Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Krooninen tulehdus on usein havaittu histologista analyysiä pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten eturauhasnäytteissä. On epäilty tukeva tekijä eturauhasen sairauksia ja niiden etenemistä ja tärkein syy vääriä positiivisia PSA testit syövän seulontaan. Oletimme, että tulehdus aiheuttaa autovasta, jotka voivat olla hyödyllisiä biomarkkereita. Meidän tavoitteena oli tunnistaa ja vahvistaa eturauhasen tulehdus liittyy seerumin autovasta eturauhassyöpäpotilailla ja arvioida ilmaus vastaavan autoantigeenien.

Methods

Eturauhasen yksilöiden eturauhassyöpäpotilaalla (N = 70) luokiteltiin osaksi korkea ja matala tulehdusta ryhmien määrän mukaan kudoksen tunkeutuvia lymfosyyttejä. Vastaava ennen leikkausta verta seeruminäytteet tutkivat autovasta-aineet käyttämällä alhaisen tiheyden proteiinijärjestelmäksi. Valitut autoantigeeneinä havaittiin eturauhasessa ja niiden ekspressiokuviota analysoitiin immunohistokemiallisesti ja qPCR. Tunnistetut autovasta-profiilia ristiintarkistettiin riippumattomalla näytejoukolla (N = 63) käyttäen Luminex-helmi proteiinijärjestelmäksi teknologia.

Tulokset

Protein joukko seulonta tunnistaa 165 autovasta differentiaalisesti runsaampaa seerumin korkea verrattuna alhainen tulehdus potilaille. Ekspressiokuviota kolmen vastaavan antigeenejä perustettiin hyvänlaatuisia ja syöpäkudoksessa immunohistokemiallisesti ja qPCR: SPAST (Spastin), STX18 (syntaksiini 18) ja SPOP (pilkku-tyypin POZ proteiini). Näistä SPAST lisääntyi merkitsevästi eturauhasen kudoksen korkea tulehdus. Kaikki kolme autoantigeeneinä oli ilmennetty eri ala- ja /tai kastraatio kestävä eturauhasen kasvaimia, kun analysoidaan tulehdukseen riippumaton kudosta mikrosirun. Ristiinvalidointi tulehduksen autovasta profiilin riippumattomaan vedostulostus käyttäen Luminex-helmi proteiinijärjestelmäksi, haetaan 51 merkittävästi erotteleva autovasta. Kolme autovasta merkittävästi yläreguloituja molemmissa näytöissä, MUT, RAB11B ja CSRP2 (p 0,05), kaksi, SPOP ja ZNF671 lähellä tilastollista merkitystä (p = 0,051 ja 0,076).

Johtopäätökset

Tarjoamme näyttöä tulehdukseen erityinen autovasta profiilin ja vahvista ilmentymistä vastaava autoantigeeneistä eturauhasen kudosta. Tämä tukee arviointi autovasta-aineiden, kuten ei-invasiivisia merkkiaineita eturauhasen tulehdus.

Citation: Schlick B, Massoner P, Lueking A, Charoentong P, Blattner M, Schaefer G, et ai. (2016) Serum autovasta-aineiden Krooninen Eturauhasen tulehdus eturauhassyöpäpotilailla. PLoS ONE 11 (2): e0147739. doi: 10,1371 /journal.pone.0147739

Editor: Aamir Ahmed, Kings College London, Yhdistynyt kuningaskunta

vastaanotettu: 28 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 07 tammikuu 2016; Julkaistu: 10 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Schlick et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat saatavilla paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: tutkimusta tukivat COMET K1 Centerin Oncotyrol-keskus Henkilökohtainen Medicine, rahoitetaan itävaltalainen Research Promotion Agency (FFG) ja tulevaisuus säätiö Maa Tirolin ja Protagen AG. ONCOTYROL GmbH, Protagen AG ja TARGOS Molecular Pathology GmbH tuettiin muodossa palkkojen tekijöille [BS, PM, GS], [AL, KM, CT, PA, SM, PSK], [DZ, MK], mutta ei ole ylimääräisiä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Kaikki muut Kirjoittajat julistaa ole kilpailevia kiinnostusta. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: Tutkimusta tukivat COMET K1 Centerin Oncotyrol-keskus Henkilökohtainen Medicine, rahoitetaan itävaltalainen Research Promotion Agency (FFG) ja tulevaisuus säätiö Maa Tirolin ja Protagen AG. Petra Massoner, Georg Schäfer ja Bettina Schlilck työskenteli ONCOTYROL. Angelika Lueking, Klaus Marquart, Carmen Theek, Peter Amersdorfer, Stefan Müllner ja Peter Schulz-Knappe työskenteli Protagen AG. Stefan Müllner on cofounder toimitusjohtaja Protagen AG. Dirk Zielinski ja Matthias Kirchner työskenteli TARGOS Molecular Pathology GmbH. Petra Massoner parhaillaan sidoksissa kuin DAAD mies kanssa Roche Diagnostics GmbH, mutta hänen tietojen mukaan tutkimukseen kertyi ennen kuuluminen, tutkimus esitteli tässä on riippumaton apurahan tai muuta työtä liittyvät Roche Diagnostics GmbH. Protagen AG omistaa patentin ”markkerisekvenssejä diagnosoinnissa eturauhassyöpä, ja niiden käyttö”. Ei ole niin kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaalien yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

eturauhanen on sivusto usein hyvänlaatuinen ja pahanlaatuisen sairauden iän tärkein riskitekijä [1, 2]. Koska varjopuolena jatkuvasti kasvava elinajanodote esiintyvyys eturauhasen sairauksien, kuten eturauhassyövän, eturauhasen liikakasvun (BPH) ja eturauhastulehdus on myös kasvussa ja näiden sairauksien ovat kasvava lääketieteellinen ja sosiaalinen ongelma, vaan myös yhä taloudellinen taakka [3- 6]. Usein, histopatologiset analyysi eturauhasen koepaloja ja kirurgisista näytteistä paljastaa tulehdusta eturauhasen sairaus, useimmiten oireeton, ”krooninen” tulehdus ominaista histologiset muutokset ja immuunijärjestelmän solujen infiltraatit [7-10]. Krooninen tulehdus voi olla yksi kuljettajien eturauhasen sairauden etenemisen ja merkittävä tekijä vääriin positiivisiin prostataspesifisen antigeenin (PSA) eturauhassyövässä testaus [11-15].

lähde intraprostatic tulehdus on vielä ole täysin paljastui, infektio, autoimmuniteetin, solun vammoja, hormonaalista vaihteluista tai ruokavalion tekijät saattavat osaltaan. Niin paljon kuin syynä eturauhastulehdus on jäljellä haaste lisätutkimuksia, sen merkitystä patologisten prosessien on epäselvä [16]. Tutkimukset viittaavat osuus kroonisen tulehduksen ja syövän synnyn ja kehityksen eturauhasen sairaus [17, 18]. Erityisesti proliferatiivinen tulehduksellinen surkastuminen (PIA), joka pidetään eturauhassyövän esiasteleesio, liittyy tulehduksellinen immuunisolujen infiltraatit, jotka stimuloivat proliferaatiota, tukea syövän synnyn kautta parannettu oksidatiivista stressiä ja soluvaurioita ja edelläkävijä pahanlaatuisten rappeuma [19]. Vaikka useimmat tutkimukset osoitettu vaikutus tulehduksen karsinogeenisuutta ja kasvaimen etenemiseen, tämä ilmiö ei rajoitu syöpää, immuunisolujen infiltraatit esiintyy myös usein hyperplastic tai jopa histologisesti normaalissa eturauhasessa kudosta [17].

valossa tarpeesta jatkaa ponnisteluja selvennetään vaikutusta tulehdus eturauhasen sairaus, helposti biomarkkereita eturauhasen tulehdus olisi suuri apu. Lisäksi tällaiset markkereita, jotka mahdollistavat vähemmän invasiivisia tapa diagnosointiin, ennusteen ja hoidon seurantaan kroonisen eturauhastulehdus tarvitaan parantaa potilaan hoitoa, lisätä spesifisyys PSA-testi eturauhassyövän havaitsemiseksi ja johtaa parannuksiin eturauhassyövän hallintaan. Tässä yhteydessä autovasta-aineita, ovat tärkeitä tyyppisiä markkerimolekyylejä, koska ne liittyvät aktiivisuutta immuunijärjestelmän. Vasta-aineet ovat ihanteellisia ominaisuuksia mahdollisina markkereita, ne ovat erittäin vakaita ja ei suoriteta lyhytaikaisten vaihteluiden keskittynyt ne ovat helposti saatavilla kautta seerumi tai plasmanäytteet ja kaikissa kliinisen laboratorion on erittäin herkkiä havaitsemismenetelmiä käytettävissä niiden kvantifiointiin. Syöpäpotilaiden se vakuuttavasti osoittaa, että anti-kasvain immuunivaste voidaan laukaista [20, 21]. Autovasta-aineita syöpää vastaan ​​antigeenejä on tunnistettu potilailla, joilla on eri kiinteä kasvain yksiköt, kuten esimerkiksi rinta- [22, 23], pään ja kaulan [24, 25], keuhko [26, 27], ruokatorven [28], paksusuolen [29] ja eturauhasen [26, 30, 31].

Viimeksi käytimme proteiini mikrosiruja varten autovasta profiloinnin veressä eturauhassyövän potilaiden ja ei-syöpä valvontaa. Olemme tunnistaneet paneeli eturauhassyövän liittyvien autovasta-[31]. Laajentaminen Näissä tutkimuksissa me täällä esitellä tunnistamista ja tunnustamista liittyvien autovasta-aineiden eturauhasen immuuni soluinfiltraat- eturauhassyövän potilailla. Lisäksi arvioimme ekspressiokuviota vastaavien autoantigeeneistä pahanlaatuisia ja ei-pahanlaatuiset eturauhasessa ja tiedusteli mutaatiot saattavat laukaista autovasta.

Materiaalit ja menetelmät

Retrospective näyte kohortti

seeruminäytteet saatiin Eturauhassyöpä Bioresource Department of Urology, Innsbruck Medical University. Veri näytteet oli otettu puitteissa Tirolin eturauhassyövän varhaiseen havaitsemiseen ohjelma ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti [32]. Tietoinen suostumus saatiin kaikki potilaat ja tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea lääketieteellinen yliopisto Innsbruckin (Study AM 3174, tarkistus 2). Kaikki näytteet saatiin ennen eturauhasen leikkaus sairastavien potilaiden biopsialla, kliinisesti paikallinen eturauhassyöpä, jotka olivat vähintään 40-vuotiaita ja jotka olivat saaneet edellisenä eturauhasen syövän hoidossa. Potilaiden valinta matala ja korkea tulehdusta tapauksissa perustui analyysiin koko eturauhanen yksilöitä, tunkeutuvia lymfosyyttejä. Kohortin 70 potilasta (38 korkea, 32 matala tunkeutumisen) varten seulonta tutkimuksessa ja 63 potilasta (33 korkea, 30 matala tunkeutumista) varten rajat validointitutkimusta rekrytoitiin.

Autovasta profilointi

analyysit käytetty autoantigeeni profilointiin, alhaisen tiheyden proteiini array ja Luminex-helmi proteiinijärjestelmäksi vastaavasti perustettiin yhtä laajasti sovellettavissa tekniikkaa eikä nimenomaan eturauhassyövän vain. Kun taas proteiinijärjestelmän tekniikkaa sovellettiin alustava seulonta tutkimuksessa myöhemmin perustettu Luminex-helmi tekniikkaa käytettiin itsenäisenä rajat validointitutkimusta.

Valikoima sisältyvät autoantigeenin proteiinien perustui aiempiin autovasta näytöt eturauhasen syöpä [31] ja autoimmuunisairauksien [33-35], ja julkaistuihin autoantigeeneinä yhteydessä esiintyvistä syöpään [36-42]. Lisäksi proteiini tuotannon tehokkuus, proteiinia laatu, ja määritys ansaintakriteerit katsottiin lopullista valintaa autoantigeeni- proteiineja. 4012 proteiinit valittiin proteiinijärjestelmän, 3061 proteiinit Luminex-helmi proteiinijärjestelmäksi. Autoantigeenille paneelit on lueteltu tukeminen Information (S1 taulukko). Helmen Proteiininmääritys ryhmitelty 8 alaryhmien kuin maksimaalinen käytettävissä useita yksittäin värikoodattu LuminexMagPlex

TM helmiä (Luminex, MV’s-Hertogenbosch, Alankomaat) on 500. Luminex-helmi autovasta määritys perustettava laaja soveltaminen, riippumatta alkuperäisestä eturauhasen pieni /suuri tulehdus seulonnan tulokset ja siksi ei vastaa täsmällisesti alkuperäisen autoantigeeni paneeli. Perustuen vastaavan geenin ID: n, 84%: n autoantigeenin proteiinien Luminexin-helmi määrityksessä olivat myös edustettuina proteiinin mikrosirulla.

autoantigeeni proteiinit ekspressoitiin

E

.

coli

ja yhdistelmä-DNA-proteiinit puhdistettiin käyttäen His-affiniteettipuhdistusmenetelmätapa. Sukupolven tasomaisen proteiini microarray suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti, proteiinit täplikäs neljänä rinnakkaisena nitroselluloosapohjaisia ​​päällystetyn FAST dioja (GE Healthcare). Hiiren ja ihmisen IgG: t eri pitoisuuksilla, joita voidaan käyttää immuunivasteen havaitsemiseksi valvonta ja datan normalisointi. Automatisoitu station (HS 4800 Pro, Tecan) käytettiin suorittamaan microarray autovasta analyysi. Array levyt blokattiin 2% (w /v) naudan seerumia (BSA) TBS, joka sisälsi 0,1% (v /v) Tween 20 (TBST) ja veren seerumin näytteet lisättiin 1: 100 laimennus 2% (w /v) BSA /TBST: ssä. Kun oli inkuboitu huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan toissijaisen (hiiren anti-ihmis-IgG: tä, 1: 5000, Sigma) ja tertiääriset (Cy3-leimattua aasin anti-hiiri-IgG, 1: 500, Jackson Immuno- Research) vasta-aineen inkubointivaiheet suoritettiin 2% (w /v) BSA /TBST: ssä huoneen lämpötilassa 1 tunti. Kunkin inkubaation jälkeen vaiheen, objektilasit pestiin 3 kertaa TBST: llä. Jalostettu proteiinijärjestelmien skannattiin konfokaalisella mikrosirulla lukija (ScanArray 4000, Perkin Elmer Life Science) ja analysoitiin käyttämällä GenePix Pro 6.0 microarray kuva-analyysi-ohjelmisto (Molecular Devices).

Luminex-helmi tekniikka autoantigeenille profilointi oli perustettiin koska sillä on useita etuja verrattuna alun perin käytetyt proteiinijärjestelmän tekniikkaa kuten korkea dynaaminen alue, alempi variaatiokertoimet, lisääntynyt vakaus johtuu kovalenttisesti proteiinien ja paremman suorituskyvyn korkean suoritustehon analyysin. Sillä helmi autoantigeeni array 3061 autoantigeenien valittiin. His-tag affiniteettipuhdistetulla yhdistelmä-DNA-proteiinien kovalenttisesti kytketty magneettinen karboksyloituja värikoodattu MagPlex

TM microsphere helmiä noudattamalla valmistajan protokollan (Luminex). Kullekin yksittäiselle kytkentäreaktion 12,5 ug antigeeniä ja 8,8 x 10

5 yksilöllisesti koodattu helmiä käytettiin. Kytkimen tehokkuus ja helmi vakautta seurattiin. Yksi helmi alaryhmä koostui jopa 384 eri antigeenin päällystettyjä helmiä ja kahdeksan kontrollipallojen. Johtuen kokonaismäärä antigeenejä, kahdeksan eri alaryhmien perustettiin ja käytettiin analyyseihin. Proteiini-päällystettyjä helmiä jaettiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille ja niitä inkuboitiin laimennettu (1: 100) seerumia näytteitä 22 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Jokaisena määrityslevyä kolme vertailuseerumit mitattiin toimii laadunvalvontaa. Sitoutumaton vasta-aineet poistettiin pesemällä. Sitoutuneet ihmisen vasta-aineet kvantifioitiin käyttämällä koettimena riiniin (PE) -leimattua anti-ihmisen toteamisvasta-ainetta (vuohen anti-ihmis-PE, Jackson /Dianova) ja sen jälkeen useita pesu- sykliä ja mittaamalla fluoresoivan signaalin FlexMap3D laite (Luminex) (DD portti +7,500-+15,000; otoksen koko: 80 ui; 1000 tapahtumaa kohden helmi alueella; timeout 60 sekuntia).

Data esikäsittely- ja biotilastollisen analyysi

Planar proteiinijärjestelmien.

Kun mediaani tausta vähennyslasku, mediaani fluoresenssin voimakkuus 4 rinnakkaisten paikkoja laskettiin jokaiselle autoantigeenin ja normalisoitiin huomasi IgG valvontaa. Cut-off määritettiin erikseen kullekin autoantigeenin ja laskettu keskiarvona signaalin voimakkuuden alhaisen tulehduksen ohjaus kohortti plus 3 keskihajontaa. Korkea tulehdus kohortti näytteitä arvot ylittävät raja-luokiteltiin positiivisiksi ja kaikki antigeenejä lajiteltiin mukaan alenevassa positiivisten näytteiden. N-kertainen lisäys tai vähennys tietyn autovasta määritettiin perusteella normalisoidun keskimääräisen signaalin voimakkuuden korkealla verrattuna alhainen tulehdus kohortissa. Sijoitus top ehdokas merkkiaineiden perustui kertamuutosta ja korjattu p-arvo.

Helmi proteiinijärjestelmien.

Mitatut mediaani helmi fluoresenssin voimakkuutta kullekin autoantigeeni käytettiin lisälaskuihin. Harvoissa tapauksissa, kun vähemmän kuin 10 helmiä haettiin mittaukseen, tämä arvo asetettiin puuttui. Nämä arvot korvattiin mediaani tämän autoantigeenin mitattiin kaikista näytteistä. Autoantigeeneinä yli 20% puuttuvat arvot jätettiin pois lisäanalyysiä. Sen jälkeen log2 muutos quantile normalisointi [43, 44] käytettiin normalisoimaan näytteitä kunkin yksittäisen lautaselle.

luokittelu viiden tehokkaimpiin autovasta-aineet tunnistetaan helmi array tekniikka erilaistumiseen matalan ja korkean tulehdus kohorttien perustui logistiikkaregressiomallin ryhmän kanssa muuttuja (korkea /matala tulehdus) kuin riippuva muuttuja ja keskimääräinen fluoresenssi arvot autovasta kuin vaikuttavia tekijöitä. P-arvot yhden vaikuttavia tekijöitä määritettiin perustuen Wald testi, ja lisäksi parametriestimaatteja ja vastaavien 95%: n luottamusväli (CI) kaksipuolinen laskettiin. Kertoimet suhde (OR) annettiin yhdessä vastaavan 95%: n luottamusväli kaksipuolinen. Luokittelu suorituskyky arvioitiin perustuvat herkkyyttä, spesifisyyttä, ja AUC-arvot, jotka saavutettiin tämän mallin [43, 45]

Toiminnalliset huomautusta ja koulutusjakson analyysi

kartoituksen jälkeen top 165 autovasta testattu positiivinen proteiinin microarray geeneihin, joukko 136 geenien saatiin ja käytettiin geenin ontologiaa analyysiä. Toiminnallinen merkintä klustereiden suoritettiin käyttäen DAVID tietokantaa (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [46, 47].

Tissue Microarray (TMA) ja immunohistokemia

rakentaminen kudoksen microarray (tulehdus-TMA) formaliinilla ja parafiiniin ihmisen kudosnäytteitä (n = 70) näytetään korkea tai matala määriä kudosta tunkeutuvia lymfosyyttejä poimittiin autovasta seulonta kohortissa. Kliiniset ja patologiset ominaisuudet on koottu taulukkoon 1 sarakkeessa ”Screening Kohortin”. Käyttö arkistoituja näytteitä johtuvien eturauhasen yksilöitä saatu yliopistollisessa sairaalassa Innsbruckin hyväksyi eettinen komitea lääketieteellinen yliopisto Innsbruckin. Kullekin tapauksessa kolme syöpäkudoksessa ydintä ja kolme hyvänlaatuinen ytimet, joiden halkaisija on 0,6 mm stanssattiin luovuttajan kudoksen ja siirretään vastaanottajan TMA block [48]. TMA koottiin käyttäen manuaalista kudosta ryhmittäjällä (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI). Tyvisolusyöpä markkeri p63 ja kasvainsolun markkeri α-methylacyl-CoA rasemaasi (AMACR) värjäykset käytetään ohjaamaan histologista diagnoosia ja SPAST, STX18 tai SPOP värjäykset, vastaavasti, suoritettiin Discovery-XT värjäytymistä laite (Ventana, Tucson, AZ) käyttäen välineenä standardiprotokollia. Target vasta, toimittajat, artikkeleiden numeroita, ja pitoisuudet olivat seuraavat: anti-SPAST, Atlas Antibodies (Tukholma, Ruotsi), # HPA017311, 1:50; anti-STX18, Atlas-vasta-aineita, # HPA003019, 1: 150; anti-SPOP, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), # SAB1406659, 01:50; anti-p63, Sigma-Aldrich, # P3362, 1: 200; anti-AMACR, Dako (Wien, Itävalta), # M3616, 1: 200, anti-CD45, Dako, # M0701, 1: 300.

Arviointi Immunohistokemiallisen värjäytymisvoimakkuuksia oli valvoo kokenut uropathologist (GS). Kuvat otettiin käyttäen Axio Imager Z2 (Zeiss) ja TissueFAXS ohjelmistot (TissueGnostics). Kvantitatiivinen immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin käyttäen HistoQuest immunohistokemia analyysin ohjelmisto (TissueGnostics). Kunkin TMA paikalla keskimääräinen voimakkuus ja prosenttiosuus positiivisesti värjättyä solua arvioitiin ja pistemäärä laskettiin kertomalla nämä kaksi arvot kullekin TMA ydin. Keskiarvon arvot laskettiin kolmesta syövän ja kolme hyvänlaatuista kudoksen ytimet kunkin potilaan. Mann Whitneyn U-testiä käytettiin analysoitaessa eroja näiden kahden ryhmän välillä.

Toinen TMA (Targos-TMA), joka käsittää 111 kudosnäytteiden histologinen normaalissa eturauhasessa (BE), hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH), eturauhasen karsinooma (CA), sekä kliinisesti diagnosoitu kastraation tulenkestävä kasvaimet (CRPC), rakennettiin ja värjättiin edellä kuvatulla tavalla. Käyttää näitä kudosnäytteitä peräisin eturauhasen leikkauksia sairaalassa Kasselin hyväksyi institutionaalisten tarkastuslautakunta. Värjäykset arvioi riippumaton patologi (M. K.) käyttäen puoli- kvantitatiivista pisteytysjärjestelmää (H-Score), joka yhdistää neljä intensiteetti kategoriaa arvioitu prosenttiosuus värjättyjen solujen [49]. Mann Whitneyn U-testiä käytettiin analysoitaessa ryhmien välisiä eroja.

RNA: n eristys ja qPCR

Kokonais-RNA uutettiin hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset alueilla jäädytettyjen kudosleikkeiden sekä potilasryhmien (korkea /alhainen tulehdus, n = 66) käyttäen AllPrep DNA /RNA Micro Kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Saksa). RNA pitoisuuksia ja puhtaus määritettiin spektrofotometrisesti. Reverse Transcription (RT) suoritettiin 500 ng kokonais-RNA: sta käyttämällä iScript valitse cDNA-synteesi kit (Bio-Rad, Hercules CA, USA) ja satunnaisia ​​heksameerialukkeita (Promega, Madison WI, USA). QPCR (40 sykliä) suoritettiin kolmena rinnakkaisena, käyttäen tuli 8 ng kokonais-RNA: ekvivalenttia cDNA kunkin 10 ui reaktiossa. Seuraavat Taqman (Applied Biosystems, Foster CityCA, USA) käytettiin: PTPRC, Hs04189704_m1; STX18, Hs01099207_m1; SPOP, Hs00737433_m1; SPAST, Hs00208952_m1; TBP, Hs00427620_m1. Kohdegeenin ilmentyminen normalisoida taloudenhoito geeni TBP. Suhteellinen ilmentyminen suhde (R) laskettiin perustuen Taqman määrityksen tehokkuutta kohdegeenin ja viite-geenin ja syklin kynnysarvo (Ct) poikkeama kunkin näytteen kontrollinäytteeseen (kalibraattori, cDNA yhdistelmä 3 hyvän- ja 3 pahanlaatuiset kudosleikkeiden, 20 ng qPCR tulo) käyttämällä seuraavaa kaavaa: R = [E

tavoite ^ ACt (kalibraattori-näyte)] /[E

viite ^ ACt (kalibraattori-näyte)] [50].

haku for SPOP mutaatioiden

Viisikymmentäkolme cDNA näytettä peräisin RNA: n eristys korkea /matala tulehdus kudosnäytteiden kuvattu edellisessä kappaleessa käytettiin SPOP mutaation näyttö. Alukepari (Eurofinsille MWG Operon, Ebersberg, Saksa) reunustavan alueen toistuvien SPOP mutaatioiden suunniteltiin käyttäen avoimen lähdekoodin ohjelmistoja Primer 3: Fwd, 5′-AAGGGTTCCAAGTCCTCCAC-3 ’; Rev, 5’-CGGCACTCAGGAACCTTTAC-3 ’[51]. PCR-monistus suoritettiin 100 ng kokonais-RNA: yhtä Taq DNA Polymerase (Peqlab, Erlangen, D) yhteensä 100 ul: soveltaen seuraavat ehdot: denaturaatio 95 ° C: ssa 2 min; 40 sykliä 95 ° C 1 min, 62 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C 1 min; venymä 72 ° C: ssa 7 min. PCR-tuotteen määrän ja koon tarkistettiin 1,2% agaroosi Flash Geelit (Lonza, Rockland, USA). DNA puhdistettiin Qiagen PCR-Extraction Kit ja sekvensoitiin käyttämällä samoja alukkeita standardin mukaisesti Sangerin sekvensoinnilla protokollaa (Mycrosynth, Balgach, CH).

Koska taajuus havaitaan SPOP mutaatioiden oli huomattavasti pienempi kuin yksi raportoitu kirjallisuudessa [51], tulokset vahvistettiin menetelmällä alun perin kuvanneet Blattner et al. [52], DNA eristettiin hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset alueilla jäädytettyjen kudosleikkeiden käyttämällä AllPrep DNA /RNA Micro Kit. Alun pre-PCR monistusvaiheessa rikastuttaa kohdealueilla, korkearesoluutioinen sulamisanalyysikokeita (HRM) suoritettiin. Tämä määritys tavoitteet eksonit 6 ja 7 SPOP geenin sisältävän kaikki aiemmin havaitut mutaatiot eturauhassyövässä (aminohapot 80-106 ja aminohapot 120-140). Näyte, joka osoitti huomattavaa muutosta sulamiskäyrää lähetettiin pois Sangerin sekvensointia vahvistaa ja tarkentaa sen muuttamista.

Tulokset

Seerumin autovasta tasot ovat koholla eturauhassyöpäpotilailla kanssa immuunisolujen tunkeutumisen eturauhasen

pyritään tunnistamaan eturauhasen krooninen tulehdus liittyy autovasta-aineita, eturauhasen syöpä potilaat, joilla on alhainen tai suuri määrä infiltroivien immuunisolujen niiden eturauhasen näytteet alistettiin analyysiin. Jotta voitaisiin tunnistaa korkean ja matalan tulehduksen potilaan ikäluokat, me käytti lukumäärän infiltroituvien immuunisolujen koko eturauhanen. Jokaisen potilaan kaksikymmentä-kolmekymmentä kudoksen diat edustavat eri aloilla eturauhasen värjättiin yleiseurooppalaisen leukosyyttien merkki CD45 määritellä kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä. Kokenut uropathologist suoritettu luokittelua kahteen ryhmään (korkea /matala tulehdus) mukaan histopatologinen luokitusjärjestelmän kroonisen eturauhasen tulehdus [53]. Potilaan näytteitä lainkaan tai lievä tulehdus oli määritelty ”pieni tulehdus ryhmä” ja ne, joilla on kohtalainen ja korkea tulehdus ”high tulehdus ryhmä”. Kliiniset muuttujat, kuten ikä, tulehdusmerkkiaine C-reaktiivisen proteiinin (CRP), Gleason Score, eturauhasen koon, PSA ja vapaa PSA oli jakaudu tasaisesti korkea ja matala tulehdusta ryhmissä (taulukko 1, S1 Kuva).

seerumin autovasta profiilit 38 korkea tulehduksen ja 32 pieni tulehdus (kontrolli) potilasta saatiin vastaavaa, ennen leikkausta verta seeruminäytteet työllistää 4012 rekombinanttiproteiinin array näyttö (Kuva 1A). Valinta antigeenin testipaneelin perustui omiin ja antoivat tietoja autoantigeeneinä liittyy eturauhassyöpään, muiden syöpien ja tulehdukseen liittyviä sairauksia, kuten multippeliskleroosi tai SLE vastaavasti [31, 36-42] (S1 taulukko). Autovasta-aineiden 3919 autoantigeenejä havaittiin ainakin yksi potilaista ja potilaiden määrä oli positiivisia autovasta-aineita, jotka vastaavat yksittäistä autoantigeeni vaihteli 0-69 70 (S1 taulukko). Ottaen huomioon positiivisten näytteiden määrää molemmissa ryhmissä syntyy luettelo 15 autovasta eniten eri läsnä suuri verrattuna pieni tulehdus ryhmä (kuvio 1 B). Kärkipään autovasta vastaan ​​spastin (SPAST, giI40806168) ja pilkku-tyypin POZ proteiini (SPOP, giI56117827) oli läsnä 37% ja 42% seerumeista peräisin korkea tulehdus potilaista taas havaittavissa alle 3% ja 10% seerumit alhainen tulehdus verrokeilla. Arviointi kertamuutosta kullekin 997 autovasta-aineiden korkeat verrattuna alhainen valvonnan tulehdus ryhmä, paljasti huomattavasti runsaus (p 0,05) 165 autovasta-aineiden korkeat tulehduksen potilaan kohortin (kuvio 1 C, S2 taulukko). Mikään niistä määritettiin yksinomaan korkean tulehdus ryhmä. Mielenkiintoista, intensiteetin taso vain yhden autovasta (sitova antigeeni FEZF2, giI157388917) oli merkitsevästi vähentynyt (log2-foldchange: -2,66, p-arvo: 0,002) on suuri verrattuna pieni tulehdus kontrolliryhmään.

vuokaaviota strategian havaitsemiseksi käyttää ja rajat validointi autovasta (AAB) allekirjoitukset liittyvät krooniseen eturauhasen tulehdus. Eturauhasen näytteet luokiteltiin kahteen (korkea /matala tulehdus) ryhmään perustuen laajuudesta immuunisolujen virustartuntoja koko eturauhasen. Vastaavaa, ennen leikkausta veren seerumin analysoitiin autovasta-aineet (AAB) käyttäen tasomaisen proteiinijärjestelmän (seulonta, n = 70). Rajat validointitutkimuksessa testaus luotettavuutta tunnistettujen AAB paneeli perustui Luminex-helmi proteiini array tekniikka (ristivalidointi, n = 63). Tilastollinen vertailu seerumin autovasta profiilit matalan ja korkean tulehdus ryhmiä käytettiin tunnistamaan ja vahvistaa eri tavoin runsas aABS. Eturauhasen kudos ekspressiokuvioiden ja sen erilaisissa eturauhassyövän etenemisen vaiheita laadittiin kolmen valitun vastaavan autoantigeeneinä (AAGs). B Pylväsdiagrammi positiivisesti luokiteltu havaintoja 15 eniten differentiaalisesti havaittujen autovasta-aineiden korkean tulehdus ryhmässä verrattuna alhainen tulehdus ryhmä. Tiedot ilmoitetaan prosentteina kokonaismäärästä positiivisten näytteiden kussakin ryhmässä. C laskeminen kertaluokkamuutos kunkin autovasta paljasti merkittävän kasvun 165 antigeenejä korkealla tulehdus eturauhasen syöpä (ylempi oikea paneeli, p 0,05, taita muutos 2, Mann-Whitney testi) ja se laski vain yhden (ylempi vasen paneeli ). D Graafinen esitys kymmenen sijoilla toiminnallisia klustereita osoitettu liittyvän tulehduksen autovasta käyttäen DAVID toiminnallinen käsinkirjoitustyökalun. Palkki koko vastaa prosenttiosuutta tunnistettu vastaavien geenien liittyy tiettyyn toiminnallisen luokan (P 0,05).

pohti 165 autovasta merkittävästi parantaa krooninen tulehdus liittyy erillisiä toiminnallisia klustereita ja siksi kartoitettu heitä vastaavien geenien suorittaa toiminnallinen merkintä klustereiden avulla DAVID tietokantaa. Useat rikastettu molekyyli toimintoja ja biologisten prosessien tunnistettiin. Kymmenen merkintä termejä ”proteiini lokalisointi” muodostuu suurin klusteri sisältää 14 liittyvät geenit koodaavat proteiineja, jotka liittyvät vesicular ihmiskaupan (GDI1, MYH9), endo- (Cdc42) ja eksosytoosilla (STX18), chromatin sitovia (CHMP5) ja sytotoksisten T- -solujen aktivaation (CTLA) kantavassa cluster ”makromolekyylikompleksi alayksikkö organisaation” koostui geenien tarvitaan DNA: n korjaukseen (SF3B3), proteiinisynteesiä (EIF2A), T-solujen lisääntymistä (FADD), ja mikrotubulusten purkaminen (STMN1, SPAST). Kaiken havaitsimme, että autovasta yliedustettuna korkea tulehdus potilaita pääasiassa suunnattu rakenteellinen antigeenejä ja solujen lisääntymistä liittyviä proteiineja (kuvio 1D, taulukko 2).

antigeenejä seerumiperäisiä autovasta ilmaistaan ​​eturauhasen

Valaistaan ​​onko antigeenit tunnistetaan autovasta-aineiden ilmaistaan ​​ja mahdollisesti väärin säädellystä eturauhaskudoksessa, tutkimme ekspressiokuviota erillisiä kohdeproteiinien. Sillä, että kolme ehdokasta antigeenejä, Spastin (SPAST), pilkku-tyypin POZ proteiini (SPOP), ja syntaksiini 18 (STX18), valittiin seuraavin perustein: (i) autovasta-aineet ovat yksi top erilaisesti runsas tulehdukseen liittyvä itse mukaan p-arvojen ja taita muutos (S2 taulukko); (Ii) vasta-aineiden IHC ovat kaupallisesti saatavilla ja vastaavat antigeenin tasot ovat riittäviä immunohistologista havaitsemista mukaan Ihmisen proteiini Atlas (www.proteinatlas.org); (Iii) organisaatiot, joilla on eri tyyppisten syöpien oli raportoitu (taulukko 3). Kudos mikrosiru lukien kudosnäytteitä korkean ja matalan tulehdus potilaiden autovasta näytön tuotettiin ja käytettiin immunoisto- näiden autoantigeenin proteiineista.

SPAST, SPOP ja STX18 löydettiin ilmaistaan ​​epiteelin hyvänlaatuinen ja syöpä alueet molemmissa potilasaineistoihin. Kvantifiointi Immunovärjäyksen intensiteettien paljasti merkittävästi lisääntynyt SPAST ilmentymisen korkea tulehdusta verrattuna alhainen tulehdus eturauhasen kudosnäytteitä. Kuitenkin SPOP ja STX18 immuunivaikutukset olivat muuttumattomina korkean ja matalan tulehduksen potilaan näytettä (kuvio 2A).

immunohistokemiallinen värjäykset edustavia kudosten microarray täplät korkea ja matala tulehdusta potilasaineistoihin. SPAST, STX18 ja SPOP ilmaistaan ​​epiteelin hyvänlaatuinen (BE) ja syöpä (CA) alueilla sekä ikäryhmät. Kvantitatiivinen analyysi suoritettiin käyttäen HistoQuest immunohistokemia analyysin ohjelmisto (TissueGnostics). Pisteet laskettiin kertomalla värjäytymisen intensiteettiä ja prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen. n = 25 ryhmää kohti. * P 0,05, Mann-Whitney testi. Bar, 100 um.