Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epiteelisolut pahanlaatuisten olosuhteissa vapauttaa DNA solunulkoiseen lokero. Solun vapaa DNA kasvaimen alkuperän voi toimia ligandina DNA tunnistusmekanismilla ja välittää muutokset epiteelin-strooman vuorovaikutuksia.

Tavoitteet

arvioida ja vertailla mahdollisten autokriininen ja parakriininen sääntelyn vaikutus normaali ja pahanlaatuisten epiteelisolujen liittyvät DNA: n TLR9 ja STING välitteisten reittien HT-29 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen adenokarsinooma solujen ja normaalien fibroblastien.

Materiaalit ja menetelmät

DNA eristettiin normaalista ja tumorous paksusuolen epiteelissä tuoreen jäädytetty poistaa kirurgisesti kudosnäytteitä käytettiin 24 ja 6 tuntia hoidon HT-29 paksunsuolen karsinooma ja HDF-α fibroblastisoluissa. Koko genomin mRNA ilmaisun analyysi ja qRT-PCR suoritettiin elementtien /jäsenet TLR9 signalointireitin. Immunosytokemiassa suoritettiin epiteelin markkereita (eli CK20 ja E-kadheriinin), DNA metyylitransferaasin 3a (DNMT3a) ja NFKB (käsitellyn HDFα soluja).

Tulokset

hallinto Kasvaimen aiheuttamien DNA HT29 solut johti merkittävästi (p 0,05) mRNA-tasolla muutos 118 geeneistä (logFc≥1, p≤0.05), mukaan lukien yliekspressio metallotioneiinin geenien (eli

MT1H

,

MT1X

,

MT1P2

,

MT2A

), etäpesäke liittyvien geenien (eli

TACSTD2

,

MACC1

,

MALAT1

), kasvain biomarkkereiden (CEACAM5 ), metabolinen geenit (eli

INSIG1

,

LIPG

), messenger molekyyli geenit (eli

DAPP

,

CREB3L2

).

Lisääntynyt

proteiinin tasot CK20, E-kadheriinin ja DNMT3a jälkeen havaittiin kasvaimen DNA hoidon HT-29-soluja. Terve DNA hoito vaikuttaa mRNA ilmentymistä 613 geenien (logFc≥1, p≤0.05), mukaan lukien lisääntynyt ilmentyminen keskeisten adapterin molekyylien TLR9 reitin (esim

Myd88

,

IRAK2

,

NFKB

,

IL8

,

IL-1β

), STING koulutusjakso (ADAR, IRF7, CXCL10, CASP1) ja

FGF2

geeni.

päätelmät

DNA tumorous paksusuolen epiteelin, mutta ei normaalista epiteelisolujen toimii pro-metastaattinen tekijä HT-29-solujen avulla yli-ilmentyminen pro-metastaattisen geenien kautta TLR9 /MyD88 riippumattoman reitin. Sitä vastoin DNA: n, jotka ovat peräisin terveiden paksusuolen epiteelin indusoi TLR9 ja STING signalointireitin normaaleissa fibroblasteissa.

Citation: Furi I, Kalmár A, Wichmann B, Spisák S, Schöller A, Bartak B, et ai. (2015) Cell Vapaa DNA Kasvain alkuperä indusoi Metastaattinen Expression Profile HT-29 Cancer Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0131699. doi: 10,1371 /journal.pone.0131699

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 08 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 5 kesäkuu 2015; Julkaistu: 02 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Furi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat saatavilla kautta Gene Expression Omnibus (GEO) hakunumerolla GSE67557.

Rahoitus: Tämä tutkimuksen rahoittivat tutkimus- ja Technology Innovation Fund, Unkari, KMR_12-1-2012-0216 BM ja Unkarin tieteellinen tutkimus Fund (OTKA-K111743 avustus) ja ZT. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Altered epiteelin-strooman vuorovaikutukset ovat perustavanlaatuisia syövän muodostumiseen. Niistä tunnettu sääntelyn ligandeja (esim kasvutekijät, sytokiinit, kemokiinit, sukupuolihormoneja) kasvainkudoksen johdettua DNA on mukana tässä tiedonannossa kautta cellular aistivat DNA [1] Useiden tutkimusten mukaan [2-4] DNA-fragmenttien kasvaimen alkuperää (eli 21-500 emästä lyhyet sekvenssit ihmisperäisiä) rooli muodostumista kasvain tukevaa mikroympäris- (eli edistävät syövän leviämisen ja kiertäminen immuunivalvonnan) [5-8] solu vapaa DNA on peräisin nekroottisen /apoptoottisten kasvainsolujen, ja voi aktiivisesti vapauttaa elävien solujen solujen väliseen osastoon [9-12]. Tämä kasvain kudos alkunsa DNA on havaittavissa plasman ja seerumin ja voisi toimia hyödyllisenä biomarkkeri syövän havaitsemiseen [11]. Se sisältää useita syövän erityisiä yksiköitä, mukaan lukien onkogeenien, tuumorisuppressorigeenit, poikkeava mikrosatelliitit, poikkeava DNA: n metylaation geenejä, ja muunnetaan kromosomaalista DNA: ta [12]. Viimeaikaiset tutkimukset vahvistivat ottoa ja säilyttämistä onkogeenien stimuloivan solujen lisääntymistä ei-pahanlaatuisia soluja jälkeen integraatio (oncometastasis) osaksi vastaanottajat cell’s genomi [13].

Siinä määrin ne ymmärretään, DNA tunnistus mekanismeja kohdesoluihin käsittävät kaksi ensisijaista sovittimen väyliä, eli toll-like-reseptori (TLR9) ja stimulaattorin interferoni-geenien (STING) polkuja. [14] Sytoplasmiset TLR9 tunnistaa endogeenisten ligandien, kuten vaara liittyvä molekyyli kaavoja (vaimentaa), kuten metyloimattoman DNA-sekvenssit [7, 8, 15] kokonaismäärä metyloimattoman DNA kasvaa samanaikaisesti globaalin DNA hypometylaatio kasvainkudoksessa verrattuna normaalissa kudoksessa [16]. Lisääntynyt ilmentyminen TLR9 havaittiin useissa kasvaintyypeissä. [1, 17-20] Lisääntynyt TLR9 ilmentyminen karsinoomasoluja liittyi korkeampi metastaattinen potentiaali, kun taas korkeammat TLR9 ilmentymisen fibroblastien kaltaisten solujen liittyi pieni todennäköisyys etäpesäkkeiden [ ,,,0],21]

STING signalointireitin on sovitin DNA sitoutumisen kautta syklisten dinukleotidien tuottaman entsyymin syklisen GMP-AMP (cGAMP) syntaasi (cGAS). [22-24]

Strong synergia on havaittu keskuudessa yhteistyössä STING ja TLR9 signalointi. Nämä kaksi signalointipolkujen differentiaalisesti säätelevät ratkaisevan sovitin molekyylien (IRF3 /7, STING, ja MyD88) [25]. Lisäksi Deng et al. (2014) ja Woo et al. (2014) edellyttäen näyttöä siitä dendriittisolujen havaita DNA kasvainsoluista kautta STING välittämää soluliman DNA tunnistus reitin. [22, 26, 27]

Perustuu aikaisempiin tuloksiin, HT-29 ihmisen paksusuolen adenokarsinoomasolua heijastuu muuttunut DNA: n metylaatio tasolla (via kohonnut DNMT3a methyltranferase aktiivisuutta) ja CK20 epiteelin merkki ilmaisun jälkeen antamista uudelleen itsensä DNA . [28] Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet autokriininen ja parakriininen vaikutukset DNA kasvain ja terveen kudoksen HT-29 syöpäsoluja ja fibroblastien koko genomista mRNA ilmaisun analyysi, ja qRT PCR validointi geenien TLR9 polku. Lisäksi immunosytokemiallisessa analyysi tehtiin valituille Differentiaatiomarkkerien, solu- adheesiomolekyylien, ja metyylitransferaasit, tarkastettavaksi proteiinitasolla hoidon jälkeen DNA terveistä ja kasvaimen kudokset.

Materiaalit ja menetelmät

HT -29 soluviljelmässä

HT-29 ihmisen paksusuolen adenokarsinooma-solut hankittiin LGC STANDARDS (cat. nro ATCC HTB-38), ja viljeltiin spesifisissä patogeenivapaissa soluviljelmässä laboratoriossa 37 ° C: ssa 5% CO

2. HT-29-soluja ylläpidettiin McCoyn 5a Medium Modified (Cat No. M8403-500 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), johon oli lisätty 10% (tilavuus /tilavuus) naudan sikiön seerumia (FBS; Standard Quality, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Itävalta), 160 ug /ml gentamysiiniä (Sandoz, Sandoz GmbH, Itävalta), ja 125 ug /ml amfoterisiini B (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

HDFα soluviljelmässä

HDFα solut hankittiin Life Technologies (cat. No. C0135C) ja viljeltiin spesifisissä patogeenivapaissa soluviljelmässä laboratoriossa 37 ° C: ssa 5% CO2: ta. HDFα soluja ylläpidettiin Medium 106 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA) täydennettynä LSGS (Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA) ja amfoterisiini B: tä (Sigma). 160 ug /ml gentamysiiniä (Sandoz, Sandoz GmbH, Itävalta).

DNA: n eristä-

Genominen DNA eristettiin makroskooppisesti normaali alueilla lähellä paksusuolen ja peräsuolen syöpiä (CRC) ja kasvainkudoksessa alueilla kirurgisesti poistetaan macrodissected tuore CRC näytteitä (vaihe II, kohtalaisesti eriytetty kasvaimia sigmoid paksusuolen ja peräsuolen (25-50 mg kudosta) High Pure PCR-templaattina kittiä (Roche GmbH, Saksa). Näitä CRC potilaat olivat kaikki vahvistettiin lopullisesti histologisia diagnoosin ja ei ole saanut ennen leikkausta kemoterapiaa tai sädehoitoa. eristetty proteiini-free-DNA käsiteltiin 20 ul RNaasi A /T1 Mix 37 ° C: ssa 1 tunti (Thermo Scientific, Saksa). pitoisuus eristetty ja puhdistettu DNA määritettiin Nanodrop- 1000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific, Saksa).

Ethics selvitys

tutkimus suoritettiin ilmoituksen mukaan Helsingin ja hyväksynyt Semmelweis University eettisen komitean ja valtiollisten alue- ja institutionaalisten komitean tiede- ja Research Ethics (TUKEB), nro: 23970-2 /2011). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta mukana tutkimuksessa.

DNA hoitoon HT-29 ja HDFα solujen

HT-29 ja HDFα solut ympättiin (tiheydellä 0.5×10

6 ja 0.1×10

6) 6 hyvin Corning CellBIND soluviljelmässä monikuoppalevyihin RPMI 1640 täydennettynä gentamysiini, amfoterisiini B ja FBS. Kun yksisolukerrokset saavutti 80-90% konfluenssiin, 15 ug normaali tai kasvaimen DNA: ta (liuotettu 200 ul: aan steriiliä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), lisättiin kuoppiin. Negatiivinen kontrolli koostui sopivat tilavuudet PBS: ää. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO2 ilmakehässä ja 95%: n kosteudessa.

eristäminen kokonais-RNA: Affymetrix HGU133 Plus 2.0 microarray ja qRT-PCR-geenin ilmentyminen analysoidaan

24 tunnin kuluttua solut pestiin kaksi kertaa 5 ml: ssa steriiliä PBS: ää. toisen pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 5 ml: aan PBS: ää. 2,5 ml solususpensiota käytettiin kokonais-RNA: eristäminen. kokonais-RNA eristetyistä HT-29-solujen uutettiin RNeasy Mini kit (Qiagen, USA) ohjeiden mukaisesti ja valmistajan. eristetty RNA säilytettiin -80 ° C: ssa.

mRNA: n ilmentymisen mikrosiruanalyysi

määrä ja laatu eristettyjen RNA testattiin mittaamalla absorbanssi ja kapillaarisen geelielektroforeesilla käyttämällä 2100 Bioanalyzer ja RNA 6000 Pico Kit (Agilent Inc, Santa Clara, USA). Biotinyloidut cRNA koettimet syntetisoitiin 4,82 ± 0,60 ug kokonais-RNA ja hajanainen käyttämällä One-Cycle Target merkintöjen ja valvonnan Kit mukaan Affymetrix kuvausta. Kymmenen ug kutakin hajanainen cRNA näytteen hybridisoitiin osaksi HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) 45 ° C: ssa 16 tunnin ajan. Mikrosiruja pestiin ja värjättiin käyttäen Fluidics Station 450 (Affymetrix) ja vasta-aineen vahvistus värjäys mukainen menetelmä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fluoresoivat signaalit havaitaan GeneChip- Scanner 3000 (Affymetrix).

tilastollinen arviointi mRNA ekspressioprofiileja

Pre-processing ja laadunvalvontaa analyysit tehtiin mukaan ehdotuksia The Kasvainten Analysis Paras käytännöt työryhmä (Kasvaimen Analysis Best Practices Working Group, 2004). Skannatut kuvat tarkastettiin esineitä; prosenttiosuus esillä puheluita ( 25%) ja asteen RNA: n hajoamisen arvioitiin. Pohjalta arviointikriteerit, kaikki mittaukset täytti minimaalinen laatuvaatimukset. Kun kyseessä on HT29 ja HDFα solu kokeita, samankaltaisuus 2-2 biologisen toistojen todettiin käyttäen euklidisen etäisyyden menetelmää. Affymetrix ilme taulukot olivat esikäsitellyt by gcRMA kanssa quantile normalisoinnin ja mediaani kiillottaa yhteenvetoa.

Lisäksi analyysit tunnistaa ilmentyvät eri ominaisuuksia suoritettiin merkitys analyysi mikrosiruja (SAM). Lähin kutistunut centroid menetelmä (ennustaminen analyysi mikrosiruja = PAM) levitettiin näytteen luokittelun geenien ilmentyminen tietoja. Prediction analyysi mikrosiruja käytetään pehmeää kynnysarvovalvonta tuottaa kutistunut centroid, joka mahdollistaa valinnan ominaisuuden geenien korkean ennakoivaa potentiaali (Tibshirani et al, 2002). Pre-processing, data mining ja tilastollisia vaiheet tehtiin käyttämällä Bioconductor kirjastoja R-ympäristössä. Lisäykset ja toiminnallinen luokitus syrjivien geenien suoritettiin käyttäen Affymetrix NetAffx järjestelmä.

käänteistranskriptiolle ja kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Kun kvantitatiivinen (Nanodrop) ja laadullisesti (Bioanalyzer RNA 6000 Pico Kit chip kit RNA ohjelma; RIN 8 kaikissa tapauksissa), käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen 1 ug kokonais-RNA (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems, USA).

Quantitative reaaliaikaista (qRT ) PCR suoritettiin käyttäen Probes Master ja SYBR vihreä (Roche GmbH, Saksa). Geeniekspressiotasot kunkin yksittäisen näytteen normalisoitiin GAPDH ilme. Keskimääräinen suhteellinen geenin ilmentyminen määritettiin ja erot laskettiin käyttäen 2-ACk (t) menetelmä. Oligonukleotidialukkeita TLR 9 (MyD88-riippuvainen) signalointireitin on lueteltu taulukossa 1.

Solujen elinkelpoisuus määritykset

0.1×10

6 HT-29-solut ympättiin tiheys 0.1×10

6 osaksi Corning CellBIND soluviljelmässä monikuoppalevyihin RPMI 1640 täydennettynä gentamysiiniä ja FCS. 24 tunnin kuluttua väliaine vaihdettiin; ja 15 ug kasvaimen ja normaalin DNA: n [liuotettu 200 ul: aan steriiliä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS)] lisättiin kuoppiin. Negatiivinen kontrolli koostuu sopivaan tilavuuteen PBS: ää. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO2 ilmakehässä ja 95%: n kosteudessa 72 tuntia.

72 tunnin käsittelyn jälkeen solut kerättiin talteen, pestiin kaksi kertaa 0,5 ml: ssa steriiliä PBS: ää, suspendoitiin uudelleen 1,0 ml: aan jääkylmää 70% etanolia ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Mittaus suoritettiin kolmena rinnakkaisena kussakin testiryhmässä.

Näytteitä sentrifugoitiin 3 minuuttia 1300 rpm. Sitten solut suspendoitiin uudelleen 300 μ1: aan uuttopuskuria; ja 3 ui RNAasi (RNaasi A /T1 Mix, Thermo Fisher Scientific Baltia UAB, Vilna, Liettua) lisättiin. 15 min kuluttua huoneenlämpötilassa inkuboinnin, 3 ui propidium- jodide (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; Cat. No. 81845) lisättiin. FACS-mittaus suoritettiin BD FACScalibur (New Jersey, USA).

trypaanisiniekskluusiolla suoritettiin arvioimiseksi solun elinkykyä altistumisen jälkeen kasvaimen ja normaalin solun vapaan DNA: ta. HT-29 cell’s elinkelpoisuus kvantitoitiin sitten laskemalla elävät ja kuolleet solut hemosy- ajanhetkellä 72 tuntia kasvain ja normaali DNA hallinto.

immunosytokemi- analyysi

Mistä HT-29 solususpensiota 2,5 ml käytettiin immunosolukemiallisten (ICC) analyysit. HT-29-solut olivat cyto sentrifugoitiin päälle peitelevy ja kiinnitettiin metanolissa lämpötilassa -20 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja sitten inkuboitiin TBS: ssä, joka sisälsi 1% naudan seerumialbumiinia, 10% normaalia vuohen seerumia, 0,3 M glysiiniä ja 0,1% Tween 20: , 1 tunti solujen permeabiliteetin aikaan saamiseksi ja estää ei-spesifisten proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia.

2×10

5 HDFα fibroblasteja ympättiin Lab-Tek 8-kuoppaisen kammion liukuu 500 ul media (Thermo Scientific, Rochester, NY) ja viljeltiin, kunnes 80-90% konfluenssiin. Sen jälkeen, kun DNA-käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla -20 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja sitten inkuboitiin PBS: ssä, joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia, /10% normaalia vuohen seerumia, /0.3 M glysiiniä ja 0,1% Tween 20, TBS-Tween 1 tunti solujen permeabiliteetin aikaan saamiseksi ja estää ei-spesifisten proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia.

immunovärjäystä, soluja käsiteltiin hiiren anti-humaani monoklonaalinen anti-TLR9 IgG: tä (1: 300; ab85860, Abcam, Cambridge, MA, USA), ja anti-DNMT3a IgG: tä (1: 300; ab13888, Abcam, Cambridge, MA, USA) 4 ° C: ssa yön yli, käyttäen HeLa-soluja positiivisena kontrollina; anti-sytokeratiini 20 (1: 200, klooni: PCK-26, Dako, Glostrup, Tanska), E-kadheriinin (1: 2, klooni: ECH6, histopatologian Ltd, Pecs, Unkari) käyttäen ihmisen paksusuolen limakalvon positiivisena kontrollina; ja kanin anti-NFKB IgG: tä (1: 100, GTX102090, Genetex, San Antonio, Texas, USA) käyttämällä HepG2-soluissa positiivisena kontrollina.

Leikkeitä inkuboitiin 30 min peroksidaasileimatulla polymeeri-piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua vuohen anti-hiiri /kani immunoglobuliineja (Envision + System-HRP-DAB; Dako, Glostrup, Tanska). Värjäys saatiin päätökseen inkuboimalla 3,3’diaminobenzidine kromogeeniliuoksen (kromogeeniliuoksen on osa Envision kit). Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä.

ICC arviointi

Lasit digitalisoitu käyttämällä korkean resoluution Panoramic Scan väline (3DHistech Ltd., Unkari) ja analysoitiin Panoramic Viewer Histoquant Module ohjelmisto (3DHistech Ltd ., Unkari). 1000 solua /slide arvioitiin. Kun kyseessä on E-kadheriinin, CK20, sytoplasmisen immunoreaktioita pisteytettiin negatiivisiksi (-), heikko (+), kohtalaisesti (++) ja vahva (+++). NFKB, DNMT3a ydin- /sytoplasmisen ilmaisuja pisteytettiin negatiivisiksi (-), heikko (+), kohtalainen (++) ja vahva (+++) immunoreaktioita. Tiheys negatiivinen (-), heikko (+), kohtalainen (++) ja vahva positiivinen (+++) pikseleitä immunoreaktiivisen soluissa arvioitiin.

Tulokset

vaikutus normaalia ja pahanlaatuinen epiteelin DNA HT-29-solujen

Ensimmäinen, käsittelimme HT-29-solujen DNA eristettiin normaalista tai kasvainkudoksen. Molemmat hoidot indusoidun mRNA: n yli-ilmentyminen metallotioneiinin geenit (so MT1H, MT1G, MT1X, MT1P2 ja MT2A) (metallotioneiini 1H, -1G, -1x, -1P2, 2A) (kuvio 1A ja 1 B). Kasvainkudoksessa johdettu DNA-hoito johti merkittävään yli-ilmentyminen n = 118 geenit (mRNA-tasolla). Näistä geeneistä, havaitsimme etäpesäke liittyviä geenejä esim kasvain biomarkkereiden CEACAM5 (syöpä -antigeeni liittyvät soluadheesiomolekyyli 5), metabolisen geenejä esim INSIG1 (insuliinin indusoima geeni 1) LIPG (endoteelin lipaasi) ja messenger molekyylin geenien DAPP1 (dual-sovitin Fosfotyrosiinin ja 3-Fosfoinositidien), CREB3L2 (cAMP-vaste-elementtiin sitoutuva proteiini 3-like 2) (taulukko 2) B

Heat kartta edustavat RNA ilmentymisen muutosten ohjaus HT-29-solujen ja HT-29-solujen käsitelty DNA eristettiin terveistä (A) ja tumorous (B) paksusuolen epiteelissä.

täydellinen säännelty geenejä on saatavilla (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) kanssa hakunumerolla GSE67557.

Analyysi 12 elementtejä TLR9 väylän HT-29-soluihin qRT-PCR

HT-29-solujen joko kasvain ja terveen paksusuolen kudosta johdettu DNA vaikutti merkittävästi IL-1β geeniin liittyvä PBS: llä käsiteltyihin kontrolleihin. Yliekspressio Tämän geenin oli korkeampi, kun kasvainkudoksen johdettu DNA hoitoon (log Fc 2,33; p≤0.05), kuin näytteissä, käsiteltiin normaalin DNA: n (log Fc 1,59; p≤0.05) liittyvät käsittelemättömiin kontrolleihin (kuvio 2A ja 2B).

Expression muutoksia TLR9 MyD88 riippuvaisen reitin geenien Affymetrix U 133 2,0 microarray valvonta, normaali ja tumorous DNA käsiteltyjen näytteiden (A) Kuva ja q RT-PCR-analyysi TLR9 MyD88 riippuvaisen reitin HT-29-soluja ( B).

solun luelinkykymäärityksillä

tulokset trypaanisinieksluusiolla testi heijastuu että kasvainsolu vapaa DNA hoito lisäsi merkittävästi elävien solujen lukumäärän suhde valvoa ryhmään (av. 54,22 ± 3,03 vs. 42,00 ± 3,78; p≤0.05). Havaitsimme lisäksi merkittävästi vähentynyt määrä elävien solujen normaalin DNA hoidetussa ryhmässä Valvontaan liittyvät ryhmään (av. 28.67 ± 3,08 vs. 42,00 ± 3,78; p≤0.05); (Kuvio 3A ja 3B).

määrä eläviä (A) ja kuolleet (B) HT-29-solujen määrää trypaanisiniekskluusiolla testi; PI solusyklin analyysi HT-29 koolonin syövän solujen (C).

PI solusyklin analyysi osoitti merkitsevästi suurempi elävien solujen populaation (G1 + S + G2 + M-vaihe) kasvaimen DNA käsiteltiin ryhmä vs. kontrolliryhmä (av. 39.11 ± 0,57 vs. 32,00 ± 2,50; p≤0.05). Normaali DNA hoito ei vaikuttanut solusyklin laskettujen solujen, mutta havaitsimme alempi solumäärän normaalissa DNA käsiteltiin näytettä (kuvio 3C).

vaikutus normaalien ja pahanlaatuisten epiteelin DNA fibroblastisoluista

hoito HDFα fibroblastien normaalin DNA johti yli-ilmentymiseen monissa geenien TLR9 Myd88 koulutusjakson, sytokiinien, kemokiinien, kasvutekijät, apoptoosin liittyvät geenit, ja prostaglandiineja. Kaikkiaan DNA normaalista paksusuolen kudos johti merkittävään ilmentymisen muutos n = 613 geenien (kuvio 4A). Sitä vastoin hoito kasvain kudos johdetun DNA vaikutti ilmentymistä vain n = 12 geenejä (kuvio 4B).

Heat kartta edustavat RNA ilmentymisen muutosten ohjaus HDFα soluissa ja HDF-α-solut käsiteltiin DNA eristetään terve (A) ja tuumori- (B) koolonin epiteelissä.

Tärkeää geeniekspression aiheuttamien muutosten terve kudos on peräisin DNA-hoidon HDFα soluissa on esitetty yhteenvetona taulukossa 3. cell free DNA indusoi säätelyä kemokiinin ligandit, kuten kemotaktisten tekijöiden, prostaglandiinien ja reseptorit prostaglandiinit lisäksi DNA tunnistus polkuja.

jälkeen kasvaimen DNA hoitoon HDFα fibroblastien, emme havainneet yliekspressio elementtejä TLR9 reitin, kemokiinit, kasvutekijät , apoptoosin liittyvät geenit, prostaglandiinit ja reseptorit prostaglandiinit.

täydellinen geenien on saatavilla (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) kanssa hakunumerolla GSE67557.

Analyysi 12 osia TLR9 polku fibroblastien qRT-PCR

Viisi geenit kanonisen TLR9 reitin (IRAK2, MyD88, NFKB, IL-8, IL-1β) osoitti merkittäviä yliekspressio käsittelyn jälkeen normaali kudos peräisin oleva solu vapaa DNA Valvontaan liittyvät soluihin. Kasvainkudoksessa johdettu DNA hoito ei vaikuttanut geenien TLR9 Myd88 reitin. (Log Fc ≥1, p≤0.05); (Kuvio 5A ja 5B).

Expression muutoksia TLR9 Myd88 riippuvaisen reitin geenien Affymetrix U 133 2,0 microarray valvonta, normaali ja tumorous DNA käsiteltiin näytettä (A) ja q RT-PCR-analyysi TLR9 Myd88 riippuvaisen reitin on HDF alfasoluista (B).

ICC analyysi epiteelisolujen erilaistumisen, adheesion ja metylointi markkereita

Tässä valitsimme kolme epiteelin markkereita eli CK20. E-kadheriinin, DNMT3a perustuvat aikaisempiin tuloksiin. [28] PBS-käsitellyt HT-29-solut osoittivat heikkoa kalvo CK20 (kuvio 6A), E-kadheriinin (kuvio 6D) ja heikko /kohtalainen sytoplasman DNMT3a (kuvio 6G) proteiinin ilmentymisen. Kasvain DNA indusoi ilmentymisen lisääntyminen on CK20 vahva positiivinen (+++) pikseliä, (kuvio 6C) E-kadheriinin heikko (+) ja kohtalainen (++) positiivinen pikseliä (kuvio 6F) ja DNMT3a heikko (+) positiivinen kuvapistettä ( Kuva 6I). (P≤0.05). Kasvain DNA edistänyt CK20 ja E-kadheriinin ilmentymisen jaksottamattomien, HT-29 paksunsuolen adenokarsinoomasolua sekä mRNA ja proteiini tasolla (taulukko 4, kuvio 6C ja 6F) (p≤0.05). DNMT3a proteiinin yli-ilmentyminen korreloi aikaisempiin tuloksiin [28].

CK20 ilmentymistä HT-29 koolonsyöpäsoluihin käsittelyn jälkeen steriiliä PBS (A), DNA normaalista paksusuolen epiteelin (B), jonka DNA tumorous paksusuolen epiteelin (C) E-kadheriinin ilmentymisen käsittelyn jälkeen steriilillä PBS: llä (D), DNA normaalista paksusuolen epiteelistä (E), jonka DNA tumorous paksusuolen epiteelin (F) DNMT3a ilmaisu käsittelyn jälkeen steriilillä PBS: llä (G) , DNA normaalista paksusuolen epiteelin (h), jonka DNA tumorous paksusuolen epiteelin (I).

ICC analyysi transkriptiotekijöiden ja metylaation markkereita fibroblasteissa

NF-KB (p65-alayksikkö) heijastunut heikko sytoplasmista /nucleolic ilmentymistä PBS käsitelty kontrolli fibroblasteissa (kuvio 7D). Vaikutuksesta normaalin kudoksen DNA: ta (kuvio 7E), mutta ei tuumorin kudoksen peräisin DNA: sta, (kuvio 7F) fibroblastien näkyy ilmentymisen lisääntyminen NFKB heikosti positiivinen pikseliä (+).

DNMT3a ilmentymisen HDF alfa fibroblasteissa käsittelyn jälkeen steriiliä PBS (A), DNA normaalista paksusuolen epiteelin (B), jonka DNA tumorous paksusuolen epiteelin (C), NFKB lauseke käsittelyn jälkeen steriiliä PBS (D), jonka DNA normaalista paksusuolen epiteelin (E ), jonka DNA tumorous paksusuolen epiteelin (F).

sytoplasminen DNMT3a ilme oli heikko (+), kohtalainen (++) taso normaaleissa fibroblasteissa (kuvio 7A). Suhde heikko positiivinen (+) pikselit on hieman lisääntynyt sen jälkeen, kun normaali ja kasvaimen DNA jälkeen (kuvio 7B ja 7C).

immunosolukemiallisten tuloksia HT-29-soluja ja HDFα fibroblastit on esitetty yhteenvetona kuviossa 8A, 8B , 8C, 8D ja 8E.

ICC arviointi CK20 (A), E-kadheriinin (B) ja DNMT3a (C) HT-29 koolonin syövän solujen ja NFKB (D) ja DNMT3a (E) HDF alfa fibroblasteissa.

keskustelu

päätavoitteena työmme oli tutkia muutoksia geenien ilmentyminen antamisen jälkeen solun vapaa DNA eristettiin terveistä ja tumorous koolonkudoksessa HT-29 epiteelisolujen ja fibroblastien. Emme ole tietoisia mistään tutkimuksissa on tutkittu ilmaisun muutoksia kahden eri solutyyppejä yhteistyössä aikana tumorigenesis tai vaikutus solun vapaa DNA eri alkuperää. Uusimpien julkaistu tutkimuksia, bakteeri-DNA aktivoi DNA tunnistus reseptoreihin, mahdollisesti johtuen taajuutta metyloimattoman CpG sekvenssit bakteerigenomissa, joka on 20 kertaa suurempi kuin selkärankaisilla genomiin. [35] Vuodesta lisätutkimuksia oli selvää, että DNA patogeenisten bakteerit ylössäätävät TLR9 ilmaisun [15], Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet geeniekspression aiheuttamien muutosten DNA kasvain alkuperää syöpäsoluissa, jonka koko genomin array. Tämä lähestymistapa on samanlainen kuin raportoineet Lee et. al. (2014), jotka osoittivat omaksumista, sisällyttäminen ja vaikutus tämän kasvainkudoksen alkunsa DNA soluproliferaatioon. [13]

geeniekspression tuloksia vahvistetaan align huomautukset viime julkaisuja osoitti, että ehjä kasvaimen DNA sitoutuu kuten ligandin TLR9, mutta ei johda alavirran aktivaation TLR9 reitin [36]. Tutkimuksessamme meidän koko genomin joukko tuloksia näyttöä siitä, että tumorous DNA toimii pro-metastaattinen tekijä riippumatta TLR9 ja STING reitit indusoimalla yliekspressio etäpesäkkeiden liittyvien geenien (MACC1, MALAT1, TACSTD2), tuumorimarkkeri (CEA) , metabolinen geenit (INSIG1, LIPG) ja messenger molekyyli geenit (DAPP, CREB3L2). MACC1 on merkittävä pro-metastaattinen tekijä, joka osoitti merkittävää yliekspressio hoidon jälkeen kasvaimen DNA. Tämä geeni liittyy läheisesti korjauksilla ilmauksia solun cycle- ja invaasio liittyviä proteiineja. [37] Tuloksemme heijastaa yli-ilmentyminen muita tärkeitä pro-metastaattinen geenit (MACC1, MALAT1, TACSTD2) vahvistavat aiemmat tiedot heijastavat merkittävä rooli näiden geenien etäpesäkkeitä ja niiden yhteydessä huonoon ennusteeseen erilaisissa ihmisen epiteelisyövissä. [29, 37, 38]

Tuumorikudos johdettu DNA hoito vaikuttaa INSIG 1 ja LIPG ilme. Nämä kaksi keskeiset elementit endoteelisolujen rasva-aineenvaihdunnan tiedetään myös liittyvän syövän etenemisessä. [31, 32] Lisääntynyt LIPG ilmentyminen raportoitiin mahdollisena virtsan syöpä biomarkkereiden. [32] Tutkimukset kuvattu lisääntyneen ilmentymisen toissijainen messenger molekyylejä (DAPP, CREB3L2) paksusuolen syövän kasvun ja invaasion koolonkarsinoomasoluissa kautta PI3K /AKT-reitin aktivointi. [33]

havaittu, että hoito kasvaimen DNA johtaa myös yli-ilmentyminen sytokeratiini 20, ja E-kadheriinin, joka on validoitu sekä RNA (taulukko 4), ja proteiinin taso (kuvio 6C ja 6F ). E-kadheriinin erittäin tärkeä säätelevä tekijä solu-solu-vuorovaikutuksen osoitti myös korkeampia ilmentymistä HT-29-solut, joita käsiteltiin kasvaimen DNA. E-kadheriinin yliekspression johtaa tukahduttaminen β-kateniinin-Tcf /Lef-riippuvaisen transkription ja todennäköisesti estää solujen apoptoosia. [39]

DNA: n metylaatio muutokset välittyvät DNMT3a ovat tyypillisiä paksusuolen syöpiä. Re-ilmentyminen tekijöiden kohdistaminen DNMT3a ilmaisu merkittävästi vähentynyt kasvaimen kasvua. DNMT3a yliekspressio hoidon jälkeen kasvaimen DNA päättelee mahdollisen yhteyden metylaatiostatuksen kasvainkudoksen peräisin DNA: n ja vaikutusmekanismi kasvainkudoksen johdettujen DNA-sekvenssien välityksellä toimiva DNA tunnistus reseptoreihin. Aiemmat tutkimukset korostavat keskeinen rooli tämän entsyymin peräsuolen syövän muodostumisen. [40]

Colon syöpä kudos ei ole eristetty, mutta sen solu- miljöö kautta kemokiinien, sytokiinien, kasvun ja apoptoosin signaaleja kommunikoi muiden kudosten. Tutkimuksissa on tarkasteltu roolin normaalin ja syövän liittyy fibroblastien (valuuttalisiin) kolorektaalisyövässä ja osoittaneet, että valuuttalisiin viljeltiin yhdessä epiteelisolujen lisää kasvaimen kasvua [41], mutta ne eivät roolin määrittämiseksi normaalien fibroblastien erikseen tuumorigeneesiin. Tavoitteena oli määrittää reaktion normaalien fibroblastien ympärillä epiteelisolujen crypts julkaistuun DNA ja seulontaan reittejä mukana tässä prosessissa.

Normaalissa fibroblasti hoidon DNA normaalista luukudoksen aktivoitumisen TLR9 kanoninen polku kuten qRT-PCR paljasti yliekspressio monien geenien TLR9 MyD88 riippuvaisen reitin (MyD88, IRAK2, NFKB, IL-8, IL-1β).

alkaen koko genomin mikrosiruanalyysi tulokset voidaan päätellä, että terveillä DNA in fibroblastien ei ainoastaan ​​tunnista TLR9 MYD 88 riippuvaisen reitin, mutta huomasimme, että elementit STING riippuvan soluliman reitin myös osoitti merkittäviä yliekspressio, mikä käynnistää IFN tuotantoa. Käyttämällä Kegg reitin kartta (https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04623+340061) 4-geenien (ADAR, IRF7, CXCL10, CASP1) päässä STING polku oli merkittävä yli-ilmentyminen käsittelyn jälkeen terveiden DNA in HDF-α fibroblasteissa. Tämä aktivoitu cGAS /STING-riippuvaisen DNA-tunnistus reitin indusoitu yli-ilmentyminen interferoni säätelytekijöiden IRF1, IRF2, IRF7, IRF9. ja indusoi voimistunutta ilmentymistä interferoni-reseptorin geenien (IFNAR2, IFNGR2). (Log FC≥1, p≤0.05) yliekspressio CASP1 ja NLRC 5 ehdottaa NLRC5-riippuvainen aktivaatio inflammasome. Davis et. al. julkaistu että NLRC5 yhteistyössä NLRP3and RNA-interferenssi-välitteisen knockdovvn NLRC5 lähes eliminoitu kaspaasi 1 toimintaa. [42]

NFKB kuin transkription säätelytekijän osoitti merkittäviä yli- ilmeneminen fibroblasteissa hoitaa normaalia DNA. (Kuva 7E) Se osoittaa, että solu vapaa DNA indusoi NFKB translokaation luovuttamista koskevat proinflammatoristen sytokiinien ja kasvutekijöiden.

Koko genomin microarray-analyysi osoitti silmiinpistävän eri määrä säätelevien geenien terveen ja kasvainkudoksen peräisin DNA-antoa (613 ja 12-geenien, vastaavasti). Vaikka terve DNA aktivoituu DNA tunnistus järjestelmien ja voimistuvan monia geenejä sytokiinien, kemokiinien, kasvutekijät, apoptoosin liittyvät geenit, prostaglandiinit, kasvaimen DNA vaikutti vain vähän geenejä, jotka eivät liity tähän säätelyyn. Mielestämme normaalien fibroblastien eivät reagoi kasvaimen DNA ja pitkäaikainen syöpään fibroblastien vuorovaikutus voisi aloittaa muutosta normaalien fibroblastien sinoomaan liittyvien fibroblastit tukevat ”metastaattinen” fenotyyppi.

Tutkimuksemme osoittaa mahdollisia etäpesäkkeitä