Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pitkän koodaamattomalla RNA hotair on raportoitu olevan heikko ennustetekijöiden biomarkkeri erilaisissa pahanlaatuisia kasvaimia. Kuitenkin tiedetään vähän yhdistys hotair mahalaukun syöpään. Tutkimme ilmaisua hotair 68 mahasyövässä näytteitä kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR ja analysoitiin sen korrelaatio kliinisten parametrien. Toiminnallista roolia hotair tutkittiin tuottamalla ihmisen mahasyövän solulinjoissa lisääntynyt tai tukahdutetaan hotair ilme. Ankkurointi-riippumatonta kasvua arvioitiin pehmytagar määrityksessä. Lisääntynyt tai tukahdutetaan hotair ilmentävät mahasyövän solua injektoitiin häntälaskimoon tai vatsaonteloon immuunivajaisiin hiirillä tutkia vaikutus tämän molekyylin etäpesäkkeitä ja vatsakalvon levittämistä. Ilmaus hotair oli huomattavasti korkeampi syövän vaurioita kuin viereisen ei-syöpäkudoksiin ihmisen syöpien. Vuonna hajanainen tyyppi mahalaukun syövän, korkean hotair ryhmä (hotair /GAPDH 1) osoitti merkitsevästi enemmän laskimoiden invaasio, usein imusolmukemetastaaseja ja alemman yleinen eloonjäämisprosentti verrattuna Low-hotair ryhmä (hotair /GAPDH 1). Pesäkkeenmuodostus pehmeä agar parannettiin on hotair-riippuvaisella tavalla. Hotair ilmentäviä MKN74 muodostettu enemmän maksan etäpesäkkeiden verrattuna kontrolliin, kun ne injektoidaan häntälaskimoon hiirillä. Lisäksi alemmat ilmentyminen hotair Kato III tukahdutetaan vatsakalvon levittämiseen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hotair on keskeinen rooli kehitettäessä mahasyövän.

Citation: Endo H, Shiroki T, Nakagawa T, Yokoyama M, Tamai K, Yamanami H, et al. (2013) Enhanced Expression of Long koodaamattoman RNA hotair liittyy mahasyövän. PLoS ONE 8 (10): e77070. doi: 10,1371 /journal.pone.0077070

Editor: Dajun Deng, Pekingin yliopiston Cancer sairaalan ja Institute, Kiina

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 05 syyskuu 2013; Julkaistu: 10 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Endo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat JSPS KAKENHI avustuksen numbers24791480 ja 24591022 (https://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/index.html), ja avustus-in-tukea Hiromi Medical Research Foundation (http: //www.smtb .jp /henkilökohtainen /toimeksianto /johto /julkinen /esimerkki /pdf /luonnollisen 06a.pdf) ja Daiwa Securities Health Foundation (https://www.daiwa-grp.jp/dsh/grant/outline.html). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ilmaantuvuus ja kuolleisuus mahasyövän ovat vähentyneet dramaattisesti viimeisten 50 vuoden aikana useimmilla alueilla maailmassa, mutta se on edelleen toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet diagnostisia menetelmiä, kuten suurentava tähystys kanssa kapea kuvantaminen (NBI) [2], ja hoito tavoitepäivämäärineen terapia [3,4], on vielä suuri määrä mahasyövän joilla on huono ennuste. Patogeenisen mekanismin edistää aggressiivinen biologinen piirre tässä syöpä on vielä selvittämättä.

Genomikartoituksen projekteja paljasti, että ihmisen genomi käsittää vähemmän kuin 2% proteiinia koodaavan geenien, ja yli 90%: n genomin transkriboidaan ei-koodaavat RNA: t (ncRNA) [5-7]. Nämä ncRNAs luokitellaan kahteen ryhmään riippuen nukleotidin koko. Mikro-RNA: t ovat noin 18-25 nukleotidin pituisia, kun taas pitkän ei-koodaavan RNA koostuu yli 200 nukleotidiä. Hotair on pitkä ei-koodaava RNA, joka tunnistettiin mukautetun muokkaus joukko on HOXC lokukseen. Hotair osoitettiin trimethylate Histon H3 lysiinin-27 HOXD lokuksen kanssa Polycomb tukahduttavia kompleksin 2 (PRC2) ja estää HOXD geenin ilmentymistä, joka sijaitsee eri kromosomin [8]. Hotair edistää etäpesäkkeiden vuorovaikutuksessa PRC2 tukahduttaa transkriptio useiden etäpesäkkeiden estogeenien rintasyövässä [9]. Tehostettu ilmentyminen hotair liittyy invasiivisuus, metastaasin ja heikkoon ennusteeseen eri syöpien, kuten rinta-, paksusuoli-, haima- ja keuhkosyöpä [9-12]. Kuitenkin tiedetään vain vähän ekspressiota ja /tai toimintaa hotair mahalaukun karsinooma kehittämiseen. Nykyisessä tutkimuksessa tutkimme osallistumista hotair ihmisen mahasyövän kehitystä ja tutki sen ilmentyminen korreloi aggressiivinen käytös mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Kudokset

68 mahasyövän kudokset saatiin potilailta, joille tehtiin leikkaus Miyagi Cancer Center (Natori, Japani), välillä 2007 ja 2011. Kaikki näytteet jäädytettiin välittömästi pian resektion jälkeen nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa tai vahvistettu 10% puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin vaha. Mahalaukun syöpiä histopatologisesti luokiteltiin suoliston tyyppi (n = 36), diffuusi tyyppi (n = 32) luokituksen mukaisesti Maailman terveysjärjestön ja aiemmissa raporteissa [13]. Ei potilaat saivat kemoterapiaa ja sädehoitoa ennen leikkausta. Tilastoanalyysiin eloonjäämiseen määriteltiin kuolema mistä tahansa syystä, ja Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrien käytettiin.

Solulinjat

mahasyöpä solulinjat MKN74 (suoliston tyyppi) [14] ja KATO III (diffuusi tyyppi) [15] saatiin RIKEN Bioresource Center (Tsukuba, Japani). Molemmat solulinjat pidettiin RPMI-1640 (Gibco /Life Technologies Co., CA), joka sisälsi 10% inaktivoitua FBS: ää (EuroClone, Milano, Italia) ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Gibco /Life Technologies Co. , CA) ja viljeltiin kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

RNA: n valmistaminen käänteistranskriptio ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Yhteensä RNA jäädytetyistä näytteistä ja solulinjat uutettiin ISOGENE (NIPPON GENE, Tokio, Japani) mukaan valmistajan protokollaa. cDNA: t kaikista näytteistä syntetisoitiin 1,0 ug kokonais-RNA: PrimeScript® 1. juosteen cDNA Synthesis Kit (TaKaRa Bio, Siga, Japani) seuraten valmistajan protokollaa. Ilmentyminen hotair kvantifioitiin LightCyclerTM Brilliant SYBR Green qRT-PCR kit (Roche Applied Science, IN) seuraten valmistajan protokollaa erityisten alukesarjoista mukaan edellisessä tutkimuksessa [9]. Taso hotair ilmentymisen kussakin näytteessä normalisoitiin kunkin GAPDH ilmentymisen tasolla. Määrittämiseksi Kunkin PCR-reaktion vahvistettiin sulamiskäyräanalyysillä analyysejä.

hotair ilmaisu retrovirusvektorin

Ihmisen hotair cDNA (addgene, Cambridge, MA), monistettiin PCR: llä ja insertoitiin pBabe puro vektori (pBabe -HOTAIR). Rekombinantti retrovirus tuotettiin Platinum-A (Plat-A, Tarjoaja professori Kitamura) pakkaukset solulinjat kuten aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, Plat-A-solut transfektoitiin pBabe -HOTAIR tai pBabe-puro-vektori (EV). Fugene-6 (Roche Applied Science) ja Opti-MEM I (Gibco /Life Technologies Co.) lisättiin valmistajan ohjeiden protokollaa. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, retrovirus sisältävä supernatantti otettiin talteen ja vietiin läpi 0,45 um: n suodattimen. MKN74 solut infektoitiin rekombinantti-retrovirukset ja sitten valitaan puromysiinin kanssa.

RNA-interferenssi

pudotus hotair Kato III, käytimme Knockout ™ RNAi Systems (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) valmistajan protokollaa. Lyhyesti, olemme suunnitelleet neljä shRNA sekvenssin kohdennettua hotair, kuten on esitetty taulukossa 1. Sen jälkeen hehkutus täydentävän shRNA oligonukleotidit, me liitettiin oligonukleotidit osaksi pSIREN vektoriin (shHOTAIR). Sitten me transfektoitu Plat-A solujen shHOTAIR tai pSIREN Vector (EV), ja tartunnan KATO III kanssa rekombinanttiretrovirukset ja valitaan puromysiinin. Solut transdusoitu sh-HOTAIR2 ja -3 vektori valittiin lisätutkimuksia varten. Jokainen

vuonna vitrto

koe suoritettiin kolmena kappaleena, toistetaan kolme kertaa ja edustavia tietoja esitetään.

shRNA

Sequence

shHOTAIR-1sensegatccgaacgggagtacagagagattttcaagagaaatctctctgtactcccgttcttttttganti-senseaattcaaaaaagaacgggagtacagagagatttctcttgaaaatctctctgtactcccgttcgshHOTAIR-2 sensegatccgccacatgaacgcccagagattttcaagagaaatctctgggcgttcatgtggttttttg anti-senseaattcaaaaaaccacatgaacgcccagagatttctcttgaaaatctctgggcgttcatgtggcgshHOTAIR-3 sensegatccgtaacaagaccagagagctgttttcaagagaaacagctctctggtcttgttattttttganti-senseaattcaaaaaataacaagaccagagagctgtttctcttgaaaacagctctctggtcttgttacgshHOTAIR-4sensegatccaattcttaaattgggctggttcaagagaccagcccaatttaagaattttttttganti-senseaattcaaaaaaaattcttaaattgggctggtctcttgaaccagcccaatttaagaattgTable 1. sekvenssit shRNA insertit varten shHOTAIR ilmentävällä vektorilla.

CSV Lataa CSV

solukasvumäärityksessä

1 x 10

4 solua ympättiin per kuoppa 96-kuoppalevyille normaalissa solujen kasvua media. 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, keltainen tetratsolia (MTT) suoritettiin käyttäen Solujen lisääntyminen Kit I (GE Healthcare Life Sciences, NJ) mukaan valmistajan protokollaa. Mittaukset absorbanssi 570 nm: ssä VersaMax (Molecular Devices, CA) tehtiin arvioimaan MTT-formatsaanin tuotannon jälkeen 24, 48 ja 72 tunnin inkuboinnin jälkeen. Indeksi arvioitiin 48 ja 72 tunnin normalisoida, että 24 tuntia.

Soft agar pesäkemuodostusta

Soft agar määritykset rakennettiin 6-kuoppaisille levyille. Pohjakerros kunkin kuopan koostui 1 ml lopullinen pitoisuus on 1 x (RPMI-1640 + 10% inaktivoitua FBS) ja 0,6% matalan sulamispisteen agaroosia. Levyjä jäähdytetty huoneen lämpötilassa, kunnes kiinteä aine, jolloin 1 ml: n kasvu agar-kerros kaadettiin, joka koostuu 1 x 10

4-solut suspendoitiin 1 x median ja 0,3% matalan sulamispisteen agaroosia. Levyjä jälleen jäähdytettävä huoneen lämpötilassa, kunnes kasvu kerros hyytynyttä. Lisäksi 1 ml 1 x median ilman agaroosia lisättiin päälle kasvu kerroksen päivänä 0 ja uudelleen päivänä 14 kasvun. Solujen annettiin kasvaa 37 ° C: ssa 4 viikkoa, ja koko pesäkkeet laskettiin.

Eläimet

6-viikkoisen naaras-NOD /Shi-scid-IL2Rγ

null (NOG ) hiiret hankittiin Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Kawasaki, Japani) ja käytettiin tässä kokeessa. Ne annettiin sopeutua viikon ajan ennen kokeita. Heidän majoitettiin puhdastilassa eläimen hoidon laitokseen Miyagi Cancer Research Center ja pidettiin vakiolämpötilassa, kosteus ja ajallisesti valaistusolosuhteet ja edellyttäen hiiri Chow /vettä halun.

häntälaskimoon määritys syöpäsolumetastaasi

vaikutuksen arvioimiseksi hotair ilmaisun veren välityksellä etäpesäke, me pistetään 1,0 x 10

5 solua HOTAIR- (n = 9) tai EV-ilmentävien (n = 9) MKN74 0,2 ml: lla PBS: ää häntälaskimoon hiirillä. Hiiriä tarkkailtiin yleensä merkkejä sairaudesta viikoittain pituus kokeen, ja ne tapettiin 8 viikkoa injektion jälkeen. Keuhkot, maksa, munuaiset, lisämunuaiset, ja pernat hiiret poistettiin ja tutkittiin makroskooppisesti esiintymisestä etäpesäkkeiden.

Peritoneaalisille etäpesäkkeiden

1,0 x 10

6 solua shHOTAIR- (n = 5) tai EV-ilmentävien (n = 5) KATO III injektoitiin 0,2 ml: lla PBS: ää vatsakalvon hiirten vaikutuksen arvioimiseksi hotair ilmaisun vatsakalvon etäpesäkkeitä. Hiiriä tarkkailtiin yleensä merkkejä sairaudesta viikoittain pituus kokeen, ja ne tapettiin 8 viikkoa injektion jälkeen. Läsnäolo kyhmyjä ja askitesta vatsaontelossa tutkittiin.

Histologia ja immunohistokemia

Leikattu kudokset fiksattiin 10% puskuroituun formaliiniin 24 tunnin ajan, sitten leikataan ja parafiiniin mikroskooppista tutkimus. Näytteet leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05) pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen ero 3 ryhmien arvioitiin käyttämällä Steel Dwass testiä tai Bonferroni analysointi ja

P

arvo ( 0,017) katsottiin tilastollisesti merkitsevä Kaiken eloonjäämistä analysoitiin Kaplan-Meier menetelmät ja arvioidaan log-rank testi, ja

P

arvo ( 0,05) pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Ekuseru-Toukei 2012 (Social Survey Research Information Co., Ltd., Tokio, Japani).

P

arvo ( 0,05) pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Ethics

Institutional Review Board on Miyagin Cancer Center (MCC) hyväksyi tutkimussuunnitelman, ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan (Luvan numero: MCC-22-30). Protokollan eläin kokeet hyväksyttiin MCC eläinten hoidon ja käytön komitea (Luvan Number: MCC-AE-2011-12).

Tulokset

Euroopan hotair humaanin mahasyövän näytteitä

hotair ekspressiotasot syöpä- ja viereisten noncancerous kudokset mahasyöpä potilaita tutkittiin qRT-PCR ja normalisoitu GAPDH ekspressiotason. Keskimääräinen ekspressiotaso hotair oli 4,952 ± 6,462 ja 3,804 ± 6,721 (hotair /GAPDH ± keskihajonta) on syöpä ja ei-pahanlaatuisten vaurioiden, vastaavasti. Ilmentymistasojen hotair olivat merkitsevästi korkeammat karsinooma leesioita verrattuna ei-pahanlaatuisten vaurioiden (

P

= 0,019, kuvio 1A).

A, hotair ekspressiotasot syöpä- ja viereisen noncancerous kudokset mahasyöpä potilaita tutkittiin qRT-PCR ja normalisoitu GAPDH ekspressiotason. Ilmentymistasojen hotair olivat merkitsevästi korkeammat karsinooma leesioita verrattuna ei-pahanlaatuisten vaurioiden (

P

= 0,019). B ja C, ihmisen mahasyöpä kudoksia edelleen luokiteltu hotair ilmentymistason osaksi korkean hotair ryhmä (hotair /GAPDH 1,0) ja Low-hotair ryhmä (hotair /GAPDH 1,0) suolistossa (B ) ja hajanainen tyyppi (C) mahasyövän, vastaavasti.

välisestä assosiaatiosta ilmaus hotair ja kliinis tekijöitä ihmisen syöpien

ihmisen mahalaukun syövän kudoksia histopatologisesti luokiteltu osaksi suoliston (n = 36) ja hajanainen tyypit (n = 32). Ihmisen mahalaukun syöpä kudoksia edelleen luokiteltu hotair ilmentymistason osaksi korkean hotair ryhmä (hotair /GAPDH 1,0) ja Low-hotair ryhmä (hotair /GAPDH 1,0) (kuviot 1 B ja C). Yhdistys hotair ilmaisun kanssa kliinis-suoliston ja hajanainen tyyppi mahalaukun syöpä on yhteenveto taulukoissa 2 ja 3, tässä järjestyksessä. Suoliston tyyppinen mahasyöpä, mitään merkittävää korrelaatiota välillä havaittiin hotair ilmaisun ja kliinis havainnot (taulukko 2). Lisäksi ei ole merkittävää yhteyttä ei havaittu välillä hotair ilmaisun ja kokonaiselinaika, vaikka korkean hotair ryhmä pyrki osoittamaan lyhyempi selviytymisen kuin Low-hotair ryhmä (kuvio 2A). Toisaalta, merkittävä assosioitunut hotair ilmaisun ja imusolmuke etäpesäke (P = 0,043), laskimoiden tunkeutuminen (

P

= 0,0083), ja lyhyet kokonaiseloonjääminen (

P

= 0,018) että diffuusi tyyppi mahasyövän (taulukko 3 ja kuvio 2B). Kuitenkin, ei ollut yhdistyksen välillä lavan ja hotair ilme.

hotair alhainen

hotair korkea

P

arvo

Age73.07 ± 9.1870.87 ± 10.650.53Gender0.63Male1016female37T0.87T1, T2610T3, T4713N0.26N078N1, N2 , N3615Ly0.68ly069ly1, LY2, ly3714v0.19v089v1, v2, v3514Stage0.501,27153,4680.50Table 2. yhdistys hotair ilmaisun kanssa kliinis-suoliston tyypin mahasyöpä.

CSV Lataa CSV

hotair alhainen

hotair korkea

P

arvo

Age59.250 ± 10.7566.35 ± 10.160.07Gender0.71male812female48T0.87T1, T212T3, T41118N0.043*N086N1,N2,N3414ly0.40ly067ly1,ly2,ly3613v0.0083*v0119v1,v2,v3111Stage0.311,2783,4512Table 3. yhdistys hotair ilmaisun kanssa kliinis ominaisuuksia hajanainen tyyppi mahasyövän.

CSV Lataa CSV

, suoliston tyyppinen mahasyöpä, ei ole merkittävää yhteyttä ei havaittu välillä hotair ilmaisun ja kokonaiselossaolo, vaikka High-hotair ryhmä pyrki osoittamaan lyhyempi selviytymisen kuin Low-hotair ryhmä. B, korkean hotair ryhmä osoitti selvästi lyhyempi selviytymisen kuin Low-hotair ryhmä hajanainen tyyppi mahasyövän (

P

= 0,018).

Generation of hotair ylä- ja alassäädetty soluja ja korrelaatio solujen elinkelpoisuuden

arvioimiseksi toiminnallista roolia hotair mahasyövän kehitystä, meillä syntyy stabiilisti hotair ilmentävien MKN74 soluja (MKN-hotair) ja stabiilisti shHOTAIR ilmentävien KATO III soluja (KATO- shHOTAIR). qRT-PCR-analyysi paljasti, että MKN-hotair solut ilmensivät tasolla hotair noin 10 kertainen verrattuna EV ilmentävien (MKN-EV) tai vanhempien MKN74 soluja ja että ilmaisu tämän molekyylin väheni 30-70% Kato-shHOTAIR solujen verrattuna EV transdusoiduissa (KATO-EV) tai vanhempien KATO III (KATO-EV) soluja (kuvio 3A). Tulokset MTT-määritystä osoittivat, ettei säätelyä ylöspäin eikä alaspäin säätely hotair vaikuttanut mahasyövän solujen lisääntymistä (kuvio S1).

, suhteellinen hotair ekspressiotasot mahasyövän solulinjoissa analysoitiin qRT- PCR-analyysillä. MKN-hotair solut ilmensivät noin 10-kertaisesti korkeampi hotair kuin vanhempien MKN74 soluja ja MKN-EV. Toisaalta, ilmaus hotair Kato-shHOTAIR solujen väheni 30 70% verrattuna vanhempien KATO III ja KATO-EV soluissa. B, Pylväsdiagrammi osoittivat suhteellista ilmentymistä hotair mahasyövän solulinjoissa, normaali ja syöpäkudosten mahan analysoitiin tässä tutkimuksessa. Expression of hotair normalisoitiin että GAPDH. Arvot on ilmaistu suhteessa 1,00 ilmentämiseen vanhempien MKN74 soluissa.

Soft agar pesäkemuodostusta

Valaistaan ​​toimintojen hotair kiinnikkeessä riippumatonta kasvua mahalaukun syövän solujen, käytimme pehmeä agar määritystä. MKN-hotair solut muodostivat suuremman määrän pesäkkeitä kuin MKN-EV-solut (

P

= 0,009, kuvio 4A). Tämän mukaisesti havainnon, KATO-shHOTAIR solut osoittivat merkittävää vähemmän pesäkkeitä kuin KATO-EV-solut (kuva 4B). Lisäksi, mahalaukun syövän solut, joilla on samanlaiset hotair ilmentymisen taso (MKN-hotair ja shHOTAIR-3, kuvio 3B), joka muodostuu yhtä paljon pesäkkeitä, mikä osoittaa, että kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun mahalaukun syövän solujen säänneltävä hotair-riippuvaisella tavalla.

Mahdolliset kiinnittymisestä riippumatonta kasvua mahalaukun syöpäsolujen arvioitiin pehmytagar määrityksessä. MKN-hotair solut muodostivat huomattavasti suuremmalle joukolle pesäkkeitä kuin MKN-EV-solut (

P

= 0,009) (A), kun taas KATO-shHOTAIR solut osoittivat merkitsevästi vähemmän pesäkkeitä kuin KATO-EV solujen hotair ilmaisun tavalla (EV versus SH- HOTAIR2,

P

= 0,016 ja EV versus sh-HOTAIR3,

P

= 0,0035) (B).

hotair ilmaisun ja mahasyövän solu etäpesäke ja vatsakalvon levittämistä

Koska hotair tehosti kiinnittämisestä riippumaton muttei kiinnittymisestä riippuvainen kasvu mahalaukun syöpäsolujen, me arveltu, että hotair voisi vaikuttaa etäinen etäpesäke ja /tai vatsakalvon levittäminen pikemmin kuin suoraan invaasio viereisiin elimiin. Tämän kysymyksen käytimme häntälaskimoon määritys ja vatsakalvon injektion solujen tutkia hotair ilmaisun edistää veren kuljettama etäpesäke ja vatsakalvon levittämiseen, vastaavasti. Kuten odotettua, MKN-hotair solujen usein näytteillä maksametastaaseista (

P

= 0,01) verrattuna MKN-EV soluissa. Lisäksi numerot ja koot metastaattisen maksakasvaimien olivat merkittäviä suurempia kanssa MKN-hotair soluja kuin MKN-EV-solut (

P

= 0,03 ja

P

= 0,019, vastaavasti, kuviot 5A ja B). Kiinnostavaa, yksi hiiri injektoitiin MKN-hotair osoitti etäpesäke munuaisten ja lisämunuaisen lisäksi maksassa, kun taas MKN-EV solujen etäpesäkkeitä muodostunut ainoastaan ​​maksassa. Johdonmukaisesti, vatsakalvon levitys väheni merkittävästi (1/5,

P

= 0,009), kun hotair inaktivoitiin Kato III soluissa, kun taas kaikki valvonta solut muodostivat vatsakalvon levitys (5/5) (kuviot 6A ja B). Metastaattista olivat histologisesti varmistettuja ja ne osoittivat voimakasta positiivista värjäytymistä ihmisen sytokeratiini (kuviot 5C ja 6C).

, vaikutus hotair on etäpesäkkeiden tutkittiin häntälaskimoon määrityksessä. 1,0 x 10

5 hotair ilmentävien solujen (MKN-hotair, n = 9) ja valvonta-soluja (MKN-EV, n = 9) injektoitiin häntälaskimoon hiirillä. MKN-hotair solujen useammin osoitti maksametastaaseista (

P

= 0,01) verrattuna MKN-EV-solut (vasen paneeli). Lisäksi numerot (keskimmäinen paneeli) ja koot metastaattisen maksan kasvaimet (oikea paneeli) olivat merkittäviä suuremmat kanssa MKN-hotair soluja kuin MKN-EV-solut (

P

= 0,03 ja

P

= 0,019, tässä järjestyksessä). B, The etäpesäkkeitä voidaan selvästi tunnustettu makroskooppisesti (nuoli). C, tuumorisolut muodostettu rauhaset ja arveltiin olevan peräisin injektoidaan ihmisen mahasyövän solulinjoissa (vasen paneeli, HE, alkuperäiset suurennus x40). Nämä kasvainsolut osoitti voimakasta immunoreaktiivisuus ihmisen sytokeratiini (oikea paneeli).

, Peritoneaalisille levitys väheni merkittävästi (1/5,

P

= 0,009), kun hotair inaktivoitiin vuonna KATO III soluissa shRNA transduktion, kun taas kaikki valvonta solut muodostivat vatsakalvon levitys (5/5). B, Hiiri vatsakalvon levittämiseen osoitti veristä askites (vasen paneeli) ja kyhmyt (nuoli oikea paneeli) in vatsaonteloon. C, Kyhmyt vatsaontelossa koostui syöpäsolujen, ja jotkut niistä olivat musiinituoton kuin sinettisormus cell carcinoma. Niiden ajateltiin olevan peräisin ruiskutettu ihmisen mahasyövän solulinjoissa (HE, alkuperäinen suurennos x 100), koska nämä solut osoittivat voimakasta immunoreaktiivisuus ihmisen sytokeratiini (oikea paneeli).

Keskustelu

tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus hotair mahasyövän ja tarkastelee sen korrelaatio kliinis kuten potilaiden ennustetta. Tuloksemme selvästi paljasti parannettu ilmentymistä hotair syövän kudoksissa verrattuna ei-syöpäkudokset vatsan ja että korkean tason ilmentymisen tämän molekyylin liittyi imusolmuke etäpesäke, laskimoiden invaasio ja huono eloonjäämisen hajanainen tyyppi mahasyövän. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​äskettäin tutkimus, jonka säätely ylöspäin hotair löytyy mahasyövän verrattuna normaaleissa kudoksissa ja korreloi kasvaimen vaiheen ja imusolmuke etäpesäke [17]. Lisäksi hotair ilmentäviä mahasyövän solujen näytteillä parantamiseksi kiinnittämisestä riippumattoman solujen kasvun

in vitro

ja etäpesäkkeitä maksaan

in vivo

taas alentunut ilmentyminen hotair mahasyövän soluissa johti pieneni ankkurista riippumaton kasvu ja vatsakalvon levittämistä, mikä viittaa siihen, että hotair on keskeinen rooli mahalaukun syövän etenemisessä.

Higher ilmentymistä hotair havaittiin syöpäsolujen kuin vastaavilla ei-kasvainsolujen erilaisten syöpien, mukaan lukien rinta-, paksusuoli-, maksa-, haima- ja nenänielun syöpä [9-11,18-20]. Näiden syöpien, hotair osoitettiin myös liittyvän etäpesäke ja /tai huonoon ennusteeseen. Lisäksi korkea hotair ilmentymisen korreloi lyhyt tautivapaan eloonjäämisen keuhkosyövän [12]. Siksi nykyisen havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aikaisempien tutkimusten osoittaa, että ekspressiota hotair on mukana parannetun aggressiivisuus eri karsinoomasoluja. Toisaalta, emme löytäneet negatiivista ennustetekijöiden vaikutus hotair suoliston tyyppi mahalaukun syövän, vaikka korkean hotair ryhmä pyrki osoittamaan lyhyempi kokonaiselinaikaa verrattuna Low-hotair ryhmä. Tämä saattaa johtua siitä, että pieni määrä potilaita nykyisessä tutkimuksessa, koska pakko ilmaus hotair käytettäessä suoliston mahasyövässä solulinja (MKN74) saavutti aggressiivinen fenotyyppi

in vitro

ja

in vivo

. Edelleen tutkimuksia suuria määriä näytteitä lisäksi kokeellinen tutkimus käyttämällä muita suoliston mahasyövän solulinjoja vaadittaisiin käsitellä tätä asiaa.

Nykyisessä tutkimuksessa ei havaittu yhteyttä välillä hotair ilmaisun ja solujen kasvua mahasyöpä. Rinta-, paksusuolen ja maksasyöpä, osallistuminen hotair solukasvun ei ole osoitettu [9,10,18], kun taas hotair edistänyt ja vähentää solujen lisääntymistä haimasyövän [11] ja keuhkosyövän [12], vastaavasti. Edelleen, ei havaittu merkittävää eroa ihon alle kasvaimen kasvua NOG hiirillä välillä hotair ilmentäviä ja ohjaus solujen olevassa tutkimuksessa (tietoja ei ole esitetty). Näiden tulosten perusteella on todennäköistä, että yhteys hotair ilmentymisen ja solujen lisääntyminen on riippuvainen syöpä. Sen sijaan riippumattomaan kasvuun mahalaukun syövän solujen selvästi parannettu on hotair-riippuvaisella tavalla. Lisäksi, hotair ilmentyminen aiheutti enemmän etäpesäkkeitä maksaan ja muihin elimiin, ja vika hotair tukahdutetaan vatsakalvon levittämistä mahakarsinooman soluja. Nämä havainnot, yhdessä sen kanssa, että hotair ilmaisun edistää etäpesäkkeiden eri karsinoomat [9-12,18], viittaavat siihen, että hotair on pääasiassa mukana metastaattisen prosessi eikä kasvuun primaarikasvaimen.

Yhteenvetona parannettu hotair ilmaisun hajanainen tyyppi mahasyövän liittyi ilmaantuvuus laskimoiden hyökkäyksen ja huonon ennusteen riippumatta T tekijä, ja pakotti ilmentyminen hotair mahalaukun syöpäsoluissa edistänyt ankkurista riippumaton solujen kasvua

in vitro

ja etäpesäkkeitä maksaan

in vivo

. Nämä tulokset osoittavat, että hotair todennäköisesti mukana kehittämässä mahasyövän ja saattaa myös olla terapeuttinen kohde hoidettaessa mahalaukun syövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

yhdistys solujen lisääntymisen kanssa hotair ilme. Tulokset MTT-määritys arvioitiin 72 tuntia normalisoitiin, että 24 tuntia. Ei suhde välillä havaittiin hotair ilmaisun ja mahasyövän solujen lisääntymistä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0077070.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme professori Kitamura (University of Tokyo, Tokio, Japani) tarjoamiseksi Platina-A soluissa.