Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA voidaan siirtää kuolevat muokatut solut viereisiin soluihin fagosytoosin apoptoottisten kappaleiden, mikä johtaa solun transformaatio. Täällä tarjoamme näyttöä oton apoptoottisia johdettujen kohdunkaulan syöpäsoluja ihmisen mesenkymaaliset solut. Mielenkiintoista on, HeLa (HPV 18 +) tai Ca Ski (HPV16 +) solujen, kätkeminen integroitu korkean riskin HPV-DNA, mutta ei C-33-soluja (HPV), pystyivät muuntamaan vastaanottajan soluja. Ihmisen ensisijainen fibroblasteja nielaisi apoptoottiset kappaleet tehokkaasti 30 minuutin kuluessa co-viljelyn. Tämä mekanismi on aktiivinen ja sisältää aktiinisytoskeletonin.

In situ

hybridisaatio transformoitujen fibroblastien paljasti HPV-DNA tumassa osajoukon syöjäsoluja. Nämä solut ilmaisivat HPV16 /18 E6-geenin, joka edistää häiriöitä p53 /p21-reitin, ja solut osoittivat kasvaimia fenotyyppi, mukaan lukien lisääntynyt proliferaationopeus, polyploidia ja ankkurointiriippumattomuudeksi kasvua. Tällainen vaakasuora siirto viruksen onkogeenien ympäröiviin soluihin, joilta puuttuu reseptoreita HPV voisi helpottaa pysyvyys viruksen pääasiallinen riskitekijä kohdunkaulan syövän kehittymisen. Tämä prosessi saattaa edesauttaa HPV: hen liittyvän sairauden etenemiseen

in vivo

.

Citation: Gaiffe E, Prétet J-L, Launay S, Jacquin E, Saunier M, Hetzel G, et al. (2012) Apoptotic HPV Positiivinen Syöpäsolut Exhibit Transforming Properties. PLoS ONE 7 (5): e36766. doi: 10,1371 /journal.pone.0036766

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 06 huhtikuu 2012; Julkaistu: 4. toukokuuta 2012

Copyright: © 2012 Gaiffe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Yhteisöt ja teokset tukivat julkisten varojen ”Region de Franche-Comté”, ”Institut National du Cancer” ja ”Ligue Contre le Cancer, Comité du Doubs.” rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, tai valmisteen käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epidemiologiset ja kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että korkean riskin ihmisen papilloomavirukset (HPV), erityisesti HPV 16 ja 18, on tärkeä rooli induktioon karsinoomien kohdunkaula [1], [2]. Mekaanista näkökohdat HPV-indusoidun karsinogeneesin liittyvät useimmiten poistamiseen E2 ORF seurauksena viruksen DNA integraation isännän genomiin [3]. Tämä johtaa sääntelemättömään ilmentymiseen viruksen E6- ja E7-geenit, jotka ovat pääasiassa muuttamalla geenejä. Ytimessä tämä muutos on sitoutumisen E6 p53 ja E6AP, joka suosii p53 hajoaminen [4] sekä E7 kompleksimuodostuksesta retinoblastoomaproteiiniin pRb [5], jolloin vapauttamisen solusyklikontrollin, DNA: n korjaukseen ja apoptoosin .

aikana kasvaimen kehittymisen, suuri osa soluista on menetetty apoptoosin kautta [6]. Kuten solukuoleman laukaisee erilaisia ​​solunulkoisia signaaleja, mukaan lukien kasvu /eloonjäämistekijää ehtyminen, hypoksia ja menetys soluväliaineen vuorovaikutuksia, sekä solunsisäisiä signaaleja, kuten DNA-vaurioita [7]. Lopuksi apoptoottiset solut tyhjennetään erikoistuneiden fagosyyttisolujen, jotka inaktivoivat ja hajoavat niiden solukomponenttien [8]. Kuitenkin apoptoottiset solut voidaan myös sisäistää erikoistumattomissa vastaanottaja soluja. Niinpä fibroblastit kykenevät nielemään apoptoottinen neutrofiilien [9], ja maksan endoteelisolujen voi sitoa ja fagosytoivat maksan apoptoottiset kappaleet [10]. Tämän endosyyttisiin prosessi, apoptoottiset solut voivat toimia DNA-vektorin, ja vaakatasossa siirretty DNA voi valikoivaa etua vastaanottajalle soluun.

horisontaalinen geenisiirto (HGT) on hyvin dokumentoitu prokaryooteissa ja myötävaikuttaa evoluutio, ekologian ja vastustuskyvyn antibiooteille [tarkistetaan [11], [12]]. Vaikka vaakasuora geneettisen tiedon kahden eukaryooteissa on raportoitu kasveissa [13], [14] ja selkärangattomat [15], harvat tutkimukset ovat keskittyneet HGT välillä nisäkässoluissa. Vaihtoa geneettinen informaatio välittyy apoptoottisten kappaleiden on osoitettu esiintyvän välillä syöpäsolujen [16]. Apoptoottisten kappaleiden transformoitujen lymfoidisoluissa kätkeminen integroitu kopioita Epstein-Barr-virus voi myös siirtää virus-DNA-sekvenssit [17]. Samoin HIV-1 provirus geenit siirretään soluja, joista puuttuu reseptoreita viruksen sisäänpääsyn [18]. DNA on myös raportoitu siirretään apoptoottista H-ras

V12- ja c-myc-transfektoidut solut p53 – /- hiiren alkion fibroblasteissa, mikä johtaa niiden transformaation [19]. Toisaalta, syöjäsoluja, jotka ilmentävät p53 tai p21 ei ole transformoitu, mikä viittaa siihen, suojaava mekanismi, jota ohjaa p53-reitin [20]. Äskettäin Ehnfors J.

et al.

Osoitettu, että fibroblastit ja endoteelisolut kykenevät hankkia ja jäljittelemällä H-ras

V12 ja c-myc-DNA: kun apoptoottisten kasvainsolujen sisältävät apinan virus 40: n suuren T-( SV40LT) antigeeni [21]. Nämä havainnot todisteita siitä, että transformaatiotehokkuus liittyy ilmaus SV40LT inhiboimaan p53 [22]. Koska suurin osa kohdunkaulan karsinoomien ilmaista E6 virus- onkoproteiinia, joka edistää p53 hajoamista, kuten myös SV40LT, me arveltu, että vaakasuora siirto HPV-onkogeenien voisi olla vaihtoehtoinen mekanismi syövän.

Täällä esitämme näyttöä siitä, että apoptoottisia soluja, jotka ovat peräisin kohdunkaulan johdettuja syöpäsolujen kätkeminen integroitu kopioita HPV pystyvät muuntamaan ihmisen ensisijainen fibroblasteja (HPF). Me osoittavat lisäksi, että vastaanottaja kasvainsolut voidaan ominaista korkea leviämisen ja hyperploidy. Lisäksi, viruksen geneettinen materiaali estävät p53 /p21-reitin ilmaistaan ​​transformoiduissa soluissa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti muutosta ihmisen ensisijainen solujen kautta oton apoptoottisten elinten HPV-tartunnan kohdunkaulan syöpä soluja.

Tulokset

apoptoottiset kohdunkaulansyövän solut sisäistää fibroblastit

apoptoosin kohdunkaulakarsinooman luovuttajan solut indusoitiin UVB säteilytys ja staurosporiinille altistuminen kuten aikaisemmin on kuvattu [23], [24] ja dokumentoitiin analyysi fosfatidyyliseriinin altistuksen (anneksiini V värjäys), DNA-pitoisuus ( propidiumjodidivärjäys) ja ydinvoiman pirstoutuminen (DAPI värjäys) (Methods S1 ja kuvio S1A ja S1B). Hoidon tuloksena ei ole eläviä soluja, jotka kykenevät leviämisen sisällä apoptoottisten solujen suspensioita (Methods S1 ja kuvio S1C ja SID). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että apoptoottisia kappaleita, jotka ovat peräisin EBV kantava B-lymfosyytit voivat lähettää DNA horisontaalisen siirron, ja että EBV-integroitu DNA voidaan edullisesti siirtää verrattuna solujen DNA [17]. Tässä tutkimuksessa olemme epäilivät HPFS- voisi nielaista apoptoottiset solut peräisin kohdunkaulan sinoomasolulinjoja HeLa (HPV18), Ca Ski (HPV16) ja C-33 A (HPV), riippumatta virologisten asemasta.

läsnäolo loisteputki apoptoottisten solujen vastaanottajan soluissa varmistettiin konfokaalimikroskopiaa. Apoptoottiset HeLa-solut, jotka sisältävät DNA: ta sotkeutua aktiinisytoskeletonin että HPFS- 48 h (kuvio 1A). Apoptotic Ca Ski ja C-33-solut myös otettu tehokkaasti vastaanottaja (kuvio 1 B). Inkuboinnin HPFS- yksin tai supernatantin apoptoottisten solujen ei aiheuttanut CFDA, SE (5- (ja 6 -) – carboxyfluoresceine diasetaatti sukkinimidyyli esteri) värjäys, mikä viittaa siihen, välisen yhteyden vihreän fluoresenssin ja läsnäolo apoptoottisten solujen (kuvio 1B ). Seuraamalla fluoresoivat väriaineet varhaisessa ajankohtina (1 h 3 h), havaitsimme aktiini rekrytointi, kun apoptoottisia soluja sidottu HPFS- (kuva 1Ci, valkoinen nuoli). Fibroblasti kalvo laajentunut noin molemmin puolin apoptoottisten solujen kautta aktiini polymerointi (kuvio 1Cii, valkoiset nuolet). F-aktiini sitten ympäröi apoptoottisten solujen muodostamiseksi phagocytic cup ja sulkea renkaaksi (kuva 1Ciii). Nämä mikroskooppisen havainnot ovat osoitus fagosytoosin, vaikka emme ole nimenomaan ominaista tämä mekanismi [25], [26]. Käyttämällä spesifisten väli- filamenttien kunkin solutyypin, varmistimme, että apoptoottisten solujen olivat epiteelisolujen (sytokeratiini- positiivinen), jotka sisäistää fibroblastit (vimentiinista positiivinen) (kuvio 1 D). Käyttäen määrällinen lähestymistapa virtaussytometrialla, arvioimme prosenttiosuus HPFS- nielaisi värjätään apoptoottisten karsinoomasoluja. Riippumatta apoptoottisten solujen käytetty, sisäistämisen tehokkuus oli samanlainen (12,5% kanssa apoptoottisia HeLa; 13% kanssa apoptoottisia Ca Ski; 14,5%, jossa apoptoottisia C-33 A) (kuvio 1 E). Kuitenkin olemme huomanneet, että 12-15%: n fibroblastien pystyivät ottamaan apoptoottisten solujen, kun taas määrä apoptoottisten solujen ympätään oli kymmenen kertaa suurempi kuin HPFS-. Tämä viittaa siihen, että fibroblastit ovat rajalliset tehokkuuden ja /tai määrän apoptoottisia solun internalisaation. Kun vastaanottaja solut ko-inkuboitiin apoptoottisia soluja 4 ° C: ssa 48 h, prosenttiosuus sisäistämisen laski merkittävästi 2%, mikä viittaa siihen, että sisäistämisen prosessi seuraa energian riippuvaisen reitin (kuva S2). Nämä tulokset osoittavat, että ihmisen ensisijainen fibroblastit voi nielaista apoptoottisia soluja, riippumatta niiden virologisen tilan kautta fagosytoosia.

(A) Co-kulttuurin HPFS- ja apoptoottisten HeLa-solut. (B) HPFS- viljeltiin yhdessä apoptoottisten Ca Ski soluja (ylhäällä vasemmalla), apoptoottisten C-33-solut (ylhäällä oikealla), yksinään (alhaalla vasemmalla) ja supernatantti apoptoottisten HeLa-solujen (alhaalla oikealla). (C) HPFS- viljeltiin apoptoottisia HeLa-solujen eri pituisia aikoja: 1 h (Ci), 2 h (CII) ja 3 h (CIII). Kuvissa aktiini rekrytointi ja Kalvopaisunta muodostuminen (nuolet). (D) HPFS, Ca Ski solut ja HPFS- sekä apoptoottista Ca Ski tai HeLa-solut värjättiin anti-vimentiinista (TRITC) ja anti-sytokeratiini (Cy 2) vasta-aineita. Mikroskoopin havainnot tehtiin kanssa -konfokaalimikroskoopilla (asteikko bar: 1 m). Kaikki tulokset edustavat neljän itsenäisen kokeen. (E) HPFS- inkuboitiin apoptoottisten HeLa, Ca Ski tai C-33-soluissa 48 tuntia ja apoptoottisten solujen sisäistämisen kvantifioitiin virtaussytometrialla.

vain HPV-positiiviset apoptoottisia soluja tehokkaasti muuttaa vastaanottajan solujen

Ehnfors

et al.

osoitti, että DNA rotan fibrosarcoma apoptoottiset solut transfektoitu H-

ras

V12, c-

myc

ja SV40LT siirretään ja muuntaa ensisijainen fibroblasteissa [21]. Koska HPV-onkogeenien kuten SV40LT, pystyvät tehokkaasti muuttaa infektoituneiden solujen ja estämällä p53-reitin, muun vaikutukset, me testasimme ovatko fibroblasteja viljeltiin apoptoottisten solujen pystyivät kasvamaan tukiriippumattomuutta mittaamalla niiden kyky muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa määritys, koska havaittu HeLa, Ca Ski ja C-33 syöpäsolujen (kuvio 2A, ylempi viiva). Sen sijaan ihmisen ensisijainen fibroblastit eivät pystyneet kasvamaan ilman kiinteää ainetta (kuvio 2A, ylempi viiva). Vaikka kolmenlaisia ​​apoptoottisten kappaleiden hoidettaviksi sidekudosmuodostussolut vain apoptoottiset solut kätkeminen HPV (HeLa- ja Ca Ski solut) muuttaneet HPFS- (kuvio 2A, keskimmäinen rivi). Kontrollit kanssa apoptoottisia soluja yksinään ei aiheuttanut pesäkkeiden muodostumiseen (kuvio 2A, alempi viiva). Nämä havainnot osoittavat, että inkubointi apoptoottisten solujen HPV-integroitu DNA tehokkaasti indusoi kiinnittymisestä riippumatonta kasvua HPFS- tunnusmerkki muutosta ja

in vitro

korrelaattina tuumorigeenisyyden

in vivo

[27 ]. Muutos tila HPFS- testattiin edelleen raja-laimennus määrityksissä. Itse asiassa, toisin kuin ensisijaisen fibroblastien, fibroblastit transformoitu apoptoottiset HeLa (FH) ja Ca Ski (FC) solut oli kyky muodostaa monikerroksisen pesäkkeitä, kun niitä oli kasvatettu alhaisella tiheydellä (kuvio 2B). Tässä vaiheessa, FH ja FC alkoi näytteille transformoitu fenotyyppi, joidenkin solujen ne näyttivät pyöristetty, toisin kuin ohjaus HPFS, joka näytetään karan muoto (kuvio 2C). Lisäksi transformoidut fibroblastit koostui enimmäkseen pakattua tai yhdistettyjen pieniä soluja, kuten HeLa ja Ca Ski soluja, kun taas ensisijainen fibroblastien muodostivat litistetty yksikerroksista.

(A) HPFS ja HeLa, Ca Ski ja C-33 kohdunkaulan syöpäsolut (ylempi viiva); HPFS- 48 tunnin kuluttua altistuksen apoptoottisten solujen (apo HPF, apo HeLa, apo Ca Ski, apo C-33 A) (keskimmäinen viiva) viljeltiin pehmeässä agarissa ja 21 päivää. Apoptoottisia soluja yksin olivat myös viljeltiin kontrollina (alempi viiva). Valokuvat otettiin 20 x suurennos. (B ja C) HPFS, HeLa-solut, Ca Ski, ja transformoituja fibroblastien apoptoottiset HeLa (FH) ja apoptoottisten Ca Ski (FC) solut (sen jälkeen, kun valinta on pehmeässä agarissa), kasvatettiin raja-laimennoksena 21 päivää. (B) Pesäkkeet värjättiin lila kristalli laskettiin, ja maljaustehokkuus (PE, solujen prosenttiosuus pystyvät muodostamaan pesäkkeitä, SD, keskihajonta) laskettiin. (C) Colony suurennuksilla valokuvattiin 40 x suurennos.

Kuvio 3A esittää joka muutti fibroblastit, FC ja FH, eivät ole positiivisia sytokeratiini- värjäystä, toisin kuin epiteelin HeLa- ja Ca Ski soluja, peruuttamista sitä mahdollisuutta, että havaittu transformoidut solut ovat harvinaisia ​​eloon jäänyt syöpäsoluja ja klonaalinen kehitys Ca Ski soluja. Kuten on havainnollistettu ylemmän vasemman paneelin kuvion 3B (D18S61 merkki, esimerkki 20 merkkiaineiden DNA-tyypitys käytetty), on transformoitu fibroblasteissa on rakenteessa DNA, joka on erilainen kuin alkuperäinen kasvainsolujen. Muut tulokset DNA-tyypitys kokeet osoittivat, että FC-solut olivat erilaiset Ca Ski soluissa, mutta sisältää joitakin alleelit Ca Ski DNA (TP53 ja D8S264 markkereita), mikä siirtää pienten DNA-fragmenttien. FC DNA sisältää myös osia kromosomeista (D17S250 markkereita), mikä siirtää suurten DNA-fragmenttien, kuten on kuvattu Holmgren [17], [19]. Vaikka nämä tulokset osoittavat kromosomi uudelleenjärjestely (tappio ja voitto alleelien) FC-solujen, emme voi sulkea pois mahdollisuutta ristikontaminaation, vaikka tämä on erittäin epävarmaa.

(A) HPFS- Ca Ski, HeLa, FC ja FH solut analysoitiin immunocytofluorescence varten cytokeratine ilmaisun (asteikko bar: 1 m). (B) DNA Ca Ski ja FC solujen monistettiin loisteputki PCR: llä käyttäen 20 mikrosatelliitteihin. Neljä edustaja mikrosatelliittimarkkereita monistusta esitetty. Erityyppiset alleelin havaitaan neljällä markkereita: D18S61 TP53, D8S264 ja D17S250.

Seuraavaksi määritetään vaikutuksia HPF muunnoksen leviämisen nopeus käyttäen kasvukäyrä ja tulokset MTT ( 3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi bromid) lisääntymisen määrityksessä on esitetty kuviossa. 4A ja 4B, vastaavasti. FH oli keskimääräinen asukasluku kaksinkertaistui aika 15 h, ja FC oli keskimäärin aika 16 h ja HPF kaksinkertaistaa aika oli suurempi tekijällä 19 (298 h) (kuvio 4A). Mitokondrioiden toimintaa mitattiin MTT-proliferaatiomääritys oli yhtäpitävä kasvukäyrän tulokset (kuvio 4B). Nämä kasvuvauhti muutokset tukevat Tuumorigeenisuustutkimuksissa vasta transformoitujen fibroblastien. Siksi testataan onko lisääntynyt kasvunopeus ja muutosta vastaanottajan solut liittyy geneettisiä muutoksia, jotka johtavat hyperploidy. Cytometry analyysit osoittivat, että DNA: n määrä kasvoi kohdat transformoitujen fibroblastien (kuvio 4C). Meidän kokeissa HPF: ää, fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo (MFI) 154 vastasi diploidisoluissa (kuvio 4D). Rahalaitos nousi 205 ja 250 jälkeen 5 (P5) ja 15 (P15) kohtia FH soluja, tässä järjestyksessä. Havaitsimme samanlaisia ​​tuloksia FC soluja (219 P5 ja 264 at P15). MFI kanavaissa 15 FH ja FC edustettuina hypertriploidy. Aneuploidian, kuten nähdään myös malli, johtuu usein tietyn geneettinen epävakaus ja se on yksi yleisimmistä ominaisuuksista syövistä [28].

(A ja B) HPFS- ja HPFS- transformoitiin apoptoottisia HeLa (FH) tai apoptoottisten Ca Ski (FC) soluja kasvatettiin osoitetun pituisia aikoja. Soluproliferaatioon tarkkailtiin joka päivä laskemalla kokonaismäärät solujen (A) ja MTT-määritysten (B). Käyrät esittävät keskiarvo (+/- SD) on kolmen erillisen kokeen. (C) HPFS- FH ja FC kanavaissa 5 (P5) ja 15 (P15) värjättiin (10

6 solua), jossa propidiumjodidiliuoksella, ja analysoitiin virtaussytometrialla. (D) MFI on G0 /G1 huippu (keskiarvo kolmen erillisen kokeen +/- SD) näyttää ploidisuus HPF, FH ja FC klo P5 ja FH ja FC klo P15.

Apoptotic HPV: hen liittyvän syöpäsolujen siirtää tehokkaasti viruksen onkogeenien fibroblasteihin

Koska vain apoptoottiset HeLa- ja Ca Ski luovuttajan solut pystyivät muuntamaan fibroblastien, me arveltu, että HPV-onkogeenien voitaisiin siirtää vastaanottajan soluja. Meidän konfokaalimikroskopialla analyysi viittasi siihen, että geneettisen materiaalin siirrettiin apoptoottisten solujen fibroblastien tumien jälkeen 6 h yhdessä viljelemisen (kuvio 5A, valkoiset nuolet). Aktiinisytoskeletonin uudelleenjärjestely näytti toimittaa apoptoottista solua kohti tumaan DNA: n siirtoa, katsottuna korkealla suurennuksella päällekkäin läpivalaisu kanssa phalloidin tai DAPI värjäys kuvia. Näiden havaintojen tutkimme HPV-DNA siirron fibroblastien vastaanottajille käyttämällä

in situ

-hybridisaatio (ISH) ja koetin hybridisoitui nimenomaan korkean riskin HPV-DNA. HeLa ja Ca Ski soluja käytettiin positiivisina kontrolleina. Vahvistaa hypoteesia, hybridisaatiosignaalit havaittiin lila pisteitä apoptoottisten solujen ja tumien transformoitujen fibroblastien (FH ja FC), kun taas mitään signaalia ei havaittu HPFS- (kuva 5B). Nämä tiedot vahvistaa hypoteesia horisontaalisen siirron viruksen onkogeenien. Toinen lähestymistapa, jossa monistetaan E6 DNA HPV 16 ja 18 vahvisti läsnäolo viruksen DNA transformoiduissa fibroblasteissa (kuvio 5C). Olemme edelleen analysoineet ilmaus E6 HPV16 ja E6 HPV18 käänteistranskriptaasi seuraa reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää. Kuvio 6A esittää, että E6 transkriptit havaittiin transformoiduissa FH ja FC solujen kuitenkin alhaisempi kuin vanhempien HeLa ja CaSki soluja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että siirto viruksen onkogeenien on tehokas ja toimiva. Jos haluat tarkemmin tutkia roolia siirretyn E6 onkogeenien estäjinä p53 ilmaisun, me immunoblotattiin p53 ja yksi sen tavoitteista, p21. Näin ollen, p53 ja p21 tasolla transformoidun HPFS- väheni huomattavasti, samanlainen lasku luovuttajan syöpäsoluja (kuva 6B). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset korostavat kriittinen rooli viruksen onkogeenin siirron muutosta ensiöparit, prosessi, joka ohittaa p53-reitin.

(A) kuvat havainnollistavat DNA siirto apoptoottiset solut fibroblastien vastaanottajille (nuolet). Mikroskooppiset havainnot tehtiin kanssa -konfokaalimikroskoopilla (asteikko bar: 1 m). (B) Korkean riskin HPV-DNA havaittiin

in situ

hybridisaatio vanhempien ja apoptoottisten HeLa- ja Ca Ski soluja, FH ja FC muttei HPFS-. Solut vastavärjättiin eosiinilla (asteikko bar: 1 m). (C) agaroosigeelielektroforeesi monistettiin ihmisen albumiinia ja E6 HPV18 ja E6 HPV16-DNA (MW: moolimassa). Kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen.

(A) E6 HPV18 ja E6 HPV16 RNA kvantifiointiin päässä HPFS- vanhempien ja fibroblastien transformoituja apoptoottisia HeLa-solujen tai apoptoottisten Ca Ski soluja (nimetty FH ja FC vastaavasti) suoritettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR seuraavat käänteistranskriptio. Kuvaajat edustavat keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta (+/- SD). (B) Immunoblottaus analyysit p53 ja p21 ilmentymistä syöpäsolulinjoissa, HPFS ja FH ja FC transformoitiin fibroblastien, käyttämällä hiiren monoklonaalisia vasta-aineita p53 ja p21. Blotteja myös koettimena β-aktiini vasta-aine.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tulokset tarjoavat suoraa näyttöä kasvaimia synnyttävän potentiaalin HPV positiivisia apoptoottisia soluja. Siirto virus-DNA on peräisin HPV-positiiviset kohdunkaulan syövän soluihin HGT edistää kasvua ja muutosta HPFS- ja voisi olla vaihtoehtoisen mekanismin HPV: hen liittyvän solun transformaatio. Bergsmedh

et al.

Aiemmin osoitettu vaaka-onkogeenin kuljetus eukaryoottisoluissa [19]. Niiden malli, luovuttajan solut olivat primäärisiä jyrsijän fibroblastien muunnettu yli-ilmentämään c-

myc

ja H

ras

V12 ja hygromysiini-resistenssigeenin, joka salli erittäin tiukat valikoima transformoituja vastaanottajan solut jälkeen HGT.

tutkimuksessamme sisäistämisen hinnat apoptoottisten syöpäsolujen olivat samanlaisia, riippumatta HPV- statuksesta. Kuitenkin havainto, että ainoa HeLa ja Ca Ski syöpäsolujen kirjanpitoarvoja luonnollisesti integroituneen HPV-onkogeenien, mutta ei HPV-negatiivinen C-33-solut kykenevät muuntamaan phagocytosing fibroblastien tukee hypoteesia, että viruksen DNA siirtämien apoptoottisia soluja voidaan käyttää uudelleen ja ilmaisemat vastaanottajan solut.

in vitro

vastaanottajasolu muunnos vaakasuoraan siirretty DNA, helpottaa DNA pirstoutuminen, osoitettiin olevan riippuvainen p53 [29]. Todellakin, p53- tai p21-vajaiden solujen, mutta ei villityypin p53 fibroblastit, tuli kasvain kaltainen jälkeen otto c-

myc

ja H-

ras

V12 onkogeenien osoittaa, että Chk2 /p53 /p21-signalointireitin suojaa soluja vastaan ​​leviämistä mahdollisesti haitallisten DNA [19], [20], [30]. Lisäksi SV40LT, mikä helpottaa p53 hajoamista, voi voittaa tämän geneettistä valvontaa sekä

in vitro

ja

in vivo

[21]. Kuten SV40LT, E6 onkoproteiineja HPV tyyppi 16 ja 18 ovat fyysisesti liittyy villikannan p53 ja suosivat sen proteosomal hajoaminen [tarkistetaan [31]]. Analyysi transformoitujen fibroblastien osoitti, että ne sisälsivät E6 HPV16 tai E6 HPV18-DNA. Lisäksi, ISH osoitti, että HPV-DNA: n apoptoottisen syöpäsolujen siirrettiin ytimet vastaanottajan fibroblasteissa. Kun DNA on siirretty, ilmentyminen HPV-E6-geenien havaittiin RNA-tasolla jopa 15 viikkoa sen jälkeen, kun alusta yhteisviljelmässä kokeissa. E6-ilmentäviä vastaanottaja solujen näytteillä alentuneesta p53 sekä sen tavoite, p21, mikä saattaa osittain selittää muutoksia kasvun ohjauspiiriä.

tarkoitus vahvistaa genotyypin joka muutti fibroblastit olivat ainutlaatuisia ja johdettiin primaarisista fibroblasteista ja vanhempien syöpäsolun linjat. Tutkimalla useita mikrosatelliittia, huomasimme, että he todella tunsivat joitakin alleelit identtisiä tunnistettu apoptoottisten kohdunkaulan syöpäsoluja. Kuitenkin johtuen menetys ensisijaisen fibroblastien vanhenemiselle, emme pystyneet vahvistamaan, että ne olivat peräisin ensimmäisen fibroblasteissa. Emme voi siis täysin sulje pois mahdollisuutta ristikontaminaation liity solulinjan, vaikka tämä mahdollisuus vaikuttaa epätodennäköiseltä. Kuitenkin virally muuttunut fibroblastit, jotka pystyivät muodostamaan pesäkkeitä osoitti erikoinen morfologisiin ominaisuuksiin, korkea proliferaationopeus ja aneuploidia-. Siirtyminen diploidiaan ja aneuploidian, tunnusmerkki havaittiin lähes kaikista syövistä [28], on havaittu varhain korkean riskin HPV-liittyvä vaurioiden kohdunkaula [32] ja syyksi on synergiavaikutuksesta E6 ja E7 onkoproteiineja [ ,,,0],tarkistetaan [31]]. Kuitenkin korkean riskin HPV kuolemattomien solujen ovat ei-tuumorigeenisiä, ja aktivoitumista solun onkogeenien c-

myc

, H-

ras

ja c-

fos

on tarpeen täysin voittaa anti-onkogeenisiä p53 ja johtaa kohdunkaulan syövän kehitykseen [33], [34], [35]. Edelleen tutkimus ilmaisun näiden mahdollisesti aktivoida solujen onkogeenien auttavat ymmärtämään mekanismi fibroblastien transformaatio. Kuitenkin HPV onkogeeni siirto voisi olla rooli tärkeämpää kuin harkita, koska ilmaus HPV16 E6 onkogeenin HPV negatiivinen C-33-solut antaa aggressiivisen fenotyypin mikä näkyy säteilyn vastarinnan siirrettyjen kasvainten [36].

Escape from immuunivalvonnan mekanismit voivat edustaa tärkein riskitekijä HPV-DNA pysyvyys ja vaurion etenemistä, kun taas virus siirto apoptoottisten kappaleiden ympäröiviin soluihin puuttuu reseptoreita HPV

in vivo

voisi helpottaa pysyvyys HPV kohdunkaula. Lisäksi tällainen siirto voisi selittää leviämisen HPV mesenkyymisolujen, havaittuna ISH kohdunkaulan karsinoomien [37], [38], ja mahdollisuus strooman säiliön HPV. Lisäksi ihmisen kiinteiden kasvainten, osajoukko syöpäsoluja, kutsutaan syövän kantasoluja, jotka todennäköisesti aloitetaan seurauksena HGT aiheuttaa hyvin aggressiivisia syöpiä, joissa on suuri alttius kohti metastaattinen levittämiseen [39]. Tämä saattaa selittää välistä positiivista määrä kasvaimensisäisenä apoptoosin ja useat kohdunkaulan kasvain parametreja kuten kasvaimen kokoa, vaurio luokalla metastaattisen fenotyypin ja potilaan eloonjääminen [7], [40], [41], [42].

lisäksi lisääntynyt esiintyvyys apoptoottisten solujen seuraavista kemo- ja /tai sädehoitoon voi olla osittain vastuussa toistumisen HPV vaurioita aiheuttamalla muutos uusia soluja samaan tai eri anatomiset paikoissa kuukauden tai vuoden kuluttua remission [43 ], [44]. Tutkimukset tästä mahdollisuudesta on perusteltua, lisäksi pyrkimyksiä löytää uusia hoitostrategioita kohdistaminen E6 /E7 onkogeenien rajoittamaan horisontaalista siirtäminen ja hallita kasvainten kehittymiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja apoptoosin

HPFS- eristettiin aikuisen ihmisen ihon jälkeen vatsan kuten aikaisemmin on kuvattu [45], ja niitä kasvatettiin täydellisessä DMEM (Lonza), joka sisälsi 10% FBS: ää (Lonza), penisilliini /streptomysiiniä ja L-glutamiinia. HPFS- uutettu leikkausjätteitä ei sovelleta validointi eettisen komitean ja potilaan suostumusta lain mukaisesti L.1245-2 on ”Code lupahakemus” sovellettu Ranskassa. Lisäksi laboratorio ihon engineering Prof. Philippe Humbert n ihotautien osastolla, joka tarjoaa ihmisen fibroblastit, on käsikirjoitus asiakirjoissa todetaan potilaan ei vastustamatta käyttää hänen leikkausjätteitä lääketieteelliseen tutkimukseen mukaisesti lain L.1211-2. Ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjat (ATCC), HeLa (HPV18, villityyppisen p53) ja C-33 (HPV negatiivinen, p53) kasvatettiin täydellisessä EMEM (Lonza), ja Ca Ski soluja (HPV16, villityyppisen p53 ) kasvatettiin täydellisessä RPMI (Lonza). Ne seurataan kuukausittain ja todettu olevan vapaita mykoplasmatyypeissä. Kaksitoista tuntia ennen apoptoosin induktio, karsinoomasoluista ympättiin 2 x 10

4 solua /cm

2. Ne käsiteltiin sitten 20 mJ /cm

2 UVB säteilytystä ja sen jälkeen 300 nM staurosporiinia (STS) (Sigma Aldrich) 48 tuntia. Apoptoottiset solut otettiin talteen sentrifugoinnin jälkeen supernatantti 300 g 10 minuuttia. Apoptoosi havaitseminen suoritettiin kuvatulla lisätietokohtaan (Methods S1). Apoptoottisten solujen inkuboitiin HPFS- suhteessa 10:01. Tämä suhde valittiin, koska korkeampi suhde aiheuttaa fibroblastien kuoleman ja alemman suhde hidastaa sisäistämisen.

Apoptotic solun sisäistämisen analyysi

apoptoottiset solut värjättiin 1 ug /ml CFDA, SE (Invitrogen Ltd) laimennettuna DMEM, jossa on 2% FBS: ää 13 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Pesun jälkeen ne inkuboitiin 48 h vastaanottajan soluja. Sillä sytometriaa analyysi, fibroblastit inkuboitiin apoptoottisia soluja kerättiin trypsinisaatiolla ja analysoitiin käyttäen Cell Lab Quanta ™ SC -virtaussytometrillä (Beckman Coulter). Apoptoottiset solut leimattiin CFDA, SE ja HPFS oli erottaa apoptoottiset solut niiden halkaisija arvioitiin virtaussytometrialla. Tapahtumat pieniä halkaisijat ( 13 um) ja positiivinen CFDA SE, katsottiin apoptoottiset solut ;, tapahtumia halkaisijaltaan suuria ( 13 pm) ja negatiivinen CFDA, SE, olivat HPFS- ja tapahtumia halkaisijaltaan suuria ja positiivisia CFDA, SE, olivat HPFS kanssa vallannut apoptoottisia soluja.

konfokaalimikroskopialla, fibroblastit kasvatettiin coverslides fiksoitiin 3,7% paraformaldehydissä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja permeabilisoitiin 0,1% triton X100: ssa 10 min ajan huoneen lämpötila (RT). Solut värjättiin käyttämällä TRITC (tetrametyylirodamiini-isotiosyanaatti) -konjugoitu phalloidin (Sigma Aldrich) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja 300 nM 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli, dihydrokloridi (DAPI; Invitrogen) 5 min RT. 3D kuva (z projektio) rekonstituoitiin 32 vaaka 2D viipaleet saadaan konfokaalimikroskopialla. Toinen joukko soluja inkuboitiin kaksi ensisijaista vasta: monoklonaalinen hiiren anti-ihmis-sytokeratiini-vasta-ainetta (klooni AE1 /AE3, DakoCytomation) käytetään 01:50 ja monoklonaalinen kanin anti-humaani vimentiinin vasta-ainetta (klooni SP20; GeneTex) käytettiin 1 :100 laimennus. Johdetun vasta-aineita (Jackson ImmunoResearch) kytkettynä syaniini 2 (CY ™ 2-konjugoitu AffiniPure Goat anti-hiiri-lgG) tai rodamiini (rodamiini (TRITC) konjugoitua AffiniPure aasin anti-kani IgG: tä) käytettiin 1:50. Coverslides lopulta tutkittiin käyttäen Olympus FluoView 1000 fluoresenssimikroskoopilla (Olympus).

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä, solujen kasvuun ja aneuploidian analyysi

Soft agar testit suoritettiin 24-kuoppalevyille semi -Solid media (DMEM, 10% FBS, 0,35% agar; Invitrogen), jossa 8 x 10

3 ja 3 x 10

5 solua /ml median pohjakerroksen (RPMI, 10% FBS, 0,5% agar ). Soluja kasvatettiin 21 päivää, ja pesäkkeet havaittiin käyttämällä Axiovert 25 käännettyä mikroskooppia (Zeiss) [27]. Pesäkkeet kerättiin sitten kaapimalla pinta pehmeässä agarissa ja kaksi solulinjaa fibroblastien transformoitu apoptoottiset HeLa (FH) ja Ca Ski (FC) solut on johdettu ja käytetään edelleen kokeita.

Ensisijainen fibroblasti transformaatio testattiin myös raja-laimennus kulttuurien 6-kuoppaisille levyille 5 x 10

2 solua /kuoppa 21 päivää. Pesäkkeet värjättiin sitten käyttämällä lila kristalli (0,1% lila kristalli (w /v), etanolia 5%) ja valokuvattiin Nikon Coolpix 4500 digitaalikamera (Nikon) [46].

Lisääntyminen transformoidut solut seurattiin laskemalla solujen kokonaismäärässä kussakin hyvin päivittäin 10 päivää, joiden Cell Lab Quanta ™ SC -virtaussytometrillä. Lisääntyminen seurattiin myös käyttämällä MTT testissä Cell Proliferation Kit I (MTT) (Roche) 5 päivän ajan.