Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän työn tavoitteena oli paljastaa metabolinen ominaisuuksia mitokondrioiden jotka saattavat olla välttämättömiä inhibition apoptoottisten mahdollisten eturauhassyöpäsoluissa. Tutkimme eristettyjä mitokondrioita normaalin eturauhasen epiteelisolut (PrEC), metastaattinen eturauhassyöpä solulinjoissa LNCaP, PC-3, DU145, ja ei-syöpäsolujen – ihmisen fibrosarkooman HT1080-solut; ja normaaleihin ihmisen lymfoblastoidisoluilla. PrEC-solut sisälsivät 2-4 kertaa vähemmän mitokondrioita solujen grammaa kohden kuin kolme PC solulinjat. Hengitysteiden toiminnan PrEC solun mitokondrioiden olivat 5-20 kertaa pienempi kuin PC mitokondrioita, riippuen alustoille ja metabolista tilaa, mikä johtui sisällön ja alempi aktiivisuus hengitysteiden entsyymin komplekseja. Mitokondrioita kolmesta metastaattisen eturauhassyövän solulinjoissa ilmeni useita ominaisuuksia, jotka ovat erottuva vain näihin soluihin: alhainen affiniteetti kompleksi I NADH, 20-30 mV korkeampi sähkö- kalvojännite- (ΔΨ). Suojaamaton kanssa syklosporiini A (CsA) PC-3 mitokondriot vaaditaan 4 kertaa enemmän Ca

2+ avaa läpäisevyyttä siirtyminen huokosten (MPTP) verrattuna PrEC mitokondrioita, ja he eivät turpoavat edes läsnäollessa alamethicin suuri huokosia muodostavan antibiootti. Läsnäollessa CsA, PC-3 mitokondriot eivät avaa spontaanisti MPTP. Olemme päätellä, että alhainen apoptoottisen potentiaali metastaattisen PC solut voivat syntyä estämällä Ca

2 +: sta riippuvaisen läpäisevyyden siirtymisen takia erittäin ΔΨ ja suurempi kyky sitoa Ca

2+. Ehdotamme, että johtuen korkeasta ΔΨ, mitokondrioiden aineenvaihduntaa metastaattisen eturauhassyövän soluissa perustuu pääasiassa hyödyntämiseen glutamaattia ja glutamiinia, jotka voivat edistää kehitystä kuihtuminen.

Citation: Panov A, Orynbayeva Z (2013) bioenergetic ja antiapoptoottisten ominaisuudet mitokondrioita ihmisen viljellyissä eturauhassyöpäsolulinjat PC-3, DU145 ja LNCaP. PLoS ONE 8 (8): e72078. doi: 10,1371 /journal.pone.0072078

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 helmikuu 2013; Hyväksytty: 05 heinäkuu 2013; Julkaistu: 08 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Panov et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grant National Institutes of Health CA69764 (kohteeseen jA Petros), Emory University Trust Urologiset Research. Cornelius F. J. Beukenkamp Endowment for Prostate Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on merkittävä syy miesten syöpäkuolemien ikäryhmä 55-74, ja yli ikä 75 on toiseksi suurin kuolinsyy Pohjois-Amerikan miehillä keuhkosyövän jälkeen ja keuhkoputken syöpä [1,2 ]. Pohjimmiltaan kaikki miehet edenneen taudin, joka kävi läpi androgeenideprivaatio hoitoja, lopulta kuolee kehittäminen androgeenista riippumattoman metastaattinen eturauhassyöpä [1,3,4]. Korkeaa kuolleisuutta eturauhassyöpään liittyy aktiivinen leviämisen eturauhasen adenokarsinooma joka jakaa kaukaisiin elinten mieltymysten luukudoksen [5]. On suuri aineistolla, mikä osoittaa, että etenemistä sekä ensimmäisen ja metastaattinen Eturauhaskasvainten määräytyy menetys solun apoptoottisten potentiaali [6-8].

osallistuminen mitokondrioiden apoptoosin on näytetty toteen suuri määrä raportteja kuvataan proapoptoottiset mitokondrion muutoksia, kuten reaktiivisten happiradikaalien (ROS), ehtyminen ATP, ja induktio mitokondrion läpäisevyyden siirtyminen huokosten (MPTP) [9-11]. On osoitettu, että Bcl-2 ja muut apoptoosia säätelevä proteiinit tämän perheen sijaitsevat mitokondrioiden liitoskohdat sisä- ja ulko-kalvoja tai intermembrane tilaa ja säätelevät apoptoosia niiden vaikutukset mitokondrion läpäisevyyden siirtymistä [12-15]. Tutkimuksia suhteita apoptoosin induktiosta eturauhassyövän soluissa ja Bcl-2: n ja Bax-sukuiset proteiinit saatiin ristiriitaisia ​​tuloksia [16-21], ja tiedot viittaavat siihen, että Bcl-2, Bcl-xL: n ja joidenkin muiden apoptoosiin liittyvien proteiinien eivät ole tärkeitä apoptoosin induktion eturauhassyöpäsoluissa [18,19,22-24]. Toisaalta, avaaminen läpäisevyyden siirtymisen huokosten suoraan riippuvainen mitokondrioiden ominaisuuksia, kuten sähköinen kalvo potentiaali (ΔΨ), tuotanto ROS [25], ja hengitysteiden toimintaa [26-28]. Siksi on tärkeää ymmärtää, biokemiallisten ja fysiologisten näkökohtien mitokondrioiden toiminnot kuin keskeinen portinvartijan kyvyttömyys eturauhassyöpäsolujen sitoutua ohjelmoitua solukuolemaa.

Vaikka on olemassa monia raportteja apoptoosin eturauhasen soluihin moduloiva mitokondriaalisen aineenvaihdunta [29-31], yleinen ei paljon tiedetä bioenergetiikan ja mitokondrioiden toimintoja normaalin tai syöpäsolun eturauhasen soluja, lukuun ottamatta erot niiden aineenvaihdunta sitruunahappoa [32] ja mitokondrioiden L-laktaattia [33]. On osoitettu, että toisin kuin useimmat pahanlaatuinen kudosten, eturauhaskasvainsoluissa on ominaista alhainen Glykolyysivaiheen ja glukoosin otto [34,35], ja suosituimmuusjärjestelmistä otto rasvahappojen yli glukoosi [36]. Korkea biokemiallinen plastisuus eturauhassyöpäsolujen auttaa heitä mukauttamaan aineenvaihdunta tyypillinen kasvain hypoksinen kunnossa [37]. Kuitenkin monissa näistä tutkimuksista mitokondrion aineenvaihduntaan eturauhassyövän soluissa, kirjoittajat käytetään antibiootteja [29,31,36-38]. On tunnettua, että aminoglykosidiantibiootit (streptomysiini, gentamisiini) ovat mitotoxic [39-41]. Olemme todenneet, että eristettyjä mitokondrioita eturauhasen syöpäsolujen, ihmisen lymfoblastoidi-solujen ja maksasolujen kasvatettiin streptomysiinin läsnä ollessa ei hengittää tahansa alustoille. Siten solujen viljelmissä, jotka sisälsivät antibiootteja ei yllä aerobista aineenvaihduntaa, ja glykolyysiin on ainoa ATP. Siksi monet johtopäätökset saatu soluviljelmissä antibiooteilla on pidettävä varoen.

Varhain tutkimuksia ultramicroscopic rakenteesta normaalia ja syöpä- eturauhasen solut ovat osoittaneet, että eturauhasen syöpäsolujen osoittavat silmiinpistävää lisääntyminen ja pleomorfisimia of mitokondriot [42]. Tämä erottaa eturauhassyöpä muista syöpätyyppeihin jossa pahanlaatuisiksi liittyy yleensä merkittävä lasku solun mitokondrioiden [43].

Normaalissa eturauhasessa, epiteelisolujen erittävät korkeatasoinen sitraatin johtunee niiden suhteellisen kyvyttömyys hapettaa sitraatti kautta Krebsin sykli [32,44]. Eturauhasen sitraatti taso kasvaa entisestään hyvänlaatuisen liikakasvun eturauhasen, mutta laskee jyrkästi kehityksen aikana eturauhasen syöpä, oletettavasti koska syöpä mitokondrioissa hankkia kyky hapettaa sitraatti [32]. Tämä metabolinen ominaisuus Eturauhassyövän mitokondrioita on vastakohta joka havaittiin monien nopeasti kasvavia syöpiä, jossa Krebsin sykli siirtyy sitraatin käyttöä sitraattiin tuotantoa, mikä lisää kolesterolin tuotantoa [45].

panos energia-aineenvaihdunnan syövän kehittymisessä ja etenemisessä on raportoitu useita teoksia [44,46,47]. Uskotaan, että tehdä syöpähoidolla syöpää erityisiä, bioenergetic metabolinen ominaisuuksia kunkin kasvaimen tyypin täytyy ensin selvitetty. Muutostyöt on bioenergetic toimintoja ihmisen eturauhassyövän LNCaP, DU145 ja PC-3-solujen on osoitettu liittyvän mitokondrioiden toimintahäiriöitä [38], ja yksityiskohtaiset mekanismit mitokondrioiden patologian edelleen epävarmat. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli valaista niitä aineenvaihdunnan ominaisuuksia mitokondrioita, joka saattaa aiheuttaa apoptoosin eturauhasen syöpäsoluja. Koska tiedetään poikkeuksellisen heterogeenisuus eturauhassyövän selvitimme mitokondrioiden bioenergetic ominaisuuksia kolme eturauhassyövän solulinjoissa, eli PC-3, LNCaP ja DU145, eroavat niiden alkuperä, tuumorigeenisyyteen, vastaus androgeenien, ja leviämisen hinnat [38,43,48 , 49]. Vertailun vuoksi tutkittiin mitokondrioita viljellystä normaalin ihmisen eturauhasen epiteelisolujen (PrEC). Kaikki nämä solulinjat ovat käytännössä luonteva kannalta mitokondrioiden toimintoja. Jotta Vertailun vuoksi tutkittiin myös ei-eturauhasen ihmisen fibrosarkoomasolulinjoilla HT1080. EBV-transformoituja ihmisen normaali lymfoblastoidisoluja (HLB) toimi viittaus miten mitokondriot viljellyistä normaalit solut reagoivat Ca

2+ kuormia ja syklosporiini A.

Tämä on ensimmäinen tutkimus bioenergetic ominaisuudet ja Ca

2 +: sta riippuvaisen läpäisevyyden siirtymistä eristetty mitokondrioita perustettu eturauhassyövän solulinjoissa ja normaaleihin ihmisen PrEC-soluissa. Me raportoimme tässä, että mitokondrioita kolmesta metastaattinen eturauhassyöpä solulinjoilla on useita erillisiä aineenvaihdunnan ominaisuuksia: 20- 30 mV korkeampi sähkö- kalvojännite- (ΔΨ), alhainen affiniteetti kompleksi I NADH, suurempi vastustuskyky Ca

2+ kuormia, ja epätavallinen vastaus syklosporiini A ja huokosia muodostavan antibiootti Alamethicin, verrattuna PrEC ja normaalin HLB mitokondrioita. Havaitut ominaisuudet eturauhassyövän mitokondrioiden voi suojata eturauhasen syöpäsolujen apoptoosin suora ja epäsuora inhibitio mitokondrion läpäisevyyden siirtymisen.

Tulokset

Mitokondrioiden saannot

Kuvio 1 esittää saannot mitokondrioita eristettiin soluja tutkimuksessa. Verrattuna PC-3, DU145 ja LNCaP eturauhassyövän solut, normaalissa eturauhasessa PrEC solut tuottivat vastaavasti 2,1, 2,3 ja 4,6 kertaa vähemmän mitokondrioita solujen grammaa kohden. Korkeimmat tuotot joukossa eturauhassyövän solut saatiin LNCaP, ja myös fibrosarkoomasoluissa (HT1080C) ja normaalin ihmisen lymfoblastoidisoluja (HLB). Saannot olivat melko johdonmukaisia ​​tietyn solulinjan, mutta vaihteli solulinjat [50].

mitokondriot valmistettiin, kuten on kuvattu menetelmät. Tulokset esitetään keskiarvona ± SE, n = 5-7 (erillinen eristykset soluista). Arvot ilmaistaan ​​mg mitokondrion proteiinia per 1 g märkiä soluja. Tilastot: **

p

0,05; ***

p

0,001. Arvot eturauhasen syöpäsolujen PC-3, DU145 ja LNCaP verrattiin normaalin eturauhasen solujen PrEC.

Hengitysteiden toiminnan mitokondrioita eristettiin viljellyistä soluista

Kuvio 2 esittää hengitysteiden toiminnan mitokondriot eri aineenvaihdunnan valtioissa. Koska vähäinen saannot mitokondrioita viljeltyjen solujen, erityisesti normaali PrEC-soluissa, olemme rajoitettu valikoima substraatteja sukkinaatti, glutamaatti + malaatti, ja sitraatti + malaatti. Sitraatti valittiin, koska silmiinpistävä eroja sitraatti aineenvaihduntaa normaalissa ja pahanlaatuiset eturauhaskudoksiin (32,44). Sukkinaatti hapetus on vaihtoehto NAD-riippuvainen substraattien lähde elektroneja. Hapettaminen glutamaatti + malaatti säädetään elektronia Complex I, mutta voi myös heijastaa toiminnan Krebs syklin split tilassa. Lisäksi Esikokeissa olemme havainneet, että eturauhassyövän mitokondrioita hapettuneen glutamaatti + malaatti huomattavasti korkeammat kuin pyruvaatti + malaatti.

Inkubaatio-olosuhteet on kuvattu menetelmät. Alustat: sukkinaatti 10 mM; glutamaatti 10 mM + malaatti 2 mM; sitraatti 10 mM + maltaatin 2 mM. Oksidatiivinen fosforylaatio (State 3) hengitystä stimuloitiin lisäämällä 150 uM ADP; kytkemättömät hengitys (State 3U) stimuloitiin lisäämällä 0,5pM cyanide-

m

-chlorophenylhydrazone (CCCP). Hengitysteiden verrokkeihin kuin suhteet valtion 3 soluhengitysaste kuin Soluhengitysnopeuden valtiossa 4

0 (ennen lisäämistä ADP).

sukkinaattia ja glutamaatti + malaatti, hengityselinten toimintaa mitokondrioiden kolmesta PC solutyyppejä tutkittavana olivat moninaiset korkeammat kaikissa aineenvaihdunnan valtioissa verrattuna mitokondrioita normaaleista PrEC soluista (kuva 2).

jossain määrin tehokkuus mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation voi arvioitaviksi hengitysteiden ohjaus suhde (RCR), jotka lasketaan suhde hengitystiheyden valtion 3 (oksidatiivisen fosforylaation) hengitysteitä kurssi valtiossa 4 (lepää hengitys). Kuitenkin absoluuttinen hinnat soluhengitys valtion 4 ja valtion 3, ovat myös erittäin tärkeitä ymmärtämisen mitokondrioiden energiatalous. Yleensä mitokondrioita normaaleista kudoksista eristetty läsnä naudan seerumin albumiinia, RCR-arvot ovat suuremmat kanssa NAD: sta riippuvaa substraatteja kuin sukkinaatin [51].

Yleisesti tiedot esitetty kuviossa 2 osoittavat selvästi, että normaali PrEC mitokondrioita eroavat merkittävästi eturauhasen syöpäsolujen mitokondriot, sekä normaalista ja pahanlaatuiset kuin eturauhasen soluissa. Kuviot 1 ja 2 osoittavat, että syöpä muutosta normaalin eturauhasen kudoksen solut oli mukana useita-kertaiseksi pitoisuus mitokondrioiden solua kohden, ja monet-kertaiseksi mitokondrioiden hengitysteiden toimintaa.

Kun normaali tai eturauhasen syöpä solujen mitokondriot hapetetaan sukkinaatti, lisäämällä ADP tai uncoupler (CCCP) tuotettu hengitysteiden korkeampi kuin vastaavat luvut NAD-riippuvaisten substraattien (kuvio 2). Siten alhainen valtion 3 hapettumista glutamaatin ja sitraatin syövässä mitokondrioita eivät johtuneet alhainen aktiivisuus ATP /ADP harjoittaja, ATP syntaasia tai toimintaa Complexes III ja IV, vaan alhainen aktiivisuus Complex I (NADH dehydrogenaasi).

Electrical kalvo potentiaalit mitokondrioita eturauhasen ja muiden kuin eturauhasen solujen

korkea mitokondrion kalvon potentiaalit karsinoomasoluja, mukaan lukien eturauhasen syöpäsoluja, verrattuna normaaliin epiteelisolujen on raportoitu useissa tutkimuksissa [52]. Kuitenkin suurin osa näistä tiedoista saatiin fluoresoiva kationinen väriaineet (rodamiini 123, JC-1, jne.), Jotka antavat vain laadullinen arviointi ΔΨ, ja joskus virheellisiä tuloksia. Sudenkuopat Fluoresoivan arviointimenetelmien mitokondrion jännitteen soluissa on käsitelty kirjallisuudessa [53,54]. Yksittäisiä mitokondrioita, käytimme TPP

+ – herkkä elektrodi, joka mahdollistaa määrällisesti arvioida ΔΨ arvot kalvopotentiaaleissa yli -100 mV [55].

Kuva 3 raportoi ΔΨ arvot eristettyjä mitokondrioita solulinjoista tutkitaan. Nämä arvot laskettiin käyttäen korjaukset sitoutumisen TPP

+ sisemmän kalvon ja matriisi (IBC, sisempi sitoutumisvakio) mukaisesti arvioitu [56], ja olettaen, että matriisin määrä 1 ui per 1 mg mitokondrioiden proteiinia. Kuvio 3 osoittaa, että ΔΨ arvot eturauhassyövän mitokondriot olivat 20-30 mV korkeampi kuin arvioitu PrEC-soluissa, ja ei-eturauhassyövän HT1080C soluja, jonka fluoresoiva väriaine menetelmä osoitti normaalia suurempi kalvon potentiaalia [52] . Tärkeää on, korkea ΔΨ eturauhasen syöpä (PC) solujen mitokondrioita ei havaittu soluissa, jotka kerättiin viljelypulloista joka saavutti noin 80-90% konfluenssiin. Mitokondrioita lähes konfluentteja viljelmiä PC soluja oli ΔΨ alle -150 mV. Laadullisesti samanlaisia ​​tuloksia saatiin viljellyistä PC-3-solujen 60% ja 90% konfluenssiin, kun solut värjättiin mitokondriot-spesifisten fluoresoivien väriaineiden eri affiniteetti jännitteiset mitokondrioita (tietoja ei ole esitetty).

Inkubaatio-olosuhteet ja laskeminen ΔΨ kuten -mV kuvataan menetelmät. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona (-mV) ± SE. Tilastot: **

p

0,05; ***

p

0,001. Arvot eturauhasen syöpäsolujen PC-3, DU145 ja LNCaP verrattiin normaalin eturauhasen solujen PrEC.

Kineettinen ominaisuudet Complex I: submitochondrial hiukkaset (SMP) B

Saat miksi eristetyn PC solun mitokondrioissa oli suhteellisen alhainen toimintaa NAD alustan (glutamaatti + malaatti, sitraatti + malaatti) verrattuna sukkinaatti, tutkimme kineettisiä ominaisuuksia Complex I määritys Complex I käsittää NADH elektronin luovuttaja ja tarkoituksenmukaista keinotekoinen elektronin vastaanottaja. Toistaiseksi 6-dekyyli ubikinonin (DB) on paras ja yleisimmin käytettyjä elektronin vastaanottaja [57]. NADH dehydrogenaasi kompleksi koostuu 46 alayksikköä, jotka on järjestetty L-muotoinen rakenne, jossa hydrofobinen alue upotettu sisäkalvon, ja hydrofiilinen ”arm” ulkonevat matriisiin tilaan, ja joka on sitoutumiskohdat NADH [58]. Hydrofobinen domeeni käsittää kaikki 7 mitokondriaalisen DNA (mtDNA) koodattuja alayksikköä, jotka sisältävät koentsyymi Q sitovan domeenin kompleksi I syöpä- ja ei-syöpäsolujen SMP. Ensin arvioitiin optimaalinen pitoisuus DB kullekin mitokondrioita. Tämän me titrattu DB, kun läsnä on ylimäärä NADH (kuvio 4 A, B), ja sitten titrattiin NADH: n läsnä ollessa optimaalinen pitoisuus DB määrittämiseksi Michaelis vakiot (Km) ja NADH (kuvio 5).

Inkubaatio-olosuhteet on kuvattu menetelmät. SMP (0,15 mg) inkuboitiin eri pitoisuuksien DB 5 min 30

oC; reaktio käynnistettiin lisäämällä 1 mM NADH.

Paneeli A: määrä DB vähennys SMP peräisin LNCaP (■), PC-3 (●), ja DU145 (▲) soluja.

paneeli B: määrä DB vähennys SMP peräisin PrEC (■), HLB (▲), ja HFS (●) soluja.

Inkubaatio-olosuhteet kuin kuviossa 2.

LNCaP ja PC-3 ja jossain määrin DU145 eturauhassyövän solulinjoissa, toimintaa Complex I, mitattuna alennus- DB, olivat korkealla ja oli silmiinpistävän kapea DB pitoisuusalueella maksimaalinen NADH: n hapettumista (kuvio 4A). Sitä vastoin kompleksi I aktiivisuus SMP peräisin PrEC, HFS, ja HLB solut olivat alhaisemmat ja osoittivat melko laaja DB pitoisuuksien tarjoamalla mahdollisimman toimintaan, vaikka toiminta itse erosivat merkittävästi (kuvio 4A, B). SMP päässä PrEC ja HFS solut osoittivat hyvin alhainen kompleksi I erityistoimia verrattuna SMP HLB ja PC solujen mitokondrioita. Suuret erot vastausten muutoksiin DB pitoisuuden välillä havaittu PC solun mitokondrioissa (kuvio 4A) ja normaali PrEC solut ja ei-eturauhasen soluissa (kuvio 4B) voi antaa viitteitä erot lipidien proteiini vuorovaikutusten mitokondrioiden kalvot, jotka voivat olla vastuussa epätavallisen vasteen puute PC solun mitokondrioiden lisäyksen Alamethicin, huokosia muodostava peptidi (katso kuva 6).

Inkubaatio-olosuhteet (Medium B) sakkaroosia 210 mM, KCI 20 mM, glysyyli-glysiini 3 mM, pH 7,2, KH

2PO

4 1 mM, sukkinaatti 10 mM, mitokondriot 0,5 mg, lopullinen tilavuus 1,0 ml. Mitokondrioiden turpoaminen kirjattiin optinen tiheys (OD) 520 nm: ssä käyttäen Shimadzu Multispec-1501 malli spektrofotometriä. Lisäykset: Ca

2 + 50 nmol /ml, alamethicin 4 ug /ml.

Kuvio 5 esittää edustava koe mittausten kompleksi I kineettiset parametrit NADH: n hapettumista, kun läsnä on optimaalinen DB pitoisuus on esitetty kuviossa 4. on ollut merkittäviä eroja SMP PC-solujen ja muita solulinjoja. SMP kolmen eturauhassyövän solulinjoissa oli sama, suhteellisen pieni affiniteetti NADH (K

M

NADH = 20 + 2,5 uM). Vertailun vuoksi affiniteetit NADH olivat vastaavasti 5, 4, ja 11 kertaa suurempi kuin kanssa SMP alkaen PrEC (K

M

NADH = 4 + 0,5 uM), HT1080C (K

M

NADH = 5 + 2 uM), ja HLB (K

M

NADH = 1,8 + 0,1 uM) soluihin. Alhainen affiniteetti NADH voisi selittää jossain määrin suhteellisen alhainen valtion 3 hapettuminen NAD-riippuvainen substraattien PC solujen mitokondrioita (kuva 2).

Arvot V

MAX for NADH hapettumiselta Complex I olivat myös silmiinpistävän erilainen välillä SMP eturauhasen syöpäsolujen ja PrEC soluja. V

MAX heijastaa pitkälti määrää entsyymin läsnä järjestelmässä tutkitaan [59]. V

maksimiarvot Complex olisin 0,3-0,45 mM DB alennetaan /min /mg proteiinia eturauhasen syöpäsolujen, ja 0,028 mM DB alennetaan /min /mg proteiinia varten PrEC SMP, joka on 10 ja 16-kertainen ero. Näin PrEC soluja ei vain ollut vähemmän mitokondrioita, mutta mitokondriot oli myös huomattavasti pienempi pitoisuus Complex I kohti mitokondrioissa kuin mitokondrioita metastaattisen eturauhassyövän solut.

Ca

2 + indusoimaa läpäisevyyttä siirtyminen PC- 3 ja HLB mitokondriot

Jo pitkään, suurin osa tietämystä Ca

2 +: sta riippuvainen läpäisevyyden siirtyminen mitokondrioita perustui lähes yksinomaan kokeiluja rotan maksan mitokondrioita (RLM) [60] . Suuri amplitudi osmoottinen turpoaminen RLM pidettiin klassisen osoitus läpäisevyyden siirtymisen huokosesta aukon aiheuttama kalsiumin läsnä ollessa epäorgaanisen fosfaatin (CAPI) (katso kuvio 6). Olemme kuitenkin havainneet, että toisin kuin RLM, mitokondriot muista kudoksista ei saa turpoavat [28], ja jopa depolarisaatio mitokondrioiden aikana kalsiumin sitomisen ei viittaa läpäisevyyden siirtyminen [50]. Osoitamme, että mitokondrioita HLB ja PC-3-soluja ei tapahtunut suuri amplitudi turvotusta aikana Ca

2+ kuormien (kuvio 6). HLB mitokondriot ei turpoavat lisättäessä alamethicin, bakteeri- epäspesifinen huokosia muodostava antibiootti, kun alamethicin ei ollut tehokasta PC-3 mitokondrioita (kuvio 6). Näin suuri amplitudi turvotusta mitokondrioita, ei voida käyttää yhdessä HLB ja PC-3 mitokondriot osoituksena aukon läpäisevyyttä siirtymisen huokosten. Siksi käytimme muita menetelmiä rekisteröityä läpäisevyyden siirtyminen näissä mitokondrioita.

Kuten mainittiin Methods, olemme rajoittaneet määritys läpäisevyys siirtyminen mitokondrioita HLB soluista, jotka voidaan kasvattaa pyörivän pulloissa, ja PrEC ja PC-3-soluja, jotka voidaan kerätä ilman solujen käsittely proteaasilla. Syy tähän piilee havainto, että hoito kudoksen (luuston lihaksen, sydänlihakseen, maksa) ennen homogenointia tai yksittäisiä mitokondrioita kanssa Nagarase tai Tripsin merkittävästi lisääntynyt mitokondrioiden kalsium säilyttäminen kapasiteetti (Panov A, julkaisematon data).

Kuviot 7 ja 8 esittävät muutoksia kalvon potentiaalia ja keskipitkällä pH aikana vähitellen Ca

2 + lastaus suojaamattoman HLB ja PC-3 mitokondrioiden hapettavat sukkinaatti (kuvio 7), ja mitokondriot suojattu 0,5 uM syklosporiini A (kuvio 8). Koska mitokondriot kuluttaa lisätty Ca

2+ kautta elektrogeeninen kalsium uniporter, The ΔΨ putosi, ja sitten palautettu alkuperäiseen tasolle. Kun yhä useammat Ca

2+ lisättiin, elektrogeeninen pyöräily kalsiumin kasvanut ja tämä vastasi laskenut asteittain ΔΨ. Kun mitokondrioiden läpäisevyyttä siirtyminen huokosten (MPTP) avataan, ΔΨ romahti lähes välittömästi kanssa HLB mitokondrioita ja hyvin hitaasti PC-3 solujen mitokondrioita. PH menetelmä rekisteröinnin Ca

2+ kulutusta mitokondrioiden avulla tarkasti rekisteröimällä hetki MPTP aukon. PH menetelmä on luotettavin kvantitatiivinen arviointi määrän Ca

2+ kuluttamaan mitokondriot ennen läpäisevyys siirtyminen tapahtuu – kalsiumin pidätyskyvyn (CRC) [28,50]. Kun MPTP avattu, alkalisoin inkubointimediumin liittyi dissosiaatiota kalsiumtrifosfaatti (Ca

3 (PO

4)

2) matriisissa, ja sitoutuminen H

+ on julkaissut PO

4

3 anioni muodostaa HPO

4

2- ja H

2PO

4

– anionit mukaisesti puskurin pH [28,61]. Näin alkalointi väliaineen yksiselitteisesti merkitsee aikaan PTP aukon. Toteutimme samanaikaisia ​​mittauksia ΔΨ ja pH. On kuitenkin syytä muistaa, että depolarisaation mitokondrioita ei aina liittynyt avaamisen MPTP, kun taas avautuminen MPTP aina johtaa romahtaminen ΔΨ [50,60]. Tämä on havainnollistettu kuvioissa 7 ja 8. Kokeessa kanssa HLB mitokondrioita (kuva 7), instant depolarisaatio mitokondrioita ja alkalisoin väliaineen tapahtui lähes samanaikaisesti johtuen avaamisen suurihuokoisessa.

(A) ihmisen lymfoblastin mitokondrioita. (B) mitokondrioissa PC-3 eturauhasen syöpäsoluja. Lisäykset: TPP

+ lisättiin 0,5 uM erissä, lopullinen pitoisuus 1,5 uM; Ca

2 + 20 nmol /ml, HCI 125 nmol /ml aiheutti ΔpH 0,07.

(A) Ihmisen lymfoblastin mitokondrioita. (B) mitokondrioissa PC-3 eturauhasen syöpäsoluja. Inkubaatio-olosuhteet, kuten kuviossa 8, paitsi, että 0,5 uM CsA oli läsnä. Lisäykset: TPP

+ lisättiin 0,5 uM erissä, lopullinen pitoisuus 1,5 uM; Ca

2 + 20 nmol /ml, CCCP 0,5pM, HCl 125 nmol /ml aiheutti ΔpH 0,07.

Kuvassa 8 vastauksia Ca

2+ HLB (kuva 8A) ja PC-3 (kuvio 8B) mitokondrioita käsiteltiin syklosporiini A (CsA). CsA on tehokkain tunnettu estäjä läpäisevyyden siirtymävaiheessa. Normaalisti CsA voimakkaasti viivästytetään MPT mutta ei estä sitä, kuten on esitetty tapauksessa mitokondrioita HLB (vertaa kuviot 7A ja 8A), kun CsA kasvatti CRC1.5 kertaiseksi. Kuitenkin, se ei ollut mahdollista indusoida MPTP aukon kalsiumin lastaus PC-3 mitokondriot suojattu CsA (kuvio 8B). Asteittainen väheneminen signaalin TPP

+ – herkkä elektrodin todennäköisemmin heijastuu siirtymä TPP

+ matriisista keräämällä kalsiumfosfaatti suolat, mieluummin kuin todellinen Depolarisaatio [28]. PH jälki, kuvassa 8B, osoittaa, että toisin kuin mitokondrioita HLB, PC-3 mitokondriot läsnäollessa CsA suulakepuristetusta protoneja epätasaisesti, vaihtelevalla H

+ /Ca

2+ suhteet. Verrattuna suojaamattoman mitokondrioita, läsnä ollessa CsA PC-3 mitokondriot kykenivät kuluttaa hyvin suuri määrä kalsiumia avaamatta MPTP. Voisimme mahdollistaa Ca

2+ vapautuminen ja avaaminen MPTP vain lisäämällä CCCP, joka on protonofori joka stimuloi mitokondrioiden Depolarisaatio. Ennen kuin lisättiin CCCP, PC-3 mitokondriot kykenivät kuluttaa lähes 5 kertaa enemmän Ca

2+: n läsnä ollessa CsA (kuvio 8B), kuin vertailukokeessa (kuvio 7B). Niinpä kokeissa esitetään kuvioissa 7 ja 8 osoittavat, että PC-3 mitokondriot ovat epänormaaleja ominaisuuksia Ca

2 + n aiheuttamaa läpäisevyys siirtyminen. Kun PrEC mitokondriot, läsnäollessa CsA CRC nousi 20 vain 40 nmol Ca

2 + /mg proteiinia (kuvio 9).

Inkubaatio-olosuhteet kuten kuvioissa 7-8. Harmaa palkit – suojaamattoman mitokondrioita hapettavat sukkinaatti, tumma baareja -mitochondria suojattu syklosporiini A: 0,5pM + oligomysiini 2 ug /ml + ADP 50 uM. Tiedot ovat M ± keskivirhe lasketaan 3 erillistä eristykset mitokondrioita. Tiedot ilmaistaan ​​nanomol Ca

2 + /mg mitokondrion proteiinia. Tilastot: *

p

0,1; ***

p

0,001. Tiedot on suojattu CsA mitokondrioita verrattiin vastaavan suojaamattoman mitokondrioita. Tiedot PC-3 solujen mitokondriot verrattiin varten PrEC solun mitokondrioiden.

Kuva 9 vertaa kalsium säilyttäminen valmiuksia mitokondrioita normaalin eturauhasen PrEC soluissa, normaalit HLB solut ja eturauhassyövän PC-3-soluja hapettavien sukkinaatti puuttuessa ja läsnä ollessa syklosporiini A. Olemme osoittaneet aiemmin, että CRC: t eristettyjä mitokondrioita samanlaisia ​​solulinjoissa, mutta peräisin eri yksilöiden, vaihtelivat huomattavasti [50]. Siksi vasteet Ca

2+ ja CsA mitokondrioiden eri solulinjoista voidaan arvioida vain laadullisesti. Kuvio 9 osoittaa, että suojaamaton PrEC mitokondrioita, oli vähäinen kyky säilyttää Ca

2+ (noin 20 nmol Ca

2 + /mg proteiinia), kun taas PC-3 mitokondriot oli 4-kertainen resistenssi kalsiumia kuormia. Mitokondrioita suojattu CsA, CRC PrEC mitokondrioiden lisääntynyt 2-kertaiseksi, sillä HLB mitokondrioita CRC kasvoi 50%, kun taas PC-3 mitokondriot CRC kasvoi lähes 5-kertaiseksi ja oli 9-kertainen korkeampi kuin PrEC mitokondrioita. Tärkeää on, toisin kuin mitokondriot päässä PrEC ja HLB soluja, CSA-suojattu PC-3 mitokondriot eivät avautuneet spontaanisti läpäisevyys siirtyminen pore, mutta vasta lisäämisen protonofori CCCP.

Keskustelu

syöpä- ja ei-syöpäsolujen tässä tutkimuksessa käytetyt peräisin eri kudoksissa ja yksilöiden [38,43,48,49]. Eroavaisuuksia viljelyolosuhteet voivat myös myötävaikuttaa havaitut erot metabolisen parametreja solujen. Aiemmin on havaittu, että mitokondrioita samaa solutyyppiä, nimittäin ihmisen lymfoblastoidisoluja (HLBM), joka on saatu eri yksilöstä oli kvantitatiivisesti erilaisia ​​satoja 1 grammaa kohti solujen, hengityselinten toimintaa ja kapasiteetin sitomiseksi kalsiumfosfaattia [50]. Laadullisesti normaali HLBM olivat samanlaiset toistensa kanssa ja erillään HLBM potilaista, joilla on Huntingtonin tauti [50]. HLBM Huntingtonin tautia sairastavilla potilailla oli myös kvantitatiivisia eroavaisuuksia soluhengitysnopeuden ja kalsium säilyttäminen kapasiteettia, mutta laadullisesti ne olivat yksilöllisesti keskenään samankaltaisia ​​[50]. Ei ollut mitään mahdollisuutta ja järkevää tilastollisen vertailun HLBM normaaleista yksilöiden ja potilailla, joilla on Huntingtonin tauti. Siksi tietojen tulkinta verrattaessa soluihin eri geneettisen taustan ja viljelyolosuhteet tulisi tehdä varoen ja perustuu pitkälti laadullisia ominaisuuksia. Quantitative vertailuja voidaan tehdä vain saman solulinjan.

tulosten pohdinta esitetään tässä artikkelissa, suhteessa paperit julkaistaan ​​syövän energia-aineenvaihduntaan aihe, jää suhteellisen vähäiseksi. Ensinnäkin tämä työ on toistaiseksi ainoa suoritettiin eristettyjä mitokondrioita normaalista ja eturauhassyövän solulinjoissa; ja toiseksi, me pidetään vaikea keskustella lukuisia julkaisuja aineenvaihduntaominaisuudet ja roolit mitokondrioiden syöpäsolujen viljeltiin antibioottien [21,23,36-38]. Aminoglykosidiantibiootit (streptomysiini, gentamysiini) ovat myrkyllisiä mitokondriot useilla tavoilla [39-41,62]. Olemme toistuvasti havaittu, että mitokondrioita eristettiin soluista viljeltiin antibioottien (penisilliini ja streptomysiini) eivät hengittää mille tahansa alustalle. Higgins et ai. [38] viljeltiin PC-3, LNCaP ja DU145-soluja, kun läsnä oli 1% penisilliini-streptomysiiniä, ja totesi, että mitokondriot nämä solut olivat huonosti.