineja.

Menetelmät /Principal Havainnot

ensin arvioitiin vaikutusta IL-12 ja IL-27, yksittäisinä aineina ja yhdessä, polarisaatio CEA-spesifisten Th2 CD4

+ T-solujen klooneja haimasyöpä potilaalle. Huomasimme, että vain yhdistelmä IL-12 ja IL-27 muunnetut polarisaatio Th2 efektorien sekä väheneminen IL-5, GM-CSF: n ja IL-13 ja induktio IFN-γ tuotantoa, joka kesti jälkeen sytokiinin poistamisen. Toiseksi, meidän arvioida vaikutus yhdistetyn hoidon polyklonaalisia CEA-spesifisten CD4

+ T-solujen lyhytaikainen uudelleen stimulaation määritykset. Yhteisymmärryksessä saadut kanssa klooneista, huomasimme, että yhdistetty hoito toiminnallisesti moduloitu Th2 polarisaatio CEA-spesifisten CD4

+ T-solujen ja parannettu ennestään Th1-tyypin immuniteetti.

Johtopäätökset /Merkitys

Yhdessä tuloksemme osoittavat, että kasvain antigeenispesifisten Th2 CD4

+ T-solujen haimasyövän ovat varustettuja toiminnallisia plastisuus. Siksi paikallista alueellista sytokiinien toimitus- tai täsmähoitoihin perustuu vasta-aineita tai molekyylejä suunnataan kasvaimeen strooman saattaa parantaa kasvaimen vastaisen immuniteetin ja parantaa fibroosia, ilman systeemistä toksisuutta.

Citation: Tassi E, Braga M, Longhi R , Gavazzi F, Parmiani G, Di Carlo V, et ai. (2009) Ei-Redundant Role IL-12 ja IL-27 Moduloiva Th2 polarisaatio Karsinoembryonaalinen antigeenispesifisen CD4 T-solut Haimasyöpä Potilaat. PLoS ONE 4 (10): e7234. doi: 10,1371 /journal.pone.0007234

Editor: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 heinäkuu 2009; Hyväksytty: 09 syyskuu 2009; Julkaistu: 02 lokakuu 2009

Copyright: © 2009 Tassi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Euroopan yhteisön (DC-THERA), Italian terveysministeriön Italian ministeriön yliopiston ja tieteellisen tutkimuksen ja Rich Foundation (LDP Haimasyöpä Research Project). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PC) on hyvin aggressiivinen tauti, jossa synkkä ennusteeseen [1]. Erikoinen on kasvain microenvironment, joka koostuu fibroblastien, haiman tähtisolut, endoteelisolujen, immuunijärjestelmän ja endokriinisten solujen ja hermoa leviämisen ja uskotaan pelata aktiivisesti taudin etenemistä ja aggressiivisuus [2].

Viimeksi [3], tutkimme laatu kasvaimen vastaisen CD4

+ T-soluvasteita in PC potilailla, joille tehdään kirurginen resektio, vertaamalla anti-karsinoembryonaalisen (CEA) ja anti-virus CD4

+ T-solu-immuniteetin. Huomasimme, että anti-CEA CD4

+ T-solu immuniteetin oli läsnä huomattavasti pienempi määrä PC potilaita verrattuna normaaliin luovuttajia. Mikä tärkeintä, kun taas CD4

+ T-solujen normaaleista luovuttajista tuotetaan pääasiassa granulosyytit makrofagit pesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF) ja pro-inflammatorisia (

eli

, Th1) sytokiinin interferoni-γ (IFN-γ ), CD4

+ T-solut potilailla tuotetaan pääasiassa interleukiini (IL) -5 ja IL-13, mikä osoittaa vinossa kohti anti-inflammatorinen (

eli

, Th2) tyyppi. Päinvastoin, missä määrin anti-virus CD4

+ T-solu-immuniteetin oli verrattavissa ryhmien välillä, ja se osoitti Th1-tyypin. Yhteisymmärryksessä Th2 vinous havaittu verenkierrossa CEA CD4

+ T-solujen immunohistokemiallinen analyysi kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä havaittiin merkitsevästi suurempi määrä GATA-3

+ (Th2) verrattuna T-bet

+ (Th1) lymfoidisolut, joka tukee Th2 vinossa myös tuumoripaikkaan.

on osoitettu, että fibroosia, mikä on tunnusmerkki PC, on vahvasti sidoksissa kehittämiseen Th2-vasteet aktivoimalla Th2 sytokiinit kollageenin synteesin fibroblastit ja samanaikaisesti vähentää kollageenin hajoamista ilman Th1 sytokiinien [4]. Siksi läsnäolo GATA-3

+ lymfoidisolut, jonka havaitsimme [3] haiman kasvain microenvironment, voisi edelleen edistää fibroosia ja paikallisia hoitoja, joilla pyritään vähentämään läsnäolo Th2 sytokiinien saattaa olla hyötyä.

eri tekijöitä, jotka edistävät CD4

+ T-solujen polarisaatio, sytokiineja on ratkaiseva rooli [5]. IL-12, tuote fagosyyttien ja dendriittisolujen vastauksena mikrobien stimulaatio, on suuri merkitys edistettäessä Th1 polarisaatio ja lisäämään CD4

+ T-solujen lisääntymistä [6]. Lisäksi, IL-12: n on osoitettu indusoivan kääntyminen Th2-polarisaatio ihmisen allergeeni-spesifisiä Th2-solut [7], [8], ja synergia IL-18, stimuloida IFN-γ tuotanto perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC ) alkaen kyhmylepra potilaista [9]. IL-27, joka on viime aikoina tunnistettu jäsen IL-12 perheen [10], myös stimuloi proliferaatiota ja synergistisesti IL-12 puhkeamisessa IFN-γ tuotantoa naiiveja CD4

+ T-solujen [10], [11]. Viime aikoina on osoitettu, [12], että IL-27 inhiboi Th2-polarisaatio naiivien hiiren CD4

+ T-soluja ja estää Th2-sytokiinien tuotannon

in vitro

polarisoituneet Th2-solut.

Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdollisuutta palata Th2 polarisoituminen

bona fide in vivo

pohjustettu CEA-spesifisten CD4

+ T-solut PC potilaista käyttämällä IL-12 ja IL-27: immuunivastetta aineita. Olemme havainneet, että IL-27 yksinään oli riittävä inhiboimaan IL-5 ja IL-13 eritystä, kun taas IL-12 stimuloi vahvasti IFN-γ tuotanto vähäisiä vaikutuksia Th2 sytokiinien eritykseen; yhdistelmä kahden indusoimien sytokiinien funktionaalisen modulaation Th2-polarisaatio.

Materiaalit ja menetelmät

aiheet ja solulinjat

PBMC saatu kaksi PC-potilaiden (pt # 15 ja pt # 43) ja yksi terve luovuttaja (ND # 11) kohortin aiheita, joissa olemme aikaisemmin havainneet anti-CEA CD4

+ T-solujen [3]. Potilaat vedettiin ennen leikkausta ja lavastus tauti oli T3N1M0 molemmissa tapauksissa. Institutionaalinen eettinen komitea (Comitato Etico Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele) oli hyväksynyt tutkimussuunnitelman ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta luovuttajien ennen verinäytteen ottoa. EBV-transformoituja lymfoblastoidisolulinjat (LCL) käytetään ja niiden HLA (HLA) -DR tyyppi olivat: SKP-LCL (β1 * 0405, * 1401; β3 * 02), perustettiin vuonna laboratoriossamme terveeltä luovuttajalta; BM21 (β1 * 1101; β3 * 0202) ja Pitout (β1 * 0701; β4 * 0101), jonka toimitti ystävällisesti K. Fleischhauer (San Raffaele Scientific Institute, Milano). LCL-soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (BioWhittaker), joka sisälsi 2 mM L-glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 50 mg /ml streptomysiiniä (BioWhittaker), ja 10% FCS: ää (BioWhittaker).

synteesi CEA-peptidien

CEA

99-111, CEA

117-129, CEA

177-189 /355-367, CEA

425-437, CEA

568-582, ja CEA

666-678 sekvenssit syntetisoitiin vaiheittaisella kiinteän faasin menetelmällä, kuten aikaisemmin on kuvattu [13]; peptidit lyofilisoitiin, liuotetaan DMSO: hon (Sigma-Aldrich), 10 mg /ml ja laimennettiin RPMI 1640 tarvittaessa.

In vitro

lisääminen CD4

+ T-solukloonien

Polyklonaaliset CEA

177-189 /355-367 CD4

+ T-solujen pt # 15, saadaan 13 päivän kuluttua lyhytaikaisia ​​kulttuuri spesifisen peptidin kanssa ja autologisten CD4

+ -depleted PBMC antigeeniä esittelevät solut (APC), kloonattiin rajoittavalla laimennuksella, kuten on kuvattu [14]. Kloonit viljeltiin X-VIVO 15 (BioWhittaker), jota oli täydennetty 5% lämmön avulla inaktivoitua yhdistettiin ihmisen seerumia (BioWhittaker), penisilliiniä (100 U /ml; BioWhittaker), streptomysiiniä (50 mg /ml; BioWhittaker), ja IL-2 (250 IU /ml; Proleukine, Novartis). Kloonit stimuloitiin uudelleen joka 15-21 päivää kanssa fytohemagglutiniinilla (PHA) (0,5 ug /ml; Sigma-Aldrich) ja säteilytettiin allogeenisen PBMC:.

CD4

+ T-solukloonien tiostimulaatiomäärityksessä

CD4

+ T-solut (10

4 /kuoppa) viljeltiin kolmena rinnakkaisena 96-U-pohjalevyt, kun läsnä on säteilytettyjä LCL (5 x 10

4 /kuoppa), tai säteilytetty autologista tai HLA-DRβ3 * 02 täsmäsi PBMC: (10

5 /kuoppa), kuten APC pulssitettiin CEA

177-189 /355-367 peptidiä (10 ug /ml) tai puhdistetun CEA-proteiinia (30 ug /ml, BiosPacific) tai normaalin ihmisen IgG (30 ug /ml, Venimmun N, Aventis Behring), negatiivisena kontrollina. Estymiseen kokeissa seuraavat monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) (Beckton Dickinson) käytettiin: anti-HLA-DR (100 ng /ml), anti-HLA-DP (3 ug /ml) ja anti-HLA-DQ (125 ng /ml). Peptidi titraus kokeissa seuraavat pitoisuudet peptidin lisättiin: 20-10-5-1-0,5-0,1-0,05-0,01 ja 0005 ug /ml. Kokeissa on immuunivastetta sytokiinien, ihmisen rekombinantti IL-12 ja /tai IL-27 (R IL-27, monoterapialla (0,01-1-10-100 ng /ml); Yhdistetyt IL-12 ja IL-27 hoito (5 ng /ml + 100 ng /ml, vastaavasti). 48 h jälkeen, supernatantti kustakin kuopasta poistettiin ja yhdistettiin sytokiinien ”havaitsemista ELISA: lla, mukaan valmistajan ohjeiden: GM-CSF: n (kynnysarvo: 31,25 pg /ml) ja transformoiva kasvutekijä (TGF) -β1 ( kynnysarvoa: 62,5 pg /ml) (Biosource International Inc.); IFN-γ, IL-5 ja IL-13 (kynnysarvo: 15,6 pg /ml) (Mabtech) ja IL-17 (eBioscience) (kynnysarvo: 7,8 pg /ml). IFN-γ, tuumorinekroositekijä (TNF) -α, IL-10, IL-4, IL-5 ja IL-2: n vapautuminen määritettiin myös käyttäen sytometria Helmet Array (CBA) Human Th1-Th2-sytokiinit Kit (kynnysarvoa : 20 pg /ml), (Becton Dickinson), seuraten valmistajan ohjeita.

Lyhytaikaiset kulttuuri ja sytokiinien vapautumisen määrityksellä

Puhdistettu CD4

+ T-solut stimuloitiin kerran

in vitro

läsnä on lisätty CEA-peptidejä, kuten aiemmin on kuvattu [3]. Lyhyesti, CD4

+ T-soluja (3 x 10

4 /kuoppa), puhdistettiin kokonais-PBMC: stä magneettiset helmet (Miltenyi Biotec), maljattiin 96-kuoppalevyille viisi rinnakkaista kunkin kunnossa ja viljeltiin X -VIVO 15 on täydennetty penisilliinillä (100 U /ml), streptomysiiniä (50 mg /ml) ja 3% lämmöllä inaktivoitua ihmisen yhdistetystä seerumista (kudosviljelyväliainetta, TCM), kun läsnä on säteilytettyjä CD4

+ – köyhdytettyä PBMC- APC kello CD4

+: APC suhde 01:03. Ärsykkeitä olivat: PHA (10 ug /ml; Sigma-Aldrich), positiivisena kontrollina; CD4

+ T-solujen läsnä ollessa APC vain, lähtötilanteessa (tyhjä); ja kunkin yksittäisen peptidin (10 ug /ml). Rekombinantti ihmisen IL-12 (5 ng /ml) ja IL-27 (100 ng /ml) lisättiin, jossa on ilmoitettu. Päivänä 7, puoli väliaine kustakin kuopasta poistettiin ja täydennettiin tuoreella TCM, joka sisälsi IL-2 (25 IU /ml), ja IL-12 ja IL-27, jossa on osoitettu, ilman mitään antigeenistimulaatiota. Päivänä 14, supernatantti kerättiin IFN-γ, IL-5, IL-13 ja GM-CSF: n vapautumisen ELISA, kuten on kuvattu edellä.

Virtaussytometria

sy- tofluorimetrisillä analyysit suoritettiin FACSCalibur ja analysoitiin käyttämällä FlowJo ohjelmistoa (Puu Star, Inc.). Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-CD3-APC, anti-CD4-PerCP, anti-CCR4-PE, anti-CCR5-FITC (Pharmingen) ja anti-CRTH2-PE (Miltenyi Biotec). TCRVβ ilmentyminen määritettiin IO Test Beta Mark Kit (Immunotech), seuraten valmistajan ohjeita.

Tulokset

karakterisointi CEA

177-189 /355-367 erityisiä Th2-sytokiinien tuottavien CD4

+ T-solukloonien

aiemmin raportoitu, että PC potilailla on Th2 vinoon anti-CEA CD4

+ T-solu immuniteetin säilyttäen ehjä ohjelmistoon virustentorjuntalääkkeiden Th1-solut [3 ]. Paremmin luonnehtivat piirre tämän anti-CEA-vastaus kloonattiin rajoittavalla laimennus CEA

177-189 /355-367 polyklonaalisia CD4

+ T-solujen pt # 15, joka saadaan sen jälkeen, kun

in vitro

lyhytaikainen uudelleen stimulaation CD4

+ T-solujen autologisella APC pulssitettu asiaa peptidi; menetelmällä, joka emme aiemmin osoitti ole suosia

in vitro

pohjustus [15]. Polyklonaaliset solut tuottivat korkeita IL-5 ja hyvin vähän GM-CSF, mutta ei IFN-γ [3], mikä viittaa siihen, että läsnä on

in vivo

käsitellyt CD4

+ T-solujen Th2-ominaisuuksia. Kaksi kloonia, joka ilmaisi saman T-solureseptorin (TCR) Vp ketju,

eli of the Vβ17 (Fig. 1 E), ja siksi käytimme niitä välinpitämättömästi seuraavissa kokeissa on

bona fide

sama klooni.

profiili sytokiiniä (A)

. CD4

+ T-soluja viljeltiin käyttäen säteilytettyjä APC: n läsnä tai poissa ollessa oleellista peptidiä 2 päivän tiostimulaatiomäärityksessä ja pitoisuus ilmoitettu sytokiinien supernatanteissa määritettiin joko CBA (ylempi paneeli) tai ELISA- (alempi paneeli). Tiedot edustavat vähintään kuusi koetta; ELISA määritykset, tiedot ovat keinoja päällekkäisiä määrityksen ± SD.

HLA rajoitus (B)

. CD4

+ T-soluja viljeltiin säteilytettyjen autologisten PBMC: tai HLA-DR täsmäsi LCL, kuten, läsnä ollessa tai ilman oleellista peptidiä (10 ug /ml), ja koska ei ole tai läsnä on anti-HLA- -DR, anti-HLA-DP ja anti-HLA-DQ mAb: t: 2 päivän jälkeen IL-5 testattiin. Ylempi paneeli:% inhibitio laskettiin IL-5-erityksen CD4

+ T-solujen läsnä ollessa kyseisen peptidin (2 ng /ml yli 0 ng /ml tausta taso). Tiedot edustavat kaksi (ylempi paneeli) ja neljä (alempi paneeli) kokeiluja ja ovat keinoja päällekkäisiä määrityksen ± SD. Vasteet huomattavasti korkeampi kuin aihiot (

eli

, pohjapinta sytokiinitasot eritys CD4

+ T-solujen läsnä ollessa LCL vain) on merkitty: ***, p 0,001 (määritetty parittomia yksisuuntainen Studentin t-testi).

Annosvastekäyrät (C)

. CD4

+ T-soluja viljeltiin titrata annosta kyseisen peptidin läsnä säteilytettyjen APC: 2 päivän tiostimulaatiomäärityksessä ja testattiin IL-5 ja IL-13 vapautuminen. Tiedot ovat keinoja päällekkäisiä määrityksen ± SD.

tunnustaminen natiivin proteiinin (D)

. CD4

+ T-soluja viljeltiin, kun läsnä oli säteilytettyjä PBMC APC, pulssitettiin joko oleellista peptidiä (10 ug /ml), positiivisena kontrollina, tai puhdistetun CEA-proteiinia (30 ug /ml) tai ihmisen IgG ( 30 ug /ml) kuin negatiivisena kontrollina 2 päivän tiostimulaatiomäärityksessä ja testattiin IL-13 vapautumisen. Tiedot ovat keinoja päällekkäisiä määrityksen ± SD. Vasteet huomattavasti korkeampi kuin aihiot (

ts.

, Pohjapinta sytokiinitasot eritys CD4

+ T-solujen läsnä ollessa PBMC vain) on merkitty: **, 0,001 p 0,05; ***, P 0,001 (määräytyy pariton yksisuuntainen Studentin t-testi).

TCRVβ lauseke (E)

. Testi suoritettiin IO Test Beta Mark kit. Quadrants asetettiin perustuvat isotyyppikontrolli värjäystä.

Pinta ilmentymä Th2 (CRTH2 ja CCR4) ja Th1 (CCR5) merkkiaineet (F)

. Täytetty histogrammit edustavat isotyyppikontrolleja; avoin histogrammit näytteet värjättiin mainituilla markkereita.

luonnehdinta CEA

177-189 /355-367 CD4

+ T-klooneja on kuvattu kuvassa 1. CD4

+ T-solukloonien tuotetaan pääasiassa IL-5, IL-13 ja GM-CSF: n, kun ne vapautetaan pieni määrä IL-4, ja IFN-γ eikä IL-2, TNF-α: n, TGF-β1, IL-10 tai IL-17 (Fig. 1A). Vaikka solut tuottavat pieni määrä IL-4, tämä malli sytokiinierityksen on yhdenmukainen Th2-polarisaatio.

tunnistamiseksi rajoitus elementti me testattiin ensin tunnustaa CD4

+ T-solut peptidin ladattu autologisten APC puuttuessa tai läsnä ollessa anti-HLA-DR, anti-HLA-DP ja anti-HLA-DQ-mAb: t. Kuten on esitetty kuviossa. 1B (ylempi paneeli), lisättiin anti-DR-mAb inhiboi (65,5%) IL-5 tuotanto CD4

+ T-solut, mikä osoittaa, että HLA-DR-molekyylin esitetty peptidi. Tunnistaa HLA-DR esittää alleelin, sitten solut altistettiin oleellista peptidiä läsnä LCL ilmaista erilaisia ​​yhdistelmiä HLA-DRβ1, β3 ja β4 alleelit ilmaistaan ​​potilaan (kuviossa. 1 B) ja testattiin IL-5 julkaisu. Kuten on esitetty kuviossa. 1B (alempi paneeli), CD4

+ T-solujen tunnustettu peptidin HLA-DRβ3 * 02, joka on alleeli jaettu potilaan ja kaksi esittää LCL (BM21 ja SKP).

Olemme myös suorittaa peptidin titrauskäyrä jossa CD4

+ T-solut altistettiin konsentraation kasvaessa oleellista peptidiä (Fig. 1 C). Kokeet osoittivat ilmentymisen klooni erittäin alhainen affiniteetti TCR.

Osoitimme aikaisemmin, että CEA-sekvenssi toistetaan asemissa 177-189 ja 355-367 sisältää

in vitro

luonnollisesti prosessoitujen epitooppia esitetään yhdessä useisiin HLA-DR-alleelit [16]. Vahvista nämä tiedot, CD4

+ T-solujen kloonit altistettiin CEA proteiinin tai normaalin ihmisen IgG, negatiivisena kontrollina, ja tutkittiin IL-13 vapautumisen. Kuten on esitetty kuviossa. 1D, CD4

+ T-solut on tuotettu IL-13: n läsnä ollessa peptidin ja, mikä tärkeintä, kun läsnä on CEA, mutta ei valvonnan proteiinin (

eli

, ihmisen IgG), osoittavat, että vaikka CEA

177-189 /355-367 CD4

+ T-solukloonien mukanaan pienen affiniteetin TCR ne tunnistavat natiivin epitoopin.

Lopuksi tarkistaa, onko Th2 sytokiiniprofiilin korreloivat kanssa fenotyyppisiä markkereita Th1- ja Th2-solujen, kloonit testattiin ekspressiota CCR5, joka ilmentyy ensisijaisesti Th1-soluihin [17] ja CRTH2 ja CCR4, jonka ilmentymistä karakterisoi Th2-solujen [17], [18]. Odotetusti sytokiiniprofiilin, CD4

+ T-solut ovat ilmentäneet pinnallaan sekä CRTH2 ja CCR4 taas CCR5 ilme oli poissa (Fig. 1 F).

Yhdistetty IL-27 ja IL-12 hoito estää eritystä Th2-sytokiinien ja stimuloi IFN-γ tuotantoa CEA CD4

+ T-solujen

seuraavaksi testasimme mahdollisuutta moduloimiseksi polarisaatio CEA

177-189 /355-367-Th2- solujen immunomodulatorinen sytokiinien IL-27 ja IL-12.

tämän tavoitteen ensin arvioitiin n nousevien konsentraatioiden vaikutusta IL-27: n tai IL-12, yksittäisinä aineina, tuotantoa CD4

+ T-solujen Th1 ja Th2 sytokiinien läsnä ollessa kyseisen peptidin. Lisäämällä IL-27 väheni annoksesta riippuvaisella-tavalla, IL-5 ja IL-13 tuotantoa, kun taas mitään vaikutusta ei havaittu IL-4: n ja IFN-γ (Fig. 2A). Lisäämällä IL-12 saavutti tasanteen vaikutus jo annoksella 5 ng /ml (kuvio. 2B): IL-5 tuotanto väheni myös, kun läsnä on IL-12, kun taas, on ero IL-27, vaikutus IL-13 oli marginaalinen kuin IL-4. Tärkeää on, ja ero IL-27, IFN-γ tuotanto kasvanut voimakkaasti (Fig. 2B). Nämä tiedot osoittavat, että sekä sytokiinit vaikuttavat efektoritoiminnan CEA-spesifisten CD4

+ T-solukloonien, mutta ei IL-27 tai IL-12, yksittäisinä aineina, oli optimaalinen moduloimaan niiden Th polarisaatio.

(A).

CD4

+ T-soluja viljeltiin oleellista peptidiä ja säteilytettiin LCL, kuten APC: n kasvavien konsentraatioiden läsnäollessa IL-27 (0-0,1-1-10- 100 ng /ml); sen jälkeen 2 päivää sytokiinin vapautumista arvioitiin CBA (IL-5 IL-4, ja IFN-γ) tai ELISA: lla (IL-13). Tiedot IL-13 ovat keinoja päällekkäisiä määrityksen ± SD.

(B).

CD4

+ T-soluja viljeltiin ja testattiin, kuten edellä on kuvattu, kun läsnä on kasvavia pitoisuuksia IL-12 (0-5-20 ng /ml). Perustasoon sytokiinien eritys CD4

+ T-solujen läsnä ollessa LCL vain vähennettiin näytteen arvot ja sen, joka on välillä 0 ja 0018 ng /ml. Tiedot edustavat vähintään kolmen kokeen.

Toiseksi, meidän arvioida vaikutus yhdistettynä hoidon kahden sytokiinien (Fig. 3). Kun käytetään 5 ng /ml, IL-12, ainoana lääkkeenä, indusoi 61%: n inhibitio IL-5 ja ei ollut mitään vaikutusta IL-13 ja GM-CSF: n, kun taas IFN-γ tuotanto oli lähes 10-kertainen . IL-27 hoito yksinään on suurin pitoisuus osoitti 78%, 30% ja 53% inhibitio IL-5, IL-13 ja GM-CSF: n, vastaavasti; kun taas vain 1,4-kertainen nousu IFN-γ tuotantoa. Kun käytetään yhdessä parhaat pitoisuuksina, synergistinen vaikutus havaittiin inhibitio IL-5 (91%) ja IL-13 (48%), kun taas, kuten odotettua tuloksista yhden aineet, GM-CSF: n eritystä ei vielä inhiboi ja IFN-γ tuotanto ei entisestään.

CD4

+ T-soluja viljeltiin asianomaisten peptidin puuttuessa (perustaso) tai, kun läsnä on IL-12 (5 ng /ml), -monoterapiasta; tai IL-27 (100 ng /ml), -monoterapiasta; tai yhdistetty IL-12 ja IL-27 2 päivän tiostimulaatiomäärityksessä ja sitten testattiin sytokiini- CBA (IL-5 ja IFN-γ) tai ELISA (IL-13 ja GM-CSF). Tiedot IL-13 ja GM-CSF ovat keinoja päällekkäisiä määrityksen ± SD. Perustasoon sytokiinien eritys CD4

+ T-solujen läsnä ollessa LCL vain vähennettiin näytteen arvot ja sen, joka on välillä 0 ja 0006 ng /ml. Tiedot edustavat viisi koetta.

modulaatio Th2 polarisaatio IL-12 ja IL-27 kestää jälkeen sytokiinien poistamisen

Voit tarkistaa, onko modulaatio Th2 polarisaatio saamien Yhdistetyt hoito IL-12 ja IL-27 oli vakaa, suunnittelimme kokeesta, jossa CEA-spesifisten CD4

+ T-soluja stimuloitiin ensin kyseisen peptidin puuttuessa tai läsnä ollessa IL-12 ja IL- 27 (5 ja 100 ng /ml, vastaavasti). Toiseksi solut stimuloitiin ilman sytokiinien pidettiin viljelmässä 14 päivää TCM plus IL-2 ja käytettiin kontrolleina. Solut käsiteltiin sytokiinien jaettiin kahteen erään ja viljellään eri olosuhteissa seuraavat 14 päivää: yhdessä tilassa sytokiineja poistettiin 2 päivän kuluttua ja solut viljeltiin säätimiä TCM plus IL-2, muissa kunnossa sytokiinien pidettiin kulttuurin koko ajan ja korvataan joka toinen tai kolmas päivä. Päivänä 14 solut kustakin kolme edellytystä testattiin 2 päivän stimulaation määrityksessä oleellista peptidiä ja sytokiinien vapautumista testattiin. Saadut tulokset on esitetty kuviossa 4. Kontrollisoluja vahvisti IL-5, IL-13, eikä IFN-γ, kun taas solut, joita pidettiin viljelmässä jatkuvasti sytokiinien vahvistettu 98% ja 74% inhibitio IL-5 ja IL- 13 tuotannon, vastaavasti, ja 11-kertainen lisäys IFN-γ. Tärkeää on, solut, joissa sytokiinien poistettiin sen jälkeen 2 päivää viljelyn oli vielä 70% ja 47% inhibitio IL-5 ja IL-13 tuotantoa, vastaavasti, ja 5-kertaisen kasvun IFN-γ vapautumista.

(A)

. CD4

+ T-soluja viljeltiin oleellista peptidiä ja joko jätettiin käsittelemättä (peptidi) tai käsitelty 2 päivää, jossa on yhdistetty IL-12 (5 ng /ml) ja IL-27 (100 ng /ml) ja sitten pestiin ja hoitamattomana (IL-12 + IL-27 (2 päivää)) tai käsitelty jatkuvasti IL-12 ja IL-27 samaan annoksina 2 viikko (IL-12 + IL-27 (14 päivää)). 14. päivänä, solut testattiin läsnä ollessa tai ilman oleellista peptidiä ja erityiset IL-5, IL-13 ja IFN-γ vapautuminen supernatantista testattiin ELISA: lla. Tiedot ovat keinoja päällekkäisiä määrityksen ± SD. Perustasoon sytokiinien eritys CD4

+ T-solujen läsnä ollessa LCL vain vähennettiin näytteen arvot, ja se oli seuraava: IL-5 (0093 ± 0006 ng /ml), IL-13 (0468 ± 0028 ng /ml), ja IFN-γ (0 ng /ml). Tiedot edustavat neljä kokeissa. (

B

). Pinta ilmentymä CRTH2, CCR4 CCR5 CD4

+ T-solujen hoidon jälkeen yhdistetty IL-12 + IL-27. Analyysi tehtiin soluja käsiteltiin 2 päivää ja sitten jätetään hoitamatta vielä viikko. Täytetty histogrammit edustavat isotyyppikontrolleja; avoin histogrammit näytteet värjättiin mainituilla markkereita.

Voit tarkistaa, onko yhdistetyn hoito vaikutti myös Th2 pinnan fenotyyppi, CD4

+ T-solut, jotka oli uudelleen stimuloitu in läsnä ollessa sytokiinit 2 päivää ja sitten niitä viljeltiin vielä seitsemän vuorokautta ilman sytokiinien, testattiin ekspressiota CRTH2, CCR4 ja CCR5. Kuten on esitetty kuviossa 4B, solut, säilyttäen CRTH2 ja CCR4 kuin ilman hoitoa (Fig. 1 F), hankki ilmentymisen CCR5.

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että modulaatio Th2 polarisaation CEA erityisiä CD4

+ T-solukloonien saadaan yhdistettyä hoitoa kestäviä, vaikka pienemmällä tehokkuus, jopa sen jälkeen, sytokiinien poistamiseen ja liittyy toiminnallisia ja fenotyyppiset ominaisuudet Th0 tai molempien Th1 ja Th2-solut.

IL-12 ja IL-27 yhdistelmä parantaa Th1 ja moduloi Th2 polarisaatio spontaanin anti-CEA CD4

+ T-soluvasteiden

Voit tarkistaa vaikutuksen yhdistetyn IL-12 ja IL-27 hoito polarisaatio CEA-spesifisten CD4

+ T-solujen enemmän fysiologinen ympäristö ja polyklonaalisia tasolla, CD4

+ T-solut potilaasta (pt # 43) ja normaalin luovuttajan (ND # 11) testattiin 14 päivän

in vitro

uudelleen tiostimulaatiomäärityksessä tunnustamiseksi asiaa peptidien puuttuessa tai läsnä ollessa kahden immunomodulatoristen sytokiinien (kuva 5). Kuten aikaisemmin raportoitu [3], ilman immunomodulatori- sytokiinien CD4

+ T-solujen pt # 43 tuotti IL-5: n läsnä ollessa CEA

425-437; IL-13: n läsnä ollessa CEA

568-582; GM-CSF: n läsnä ollessa CEA

568-582 ja IFN-γ läsnäollessa CEA

568-582 ja, joskin paljon vähemmän, mutta merkittävää, CEA

177-189 /355 -367 (Fig. 5,

vasen paneeli

s, harmaat pylväät

). Yhdistelmä IL-12 ja IL-27 lähes poistetaan IL-5 (99%: n inhibitio) ja IL-13 (76%: n esto), kun taas indusoidun

de novo

IFN-γ erityksen läsnä CEA

425-437, parannettu (9-kertainen lisäys) IFN-γ tuotannon läsnä CEA

177-189 /355-367 ja vahvisti IFN-γ samalla voimakkaasti alentunut IL-13 (98%: n inhibitio) ja GM- CSF (80%: n esto) tuottaen CEA

568-582 (Fig. 5,

vasen paneeli

s, mustat palkit

). Kuten aiemmin on raportoitu [3], ilman immunomodulatorinen sytokiinien CD4

+ T-solujen ND # 11 osoittivat merkittävää lisääntymistä [3] ja erittäin pieni määrä IFN-γ erityksen läsnä CEA

99- 111, kun taas mitään merkittävää IL-5 ja GM-CSF havaittiin tahansa peptidin läsnäolon (kuvio. 5,

oikea paneeli

s, harmaat pylväät

). IL-13 vapautuminen ei testattu. Sytokiini hoito voimakkaasti lisätyn (23-kertainen) IFN-γ release vastaan ​​CEA

99-111, vaikka odotetusti mitään vaikutusta IL-5 ja GM-CSF: n tuotannon havaittiin (Fig. 5,

oikeus paneeli

s, mustat palkit

). Molemmissa tapauksissa nämä kaksi sytokiinien aiheuttama modulaatio Th2 tai monistamiseen Th1 vastauksista, jotka olivat jo läsnä, vaikkakin hyvin alhainen, ilman sytokiinien yhdistelmä, kun ei ollut näyttöä

de novo

spesifinen tunnistus CEA peptidejä.

CD4

+ T-solujen pt # 43 ja PU # 11 viljeltiin viisi rinnakkaista, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät, jossa reagoiva CEA peptidejä, puuttuessa ( harmaat pylväät) tai läsnä ollessa (mustat pylväät) yhdistetyn hoidon IL-12 (5 ng /ml) plus IL-27 (100 ng /ml). 14 päivän jälkeen, IL-5, IL-13, GM-CSF: n ja IFN-γ: n vapautuminen testattiin ELISA: lla. Tiedot ilmoitetaan ovat keinoja päällekkäisiä määrityksen ± SD. Katkoviivat tunnistaa perustason sytokiinierityksen läsnä ollessa APC vain. n.d. = Ei määritetty.

Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että IL-12 ja IL-27 edistää funktionaalisen modulaation Th2-tyypin ja monistaminen ennestään Th1-tyypin anti-CEA-vasteita.

keskustelu

Tässä tutkimuksessa raportoimme että yhdistys on immuunivastetta sytokiinien IL-12 ja IL-27 kykenee moduloimaan toiminnallista polarisaatio anti-CEA Th2 CD4

+ T-solut PC potilaiden ja tehostaa ennestään Th1-tyypin anti-CEA CD4

+ T-soluja.

Osoitamme, että hoito IL-27 monoterapiana estämällä sekä IL-5 ja IL-13 vapautumisen CEA-spesifisten Th2-solut. Tämä vahvistaa ihmisen järjestelmässä aiemman raportin, joka on kuvattu IL-27 kuin pystyy tukahduttamaan Th2 sytokiinien tuotanto

in vitro

polarisoitunut hiiren Th2-solujen [12]; mutta, at ero tämän raportin, meidän järjestelmä, jossa käsittelemme

bona fide in vivo

polarisoitunut CD4

+ T-solujen IL-27 ei ollut vaikutusta IFN-γ eritystä. Mikä tärkeintä, me paljasti myös uuden toiminnon IL-27, joka on esto GM-CSF tuotannon. Kun IL-12 käytettiin ainoana lääkkeenä, sitä voimakkaasti parannettu IFN-γ tuotantoa, kun taas oli vain vähäinen vaikutus tukahduttamaan vapauttaa Th2 sytokiinien, ja IL-13 erityisesti ja mitään vaikutusta GM-CSF. Tämä on myös ero aikaisempien raporttien kanssa, [7], [8], jossa IL-12: n osoitettiin palata polarisaatio ihmisen allergeenispesifisten Th2-solut indusoimalla IFN-γ ja inhibitio IL-4-tuottamista. Itse asiassa, kun kyseessä ovat meidän klooneja IL-4, joka kuitenkaan ei ole tuotettu suuria määriä, ei inhiboinut ole IL-27 tai IL-12. Ainoa Th2 sytokiini vaikuttavat IL-12 oli IL-5; Tämä toiminto on myös aikaisemmin raportoitu T-solukloonien saatu bronkoalveolaarinen huuhtelu astmapotilailla [19].

Yhdessä me osoittavat, että järjestelmä IL-12 ja IL-27 on ei tarpeeton roolit moduloimaan polarisaatio perustettu CEA-spesifisten Th2 CD4

+ T-soluja, ja että modulointi toiminnalliset ja fenotyyppinen Th2 polarisaatio anti-kasvain CD4

+ efektorien osaksi Th0 tyyppi saatiin ainoastaan ​​läsnä ollessa yhdistettynä synergistinen hoidon kaksi sytokiinit. Modulaatio sytokiinien tuotannon oli, ainakin siinä tapauksessa kloonien, enimmäkseen toiminnallinen induktion kanssa varsin erikoinen fenotyyppi jossa CCR4, CRTH2 ja CCR5 ilmaisun rinnakkain (

eli

, ei tyypillinen joko Th1- tai Th0 solut). Alustavat kokeet (tuloksia ei esitetty), jossa arvioimme sytokiinien ”tuotannon yhden solun tasolla solunsisäinen värjäys osoitti, että:

i

) IL-27 yksinään ei vaikuttanut prosenttiosuus IL-5 ja IL-