Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MikroRNA ovat väärin säädellystä kilpirauhasen syöpä ja tärkeitä rooleja transkription jälkeisellä sääntelyn tavoite onkogeenien ja /tai tuumorisuppressorigeeneille.

Menetelmät /Principal havainnot

Tutkimme funktio miR-126-3p in kilpirauhassyöpä solut, ja merkkiaineena taudin aggressiivisuuteen. Huomasimme, että miR-126-3p ilmentyminen oli merkitsevästi pienempi suuremmissa kasvaimia, Tuumorinäytteissä kanssa ekstratyroidaalisen hyökkäyksen, ja korkeamman riskiryhmän kilpirauhassyövän 496 papillaarinen kilpirauhassyövän näytteitä Cancer Genome Atlas tutkimuskohortissa. Itsenäisessä vedostulostus, alentaa miR-126-3p ilmentymistä havaittiin follikulaarinen kilpirauhasen syövät (joka on Kapselipolysakkaridiantigeenin ja angioinvasion) verrattuna follikulaarinen adenoomia. Mekanistisesti kohdunulkoinen yliekspressio miR-126-3p ehkäisi merkittävästi kilpirauhassyöpä soluproliferaatiota,

in vitro

(p 0,01) ja

in vivo

(p 0,01), pesäkkeiden muodostumisen (p 0,01), kasvaimen pallojakaantuminen muodostumista (p 0,05), solumigraatiota (p 0,05), VEGF eritystä ja endoteelin putken muodostumiseen, ja keuhkometastaasitestissä

in vivo

. Löysimme 14 ennusti kohdegeenien, jotka merkittävästi muuttunut upon miR-126-3p transfektion kilpirauhasen syöpäsoluja, ja jotka ovat osallisina syövän biologian. Näistä 14 geenit,

SLC7A5

ja

ADAM9

vahvistettiin inhiboituvan miR-126-3p yliekspression ja olla kohdistu suoraa miR-136-3p.

johtopäätökset /merkitys

Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa, että miR-126-3p on kasvain heikentävän toiminto kilpirauhasen syöpäsoluja, ja liittyy aggressiiviseen sairausfenotyyppi.

Citation: Xiong Y, Kotian S, Zeiger MA, Zhang L, Kebebew E (2015) miR-126-3p Estää Kilpirauhasen syöpäsolujen kasvua ja etäpesäkkeiden ja liittyy Aggressiivinen kilpirauhassyöpä. PLoS ONE 10 (8): e0130496. doi: 10,1371 /journal.pone.0130496

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 19. toukokuuta 2015 Julkaistu: 05 elokuu 2015

Tämä on avoin pääsy artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 julkisuuteen omistautumista

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee sisäiset tutkimusohjelman Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Kirjoittajat eivät eturistiriitoja paljastaa.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kilpirauhasen syöpä on yleisin hormonitoimintaa syöpä ja yksi nopeimmin kasvavista syöpä diagnoosit Yhdysvalloissa [1,2]. Kilpirauhassyövän peräisin parafollicular soluista (medullaarinen) ja follikulaarinen soluja (ei-medullaarinen), joiden osuus on yli 95% kaikista kilpirauhassyöpä tapauksissa ja luokitellaan neljään suurta histologinen ryhmään: follikulaarinen kilpirauhassyöpä (FTC), papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC ), anaplastinen kilpirauhassyöpä (ATC), ja Hürthle karsinooma (HCC).

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavaa RNA: t, jotka ovat noin 21 nukleotidin pituisia ja säädellä geeniekspressiota [3,4]. miRNA on merkittävä rooli kasvainten synnyssä ja osoittaa huomattavaa kudosspesifisyys ja miRNA on myös todettu olevan hyvä syöpä biomarkkereita [5]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että useat miRNA ovat väärin säädellystä in kilpirauhassyövän peräisin follikulaarinen soluista [6-8]. Aiemmissa tutkimuksessa, huomasimme, että ilmentyminen miR-126-3p säädeltiin vähentävästi pahanlaatuiset kilpirauhasen kasvain näytteissä verrattuna hyvänlaatuinen kilpirauhasen kasvain näytteissä [9,10]. Vaimentua miR-126-3p ilmentymistä havaittiin FTC ja HCC, jotka ovat vain histologisesti erotettavissa follikulaarista tai Hürthle adenoomia, kun Kapselipolysakkaridiantigeenin invaasio ja /tai angioinvasion ovat läsnä. Rooli miR-126-3p kilpirauhassyövän hoitoon ei ole tutkittu aikaisemmin, mutta meidän ilmaisun analyysin kilpirauhassyöpä näytteissä viittaa siihen, että menetys miR-126-3p voi liittyä kilpirauhassyöpä etenemistä, ja että se voi toimia tuumorisuppressorin.

Tässä tutkimuksessa testasimme hypoteesia, että miR-126-3p on tuumorisuppressori ja liittyy sairautena. Selvitimme funktio miR-126-3p in kilpirauhasen syöpäsoluja käyttäen sekä

in vitro

ja

in vivo

malleissa. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-126-3p ehkäisi merkittävästi kilpirauhassyöpä soluproliferaatiota, pesäkemuodostusta, kasvaimen pallomainen muodostumista, muuttoliikkeen, VEGF eritystä ja HUVEC-putken muodostumiseen, ja keuhkoetäpesäkkeet

in vivo

. Lisäksi olemme havainneet, että miR-126-3p säätelee ilmentymistä monista syöpään liittyvien geenien, mukaan lukien koodaus liuenneen aineen kantaja-perheen 7-jäsenisen 5 (

SLC7A5

) ja disintegriini- ja metalloproteinaasi domeenin sisältävä proteiini 9 (

ADAM9

), ja että se suoraan kohdistuu näiden geenien. Lopuksi miR-126-3p ilmentyminen havaittiin liittyvän sairauden aggressiivisuus.

Methods

Animal Care ja käyttö komitea National Cancer Institute, National Institutes of Health hyväksyi eläinkokeessa protokollaa. Kun hiiret saavutti inhimillinen eutanasia kriteerit, hiiret kuvaamisen, ja lopetettiin CO2 hengitettynä. Tutkimuksen hyväksyi Office for Human Research Suojaukset ja potilastiedot kerättiin prospektiivisesti alle Institutional Review Board-hyväksytty protokolla National Institutes of Health Clinical Center (Bethesda, Maryland) saatuaan kirjallinen suostumus.

ihmisen kilpirauhanen kasvain näytteet, solulinjojen ja viljelyolosuhteet

ihmisen kilpirauhaskudokseen saatiin aikaan kasvaimen poisto, heti pikajäädytettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kudoksen sarjaleikkeissä käytettiin RNA ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla diagnoosin varmistamiseksi, ja että kasvainsolun pitoisuus oli 80% tai korkeampi. Tutkimuksen hyväksyi Office for Human Research Suojaukset ja potilastiedot kerättiin prospektiivisesti alle Institutional Review Board-hyväksytty protokolla National Institutes of Health saatuaan kirjallinen lupa.

Ihmisen kilpirauhassyöpä solulinjat XTC- 1 (HCC), FTC-133 (FTC), ja TPC-1 (PTC) pidettiin DMEM: ssä, jossa on 4500 mg /l D-glukoosia ja L-glutamiinia, ja 110 mg /l natriumpyruvaattia, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kilpirauhasta stimuloiva hormoni (10 mU /ml), penisilliiniä (10000 U /ml), streptomysiiniä (10000 U /ml), Fungizonea (250 mg /ml), ja insuliinia (10 ug /ml) tavallisessa kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2 ja 95% O

2 ilmakehässä. FTC-133-Luc2 solut tuotettiin transfektoimalla FTC-133-soluja, joissa lusiferaasia ilmentävän vektorin, ja soluja viljeltiin samassa alustassa G418 pitoisuutena 200 ug /ml [11]. Solulinjoja autentikointia lyhyitä tandem repeat profilointia.

miRNA transfektion

miRNA jäljittelevät HSA-miR-126-3p (miRNA matkivat, Pitoisuus ID: MC12841, Applied Biosystems, Foster City , CA) transfektoitiin soluihin pitoisuutena 25 nM käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), seuraten valmistajan protokollaa. Oligonukleotidi ei aiheuta mitään tunnettua miRNA (miRNA mimiikkapanelit Negative Control # 1; Applied Biosystems) käytettiin negatiivisena kontrollina.

RNA: n eristys ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR

Kokonais-RNA oli eristetty solulinjoista ja kudosnäytteitä käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Taqman MicroRNA Assay (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) käytettiin mittaamaan miR-126-3p ilmentymisen tason (HSA-miR-126-3p, määritys ID: 002228). Kokonais-RNA käänteistranskriptio miRNA-spesifistä aluketta, mitä seuraa reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen TaqMan-koettimia. U6 käytettiin endogeenista ohjaus. Suhteelliset määrät

ADAM9

ja

SLC7A5

mRNA: t määritettiin käyttäen TaqMan-määritys (Applied Biosystems) ABI 7900 HT-järjestelmä; ihmisen

GAPDH

käytettiin endogeenista ohjaus. ΔΔ Ct menetelmää käytetään laskettaessa ekspressiotasoja.

Western blot

Koko-solulysaatti valmistettiin RIPA-puskurilla (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), ja sitä käytettiin ADAM9 proteiinin havaitsemiseen Western blot käyttäen kaniinin polyklonaalista anti-ADAM9-vasta-ainetta (laimennus 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) ja SLC7A5-proteiinin havaitsemiseen Western blot käyttäen kaniinin polyklonaalista anti-SLC7A5-vasta-ainetta (1: 500 laimennus; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). GAPDH-proteiinin, ohjaus, havaittiin käyttämällä hiiren monoklonaalisia anti-GAPDH (# 0411) vasta-aineen (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Proliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio määritettiin käyttämällä CyQuant Cell Proliferation Assay (Invitrogen), mukaisesti valmistajan protokollaa. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin fluoresenssi mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), jossa eksitaatio 485 nm ja emissio-detektiota 538 nm: ssä.

Migration määrityksessä

Cellular Migraatio mitattiin käyttäen BD Chamber (Catalog # 354578, BD Biosciences, Bedford, MA), mukaan valmistajan ohjeiden. Soluviljelmän elatusainetta 10% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti alempi hyvin Boyden-kammion. Kilpirauhassyöpä soluja siirrostettiin ylempään osastoon kammion seerumivapaassa väliaineessa (4 x 10

4 solua per kuoppa). Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 22 tuntia, ei-vaeltavat solut poistettiin ylemmältä pinnalta, ja soluja, jotka olivat vaeltaneet kalvon läpi alempaan pintaan värjättiin Diff-Quik tahra Set (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). Kuvat otettiin kalvon kunkin insertin mikroskoopilla (50-kertainen suurennus) käyttäen digitaalikameralla. Kuvat otettiin katsellaan tietokoneen näytöllä ja solut viidellä kunkin insertin laskettiin.

Sferoidiviljelmiä kulttuuri

Kaksi päivää sen jälkeen miRNA transfektiosta solut trypsinoitiin, laskettiin, resuspendoitiin elatusaineissa ja levytettiin Ultra Low Cluster levy (Costar, Corning, NY) 3,5 x 10

4 solua kuoppaa kohti. Levyjä viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja väliaine vaihdettiin joka 2-3 päivä. 2 viikon kuluttua viljelyn jälkeen solut värjättiin kristallivioletilla ja valokuvattiin mikroskoopilla. Yhteenlaskettu pinta-ala pallosia kuvan sisällä mitattiin ympäröimällä kehä kunkin sferoidi, merkintä koko alueella, ja laskemalla pikselin numeroita ImageJ ohjelmistoa (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Pehmeä agar -määritys pesäkkeiden muodostumisen

Kolmen vuorokauden kuluttua miRNA transfektion, FTC-133-solut trypsinoitiin, laskettiin ja suspendoitiin uudelleen elatusaineissa. Kaksikerroksinen pehmeässä agarissa määritykset suoritettiin kuuden kuoppalevyillä. Pohja agarkerroksessa (2 ml /kuoppa) sisälsi 0,6% agaria (Difco agar jalo, BD Diagnostics, Sparks, MD) Hamin F-12 väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS, penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä ( 10000 U /ml), ja Fungizonea (250 ng /ml). Kolmekymmentä tuhatta solua sekoitettiin 1 ml ylemmän agar-liuosta (0,35% agaria elatusaineissa). 30 minuutin kuluttua 1 ml elatusaineita lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja media oli vaihdetaan kahdesti viikossa. Kahden viikon viljelyn, solun pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja tutkitaan mikroskoopilla. Colony laskenta tehtiin kolmella eri aloilla.

-tuumoriksenografti tutkimukset

FTC-133 soluja, jotka sisälsivät lusiferaasireportterigeenillä

luc2

transfektoitiin miR-126-3p tai asennuspalveli- NC ja istutettiin ihonalaisesti (10

6 elävät solut) vasempaan ja oikeaan kyljet Kateenkorvattomien nude-hiirten. Kasvaimet mitattiin mittaharpilla eri ajankohtina, ja tilavuudet laskettiin pituus x leveys x korkeus. Ruumiinavaus kasvainnäytteet valokuvattiin dokumentoida brutto morfologia, ja sen jälkeen näytteet punnittiin. FTC-133-

luc2

-soluja (7,5 x 10

5) transfektoitiin miR-126-3p ja miR-NC injisoitiin kateenkorvattomiin nude-hiiriin häntälaskimon kautta, ja hiiret kuvattiin viikoittain käyttäen Xenogen IVIS 100 järjestelmään.

haavan paranemista määritys

kilpirauhassyöpä solujen vaeltamiseen arvioitiin käyttämällä naarmu haavan paranemista määritys [12], jossa 150000 solut transfektoitiin miRNA, päällystetty kuuden kennon levyt, ja annettiin kiinnittyä ja kasvaa 44 tunnin ajan (miRNA). Seuraavaksi kolme pystysuoraa haavat tehtiin steriilillä 10-il pipetin kärki, ja sitten vaakasuora viiva tehtiin yli kolme riviä, jotta solut voitiin havaita samassa pisteessä. Solut tutkittiin 12 tunnin välein ja leveyden mittaukset jopa 24 tuntia.

VEGF ELISA

Culture media supernatantti kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen kilpirauhassyövän solujen miR-NC tai asennuspalveli- 126-3p. VEGF-tasot mitattiin käyttäen ihmisen VEGF: Quantikine-ELISA-kittiä (R 0,05. Nerokkuus Pathway Analysis (IPA) järjestelmä (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) käytettiin reitin analyysiin.

miRNA-126-3p tavoite ennustukset

TargetScan 5,1 (http: //targetscan .org /) käytettiin tunnistamaan mahdolliset suorat kohdegeenejä miR-126-3p.

lusiferaasireporttiterilla määritys

1573 emäsparin 3′-UTR ihmisen

ADAM9

kloonattiin tyhjään lusiferaasireportteri- vektori, pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), muodostetaan villityyppisen

ADAM9

3′-UTR lusiferaasireportteri konstruktilla (pEZX-ADAM9-3’UTR) . 2947 emäsparin 3′-UTR ihmisen

SLC7A5

kloonattiin myös pEZX-MT01, tuottaa villityypin

SLC7A5

3′-UTR lusiferaasireportteri konstruktilla (pEZX-SLC7A5- 3’UTR). Sillä kaksi lusiferaasianalyysissä, FTC-133-soluja maljattiin kolmena kappaleena 24-kuoppaisille levyille ja ko-transfektoitiin 0,25 ug reportteri-konstrukti ja 15 pmol miR-126-3p tai miR-NC käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . 24 tunnin kuluttua solut lyysattiin ja analysoitiin sekä tulikärpäsen ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus käyttäen miR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia) SpectraMax M5e mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti.

tietojen analysointi

The National Cancer Instituten Cancer Genome Atlas (TCGA) aineisto varten kilpirauhassyöpä käytettiin määrittämään yhdistyksen välillä miR-126-3p ilmaisun ja taudin aggressiivisuus (data portaali, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). Normalisoitu voimakkuus arvot (log 10) miR-126-3p ilmentyminen saatiin 454 papillaarinen kilpirauhassyövän näytteitä. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Määrittämään tilastollista merkittävyyttä, varianssin analyysiä ja t-testillä käytettiin tarvittaessa. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

miR-126-3p ilmentyminen kilpirauhassyöpä liittyy aggressiiviseen sairausfenotyyppi ja kasvaimista Kapselipolysakkaridiantigeenin ja angioinvasion

Meillä oli aikaisemmin tunnistettu miR-126-3p jotta vaimentua kilpirauhasen syövät follikkelisolujen alkuperää ja kasvaimen tyypit, jotka olivat vaikeasti diagnosoida by Tuumorinäytteiden tutkimista Kapselipolysakkaridiantigeenin invaasio ja angioinvasion voida määrittää yhteisellä sytologia. Niinpä olimme kiinnostuneita määritettäessä, jos miR-126-3p ilmentyminen liittyi taudin aggressiivisuutta ja erityisesti kasvaimissa Kapselipolysakkaridiantigeenin hyökkäyksen ja angioinvasion. Tämän tutkimiseksi käytimme TCGA aineisto varten papillaarinen kilpirauhassyövän. Huomasimme, että miR-126-3p ilmentyminen oli matalampi suuremmissa primaarikasvainten (kuvio 1A), Tuumorinäytteissä kanssa ekstratyroidaalisen invaasiota (kuvio 1 B) ja riskiryhmään kilpirauhassyöpä (kuvio 1 C). Koska yhdistys miR-126-3p on aggressiivisempaa Papillaarisemman kilpirauhassyöpä, me seuraavaksi kysytään miR-126-3p ilmentymistä pienempi lokalisoitu kasvaimissa Kapselipolysakkaridiantigeenin hyökkäystä ja angioinvasion käyttäen follikulaarisen kilpirauhassyövän ja adenoomia näytteitä joka maligniteetin on perustettu ainoastaan Jos näitä kahta tunnusmerkkejä syöpä. Löysimme miR-126-3p oli merkitsevästi pienempi lokalisoitu follikulaarinen kilpirauhassyöpä verrattuna follikulaarinen adenoomia (kuvio 1 D). Nämä havainnot yhdessä viittaavat siihen, että miR-126-3p saattaa olla merkittävä rooli kilpirauhassyöpä aloittamisen ja tai etenemiseen.

(A) miR-126-3p on huomattavasti alhaisempi suurempien papillaarinen kilpirauhassyövän (T3 verrattuna T2 ja T1 kasvaimet). Tiedot TCGA näytteiden saatavilla kasvaimen kokoa tietoja. T1 kasvaimia alle 2cm eikä kasvava ulkopuolella kilpirauhasen, T2 kasvaimet 2cm mutta 4cm ja kasva ulkopuolella kilpirauhasen, T3 kasvaimet mittaus 4cm tai kasvava ulkopuolella kilpirauhasen. ** Osoittaa p 0,01, *** osoittaa p 0,001. Y-akseli on log

10 normalisoitu ilme. (B) miR-126-3p ilme on huomattavasti alhaisempi papillaarinen kilpirauhassyövän minimaalisella ja kohtalainen ekstratyroidaalisen hyökkäystä. ** Osoittaa p 0,01, *** osoittaa p 0,001. Y-akseli on log

10 normalisoitu ilme. (C) miR-126-3p ilme on huomattavasti alhaisempi korkean ja keskitason MACIS riski papillaarinen kilpirauhassyövän verrattuna alhainen MACIS riski kasvaimia. MACIS on ennustetyövälineenä pisteytystä käytettiin TCGA tietokantaan, joka perustuu läsnäolo etäpesäke, potilaan ikä, täydellisyys resektio, paikallisten Invasion, ja kasvaimen koon. ** Osoittaa p 0,01, *** osoittaa p 0,001. Y-akseli on log

10 normalisoitu ilme. (D) miR-126-3p ilme on huomattavasti alhaisempi follikulaarinen kilpirauhassyöpä kuin follikulaarinen kilpirauhasen adenoomia. Kaikki follikulaarinen kilpirauhassyöpä tapauksessa oli histologinen todisteita Kapselipolysakkaridiantigeenin ja verisuonten invaasio ja adenoomien ei ollut mitään todisteita Kapselipolysakkaridiantigeenin ja verisuonten invaasio. ** Osoittaa p 0,01. Y-akseli on 2 ^ – (ΔΔCt).

miR-126-3p säätelee kilpirauhassyöpä solujen lisääntymistä, pesäkkeiden ja pallomainen muodostumista, ja solumigraatiota

Koska yhdistyksen välillä Kääntäkää 126-3p ilmaisun ja aggressiivinen kilpirauhassyöpä sairausfenotyyppi, halusimme selvittää, onko funktio miR-126-3p kilpirauhassyövän hoitoon voisi mekaanisesti selittää tätä yhdistystä. Me yliekspressoitu miR-126-3p kolmessa hyvin tunnettu ja todennettu kilpirauhassyöpä solulinjoissa (TPC-1, FTC-133 ja XTC-1) käyttäen miR-NC negatiivisena kontrollina määrittää sen vaikutus solujen lisääntymistä. miR-126-3p yliekspressio inhiboi solujen proliferaatiota merkittävästi TPC-1: n ja FTC-133 solujen 120 tuntia, 52% (p 0,001) ja 37% (p 0,001), vastaavasti; kuitenkin, se inhiboi lisääntymistä vain 16% XTC-1 solujen 168 tuntia (p 0,001) (kuvio 2A, 2B ja 2C). Pehmeä agar pesäkkeiden muodostumisen määritys suoritettiin arvioimaan kiinnittymisestä riippumattoman kasvun FTC-133, joka on pesäkkeitä muodostava kilpirauhassyöpä solulinja. Löysimme huomattavasti pienempi määrä siirtomaiden FTC-133 solulinjoissa yliekspressoivia miR-126-3p (kuvio 2D). Tutkimme myös vaikutusta miR-126-3p kilpirauhasen syöpä kasvain pallomainen muodostumista. FTC-133 ja XTC-1 solulinjoissa pallosten muodostamiseksi, kun viljellään ultra-low kiinnittyvä kulttuuri pulloihin, ja transfektion jälkeen miR-126-3p lukumäärä ja koko pallosia oli merkittävästi vähentynyt (kuvio 2E).

(A-C) kilpirauhassyöpä solulinja leviämisen estämisen miR-126-3p yli-ilmentymisen. Y-akseli edustaa solujen määrä. Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (SEM). (* Osoittaa p 0,05; ** osoittaa p 0,01; *** osoittaa p 0,001). (D) miR-126-3p yliekspressio estää pesäkkeenmuodostusta kilpirauhasen syöpäsoluja. Colony numerot FTC-133 solulinjoissa. Y-akseli edustaa pesäkkeiden lukumäärä näkökenttää kohti. Virhe pylväät edustavat SEM (*** osoittaa p 0,001). (E) miR-126-3p yliekspressio vähentää koko ja määrä pallosia. Ylälevy: edustava kuva rakeita kulttuuri miR-126-3p yli-ilmentymisen (FTC-133-solut). Alempi paneeli: kvantifiointi sferoidiviljelmiä eroista XTC-1 ja FTC-133-solujen miR-126-3p yli-ilmentymisen. Yhteenlaskettu pinta-ala pallojen sisällä kuvan mitattiin ympäröimällä kehä kunkin sferoidi, merkintä koko alueella, ja laskemalla pikselin numerot ImageJ ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Y-akseli edustaa koko ja lukumäärä palloset. Virhe pylväät edustavat SEM (* osoittaa p 0,05).

vieressä määritti miR-126-3p solu- siirtolaiskysymyksen naarmu haavan paranemista määrityksessä. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-126-3p esti merkittävästi haavansulkemiseen in TPC-1-solut (p 0,001), FTC-133-solut (p 0,001), ja XTC-1-solut (p 0,01) (kuvio 3A). Vahvista Tutkimuksemme myös käytetty Boyden kammion määritys tutkia vaikutusta miR-126-3p solu- muuttoliikettä. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-126-3p myös esti merkittävästi solujen vaeltamiseen (kuvio 3B).

Haavan paranemista määrityksessä (A) ja Boyden kammion määritys (B) tiedot. MiR-126-3p yliekspressio merkittävästi vähentynyt haavan leveyden suljin 24 tuntia kaikissa kilpirauhassyöpä solulinjoissa tutkittu. Y-akseli edustaa haavan etäisyys. Virhe pylväät edustavat SEM (** osoittaa p 0,01; *** osoittaa p 0,001). MiR-126-3p yli-ilmentymisen merkittävästi vähentynyt määrä siirtynyt solujen kaikissa kilpirauhasen syöpäsoluja Boyden kammiossa määrityksessä. Y-akseli edustaa määrää siirtynyt solujen kenttää kohti. Virhe pylväät edustavat SEM (* osoittaa p 0,05; ** osoittaa p 0,01; *** osoittaa p 0,001).

miR-126-3p säätelee kilpirauhasen kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden

in vivo

Koska meidän

in vitro

data, halusimme arvioida vaikutuksia miR-126-3p kasvaimen kasvuun

in vivo

ja onko lyhytaikaisesti kohonneita miR-126-3p voisi olla jatkuvaa pitkän aikavälin fenotyyppisen vaikutuksen. Huomasimme, että tuumoriksenografteja johdettu FTC-133-

luc2

transfektoitujen solujen miR-126-3p olivat huomattavasti pienempiä ja painoi alle tuumoriksenografteja päässä miR-NC (p 0,01) (kuvio 4A) . Koska yksi dramaattisia vaikutuksia miR-126-3p yliekspressio

in vitro

oli solumigraatiota, me seuraavaksi määritetään, onko miR-126-3p säännellyn etäpesäke

in vivo

. Sen määrittämiseksi, onko yli-ilmentymisen miR-126-3p voisi estää kasvaimen etäpesäke

in vivo

, FTC-133-

luc2

transfektoitujen solujen miR-126-3p ja miR-NC ruiskutettiin kateenkorvattomiin nude-hiiriin häntälaskimon kautta, ja hiiret kuvattiin joka viikko. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-126-3p dramaattisesti tukahdutetaan keuhkometastaasitestissä tässä mallissa (kuvio 4B).

(A) kasvu kasvaimen nude-hiirissä. Vasen paneeli: edustavat kuvat hiirten ksenograftin koko ruumiinavauksessa. Keskimmäinen ja oikea paneeli: kasvain lusiferaasivaikutusta ja kasvaimen tilavuuden mittaus, ja paino. FTC-133-Luc2 transfektoitujen solujen miR-126-3p ja miR-NC istutettiin ihonalaisesti kyljissä Kateenkorvattomien nude-hiirten. (B) Kasvaimen etäpesäkkeiden. Vasen paneeli: Kuvat ovat hiirten etäpesäkkeitä osoittavat luminenssi signaali. Middle paneeli: kvantifiointi luminesenssin signaalin voimakkuuden erot miR-126-3p ja miR-NC. FTC-133-Luc2 transfektoitujen solujen miR-126-3p ja miR-NC injisoitiin kateenkorvattomiin nude-hiiriin häntälaskimon kautta, ja hiiret kuvioitiin Xenogen IVIS 100 järjestelmään. Suhteellinen luminenssi signaali kunkin hiiren lasketaan suhteena alkuperäisen signaalin signaali kesti 14 päivää injektion. Kuvissa tässä otettu 7 viikkoa sen jälkeen, kun vein kasvainsolujen injektion. Virhe pylväät edustavat SEM (* osoittaa p 0,05; ** osoittaa p 0,01; *** osoittaa p 0,001). Kaikki eläinten kokeet toistettiin kaksi kertaa. Oikea paneeli: edustava mikroskooppinen kuva (hematoksyliinillä ja eosiinilla [H 0,01), mutta eikä ADAM9 mRNA: n ilmentymisen (kuvio 5E).

(A) Immunoblotit on SLC7A5 ja GAPDH TPC-1 ja XTC-1-solulinjoja, jotka oli transfektoitu joko miR-126-3p tai miR-NC 72 tuntia. FTC-133 solulinjaa ei ollut havaittavaa proteiinia lauseke SLC7A5. (B) Immunoblotit varten ADAM9 ja GAPDH TPC-1, FTC-133 ja XTC-1 solulinjoja, jotka oli transfektoitu joko miR-126-3p tai miR-NC 72 tuntia

in vitro

. (C) Immunoblotit havaitsemiseksi ADAM9 ja GAPDH FTC-133-Luc2 tuumoriksenografteja, jotka oli inokuloitu ihonalaisesti kylkiin kateenkorvattomiin nude-hiirillä ja annettiin kehittyä 10 päivää. (D) Lusiferaasiaktiivisuus on pEZX-SLC7A5-3’UTR ja pEZX-SLC7A5-3’UTR FTC-133-soluja, kun ko-transfektoitiin miR-126-3p tai miR-NC. Kaikki lusiferaasi mittaukset tehtiin kolmena kappaleena ja arvot luettiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Virhe pylväät edustavat SEM (*** osoittaa p 0,001). (E) Ilmaisu taso miR-126-3p merkittävästi käänteisesti yhteydessä ilmentymistason

SLC7A5

vuonna 481 papillaarinen kilpirauhassyövän näytteitä TCGA aineisto. *** Osoittaa p 0,001.

miR-126-3p vähentää VEGF eritystä ja endoteelin putken muodostumiseen

Koska löysimme miR-126-3p ilmaisu on pienempi lokalisoitu follikulaarinen kilpirauhassyövän Kapselipolysakkaridiantigeenin ja verisuonten invaasio, ja miR-126-3p on raportoitu säädellä angiogeneesiä ja tavoite

VEGF

, me seuraavaksi ratkaistava, onko miR-126-3p angiogeneesiä säätelevän kilpirauhassyövän syöpäsoluissa [17-20] . Huomasimme, että miR-126-3p yliekspressio merkittävästi vähentynyt VEGF eritystä kahdessa kolmesta kilpirauhasen syöpäsoluja

in vitro

(kuvio 6A). Yksi tärkeimmistä determinantit onnistunut kasvaimen kasvu on kyky rekrytoida uusia verisuonia. Niinpä olemme analysoineet VEGF-proteiinin ekspressiotaso keuhkoissa etäpesäkkeitä päässä

in vivo

tutkimuksissa ja endoteelin putken muodostumiseen käyttäen HUVEC määritystä

in vitro

.