Krooninen sairaus

tiivistelmä

munuaissolukarsinooma (RCC) on kuudenneksi yleisin syöpä Yhdysvalloissa. Vaikka RCC on erittäin metastaattinen, on olemassa muutamia terapeuttisia vaihtoehtoja metastasoituneen RCC, ja ilman taudin etenemistä potilailla jopa uusin kohdennettu terapeuttisten on vain korkeintaan kaksi vuotta. Siten uusia terapeuttisia kohteita tähän tautiin kaivataan kipeästi. Perustuen aiempiin metabolomiikan tutkimukset osoittavat muuttamista peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorin α (PPARa) liittyviä tapahtumia sekä RCC potilaan ja ksenograftin hiiret materiaaleja, tämän reitin tutkittiin edelleen nykyisessä tutkimuksessa asettamisessa RCC. PPARa on tumareseptorin proteiinia, joka toimii transkriptiotekijänä ja geenejä, mukaan lukien ne, jotka koodaavat entsyymejä, jotka osallistuvat energia-aineenvaihduntaan; vaikka PPARa on raportoitu säätelemään kasvaimen kasvua useissa syövissä, sitä ei ole arvioitu RCC. Erityinen PPARa-antagonisti, GW6471, indusoi sekä apoptoosin ja solusyklin pysähtymisen G0 /G1 VHL (+) ja VHL (-) RCC-solulinjat (786-O ja Caki-1), joka liittyy vaimennus solusyklin säätelyproteiineja c Myc, sykliini D1, ja CDK4; Tämä tieto vahvistettiin nimenomaan PPARa estovaikutuksen siRNA menetelmillä. Mielenkiintoista on, että kun glykolyysiin on estetty useita menetelmiä, sytotoksisuus GW6471 on synergistisesti lisääntynyt, mikä viittaa siihen, kytkin rasvahapon hapettumisen glykolyysin ja tarjoaa täysin uusia terapeuttisia lähestymistapa RCC.

Citation: Abu Aboud O, Wettersten HI, Weiss RH (2013) esto PPARa indusoi solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosi, ja synergistisesti Glykolyysi esto in Munuaiset syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (8): e71115. doi: 10,1371 /journal.pone.0071115

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 26 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 07 elokuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health myöntää 1R01CA135401-01A1 ja 1R01DK082690-01A1 (jotta RHW) ja Lääkäripalvelut USA Department of veteraaniasiat (ja RHW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munuaissolukarsinooma (RCC) on maailmanlaajuisesti 13. yleisin syöpä, ja yksi harvoista syöpien jonka esiintyvyys lisääntyy syistä, jotka eivät ole täysin selvillä, mutta se voi liittyä tupakointi ja lihavuus (tarkistetaan [1 ] ja [2]). Viimeisten vuosien ajan kohdennettuja hoitomuotojen ovat yhä saatavilla ja ovat osoittaneet huomattavaa lupaus hoitoon RCC ja muiden pahanlaatuisten kasvainten; kuitenkin, vaikka tällaisten hoitomuotojen elinajanodote on yleensä vain pidentää alle vuoden, johtuen lääkeresistenssin kehittymisen [3]. Kun otetaan huomioon, että yhä useammat potilailla, joilla on loppuvaiheen tauti ja Resistenssitasot tällä hetkellä saatavilla lääkkeitä, uusia terapeuttisia kohteita kaivataan kipeästi. Tunnistaminen tällaisia ​​tavoitteita voi johtaa sekä suunnitella uusia lääkkeitä ja /tai uudelleenarviointi nykyisten lääkkeiden käyttöä RCC potilailla.

Peroksisomiproliferaattori aktivoituvan reseptorin α (PPARa) kuuluu steroidihormonireseptori superperheen [4]. Tähän mennessä, kolme PPAR-alatyyppiä (α, ß ja γ) on tunnistettu monia lajeja, mukaan lukien ihmiset [5]. Kuten tapahtuu muiden steroidihormonireseptorit, ligandin aktivointi, PPAR heterodimerisoitua retinoidi-X-reseptori (RXR), sitoutuvat tiettyyn promoottorisekvenssi (peroksisomiproliferaattorin vaste-elementti tai pPre), ja sen seurauksena aiheuttaa ilmentymisen erilaisia kohdegeenien [6] osallistuvat henkilöt mukaan lukien glukoosi, lipidien ja aminohappoa aineenvaihdunnan [7].

PPARa reseptorit on tärkeä, vaikkakin todennäköisesti pleiotrooppista antaneet useita toimintoja, rooli maligniteetti. Olipa ne toimivat tuumorisuppressoreilla tai indusoijien syövissä on vielä epävarmaa; tällaiset tehtävät voivat liittyä syövän tyyppi ja /tai erityisten mikroympäristön kasvain. Vaikka tuumorisuppressiogeeneksi by PPARa on raportoitu joidenkin syöpien mukaan lukien melanooma [8] ja glioblastooma [9], PPARa on myös todettu johtavan etenemisen kasvaimen kasvua muissa syövissä kuten maksasyövän [10] ja rintasyövän [11]. Meidän jatkuva tutkimus munuaissyövän käyttäen metabolomiikan menetelmiä, olemme huomanneet, metabolinen allekirjoitukset PPARa mukauttamisen ihmisen RCC solu (Caki-1) ksenograftimallissa kaikkien kolmen ”matriiseja” (kudos, seerumi, ja virtsassa) [12]. Onko tämä havainto johtuu syy PPARa aktivaation oncogenesis vai onko se yksinkertaisesti syöpä ”allekirjoitus” ei määritetty tässä tutkimuksessa. Kuitenkin tämä havainto sai meidät arvioimaan PPARa-agonistit ja antagonistit, ensimmäistä kertaa, mahdollisina RCC hoitoja.

osoittavat nyt, käyttäen erityistä PPARa-antagonisti sekä siRNA menetelmiä, että erityiset PPARa antagonismi johtaa varhainen solukierron pysähtymisen sekä apoptoosin RCC solulinjoissa. Lisäksi tarjoamme todisteita siitä, että kun RCC solut menettävät glykolyysijärjestelmän alustan, ne tulevat herkempiä PPARa antagonisteja, mikä viittaa siihen, että RCC solut muuttavat niiden energia-aineenvaihdunnan reittejä näissä olosuhteissa, ja osoittaa toteutettavuus yhdistelmän PPARa antagonistien ja glykolyysiin estäjä hoito tähän sairauteen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

RCC solulinjat, Caki-1, ja 786-O saatiin American Type Culture Collection (Rockville , MD, USA), ja ”normaali ihmisen munuaisen” (NHK) solulinja saatiin Lonza (Basel, Sveitsi). 786-O ja Caki-1-soluja ylläpidettiin RPMI ja NHK-solut ylläpidettiin DMEM: ssä, jotka molemmat oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml streptomysiiniä ja 100 mg /ml penisilliiniä. Soluja pidettiin 5% CO

2 ja 37 ° C: ssa.

Materiaalit

Formaliinifiksoidusta parafiiniin upotettu dioja (hematoksyliini- eosiinilla [H Dead Cell määritys suoritettiin käyttäen Muse ™ Cell Analyzer Milliporesta (Billerica, MA) seuraavan valmistajan ohjeita. Lyhyesti, kun asianomaiset hoidot, soluja inkuboitiin anneksiini V ja Dead Cell Reagent (7-AAD) ja tapahtumia kuollut, myöhään apoptoottiset, varhainen apoptoottiset, ja elävät solut laskettiin.

Immunoblottausmääritys

Immunoblottaus tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [13]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun asianomaiset hoidot, solut pestiin PBS: llä, hajotettiin hajotuspuskurissa, ja solulysaatit immunoblotattiin. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa yksi tunti huoneen lämpötilassa, inkuboitiin osoitetun vasta-aineita, ja tutkitaan sitten piparjuuriperoksidaasiin merkitty anti-hiiri- tai anti-kani-lgG-vasta-aineita. Signaali havaittiin käyttäen ECL Plus ratkaisuja.

siRNA Transfektio

Ilmoitettu solut maljattiin kuuden kuoppalevylle varten immunoblottauksella tai T25-pulloihin solusyklin analyysit ja apoptoosin määrityksiä. 24 tunnin kuluttua, yksisolukerrosten noin 75% konfluenssiin alistettiin siRNA transfektiota. Transfektioseos valmistettiin Opti-MEM glutaMax väliaineen Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) ja siRNA Lipofectamine RNAiMAX mukaan valmistajan protokollaa. Lopullinen pitoisuus siRNA lisätään solut olivat 100 nM. Soluja viljeltiin, kun läsnä oli transfek- seosta 24 tuntia, ja seuraavana päivänä, transfektioseos korvattiin tuoreella RPMI-, ja soluviljelmä jatkettiin vielä 48 tuntia. Transfektion jälkeen solut kerättiin immunoblottauksella, solusyklin analyysi, tai apoptoosin määritystä.

Tilastollinen analyysi

vertailu keskiarvojen suoritettiin käyttäen riippumaton näytteiden t-testiä. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

PPARa Näyttää Lisääntynyt ilmentäminen High Grade verrattuna huono laatu RCC

Ennen määrittää merkitystä PPARa RCC, ensin arvioinut proteiinin tasot luokan 1 ja 4. asteen RCC kudoksia immunohistokemiallisesti. Arkistoitu RCC kudokset otetaan nephrectomy näytteistä arvioitiin immunohistokemiallisesti tietyn PPARa vasta-ainetta. RCC kudoksiin histologista diagnoosia Fuhrman 4. asteen osoitti voimakkaampaa värjäytymistä PPARa vaikka oli minimaalinen värjäys luokan 1 kudosten (Fig. 1). Kiinnostaa, valtaosa sytosoliin palkkaluokan 1 soluissa koostui jos ”purku” osatekijän, tiedetään olevan glykogeenin ja lipidien, jotka eivät tahraa kanssa PPARa aineella [14].

RCC tuumorikudoksia eri Fuhrman laadut valmistettiin immunohistokemiaan kuvatulla Materiaalit ja menetelmät ja tutkittiin PPARa vasta-aineella. Valomikroskooppikuvat Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmea potilasta kussakin ryhmässä. Bar = 50 pm.

tiettyä PPARa Antagonist, mutta ei agonisti, vaimennettu RCC elinkykyyn

kohonneeseen PPARa havaittiin korkealaatuista kudoksissa tarjoaa vain vähän tietoa toiminnalliset tila tai signalointi ominaisuuksia tämän reseptorin. Alkaa vastata tähän kysymykseen, arvioimme toiminnallista roolia PPARa on RCC solujen elinkelpoisuuden MTT: llä. Sekä Caki-1 (VHL villityypin) ja 786-O (VHL mutatoitu) soluja inkuboitiin erikseen tietyn PPARa-agonisti, WY14,643 [15], tai tietyn PPARa-antagonisti, GW6471 [16] pitoisuuksina 12,5-100 uM 72 tuntia, ja solujen elinkyky arvioitiin. Vaikka WY14,643 joko ei ollut vaikutusta, tai hieman lisääntynyt, solujen elinkelpoisuus, GW6471 merkittävästi ja annoksesta riippuen esti solujen elinkykyä (jopa noin 80%) sekä solulinjoissa (Fig. 2).

RCC solut (Caki-1 ja 786-O) käsiteltiin DMSO, WY14,643 (WY), tai GW6471 (GW) osoitetussa annokset 12,5-100 uM 72 tuntia ja solujen elinkelpoisuuden määritys suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit Menetelmät. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolme toistoa. * P 0,05 verrattuna DMSO. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan.

Euroopan PPARa Antagonistiominaisuudet aiheutti Molemmat solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin molemmissa solulinjoissa

laski solujen elinkelpoisuus havaittiin inkubaation jälkeen molempien RCC solulinjojen kanssa PPARa antagonisti GW6471 voisi johtua joko vähentynyt proliferaatio, apoptoosin induktion, tai molempia. Alkaa vastata tähän kysymykseen, meidän on ensin arvioitava solujen lisääntymistä käyttämällä virtaussytometria menetelmiä. Molemmat solutyypit inkuboitiin GW6471 tai DMSO-ajoneuvon 24 tuntia, minkä jälkeen solu- syklin analyysi suoritettiin. GW6471 pidätettiin solukierrossa G0 /G1 vaiheessa niin Caki-1 ja 786-O-solut (Fig. 3), mikä viittaa siihen, että MTT-määritystä on, ainakin osittain, mikä osoittaa, solusyklin pysähtymisen.

RCC-soluja (Caki-1 ja 786-O) käsiteltiin DMSO (jatkuu) tai GW6471 (GW) 25 uM: ssa 24 tunnin ajan ja solu- syklin analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolme toistoa.

Voit selvittää PPARa antagonismia johti apoptoosin lisäksi solusyklin pysähtymiseen, me seuraavaksi arvioidaan anneksiini V värjäystä samanlaisissa olosuhteissa kuin edellä. Käsittelyn jälkeen molempien solulinjojen GW6471 tai DMSO: ssa 24 tunnin ajan, solut altistettiin virtaavat cytometery analyysin jälkeen anneksiini V-värjäyksellä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Arvioituna solulajittelulla, GW6471 lisääntynyt määrä koko apoptoottisten solujen sekä Caki-1 ja 786-O-solulinjat (Fig. 4A). Vahvista apoptoosia näissä olosuhteissa, PARP lohkaisu soluissa käsitelty GW6471 verrattuna DMSO: ssa arvioitiin myös (kuvio. 4B). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että vähennetään signaali nähdään MTT-määritystä inkuboinnin jälkeen solut GW6471 johtuu sekä solukierron pysähtymisen ja apoptoosin.

. RCC-soluja (Caki-1 ja 786-O) käsiteltiin DMSO: ssa tai GW6471 (GW) osoitetussa annoksina 24 tuntia ja anneksiini V-pohjaisen apoptoosin määritys suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. B. RCC-soluja (Caki-1 ja 786-O) käsiteltiin DMSO: ssa tai GW6471 (GW) osoitetussa annoksina 24 tuntia ja immunoblottaus suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. ß-aktiini immunoblotat- latauskontrollina. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolme toistoa.

edelleen arvioimista mekanismia solukierron pysähtymisen ja apoptoosin induktion GW6471, mittasimme tasot solukierron ja apoptoosin asiaan viestintäproteiinit osallisena säätelyssä G0 /G1 tarkastuspiste. Molemmat solulinjat käsiteltiin 24 tunnin ajan GW6471, ja sitten solu- lysaattia immunoblotattiin CDK4, sykliini D1, ja c-Myc-vasta-aineita; kaikki nämä proteiinit olivat merkittävästi pienensi PPARa antagonisti, tukee havaittu G0 /G1 pidätystä ja viittaa mekanismi sama (Fig. 5).

RCC-soluja (Caki-1 ja 786-O) käsiteltiin DMSO (jatkuu) tai GW6471 (GW) 25 uM: ssa 24 tunnin ajan, ja immunoblottaus suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kuvissa edustavat vähintään kolmea potilasta kussakin ryhmässä.

siRNA transfektoinneilla Vahvista erityisyys PPARa estäjä

Sen varmistamiseksi, että havaitut vaikutukset GW6471 esto ovat ominaisia ​​PPARa esto, käytimme siRNA lähestymistapaa. Caki-1-soluja transfektoitiin ohimenevästi PPARa siRNA tai sekoitetun sekvenssin ohjaus siRNA, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kun kontrolliin verrattuna siRNA, PPARa siRNA heikennetty proteiinin tasot PPARa (Fig. 6A) samanlainen kuin mitä havaittiin GW6471 tässä solulinjassa (vertaa Fig. 6A kuvioon. 5 vasen paneeli), vahvistetaan sekä tehoa siRNA ja spesifisyys GW6471 kohti PPARa. Useita yrityksiä tehtiin transfektoimaan 786-O-solujen kanssa samanlainen siRNA, mutta nämä eivät olleet onnistuneita.

Caki-1-soluja transfektoitiin kontrolli-siRNA tai PPARa-siRNA 100 nM 72 tuntia ja käsitellään immunoblottauksella, solu syklin analyysi, ja apoptoosimäärityksessä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. A. PPARa proteiini taso vaimenee soluissa transfektoitu PPARa siRNA. B. PPARa siRNA transfektion pidätettiin solukierrossa G0 /G1 vaiheeseen. C. CDK4, sykliini D1, ja c-Myc-proteiinin tasot vaimennetaan transfektoiduissa soluissa PPARa siRNA. D. PPARa siRNA transfektio indusoi apoptoosia. Esitetyt tiedot ovat kumpikin edustaa vähintään kolme toistoa.

Varmista, että solusyklin ja apoptoottista tapahtumia havaittu GW6471 inkuboinnin olivat itse asiassa johtuu PPARa eston eikä off-tavoite vaikutukset antagonisti, arvioimme soluja olosuhteissa siRNA transfektion rinnakkain GW6471 inkubointia. siRNA transfektio Caki-1-soluissa pidätettiin solukierrossa G0 /G1 (Fig. 6B), heikennetty proteiinin tasot CDK4, sykliini D1, ja c-Myc (Fig. 6C), ja indusoi apoptoosia (Fig. 6D) kanssa identtisellä tavalla kuin mitä havaittiin GW6471 hoito, mikä osoittaa, että solusyklin pysähtymiseen ja vaimennus näiden proteiinien GW6471 oli itse asiassa johtuu PPARa antagonismin. Näin ollen, vaikutukset GW6471 on solusyklin, sen sääteleviä proteiineja, ja apoptoosin seurauksena erityisistä PPAR-a-antagonismi.

PPARa antagonismi ja Glykolyysi inhibitio synergistisesti vaimentaa RCC elinkykyyn

Koska PPARa on tunnettu aktivoida rasvahappojen hapettumista (FAO) ja laskevan glukoosin hyväksikäyttöä [17], me arveltu, että PPARa antagonismi voi aiheuttaa solujen vähentää riippuvuuttaan FAO ja siten kauniisti riippuvaisia ​​Glykolyysivaiheen niiden energialähde; tällainen havainto ehdottaa uutta lähestymistapaa kliininen hyöty PPARa antagonistien, etenkin RCC hoitoa. Arvioida tämän hypoteesin, käsittelimme RCC soluja GW6471 ja /tai glykolyysijärjestelmän estäjän 2-DG ja sitten mitataan solujen elinkelpoisuus. Näissä olosuhteissa oli synergistinen vaimennus solun elinkelpoisuutta, GW6471 ja 2-DG. Sen vahvistamiseksi, että 2-DG, joka kilpailee glukoosin ja täten vaimentaa solun Glykolyysivaiheen, aiheutti solujen vähentää glukoosin käyttöä, käsittelimme solut GW6471 kasvatettu glukoosin tyhjennetty kasvualusta. Sekä 2-DG hoito ja glukoosin ehtymisen herkistyneet RCC solut PPARa antagonismin (Fig. 7), mikä viittaa siihen, pohjapinta riippuvuus RCC solujen PPARa aiheuttaman FAO niin, että solut siirtyä glukoosiksi riippuvuuteen, kun FAO on heikennetty kanssa PPARa esto. Arvioida mahdollisia eroja RCC vs. ”normaali” RTE solulinjat, suoritimme rinnakkaisia ​​kokeita ”normaali” ihmisen munuaisen solulinja (NHK) saatiin kaupallisesti ja todettu samanlaisia ​​muutoksia (kuva S1). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kaksi esto PPARa ja Glykolyysivaiheen on potentiaalinen uusi ja tehokas yhdistelmä terapeuttinen lähestymistapa RCC.

. RCC-soluja (Caki-1 ja 786-O) käsiteltiin DMSO (Cont), GW6471 (GW) 25 uM, ja /tai 2-DG (5 mM) 72 tunnin ajan, ja solujen elinkelpoisuuden määritys suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. B. RCC soluja (Caki-1 ja 786-O) käsiteltiin DMSO (Cont), GW6471 (GW) 25 uM, alhainen glukoosi media (Lo Glu) tai GW6471 vähän glukoosia 72 tuntia ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määritys, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolme toistoa. ** Synergistinen vaikutus verrattuna kunkin hoidon erikseen. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan.

Keskustelu

RCC on kuudes yleisin syöpä Yhdysvalloissa ja on yksi harvoista syöpien jonka esiintyvyys kasvaa tällä hetkellä; 5-y selviytymisen metastasoituneen RCC on synkkä 26% (TNM Stage IV perustuu vuoden 2005 tilastoihin) [18]. Sillä on noin kolmasosa potilaista, joilla esiintyy etäpesäkkeitä on useita FDA-hyväksyttyjä lääkkeitä saatavilla, niiden joukossa usean estäjät (esim sorafenibia ja sunitinibille) [19] ja nisäkkäiden rapamysiinin kohde (mTOR) estäjät [ ,,,0],20]. Koska ilman taudin etenemistä jopa näiden uusien lääkkeiden on vaivaiset yksi-kaksivuosi, ja koska lähes kaikki potilaat aluksi esittää metastasoitunutta syöpää periksi heidän sairautensa [21], on välttämätöntä tutkia uusia terapeuttisia lähestymistapoja metastasoituneen RCC.

PPARa on ligandi-aktivoidun transkriptiotekijän, joka kuuluu nukleaarihormonireseptorit superperheen [22]. Tämä reseptori on osoitettu stimuloivan rasvahappojen aineenvaihduntaa [17], vaimentaa glykolyysin [17], ja säännellä tuumorigeneesiin edistämällä transkriptiota sen kohdegeenien [23] – [28]. Huolimatta laaja tuntemus eri tavoitteet PPARa, täsmällistä asemaa tämän reseptorin säätelyyn syöpä on vielä epävarmaa.

PPARa-agonistit on osoitettu vähentävän kasvun melanooman, glioblastooma, ja fibrosarkooma, ja nämä vaikutukset on yhdistetty PPARa inhiboivan vaikutuksen endoteelisolujen proliferaation sekä PPARa-riippuvaisen down-regulation P450, ja estää siten neoangiogeneesiin [29], [30]. Toisaalta, aktivointi PPARa on osoitettu lisäävän proliferaation rintasyövän solulinjoissa [11]. Lisäksi pitkän aikavälin anto PPARa-agonistit aiheuttanut maksasyövän jyrsijöillä [31], ja

Pparα-

null hiiret olivat resistenttejä maksakasvaimia vaikutuksia PPARa-agonistit [31], [32]. Nämä tiedot osoittavat, että PPARa lla pleiotrooppinen rooli syövän, mutta onko se toimii tuumorisuppressorina tai onkoproteiinia näyttää erittäin riippuvainen syöpätyypin tai jopa solutyypin.

pohjaksi Tässä tutkimuksessa äskettäin löydetty metabolisen allekirjoitus RCC hiirillä ksenosiirrettyjä ihmisen RCC (Caki-1) solujen [12]. Tutkimuksemme tukee toinen urogenitaalinen syöpien verrataan mRNA ja miRNA profilointi, joka osoitti osoituksena täydennetyn PPARa väylän RCC muttei virtsarakon syöpä [33]. Vaikka nämä tutkimukset tukevat onkogeenisessä vaikutus PPARa RCC, molekyylimekanismeja tumorigeneesin jonka PPARa ja mahdollinen terapeuttinen lähestymistapa PPARa esto ei ole arvioitu RCC. Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että PPARa-antagonismi vaimentaa RCC solujen kasvua G0 /G1 vaiheen solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin induktio liittyy pienentynyt CDK4, sykliini D1, ja c-Myc tasoilla.

Vaikka on ollut tutkimuksia, jotka osoittavat ylös-säätely PPAR metaboliittien [12] ja geenit [33] RCC, ei tutkimus on osoittanut muuttaminen todellisen PPARa proteiinin tasot liittyvät kasvaimien syntyyn. Tässä tutkimuksessa osoitamme lisääntynyt PPARa tasolle korkealaatuista RCC kudosten vs. huono laatu kudoksia, mikä viittaa siihen, että PPARa proteiini tasoilla liittyy aggressiivisuus RCC. Koska PPARa säätelee rasvahappojen hapettumista (FAO) kautta kohdegeenin transkription [34], ja kun otetaan huomioon se, että luokan riippuvainen korjauksilla energia väyliä (kuten FAO) proteiinit on raportoitu [35], on mahdollista, että PPARa ainakin osittain on rooli aggressiivisuutta ja energia-aineenvaihdunnan eroja funktiona arvosana RCC. Tätä mahdollisuutta tukee se havainto, että matala-asteinen RCC soluilla on laajempi selkeä sytosoliin, joka koostuu rasva-ja glykogeenin, kuin korkeamman asteen solujen [14], [36].

Sen arvioimiseksi, PPARa on elinkelpoinen potentiaalia terapeuttisena kohteena pitkälle RCC, olemme analysoineet tehoa PPARa antagonismin käyttäen tiettyä PPARa-antagonisti, GW6471, RCC solulinjoissa. Meidän tiedot osoittivat ensimmäistä kertaa, että tällainen käsittely aiheutti G0 /G1 solukierron pysähtymisen sekä apoptoosin induktion. On mahdollista, että nämä tapahtumat liittyvät energia-aineenvaihdunnan muutoksia, jotka ovat hyvin tutkittu normaaleissa soluissa ja monissa sairauksia, kuten sydän- ja verisuonitauteja sekä syöpää, jossa PPARa on ehdotettu terapeuttiseksi tavoite [10], [17], [ ,,,0],37], [38]. Tietääksemme meidän on ensimmäinen tutkimus osoittaa solukierron pidättäneet PPARa esto RCC.

PPARa antagonismin sekä GW6471 ja erityinen siRNA osoitti alenemista c-Myc, sykliini D1, ja CDK4. Nämä havainnot tukevat tutkimukseen, joka osoitti PPARa riippuvaisia ​​nousuja c-Myc, sykliini D1, ja CDK4-proteiini [39], jonka PPARa-agonisti WY-14643 villityypin hiiren maksasoluja muttei PPAR-a null soluja. Solun proto-onkogeenin,

c-myc,

liittyy ihmisen erilaisten syöpien ja on vahvasti osallisena valvonnassa soluproliferaation, ohjelmoitu solukuolema, ja erilaistumista [40]. PPARa on osoitettu vakauttaa c-Myc-proteiinin kautta tukahduttaminen let-7c miRNA [41]. Näin ollen, on mahdollista, että vaimennus c-Myc-proteiinin RCC soluissa PPARa-antagonismi oli lisäämällä let-7c mikä laski vakauden c-Myc. Sykliini D1 /CDK4 kompleksi edistää solusyklin etenemisen kautta fosforylaation sen alustan mukaan lukien pRb (tarkistetaan [42]). Vaimennus c-Myc tukahduttaa sykliini D1 /CDK4: n ilmentyminen ja aktiivisuus G1 /S siirtyminen [43], [44]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että havainto, että PPARa esto johtaa laski c-Myc tasot voi selittää laskua sykliini D1 /CDK4: n ja siten aiheuttaa havaitun solusyklin pysähtymisen G0 /G1 RCC soluissa.

Merkittävä löytää meidän oli, että PPARa esto ei ainoastaan ​​pidätetty solusyklin mutta myös aiheutti apoptoosin RCC soluissa. Mielenkiintoista on, CDK4 inhibition on raportoitu indusoivan apoptoosia [45] aiheuttamalla translokaatio RelA, pääasiallinen komponentti NFKB, mistä sytoplasmasta nucleoplasm ja sitten nucleolus johtaa tukahduttaminen anti-apoptoottisen proteiinin tuotantoa, mukaan lukien surviviiniin. Koska havaitsimme syvällinen CDK4 eston jälkeen PPARa antagonismi, on mahdollista, että PPARa inhibitio-indusoitua apoptoosia oli seurausta CDK4 vaimennus ainakin RCC-soluissa.

edelleen laajentaa mahdollisuuksia PPARa inhibition kuin terapeuttinen lähestymistapa, haimme yhdistelmä hoitoja, jotka lisäävät tehoa PPARa antagonisti. Koska yksi rooleista PPARa liittyy yhä FAO [10] sekä vähentää glykolyysin on transkription ja toimiva johtaa vähenemiseen pyruvaatti ja laktaatin tuotantoa [17], me arveltu, että PPARa-antagonismi voi johtaa lisääntyneeseen riippuvuus solujen on Glykolyysivaiheen koska vaimennus FAO. Meidän havainto, että teho GW6471 oli merkitsevästi korkeampi glukoosi-tyhjennetty kasvualusta kuin säännöllistä tiedotusvälineet vahvistivat lisäksi tämä olettamus ja edelleen ehdotti, että synergistinen vaikutus PPARa antagonisti ja 2-DG yhdistelmähoito oli nimenomaan estämällä Glykolyysivaiheen eikä off-tavoite vaikutuksia 2-PO. Lisäksi tämä havainto tukee tulevaisuuden arviointi dual terapeuttisia joita voitaisiin käyttää samanaikaisesti siten hyökkää RCC sen akilleenkantapää energia-aineenvaihduntaan.

Tulosten että NHK solut osoittivat samanlaisia ​​muutoksia näissä olosuhteissa olisi lieventää useita ongelmia . Ensinnäkin käyttäytyminen kaikissa solulinjoissa, erityisesti solujen väitti olevansa ”normaali”, on arvioitava niiden in vivo yhteydessä ennen lopullisia johtopäätöksiä voidaan tehdä niiden käyttäytymisestä, koska sellaisia ​​kysymyksiä kuin stroomasolujen vaikutus sekä sytokiinien release ja muut autokriininen vaikutteita. Toiseksi anto GW6471 kanimallissa (4 mg /kg bolus IV injektio) [46] ei aiheuttanut brutto muutoksia munuaisten tai muutokset virtsaneritys verrattuna kontrollieläimiin 5 tunnin jälkeen (Christopher Lotz, henkilökohtainen tiedonanto ).

Yhteenvetona osoitamme täällä ensimmäistä kertaa, että (1) PPARa on yliaktiivista korkealaatuista RCC kudoksiin verrattuna huono laatu kudoksiin, (2) PPARa esto vaimentaa RCC solujen elinkykyä läpi c-Myc, CDK4 ja sykliini D1 lasku välittämän solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin induktio, ja (3) glykolyysiin esto synergoi PPARa vastaan ​​solujen elinkykyä. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, PPARa esto uutena terapeuttinen lähestymistapa kehittyneiden RCC.

tukeminen Information

Kuva S1.

glukoosi ehtyminen synergia PPARa antagonisti esiintyy ensisijaisesti normaalin ihmisen munuaisen epiteelisolujen (NHK) soluja. NHK-soluja käsiteltiin 2-DG ja altistettiin ilman glukoosia median, kuten on kuvattu kuviossa. 7. Esitetyt tiedot edustavat vähintään kolme toistoa. ** Synergistinen vaikutus verrattuna kunkin hoidon erikseen. Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0071115.s001

(TIFF) B