Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tyhjennä solu munasarjasyöpä on epiteelin munasarjasyövän histotype, joka on vähemmän herkkä kemoterapiaa ja kuljettaa huonompi ennuste kuin vakavasta ja endomet- histotypes. Tästä huolimatta potilaat, joilla on kasvain, käsitellään samalla tavalla kuin kaikki muut munasarjojen syöpien. Edellinen genominen analyysi on ehdottanut, että selkeä solu syöpiä ovat ainutlaatuinen kasvain alatyypin. Täällä syntyy ensimmäinen koko genomista ilmaisun profilointi käyttäen epiteelin komponentti selkeitä solun munasarjojen syöpien ja normaalin munasarjan pintaan näytteitä eristettiin laser kaapata mikrodissektion. Kaikki paneelit analysoitiin BRB ArrayTools ja PathwayStudio ohjelmisto tunnistaa signalointireittejä. Tunnistetut väyliä validoitu käyttäen vakavien, kirkas syöpä solulinjoja ja RNAi-tekniikkaa.

In vivo

vahvistusten suoritettiin käyttäen potilaalle tehdä hiirimallissa ja liposomaalinen kapseloitu siRNA. Potilaasta johdettujen selkeä solujen ja serous munasarjojen kasvaimia oksastettu alle munuaisten kapseli NOD-SCID arvioida terapeuttista potentiaalia tunnistettu kautta. Havaitsimme merkittävä aktivoitu reittejä selvästi soluissa, joissa on hypoksinen solujen kasvua, angiogeneesin, ja glukoosiaineenvaihdunnan ei nähty muissa histotypes. Knockdown keskeisten geenien Näitä reittejä herkistynyt selkeä solu munasarjasyövän solulinjoissa hypoksia /glukoosin poisto.

In vivo

kokeiden avulla potilas johdettu kasvaimia osoittavat, että selvä kasvaimet ovat erityisen herkkä angiogeneesiä torjuvina hoito (eli sunitinibilla) verrattuna vakavasta kasvaimia. Olemme tuottaneet histotype erityinen, geeni allekirjoitus liittyy selkeä cell munasarjasyövän, joka tunnistaa tärkeää aktivoida väyliä kriittinen heidän ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia. Nämä tulokset tarjoavat rationaalinen pohja radikaalisti erilainen munasarjojen selvä solujen potilailla.

Citation: Stany MP, Vathipadiekal V, Ozbun L, Stone RL, Mok SC, Xue H, et al. (2011) tunnistaminen Novel terapeuttisia kohteita mikropaloitelluista Clear Cell munasarjasyöpiä. PLoS ONE 6 (7): e21121. doi: 10,1371 /journal.pone.0021121

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. helmikuuta 2011; Hyväksytty: 19. toukokuuta 2011; Julkaistu: 06 heinäkuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat osittain Intramural tutkimusohjelma National Cancer Institute National Institutes of Health (MJB) ja OvCaRe (aloite Vancouver General Hospital ja University of BC sairaalan säätiö ja BC Cancer Foundation) (YZW), BC Cancer Foundation ja Pfizer Canada (tutkija aloittama projekti, SLE ja YZW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Pfizer Canada on terveydenhuollon yritys. SLE ja YZW sai tutkija aloittama hankerahoituksella Pfizer Kanadasta. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Tyhjennä solu munasarjasyöpä (CCOC) alun perin kuvattu mesonephroma ovarii vuonna 1939 Schiller koska sen samanlainen ulkonäkö munuaissyövän [1]. Lisätutkimukset siitä lähtien, on osoittanut, että nämä kasvaimet ovat munasarjojen alkuperästä [2], [3], [4], [5], [6] CCOC edustaa 4-14% kaikista epiteelin munasarjojen syöpien ja sen kliininen käyttäytyminen poikkeaa muiden epiteelisolujen histotypes [4], [6], [7]. Potilaat, joilla on vaihe I CCOC on 27% riski toistumisen [8] on viiden vuoden pysyvyys hinnat 60% verrattuna 80%: ssa serous kasvaimia [8]. Potilaat, joilla on myöhäisessä vaiheessa tauti on myös huonompi ennuste verrattuna potilaisiin, joilla pitkälle vakavien munasarjasyöpä [8]. Tämä heijastaa todennäköisesti CCOC n alennetun vastauksena perinteiseen platina /taksaani kemoterapian, raportoitu olevan välillä 11-45% vuoden ensilinjan hoitoon [8], [9]. CCOC potilailla on myös korkeampi tromboembolisten tapahtumien verrattuna potilaisiin muihin epiteelin munasarjasyöpä histotypes [10].

Kudostutkimuksissa CCOC solut ovat ”selvä” johtuen korkeasta sytoplasman glykogeenipitoisuus joka on artefakti H E värjäystä [11], [12]. CCOC on todettu Mikroskooppitutkimus samankaltaisuutta tyhjentää cell carcinoma vaginan ja kohdun limakalvon. Tämä Mikroskooppitutkimus samankaltaisuus kuljettaa yli geneettinen samankaltaisuus samoin. Zorn et ai. samankaltaiset geeniekspressioprofiilien selkeitä solun on kasvaimia munasarjoissa, kohdun limakalvo, ja munuaisten kanssa käyttämällä 11000 probeset array [13]. Tämä geneettinen päällekkäisyys, ei kuitenkaan ulotu vertailua vakavien ja endomet- histotypes munasarjojen ja kohdun limakalvon alkuperää. Toinen geeniekspressioprofiili of CCOC käyttäen 7129 koetinsarjaa array osoitti sen olevan hyvin erillään muista histotypes [14]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että on olemassa samankaltaisia ​​polkuja, jotka johtavat selkeitä solun histotype riippumatta elin alkuperää.

Tässä tutkimuksessa esittelemme tulokset ensimmäisen koko genomin ilmentymisen profilointi mikropaloitelluista CCOC näytteitä. Gene ontologia ja koulutusjakson analyysi osoittivat tärkeimmiksi aktivoitu reittejä mukana hypoksinen solujen kasvua, angiogeneesin, ja glukoosiaineenvaihdunnan. Oletimme, että nämä reitit voisi tarjota mekanismi aggressiivista kliinistä luonnetta CCOC. Osoitamme, että selkeä syöpä solulinjoja hengissä parempi serous solulinjat hypoksiaolosuhteissa ja glukoosin vailla ehtoja ja tämä johtuu osittain näiden aktivoituvien reittien joihin HIF1 α ja enolaasi.

In vivo

kokeiden avulla potilas johdettuja kudoksia osoittavat, että selvä solu tuumoriksenografteja ovat erityisen herkkä angiogeneesiä torjuvina hoito (sunitinibilla) verrattuna vakavasta kasvaimia. Yhdistelmähoito Sunitinibin ja RNAi HIF1α ja enolaasin osoittaa synergististä anti kasvain aktiivisuutta. Nämä tulokset tarjoavat rationaalinen pohja tiettyjen terapia näillä potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Munasarjasyöpä kudosnäytteet saatiin ilmoitettiin kirjallinen suostumus potilaalla, joille kahdenvälisistä salpingoophorectomy Vancouver General Hospital seuraava protokolla hyväksymä University of British Columbian Clinical Research Ethics Board, Kanada. Näytteet käytetään profilointiin kerättiin alle protokollien hyväksymien institutionaalisten tarkastuslautakunta Brigham ja naisten Hospital (Boston, MA, USA) ja saatiin ilmoitettiin kirjallinen suostumus potilaista. Eläinten hoito ja kokeet suoritettiin ohjeiden mukaisesti ja hyväksyntää University of British Columbia – British Columbia Cancer Agency tutkimuseettiseltä (UBC BCCA REB) (numero: H04-60131) ja MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care ja käyttö komitea, USA (IACUC Number: 12-02-18233).

Tissue yksilöitä, mikrodissektion, RNA: n eristys ja monistus

Kymmenen selkeä solu munasarjasyöpä näytteet saatiin primäärikasvaimissa aikaisemmin hoitamattomista munasarjasyöpä potilaiden Brigham ja naisten Hospital (Boston, MA). Joukko 10 normaalista munasarjan pintaepiteelissä (OSE) cytobrushing yksilöitä saatiin myös normaalista munasarjat potilaiden leikkauksen aikana hyvänlaatuisen merkkejä. Jäädytetyt osat (7 um) on kiinnitetty päälle FRAME dioja (Leica, Wetzlar, Saksa), kiinnitettiin 70% alkoholia 30 sekuntia, värjätään 1% metyyli vihreä, huuhdeltiin deionisoidussa vedessä, ja kuivattiin ilmassa. Mikrodissektion suoritettiin käyttäen MD LMD laser microdissecting mikroskoopilla (Leica). Kasvainsoluja (~5,000) leikeltiin tapauskohtaisesti. RNA eristettiin, uutettiin ja puhdistettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. Jotta tuottaa riittävästi cRNA varten mikrosiruanalyysi, kahden syklin monistus protokolla (Affymetrix) käytettiin, joka on aiemmin kuvattu [16].

mikrosiruanalyysi

Kaikki array data on Minimi Information noin Microarray Experiment (MIAME) -yhteensopiva ja raakadataa on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta (GEO, Liittyminen numero: GSE29450) B

data normalisointi.

Global normalisoinnin jonka tavoiteltu arvo 500 sovellettiin kaikkiin 20 taulukoiden harkittavana käyttäen Gene Chip Operating Software (Affymetrix). Normalisoitu data ladattiin National Cancer Instituten Microarray Analysis Database (MADB) laadunvalvonnasta seulonta ja lajittelu ennen loppupään analyysit (https://nciarray.nci.nih.gov/index.shtml). Biometrinen Research Branch (BRB) ArrayTools version 3.2.2 kehittämän ohjelmiston Drs. Richard Simon ja Amy Peng Lam on Biometrics Research Branch National Cancer Institute käytettiin suodattaa ja täydentää tilastollinen analyysi array data. BRB-ArrayTools on monitoiminen Excel-apuohjelma, joka sisältää apuohjelmia käsittelyyn ja analysointiin microarray tietoja käyttämällä R-versiossa 2.0.1 ympäristöä (R Development Core Team, 2004). Hybridisaatio kontrollikoettimen sarjaa ja koetin asetetaan kertoimeksi poissaolevaksi α1 = 0,05 tai marginaalinen (M) α2 = 0,065 suljettiin pois. Lisäksi vain ne selostukset läsnä yli 50%: n taulukot ja näytetään varianssi alkuun 50. prosenttipiste arvioitiin.

Class Vertailun geeni ontologian, ja polku analyysi.

monimuuttuja permutaatio testin BRB ArrayTools käytettiin tunnistamaan ilmentyvät eri geenit. Luettelo probesets sisältävien 10% vääriä positiivisia luottamustasolla 95% jälkeen saatiin yhteensä 2000 permutaatioista. Differentiaalikaavojen pidettiin merkitsevä p-arvo 0,001. Satunnainen varianssi

t

testi ja kokonaisarviointi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16].

Jotta voitaisiin tunnistaa erityisesti toiminnalliset luokat geenejä, jotka olivat hyvin rikastettu CCOC tunnistimme geeni ontologian ( GO) luokat, jotka olivat tilastollisesti merkitseviä keskuudessa luettelo säädellään eri tavalla geenejä. Hotelling hakaviivain Testi suoritettiin tunnistaa merkittäviä GO luokkia. Jotta tiedettäisiin signalointireiteissä mukana CCOC, geeni lista, joka syntyvät mikrosiruanalyysi tuotiin PathwayStudio ohjelmisto (Ariadne Inc, Rockville, MD).

kvantitatiivinen RT-PCR

kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin 10 selkeitä solun munasarjasyöpä näytteitä ja 10 OSE näytteitä. 50 ng kaksinkertaisen monistettu tuote käytettiin kaikista 20 näytteestä käyttäen alukesarjoja spesifisiä 12 valitun geenin ja taloudenhoito geenit GAPDH, GUSB, ja syklofilliini. ICycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) käytettiin yhdessä One-Step qRT-PCR SYBR Green (Invitrogen Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA) mukaan aiemmin kuvattu sykliolosuhteita [17]. Laskea suhteellinen ilmaisu kunkin geenin, 2

-ΔΔCT menetelmää käytettiin keskimäärin C

T arvoa kolmelle taloudenhoito geeneistä.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

ihmisen selvää solun munasarjasyövän solulinjoissa ES-2, TOV21G, ja RMG1 ja vakavien solulinjat OVCA 420 ja OVCA 432 ylläpidettiin 01:01 seos väliaineen 199 (Invitrogen Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA) ja keskipitkän 105 (Sigma, St. Louis, MO), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% L-glutamiinia. Ihmisen serous munasarjasyövän solulinjoissa SK-OV-3 ja OVCAR-3 pidettiin RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% L-glutamiinia. Caov3 ja OVCA 429-soluja ylläpidettiin DMEM (Invitrogen Life Technologies), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% L-glutamiinia. ES-2, TOV21G, SKOV3, OVCAR3 CaOV3 ja RMG1 solulinjat hankittiin American Type Culture Collection ja Japani kerääminen Research Bioresources. OVCAR 420, OVCAR 432 ja OVCA 429 saatiin laboratoriossa Gynecologic Oncology Brigham and Women n sairaala [18].

Hypoksia /glukoosi puutosolosuhteille

Solut selvä solu- ja serous munasarjojen alkuperää maljattiin ja sijoitetaan olosuhteissa normoksia DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamiinia tai hypoksia glukoosi-DMEM: 10% FBS, 1% L-glutamiinia (Invitrogen Life Technologies). Hypoksia tuotti huuhtelemalla inkubaattorissa (Thermo Forma Series II, Thermo Fischer Scientific, Inc., Waltham, MA) typen saavuttamiseksi seokseen, jossa oli 1% O

2, 5% CO

2, ja 94% typpi. Inkubaattorissa pidettiin 37 ° C: ssa.

soluproliferaatiomääritykset

syöpäsolulinjoja ympättiin 96-kuoppalevyille 8 rinnakkaista (ES-2, TOV21G, OVCA 420, SK- OV-3, OVCAR-3, OVCA-420, OVCA-429: 5 x 10

2 solua per kuoppa, Caov3, OVCA-432, RMG1: 1 x 10

3 solua /kuoppa) ja sijoittaa joko ehdot normoksia kanssa väliainetta, joka sisälsi normaalin glukoosia (NN) tai hypoksia /glukoosin poisto (HG) 24, 48, ja 72 tuntia. Kun nämä kaudet, suhteellisia lukuja elinkelpoisten solujen mitattiin fluorimetrisessä, resatsuriinia-pohjainen Cell Titer Blue määritystä (Promega, Madison, WI) mukaan valmistajan ohjeiden 560

Ex /590

Em nm: ssä Victor3 multi-label counter (PerkinElmer, Saksa). Kaksinkertaistaa kertaa kullekin solulinjan alla kunnossa laskettiin Prism 4,02 Software (Graph Pad, San Diego, USA). Kertainen muutos kaksinkertaistaa aikaan hypoksian /glukoosin poisto verrattuna tavanomaisissa laskettiin ja keskiarvo kullekin solulinjan yli kahdessa kokeessa. Keskimäärin kertainen muutos laskettiin serous solulinjojen ja selkeä solulinjat ja verrattiin.

Cell pyöräily määritys

Solusykli tila ES-2 ja OVCA 420 soluja verrattiin olosuhteissa of normoksia ja hypoksia /glukoosin poisto virtaussytometrialla. Lyhyesti, 7,5 x 10

4 ES2 soluja ja 2,0 x 10

5 OVCA420 Solut siirrostettiin 60 mm

2 levyä kolmena kappaleena, ja annettiin inkuboitua yön yli. Kasvualusta vaihdettiin seuraavana päivänä, ja solut asetettiin edellä mainituissa olosuhteissa. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia (normoksia 37 ° C: ssa tai hypoksia /glukoosin poisto 37 ° C: ssa), media ja kiinnittyneet solut kerättiin ja sentrifugoitiin 1500 χg 5 minuuttia. Pelletti pestiin 2 ml fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ja sentrifugoitiin 1500 χg 5 minuuttia. Solut suspendoitiin uudelleen 200 ul: aan kylmää PBS: ää. 2 ml jääkylmää 70% etanolia lisättiin, ja soluja inkuboitiin jäillä 30 minuuttia läpäiseviksi. Sen jälkeen solut sentrifugoitiin 1500 χg 10 minuuttia. Supernatantti dekantoitiin ja 900 ui huoneenlämpötilassa PBS: ää käytettiin solujen suspendoimiseksi uudelleen. 100 ui RNAasi A: ta (10 mg /ml, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ) ja 10 ui propidiumjodidia (1 mg /ml, Sigma) lisättiin, ja putkia inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan välttäen valoa. DNA sisältö määritettiin virtaussytometrialla (FACSCalibur, Becton, Dickinson, and Company, Franklin Lakes, NJ) ja histogrammit DNA sisältö analysoitiin käyttämällä FlowJo 7,2 (Tree Star, Inc., Ashland, OR) kuvaamaan väestön fraktiot kunkin vaiheen solusyklin.

kaspaasi-3-määritys

suoria mittauksia kaspaasi 3: n aktiivisuuden tehtiin käyttämällä kaspaasi-3 fluorometrisen-(Invitrogen Life Technologies). Lyhyesti, 2,0 x 10

5 OVCA420 Solut siirrostettiin 60 mm

2 levyille ja annettiin inkuboitua yön yli. Päivänä 0, media poistettiin ja levyt asetettiin sitten ehdot normoksia /normaali glukoosi tai hypoksia /glukoosin poisto. Solut kerättiin 24, 48, ja 72 tuntia. Solut kerättiin, pelletoitiin, suspendoitiin uudelleen 50 ul: aan jäähdytettyä Cell Lysis Buffer, ja inkuboitiin jäillä 10 minuutin ajan. Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-proteiinin määrityksellä (Pierce, Rockford, IL). 50 ui 2 x reaktiopuskurilla ja 10 mM DTT lisättiin kuhunkin 50 ui: n näyte solulysaattia. 5 ui 1 mM DEVD-AFC substraattia lisättiin sitten kuhunkin näytteeseen samalla välttäen valoa. Sitten näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan pimeässä. MEF-solut (60 mm: n levy, 80% konfluentteja), käsiteltiin 10 ul: sykloheksimidillä ja 30 ng TNFa käytettiin positiivisena kontrollina. Fluoresenssi sitten arvioitiin Victor3 multi-label counter (PerkinElmer, Saksa), jossa 405

Ex /535

Em nm suodattimet. Kansi kasvu Casase-3-aktiivisuus määritettiin suhteellinen fluoresenssi per ug proteiinia.

Necrosis määrityksessä

Jotta määritys läsnäolon kuolion, CytoTox-ONE ™ homogeenisen kalvon eheyden määritys käytettiin valmistajan suosittelema (Promega). Tämä määritys mittaa vapautumista LDH solujen vaurioitunut kalvot. Lyhyesti, 5 x 10

3 OVCA-420-soluja maljattiin 96-kuoppaiselle levylle kolmena kappaleena. Kasvualusta vaihdettiin seuraavana päivänä, ja solut asetettiin ehtoja joko normaali happi /normaali glukoosi tai hypoksia /glukoosin poisto. 48 tuntia myöhemmin, levyt poistettiin inkubaattorista ja tasapainotettiin 22 ° C: ssa. Jotta tuottaa korkeintaan LDH Release ohjaus, 2 ui: aan lysis-liuosta lisättiin kontrollikuoppiin laitetaan normaalissa happea /normaali glukoosia. 100 ui CytoTox-ONE ™ Reagent lisättiin kuhunkin kuoppaan. Sen jälkeen, kun oli inkuboitu 10 minuuttia 22 ° C: ssa, 50 ui Stop Liuos lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä ravisteltiin 10 sekuntia. Kustakin kuopasta 100 pl siirrettiin läpinäkymätön levy ja fluoresenssi kirjattiin 560

Ex /590

Em nm Victor3 multi-label counter (PerkinElmer, Saksa). Vähentämisen jälkeen elatusaine taustaa prosenttia sytotoksisuus laskettiin jakamalla kokeellinen fluoresenssin Maximum LDH Release fluoresenssin.

hoito solulinjojen siRNA oligonukleotidien

knockdovvn HIF1 α ja enolaasi 1 suoritettiin käyttäen siRNA oligonukleotideja (Qiagen, Inc.). Käänteinen transfektioprotokolla suoritettiin käyttäen Oligofectamine (Invitrogen Life Technologies, Inc.) kuin valmistajan suosittelema 96-kuoppaisen levyn muodossa. Kunkin hyvin, 50 nM siRNA ja 0,5 ui Oligofectamine transfektioreagenssia laimennettiin 50 ul: aan seerumivapaata DMEM: ää, ja annettiin inkuboitua huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. ES-2-solut, TOV-21G-soluja, ja RMG-1-solut ympättiin 96-kuoppalevylle 1,0 x 10

4-soluja, 2,0 x 10

4-solut, ja 5,0 x 10

4 solua per kuoppa, vastaavasti. Salattu siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. 48 tuntia transfektion jälkeen elatusaine korvattiin glukoosin DMEM: ssä, ja soluja pantiin olosuhteissa hypoksian. Kasvu arvioitiin 0 ja 24 tunnin Cell Titer Blue määritys (Promega). Leviämisen määrityksissä ES2 ja TOV21G solulinjoja suoritettiin käyttäen 75 nM siRNA: 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen.

In vivo

pelkistys ENO1 tai HIF1 α käyttämällä siRNA-DOPC kanssa tai ilman sunitinibin estää CCOC syövän etenemisen kateenkorvattomissa nude-hiirissä

Nainen kateenkorvattomia nude-hiiriä hankittiin National Cancer Institute, Frederick Cancer Research ja Development Center (Frederick, MD). ES2 solut trypsinoitiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen Hanks ’tasapainotettuun suolaliuokseen (Gibco, Carlsbad, CA) ja injektoitiin intraperitoneaalisesti hiiriin (1 x 10

6 solua /hiiri). Jotta alas-säädellä enolaasin ja HIF1 α in vivo, kunkin siRNA käytettiin. Ei-kohdistuksen, epäspesifinen sekvenssi 5′-ATT TCT CCG AAC GTG TCA CGT-3 ’käytettiin kontrollina, kun taas ihmisen spesifisiä sekvenssejä käytettiin enolaasi (5’-GCG CAT TGG AGC AGC AGA GGT TTA3) ja HIF -1 α (5 ’CAG TTG TCA CCA TTA GAA A-3’). Nämä tavoitearvot erityisiä siRNA: t hankittiin Sigma-Aldrich ja valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [19], [20]. Lyofilisoitu DOPC sisällytetty siRNA hydrattiin PBS ja pistetään vatsaonteloon kahdesti viikossa seuraavat meidän aiemmin julkaistu protokollat ​​[21] 5,0 mg siRNA /200 ml suspension. Sama tilavuus PBS: ää ruiskutetaan intraperitoneaalisesti käytettiin kontrollina.

SU11248 /sunitinibimaleaatti (Sutentin Pfizer) suspendoitiin karboksimetyyliselluloosan ajoneuvon seosta, joka sisältää natriumkarboksimetyyliselluloosa (0,5% paino /tilavuus), NaCl (1,8% paino /tilavuus), Tween 80 (0,4% paino /tilavuus), bentsyylialkoholia (0,9% paino /tilavuus), ja käänteisosmoosilla deionisoitua vettä (lisätty lopullinen tilavuus), ja pH säädettiin arvoon 6,0 kuten aikaisemmin on kuvattu [22]. Sunitinibi rakennetta ja toimintaa on aiemmin raportoitu [23]. Drug alikvootit valmistettiin kerran viikossa ja säilytettynä pimeässä 4 ° C: ssa. Hiiriä käsiteltiin 40 mg /kg 200 pl: ajoneuvon letkuruokinnalla kerran päivässä. Päivittäinen letkulla pelkällä vehikkelillä, käytettiin kontrollina. Seitsemän päivän kuluttua ES2 solujen injektion, hiiret jaettiin satunnaisesti ja käsiteltiin kontrolli, enolaasi tai HIF1 α siRNA-DOPC ± sunitinibipitoisuutta (n = 10 /ryhmä). Hoitoa jatkettiin 3 viikkoa, minkä jälkeen kaikki hiiret kokeessa tapettiin ja niille tehdään ruumiinavaus, ja kasvaimet kerättiin talteen. Kasvaimen paino ja kyhmy count kirjattiin. Kasvainkudoksessa jäädytettiin optimaalinen leikkaamiseen lämpötila (MMA) media valmistautua jäädytetty dioja myöhempää CD31 värjäystä.

immunohistokemiallinen värjäys CD31

immunohistokemiallinen värjäys CD31-antigeenin suoritettiin jäädytetty dioja arvioimaan kasvain mikroverisuonitiheys (MVD). Leikkeitä kiinnitettiin kylmässä asetonissa 10 minuutin ajan. Endogeeninen peroksidaasi estettiin 3% H

2O

2 metanolissa ja epäspesifinen epitooppeja blokattiin käyttämällä 5% normaalia hevosen seerumia ja 1% normaalia vuohen seerumia. Dioja inkuboitiin sitten anti-hiiri-CD31 (1:800 laimennus, PharMingen, San Diego, CA) 4 °: ssa yön yli. PBS-pesun jälkeen, sopiva HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen esto-liuokseen lisättiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Lasit kehitettiin 3, 3 ”-diaminobenzidine (DAB) kromogeeni (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja vastavärjättiin Gil nro 3 hematoksyliinillä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). MVD laskettiin katselemalla 10 edustaja 200 × näkökenttään objektilasia kohti kummassakin hoitoryhmässä ja laskemalla mikroverisuonten kohti kentän. Pienten suonten määriteltiin avoin onteloon ainakin yhteen CD31-positiivinen solu sen välittömään läheisyyteen.

Differential vaikutus Sunitinibin on transplantable potilaasta johdettujen munasarjasyöpään kasvaimia

Kuusi- kahdeksaan viikkoa vuotias nainen NOD-SCID-hiiriä kasvatettiin jota BC Cancer Research Centre Animal Resource Centre, BC Cancer Agency, Vancouver, Kanada. Hiiriä pidettiin erityisin, patogeenivapaissa olosuhteissa steriiliin suodatin-top häkeissä korkean hyötysuhteen hiukkaspäästöjen-suodatettu ilmanvaihto telineet, ja sai steriili jyrsijän ruokaa ja vettä. Munasarjasyöpä kudosnäytteitä saatiin tietoisen suostumuksen potilailta, joille suoritetaan kahdenvälisistä salpingoophorectomy Vancouver General Hospital. Lyhyesti, kehittää transplantable syöpä pehmopaperilinjojen, tuore kasvain kudos leikattiin pieniksi paloiksi ja oksastetaan sisälsivät kapselin alle kapseli paikalle naisen NOD-SCID-hiirissä myöhempää sarjasiirteillä ja luonnehdinta kuten aikaisemmin on kuvattu [24], [25]. Paneeli munasarjasyövän kudoksen ksenograftimalleja, eli kolme serous karsinooma pehmopaperilinjojen (LTL237, 247 ja 259) ja yksi selkeä cell carcinoma pehmopaperilinjan (LTL175) (https://livingtumorlab.com/PDC_Ovarian.html), käytettiin.

Sunitinibi tehotutkimukseen 96 kappaletta kudosten (4 x 2 x 1 mm

3) ksenografteista kunkin muodostuneen kasvaimen pehmopaperilinjan oksastettu alle munuaiskotelo 24 naaras NOD-SCID-hiirissä, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kun implantit vakiintunut, päästä keskimääräinen tilavuus noin 20 50 mm

3 [24], [25], eläimet lajitellaan neljään ryhmään (6 hiirtä /ryhmä; 2 köynnöksen kohti munuainen). Hoito toimeksiannot olivat sunitinibille tai aktiivinen ajoneuvo (negatiivinen kontrolli). Sunitinibille annettiin 0,5% karboksimetyyliselluloosaa suspensiota käyttäen annosta 40 mg /kg kehon painoa (suun kautta, kerran päivässä, kaksi viikkoa) löytyi tehokkaita erilaisiin hiiren ksenograftimalleissa, kuten muualla on kuvattu [26]. Hiiret annetaan ruoka ja vesi

ad libitum

ja tarkkaillaan päivittäin muutoksia yleisen terveyden ja merkkejä stressistä, myös painon menetys, ripuli, muutokset ruoan /veden saanti, ulkonäkö (selän asento, uponnut silmä , hengitysvaikeuksia) ja käyttäytyminen (letargia). Vaikutus tuumorin kasvuun arvioitiin mittaamalla kasvaimen tilavuuden ruumiinavauksessa mittaharpilla ja kaavaa: tilavuus (mm

3) = 0,52 x pituus x leveys x korkeus (mm), kuten aiemmin on kuvattu [25], ja histokemiallisilla analyysi kasvainkudoksen kohdissa (katso jäljempänä).

Measurement tyrosiinifosforylaation VEGFR2 ja PDGFRβ in ksenografteissa kautta Western blotting

Within 2 tuntia viimeisen annon sunitinibin edellä tehotutkimuksissa ksenografteja hoidettujen ja verrokkihiiret jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 C: ssa myöhempää käyttöä varten. Lysaatit valmistettiin homogenoimalla kudokset kylmällä lyysipuskurilla (50 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 nM MgCl

2, 10% v /v glyserolia, 1% Triton X-100, 1% natriumortovanadaattia, 2 mM NaF, 2 ug /ml aprotiniinia, 2 ug /ml leupeptiiniä ja 2 ug /ml pepstatiini-A), kuten on kuvattu muualla [26]. Immu-, proteiinipitoisuus säädettiin 500 ug. Proteiinit precleaned proteiini A-Sepharose (Cat. No. 16-125, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY) 15 minuutin ajan 4 ° C. Supernatantit (1 ml), inkuboitiin 4 gg kanin anti-VEGFR2 (Cat. Nro 07-716), tai anti-PDGFRβ (Cat. Nro 05-825) vasta-aineita (Upstate Biotechnology Inc.) 90 minuutin ajan 4 ° C, ja lisäämisen jälkeen 25 ui 50% (v /v) proteiini A-Sepharose, inkuboitiin edelleen 60 minuuttia 4 ° C. Antigeeni-vasta–helmi-kompleksit pestiin vähintään kolme kertaa hajotuspuskurilla, minkä jälkeen lisätään 25 ui latauspuskuria ja keittämällä 1 minuutin ajan proteiinin eluointia. Proteiinit erotettiin 5% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin sitten PVDF-kalvo havaitsemiseksi fosforyloidun tyrosiinin käyttäen hiiren monoklonaalista vasta-ainetta fosfotyrosiinin (Cat. Nro sc-7020, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Kalvot myöhemmin riisuttu ja uudelleenseulottiin havaitsemiseen koko VEGFR2 ja PDGFRβ käyttäen samaa vasta-ainetta käytetyt valmisteet immunosaostus.

Apoptosis havaitseminen

parafinoidut kudosleikkeiden (5 pm paksu) tutkittiin TUNEL määritys (ApopTag® Apoptosis Detection Kit, Chemicon, Temecula, CA), kuten aiemmin on kuvattu (26). Lyhyesti, leikkeitä inkuboitiin 15 minuutin ajan 20 ug /ml proteinaasi K: ta huoneenlämpötilassa ja sitten pestiin perusteellisesti tislatulla vedellä. DNA-fragmentit on tuotettu apoptoottisen prosessin merkittiin digoksigeniinillä nukleotidin kautta 60 min inkubaation 37 ° C: ssa terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) kosteuskammiossa. Sitten leikkeitä huuhdeltiin ja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, jossa anti-digoksigeniinivasta-konjugoitu fluoreseiini. Sen jälkeen, kun counterstaining 4′-6-diamino-2-fenyyli (DAPI), objektilasit tutkittiin prosenttiosuus fluoreseiini-tagged soluihin käyttäen Zeiss Axioplan-2 fluoresenssimikroskoopilla.

Histologia, immunohistokemia ja pienten suonten tiheys arvio

valmistaminen parafinoidut kudosleikkeiden, niiden värjäys ja immunohistokemiallista analyysit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu (23, 24). Anti-von Willebrand tekijä VIII vasta-aineen (Cat. No. A0082, DAKO Diagnostics Canada Inc .; 1:200) käytettiin tunnistamiseen mikrosuonten. Kaikki kudosleikkeet kevyesti vastavärjättiin 5% (w /v) Harris hematoksyliinillä (H 0,05, paitsi mikrosiruanalyysi, jossa merkitys asetettiin p 0,001.

Tulokset

Koko genomin ilmentymisen profiilit mikropaloitelluista CCOC tunnistaa differentiaalisesti ilmentyvien geenien

geeniekspressiomalleja RNA eristettiin epiteelin komponentti 10 selkeä solujen munasarjasyövän näytteet eristettiin laser talteenotto mikrodissektion verrattiin vastaavasti RNA: ta eristettiin 10 normaalin munasarjan pintaepiteelin näytteitä käyttäen Affymetrix U133 plus 2 paneelit. Normalisoinnin jälkeen ja alustavan analyysin, 16013 informatiivinen probesets kulunut suodatus kriteerit. Käyttämällä monimuuttuja permutaatio testi antaa 95%: n varmuudella, että määrä vääriä löytöjä ei ylittänyt 10%, 3288 probesets varten 2559 geenien havaittiin säädellään eri tavalla, määritellään 1,5-kertaiseksi tai enemmän eroa ilmaisutapoja tilastollista merkitystä p & lt 0,001. Graafinen esitys tämän ero geenin ilmentyminen voidaan nähdä kuviossa 1a. Validoida microarray data, 12-geenit, jotka ilmentyvät differentiaalisesti valittiin satunnaisesti qRT-PCR-analyysiin. Kymmenen 12 geenit ilmentyvät differentiaalisesti on qRT-PCR, jolloin yleinen microarray validointi osuus 83% (kuva 1b, c ja taulukko S1).

(a) graafinen esitys koko genomin ilmentymisen profilointiin Clear Cell munasarjasyöpä Yksilö (CCOC) ja Munasarjojen pintaepiteelissä (OSE). (B) ja (c) Vertailu qRT-PCR data ja mikrosirujen tiedot kuuden yliekspressoitu ja neljä ali-ilmentynyt geenejä käytetään validointi (d) Pathway analyysi erilaisesti geenien tunnistettu selvä solussa munasarjasyöpä mikrosirun. Geenit mukana analyysissä oli oltava kertamuutos ≥1.5. Useita koetinsarjojen laskettiin keskiarvo kullekin geeniä.

punainen

, geeni sääteli.

Sininen

, geeni alassäädetty.

tunnistaminen aktivoitu koulutusjaksojen CCOC

Jotta voitaisiin tunnistaa aktivoituvien reittien läsnä CCOC, toiminnallinen luokat ilmentyvät eri geenit tunnistettiin käyttämällä geeniä ontologian (GO) analyysi. Tilastollisesti merkitsevä luokat osoittaa useita osallistuvia geenejä hiilihydraattiaineenvaihdunnan, glukoosin aineenvaihduntaa, glykolyysin ja verisuonten kehitystä (taulukko 1). 3288 probesets ja niihin liittyvät suhteellisen ekspressiotietojen verrattuna OSE tuotiin PathwayStudio 6.0 -ohjelmisto. Pathways mukana angiogeneesiin, hyytymisen, glukoosin aineenvaihduntaa, solujen lisääntymisen, ja soluliikkuvuus näkyivät (kuvio 1 d). Esimerkiksi HSPCA, joka on osoitettu vakauttamiseksi HIF1α (27), havaittiin olevan yli-ilmentynyt.