Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Surviviini on apoptoosi-inhibiittori ja sen yli ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen useita syöpäsairauksia. Vaikka useat tutkimukset ovat analysoineet surviviinin ilmentyminen ruokatorven okasolusyöpä, harvat ovat keskittyneet ruokatorven adenokarsinooma (EAC) ja /tai syöpään vieressä levyepiteelillä (CASE). Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli 1) määrittää aste surviviinipeptideille jopa sääntelyn näytteitä EAC ja CASE, 2) arvioida, jos surviviinin ilmentymistä EAC ja CASE korreloi uusiutumista ja /tai kuolemaan, ja 3) tutkia vaikutusta surviviini estoa apoptoosin EAC soluissa.

Methods

Tuorenäytteissä EAC ja CASE samasta potilaasta käytettiin qRT-PCR ja Western blot-analyysi, ja formaliinilla kiinnitetyt, paraffiini- upotettu kudosta käytettiin immunohistokemiallisesti. EAC solulinjat, OE19 ja OE33, transfektoitiin pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) ja pudotus surviviinin ilme. Tämä vahvistettiin qRT-PCR Surviviinia ilmaisun ja Western blot-analyysi pilkkoa PARP, halkaistut kaspaasi 3 ja surviviinin. Surviviinivasteita ekspressiotietojen korreloi kliinisten tutkimusten tulosten kanssa.

Tulokset

Surviviinispesifisiä ilme oli huomattavasti korkeampi EAC kasvain näytteissä verrattuna CASE samasta potilaasta. Potilaat, joilla on korkea ilmentymisen surviviinille EAC kasvain oli kohonnut kuolleisuusriski. Surviviinispesifisiä ilmentyminen havaittiin myös CASE ja korreloivat lisääntynyt riski etäpesäkkeenä. Solulinja arviointi osoitti, että inhibitio surviviinin johti apoptoosin lisääntyminen.

Johtopäätös

Korkeampi ilmentymä surviviinille kasvainkudoksessa liittyi lisääntynyt kuoleman riski; kun surviviinin ilmentyminen CASE oli ylivoimainen ennustaja toistumisen. Esto surviviinille EAC solulinjoissa edelleen kohonneen apoptoosin, joka tukee mahdollisia hyötyjä hoitostrategioita suunnattu tämä merkki.

Citation: Malhotra U, Zaidi AH, Kosovec JE, Kasi PM, Komatsu Y, Rotoloni CL, et ai. (2013) ennusteen arvioinnissa ja valikoidut esto surviviinin ilmentäminen ruokatorven adenokarsinooma ja Cancer-Vieressä levyepiteelillä. PLoS ONE 8 (11): e78343. doi: 10,1371 /journal.pone.0078343

Editor: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 heinäkuu 2013; Hyväksytty 13 syyskuuta 2013 Julkaistu 4 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Malhotra et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: David Gold ja Irene Blumenkranz tarjota avustusta tukea. Lupanumeroita ja URL ei ole saatavilla. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven syöpä on tällä hetkellä kahdeksas yleisin syöpä maailmassa; ruokatorven adenokarsinooma (EAC) osuus 50% ruokatorven syöpään tapauksissa [1] – [5]. Viiden vuoden eloonjääminen ruokatorven syöpä on alle 20% ja sen esiintyvyys on kasvanut lähes kolminkertaiseksi läntisen pallonpuoliskon viimeisten 20 vuoden aikana [6], [7]. Useimmat EAC potilaat diagnosoidaan pitkälle sairaus ja huono pitkäaikainen eloonjäämisprosentti kanssa tällä hetkellä työssä kemoterapia-aineiden [5], [8], [9]. Teho nykyinen hoito on saavuttanut tasanteen ja tiivistyi entisestään sytostaattien tai säteilyn annoksen suurentaminen on osoitettu liittyvän merkittäviä haitallisia sivuvaikutuksia. Näin ollen tarve kehittää tehokkaita hoitomuotoja kehitettäessä, joilla pyritään hoitamaan tiettyjä mekanismeja syövän tarvitaan parantamiseksi säilymiseen [2] – [4], [10], [11].

surviviinia myös tunnettu Bakuloviraalista Inhibitor apoptoosin Toista-jossa on vähintään 5 tai BIRC5, on apoptoosi-inhibiittori tai ohjelmoidun solukuoleman [10] – [13]. Vaikutusmekanismia läpi sisäisen reaktiotien on seuraava: surviviini sitoutuu ja estää kaspaasi 9, jolloin deaktivointi apoptoottisen reitin; prokaspaasi 3 ei pilkotaan, ja näin ollen ei pilkkovat PARP (poly ADP-riboosi-polymeraasi); tämän seurauksena PARP pysyy aktiivisena, ja jatkuu DNA korjaukseen, mikä johtaa apoptoosin estämiseen (kuvio 1) [8], [10], [11], [13], [14]. Tavallisesti surviviini vain havaituista alkion ja sikiön kehitykseen keinona säädellä asianmukaisesti solujen jakautumista ja kasvua ja on huomaamaton useimmissa lopullisesti erilaistuneita normaaleissa kudoksissa [15]. Jotkut normaalin aikuisen kudoksissa pysyviä surviviinin ilmentymisen ovat hematopoieettisten kantasolujen [16], tymosyyttien [17], melanosyyttien [18], mahan limakalvon [19] ja paksusuolen epiteelin [19]. Tutkimuksissa on raportoitu lisääntyneen ilmentymisen surviviinille useiden syöpien, kuten rinta-, keuhko-, melanooma, leukemia, lymfooma, paksusuolen, haiman, ja jne. [15]. Todisteet myös tukee yli ilmentyminen surviviinille ruokatorven okasolusyöpä ja sen yhteydessä huonoon ennusteeseen [3], [4], [8], [10], [11], [20]. Koska surviviini ole ilmaistu suurin osa terveiden kudosten, se edustaa ihanteellisen tavoite kehittää uusia syövän aineita [3], [4], [8], [10], [11], [13], [20 ], [21]. Itse aineet kohdistuvat surviviinille hetkellä vaiheessa I ja II vaiheen kliinisissä kokeissa potilailla, joilla on edennyt syöpä, jossa menetelmiä eston ovat antisense- oligonukleotidit (ASO), transkriptiorepresso-, ja immunoterapia [10], [14], [22]. Joillakin näistä aineista ovat osoittaneet lupaavia alustavia tuloksia, mutta yksikään ei ole yleisesti parantunut eloonjääminen [3], [4], [7], [10], [11], [14], [22] – [24].

surviviinin sitoutuu ja estää kaspaasi 9, kaspaasi 9 ei pysty pilkkomaan kaspaasi 3, kaspaasi 3 ei pysty pilkkomaan PARP, PARP edistää DNA: n korjaukseen ja ei aiheuta apoptoosia.

Vaikka on ollut monia raportteja analysoidaan roolia surviviinille ruokatorven okasolusyöpä (SCC), hyvin harvat tutkimukset ovat käsitelty sen rooli ruokatorven adenokarsinooma (EAC) [3], [4], [7] – [9], [21] , [25], [26]. Lisäksi ilmaus tästä anti-apoptoottisen geenin syöpää viereisen levyepiteelillä (CASE) ei ole tutkittu. Tarkoituksena Tutkimuksessamme oli siis 1) määrittää aste surviviinipeptideille jopa sääntelyn näytteitä EAC potilaiden ja CASE, 2) arvioida toistuminen ja selviytymisen surviviinipeptidillä ilmaisua EAC ja CASE kudos, ja 3) tutkia vaikutusta surviviinispesifisten estoa apoptoosin EAC solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus suoritettiin hyväksynnän saatuaan University of Pittsburgh Institutional Review Board. Näytteitä otettiin UPMC Cancer Center – Ruokatorven syöpäriski Registry, University of Pittsburgh IRB Tutkimus nro 98-122 kanssa URL: https://www.upmccancercenter.com/trials/trialDisplay.cfm?id=2277 type=D. Osana tutkimusta, kaikki potilaan näytteet saatiin täydellä kirjallisen suostumuksen.

Solulinjat

EAC solulinjat OE19 (JROECL19) ja OE33 (JROECL33) on saatu Sigma-Alderich (St. Louis, MO). Ne molemmat yllä Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 solujen kasvatusalusta (Life Technologies, Carlsbad, CA, 21870076), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, 26140079), 1% L-glutamiini (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25030081), 1% penisilliini-streptomysiini (Life Technologies, Carlsbad, CA, 15070063). Kaikki solut varastoitiin 25 cm

2 pulloihin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmankosteuden suhteen. Trypsiini-EDTA: ta (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25200072) käytettiin sato soluja niiden pulloon ja valmistaa yhdessä solususpension Western blot -analyysi ja Käänteinen transkriptio – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

siRNA transfektio

OE33 ja OE19 ympättiin 6-kuoppaiseen levyyn tiheydellä 4 x 10

5 24 tuntia ennen transfektiota. Solut joko transfektoitu pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) tai käsittelemätön. SiRNA luokat hyödyntää mukana surviviinispesifiset siRNA, tai negatiivinen kontrolli (ryntäily) (Dharmacon, Lafayette, CO, D-001810-10-05). Kukin siRNA liuos laimennettiin 100 uM kalusto 5 uM RNaasittomissa H

2O, sitten laimennettiin 0,25 uM Opti-MEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, 31985062). Samalla, 2 ui transfektioreagenssia 4 (Dharmacon, Lafayette, CO, T-2004) per reaktio laimennettiin 98 ul: n Opti-MEM. Liuokset erikseen inkuboitiin 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, sekoitetaan keskenään, ja inkuboitiin vielä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lopullinen siRNA liuos laimennettiin 1 ml per reaktio Opti-MEM lopulliseen pitoisuuteen 25 nM. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 kostutetussa ilmassa, jossa on RPMI-elatusaineeseen muutos 24 tunnin kuluttua. Kokosolulysaatti kerättiin 48 tuntia RNA-analyysiä varten tai 72 tuntia proteiinin analyysiin.

Potilaille ja Kudosten valmistelu

Tutkimus suoritettiin hyväksynnän saatuaan University of Pittsburgh Institutional Review Board. Potilaat, joille tehtiin esophagectomy lokalisoitu ruokatorven adenokarsinooma alusta 2008 loppuun 2010 oli mukana tutkimuksessa. Neljäkymmentä seitsemän näytettä seulottiin ja sen jälkeen ilman okasolusyöpä, adenosquamous syöpä, ja kudosten lohkot, joissa on alle 70% tuumorin, yhteensä 37 potilasta analysoitiin tässä tutkimuksessa. Kliiniset tiedot kuten ikä, sukupuoli, kansallisuus, kliiniseen vaiheeseen, elintärkeä asema, tupakointi historia, kokonaiselinaika ja aika uusiutumiseen saatiin Department of Cardiothoracic Kirurgian kliinisen tietokannan. Varmistaakseen Potilaan luottamuksellisuus, rehellisenä välittäjänä järjestelmä oli käytössä tarjoamaan de-tunnistaa kliininen aineisto liittyy kudosnäytteiden [27]. Tuore kudos upotettiin OCT käytettiin kvantitatiivista käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) ja Western blot-analyysi. Formaliini-, parafiiniin upotetut (FFPE) kudosta käytettiin immunohistokemiaa.

Western blot -analyysi

Proteiini kerättiin kustakin solulinjasta hoitoryhmässä lisäämällä lyysipuskuria (RIPA-puskuri, joka sisälsi 0,1% proteaasiestäjäseostabletit sekoitus, 0,1% Halt fosfataasinestäjällä cocktail sekoitetaan ja 1% PMSF) ja käyttämällä solun nostaja. Liuosta pyöritettiin yhden tunnin ajan 4 ° C: ssa täysin solujen hajottamiseksi, sitten sentrifugoitiin 12000 g: llä 4 ° C: ssa 20 minuuttia erottamiseksi proteiinia. Supernatantti, joka sisältää proteiinin otettiin talteen ja kvantitoitiin käyttäen BCA Pierce Assay (ThermoFisher, Rockford, IL, 23227). Kolmekymmentäviisi ug proteiinia kustakin näytteestä denaturoitiin ja erotettiin 4-20% SDS-PAGE-gradienttigeelissä (Bio-Rad, Hercules, CA, 161-1159), sitten elektroblotattiin Immobilon-P PVDF nitroselluloosamembraanille (Millipore Corporation , Billerica MA, IPVH08100). Membraani blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta TBS-T huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan. Vasta-aine kiinnostavia inkuboitiin kalvon kanssa 4 ° C: ssa yön yli, minkä jälkeen 1,5 tunnin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa vastaavan piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Cell Signal, Boston MA, 7074 tai 7076, 1:3,000) surviviinia-vasta-ainetta ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, sc-47750) käytettiin 1:200, kaspaasi-3 (Cell Signal, Boston, MA, 9665) at 1:1,000, halkaistut-PARP (Cell Signal, Boston, MA, 9546) at 1:2,000 ja β-aktiini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, A1978) on 1:30,000 käytettiin latauskontrollina. Signaalit kehitettiin käyttäen kemiluminesenssi-reagenssia (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, 509049324).

Quantitative Käänteinen transkriptio – Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA puhdistettiin solulinjoja käyttämällä RNeasy Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA, 74004). Lyhyesti, pellettejä sisältää 1 x 10

6 solua vorteksoitiin vuonna RLT lyysipuskuria ja RNA uutettiin seuraavat valmistajan protokollaa käyttäen eluutiotilavuutena 14 ul. Käyttämällä ND-2000 spektrofotometrillä (Nanodrop Technologies, Inc, Wilmington, DE), laatu ja määrä RNA arvioitiin OD

260/280. Komplementaarisen DNA: n (cDNA), tehtiin käänteistranskriptio 3 ug kokonais-RNA: sta käyttäen RNA-cDNA ecodry esiseosta kokonaistilavuudessa 20 ui (Clontech, Mountain View, CA, 639547) mukaan valmistajan protokollaa. Reaktio-olosuhteet olivat 42 ° C: ssa 60 minuuttia, minkä jälkeen 70 ° C: ssa 10 minuutin ajan käyttäen ABI Prism 7900HT PCR lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). PCR suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui käyttäen 600 ng cDNA: ta, 1 x Taqman PCR universal perusseosta (Invitrogen, Grand Island, NY, 4304437), ja 1 x surviviinin tai GAPDH-aluketta (Applied Biosystems, Carlsbad, CA hs03043576_m1 ja hs99999905_m1) kunkin reaktion. Pyöräily parametrit olivat: yksi sykli 95 ° C: ssa kymmenen minuuttia, minkä jälkeen 45 sykliä 95 ° C 15 sekunnin ajan, ja 60 ° C: ssa yhden minuutin on StepOne Plus järjestelmä (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Kaikki reaktiot suoritettiin teknisen kaksoiskappaleet.

uuttaminen kokonais-RNA: tuore kudoksesta tehtiin käyttäen Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA 74104). Lyhyesti, 10 um lokakuu osat leikattiin RLT-puskuria, hajotettiin käyttäen 20 gaugen tylppä pää neulan ja RNA uutettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttäen eluutiotilavuus 50 ul. qRT-PCR suoritettiin One-step qRT-PCR Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA 4310299) valmistajan ohjeiden kokonaistilavuudessa 20 ui käyttäen 2 ul kudosta lysaatin ja 1 x surviviinin tai 1 x GAPDH-aluketta ( Life Technologies, Carlsbad, CA hs03043576_m1 ja hs99999905_m1) kunkin reaktion. Sykli käytetyt olosuhteet olivat: 1 sykli 50 ° C: ssa 30 minuuttia, 95 ° C: ssa 2 minuuttia, ja 50 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 60 ° C: ssa 45 sekunnin ajan käyttäen ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems , Carlsbad, CA). Kaikki reaktiot ajettiin tekniseen kolmena rinnakkaisena. Amplification tontteja molempien näytteen luokkia, solulinjojen ja tuore kudoksista tutkittiin StepOne ohjelmisto, varustettu StepOne Plus järjestelmä, määrittää syklin kynnys (CT). GAPDH käytettiin normalisointia ekspressiotietojen. 2

-ΔCT menetelmää käytettiin määrittämään surviviinin taittaa ilmentyminen kasvainkudoksessa ja CASE.

immunohistokemia

FFPE osat immunovärjättiin osoittamaan surviviinin ilmentymistä EAC kasvain ja pariksi squamous epiteelin näytteitä . Reaktiivinen ihmisen nielurisojen ja ei-immuuni seerumi ajettiin rinnan positiiviset ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti. Kudosnäytteet leikattiin 4 um päälle ladattu dioja ja parafiini. Objektilasit upotettiin 0,01% Triton X-100 kymmenen minuuttia huoneenlämpötilassa, huuhdeltiin juoksevalla H

2O, sitten upotetaan 10 mM sitraattipuskurissa, pH 6,0 95 ° C: ssa 20 minuuttia antigeenin haku. Esto esiintyi 3% H

2O

2 seurasi vesijohtovettä pestä. Kolmen pesun jälkeen 1 x Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa 0,001% Tween 20: tä (TBS-T), levyt blokeerattiin edelleen 2,5% normaalia hevosen seerumia (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401). Surviviiniproteiini primaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, sc47750) levitettiin 1:50, yön yli 4 ° C: ssa. Levyjä pestiin kolme kertaa TBS-T, inkuboitiin sitten ImmPress anti-kani-reagenssin (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401) 30 minuuttia auttamaan surviviinin ilmentymisen havaitsemiseen. Jälleen, levyjä pestiin kolme kertaa TBS-T, ja kehitettiin käyttäen ImmPact DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SK4105).

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmistoa (IBM, Armonk, NY, Version 20). P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kussakin kudosnäytteestä, keskiarvot Surviviinin mRNA ekspressiotasoja (määritetty 2

-ΔCT menetelmä) arvioitiin kummassakin EAC kasvainkudoksessa (kasvain surviviinin taso) ja CASE kudosnäytteistä (normaali surviviini taso). Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan kasvaimen keskimääräinen ja normaali surviviinin tasolla. Vastaanotin toimii (ROC) analyysiä käytettiin sen määrittämiseksi surviviiniin tasoilla voitaisiin käyttää määrittelemään korkean ja matalan riskin ryhmiä uusiutuminen; korkea riski /alhainen riski vahvistettuja kynnysarvoja ROC-analyysit käytettiin luokitella potilaille suuri riski /alhainen riski molemmille CASE kudosten surviviinin tasoilla ja EAC kudosten surviviinin tasoilla. Erillinen ROC analyysit tehtiin ennustavat uusiutumisen välillä CASE kudoksesta surviviinista tasoilta ja EAC kudoksesta surviviinin tasoilla. Molemmissa tapauksissa silmämääräinen tarkastus tuotetun graafisen lukuja käytetään yhdessä listattu Surviviinispesifisiä pisteet leikata pistettä vastaavien herkkyys ja (1 miinus) spesifisyys, jotta voidaan määrittää optimaalinen kynnysarvojen määrittelemiseksi korkean ja matalan riskin ryhmiin.

Mitä ROC menettely kynnyksen määrittämiseen käytimme tavanomaista silmämääräisesti käyrän määrittämiseksi että kohta lähimpänä vasemmassa yläkulmassa ROC hahmo yhdessä tarkastus vastaavien herkkyys ja spesifisyys arvot pitkin käytettävissä arvot. Tämä tarjosi millä tavoin määritetään arvo edellyttäen paras tasapaino herkkyyden ja spesifisyyden. Kun tarkastuksen ROC lukuja, tämä tarkastus oli suhteellisen suoraviivaista CASE, mutta oli hieman vähemmän suoraviivaista kasvainten solujen tasoilla. Tässä tapauksessa arvo valittiin joka korostettiin herkkyydestä spesifisyyden kustannuksella, koska väärät negatiiviset katsottiin olevan vaarallisempi kuin olivat vääriä positiivisia. Tämä luottaa raskaammin lasketun herkkyys /spesifisyys arvot oli ei-merkitsevä AUC (pinta-ala käyrän) ja vastaavasti ei silmin havaittavia leikata kohta.

Kaplan-Meierin käyrä muodostettiin määrittämään selviytyminen perustuu korkeaan ja matalan riskin toistumisen ryhmiä. Mantel-Cox Log Rank Test tehtiin, jotta voidaan verrata kokonaiselossaoloaikaa välillä riskiryhmiin. Coxin suhteellisen vaarat mallia käytettiin tehokkuuden arvioimiseksi surviviinin tasolla sekä CASE ja EAC kudosnäytteiden ennustettaessa kuolevuuden.

Tulokset

yli-ilmentyminen surviviinille EAC solulinjoissa, ihmisen kasvain ja CASE kudoksen

surviviinin mRNA-ekspressio oli merkittävästi suurempi tuumorinäytteissä verrattuna CASE kudosnäytteitä on qRT-PCR-analyysi (kuvio 2A). Keskimäärin kasvaimen näytteitä osoitti tasot surviviinin ilmentymisen 3 x suurempi kuin CASE kudoksen (p 0,00001. Kuvio 2B). Immunohistokemia (kuvio 3) ja Western blot -analyysi (tietoja ei esitetty) vahvisti myös surviviinin ilmentymistä sekä EAC kasvaimen sekä CASE.

: qRT-PCR suoritettiin vertailua surviviinin ilmentymisen välillä kasvaimen ja vierekkäisten levy- epiteelin kudosta. B: keskimäärin kasvain näytteet osoittivat 3 × suurempi surviviinin ilmaisu kuin pariksi viereiseen kudokseen.

Surviviinispesifisiä ilmentyminen arvioitiin kautta IHC värjäystä, kasvain kudosten ja viereisen levyepiteelillä osoitti läsnäolon värjäytymisen ohjeellinen surviviinispesifisten ilmaisun. Nuolet edustavat positiivista värjäytymistä.

esto surviviinille EAC solulinjoissa lisännyt apoptoosin

siRNA kohdennettuja surviviinille alensivat ilmentyminen surviviinille OE19 ja OE33 solulinjoissa verrattuna kontrolleihin on qRT-PCR: llä (kuvio 4A). Samoin siRNA inkubaatio johti downregulation Surviviinin ilmentymisen molemmissa solulinjoissa on Western Blot analyysi. Pieneneminen surviviinin ilmentyminen johti ylösajon loppupään apoptoottisen proteiinin, halkaistut PARP. Pilkottiin kaspaasi 3 oli kulunut läpi reaktion PARP, jolloin säätelyä pilkotun PARP (kuvio 4B).

OE19 ja OE33 EAC solulinjat transfektoitiin siRNA ja surviviinin ekspressio analysoitiin ja ohjaimen välillä transfektoituja solulinjoja. Molemmat solulinjat transfektoidaan siRNA osoitti selkeitä esto ja downregulation surviviinispesifisten ilmaisua. B: Western blot siRNA eston surviviinille EAC solulinjassa. siRNA inkuboitiin OE19 ja OE33 solulinjoja estävän surviviinin ilme. p-Actin käytettiin latauskontrollina. Surviviinin vaimentua, kun taas loppupään apoptoottiset proteiinit pilkotaan kaspaasi 3 ja halkaistut PARP oli voimistunut. Säätely loppupäässä apoptoottisten proteiinien osoittaa apoptoosin tapahtuu läpi inkubaation siRNA.

Kliiniset vaikutukset surviviinin yli-ilmentymisen

Kolmekymmentäseitsemän EAC potilailla, joille tehtiin esophagectomy lokalisoitu ruokatorven adenokarsinooma sisällytettiin tutkimus (taulukko 1). Näytteet koostui kolmekymmentä miehillä (81%) ja seitsemän naisilla (19%) ja iät vaihtelevat 44-90 vuotta (keskiarvo = 62,76, sd = 10,94). Vaihe jakelu tutkimuskohortissa perustuu American sekakomitean Cancer (AJCC) syöpä pysähdyspaikan vahvisti 6 potilasta, joilla on vaiheen I sairaus, 13 vaiheen II ja 18 potilasta, joilla on vaiheen III tauti (taulukko 2). Seitsemän potilasta sai neo-adjuvanttihoito ja kahdeksantoista potilasta sai adjuvanttihoitoa leikkauksen jälkeen. Kaksi potilasta neo-adjuvantti ryhmä sai samanaikaista Kemoterapia ja suurin osa potilaista sai platina /fluorourasiilipohjaisen yhdistelmä kemoterapiaa (taulukko 3). Tällä keskimääräinen seuranta +12,06kuukausi, kolmetoista potilaalle kehittyi toistuminen, 12 potilasta, joilla etäpesäkkeenä ja 1 potilas, jolle tuloksia ei ole raportoitu. Niistä 12 potilaasta, joilla etäpesäkkeenä, 3 oli myös paikallisen uusiutumisen. Kymmenen potilasta (77%) oli kuollut aikaan pitkäaikaisen seurannan.

ROC-analyysi osoitti, että kynnys on suurempi tai yhtä suuri kuin 2,85 Keskimääräisen surviviiniperäistä mRNA: n ekspression CASE indikoi kohonnutta riskiä varten etäpesäkkeenä herkkyydellä 0,77, spesifisyys 0,83, ja AUC 0,73 (p 0,05. PPV = 0,71, NPV = 0,87) (kuva 5). Täten potilaalla ilmenee keskimääräinen surviviinin ilmentymistä 2,85 tai suurempi CASE luokiteltiin osaksi riskiryhmään ja ne, joilla ekspressiotasot on alle 2,85 luokiteltiin osaksi alhaisen riskin ryhmään. Vaikka normaali Histologisesti surviviiniperäiset yli-ilmentymisen CASE osoittautui indikaattori etäpesäkkeenä. Surviviinin ilmentyminen kasvainkudoksessa ei korreloinut toistumisen. Luokittelu osaksi korkea ja matala riskiryhmiin käyttämällä kynnys

kasvain

surviviinin ilmentymistä 3,66 ei ennustanut toistumisen (p = 0,55) mutta ei ennustaa kasvua kertoimella kuoleman EAC (kuvattu myöhemmin).

todennäköisyys etäpesäkkeenä määritettiin Surviviinia tasoja ihmisen EAC kasvain ja vieressä squamous epiteelin kudosta. Lisääntynyt surviviini tason viereisissä levyepiteelikarsinooma epiteelikudoksessa määritettiin riskitekijä etäpesäkkeenä (p = 0,02).

Kaplan-Meier selviytymisen dikäyrät korkean ja matalan riskin ryhmään sen perusteella CASE surviviinin ilme. Korkean riskin ryhmässä osoitti yhdistyksen lisääntyneeseen kuolleisuuteen, joskaan korrelaatio ei saavuttanut merkitsevyyttä (p = 0,12, kuva 6). Kaplan-Meier-analyysi kasvaimen surviviinin korkean ja matalan riskin ryhmiin tulokset olivat samanlaiset (p = 0,11).

Kaplan-Meier selviytymisen dikäyrät korkean ja matalan riskin ryhmään perustuen viereisten squamous epiteelin surviviinin CASE ilme. Korkean riskin ryhmässä osoitti yhdistyksen lisääntyneeseen kuolleisuuteen, joskaan korrelaatio ei saavuttanut merkitystä. Kaplan-Meier-analyysi kasvaimen surviviinin korkean ja matalan riskin ryhmiin tulokset olivat samanlaiset (p = 0,11).

Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin tehokkuuden arvioimiseksi surviviinin tasolla sekä CASE ja EAC kasvain kudosnäytteet ennustaa kuolleisuutta. Muita riskitekijöitä otettiin huomioon ikä klo esophagectomy, tupakoinnin (pakkauksissa per vuosi), alkoholin kulutus, ja historia Barrettin (taulukko 4). Tupakointi liittyi suurempi kuolleisuus (p = 0,06) kanssa kertoimella kuolleisuuden ollessa 1.018 enemmän kunkin paketin vuodessa savustettu. Surviviinin ilmentyminen kasvainkudoksessa liittyi lisääntynyt kuoleman riski (p = 0,05). Todennäköisyys potilaan korkean riskin kasvain surviviiniperäisten ryhmä kokee kuolema oli 5,23 kertaa suurempi kuin potilaan luokiteltu matalan riskin ryhmään (p 0,05).

Keskustelu

Tutkimukset ovat osoittaneet korkeampaa surviviinille metaplastiset lieriöepiteeliin ja dysplastic Barrettin epiteeli verrattuna squamous kudosta siten tukee oletusta, että säätelyä tämä geeni on todennäköisesti varhainen tapahtuma edeltävän kehittämisen adenokarsinooma [12]. Raportit ovat myös tuettu surviviinin mahdollisena biomarkkereiden ruokatorven okasolusyöpä [28], mutta on olemassa ristiriitaisia ​​tietoja koskien sen ennustetekijöiden rooli ruokatorven adenokarsinooma [29]. Eräässä tutkimuksessa Rosato ja työtovereiden surviviiniperäiset ilme ei ollut ennusteen arvioinnissa potilaille, joilla EAC. [9] tavoitteena nykyinen oli arvioida rooli tämän antiapoptoottisten geeni syvällisemmin ruokatorven adenokarsinooma ja CASE ottaen huomioon kasvain heterogeenisyys sekä ilmaus geneettisiä muutoksia ennen histologinen osoitus kasvaimen fenotyypin viereisissä epiteelin .

analyysi ihmisen kudoksesta käyttäen IHC, Western blot ja qRT-PCR vahvisti säätelyä surviviinille EAC kasvainkudoksessa verrattuna CASE. Tuloksemme, että kasvanut surviviinin ilmentymistä EAC kasvainkudoksessa on riskitekijä kuolemaan kanssa korkean riskin kasvain surviviiniperäisten ryhmän ollessa 5 kertaa suurempi riski kuolla kuin luokiteltu matalan riskin surviviiniin ryhmä. On mahdollista, että mitä suurempi ilmaisua sisällä EAC kasvainkudoksen voivat koskea aggressiivisuus kasvain (eli paheneminen cellular dysregulation), joten korreloi kuolleisuutta. Kuitenkin perustuu meidän otoskoko, tämä tutkimus on todennäköisesti alimitoitettu ja suurempi joukko potilaita olisi tarpeen tutkia näiden järjestöjen edelleen.

Lisäksi ilmaus surviviinille CASE ollut täysin poissa, kuten voidaan odottaa terminaalivaiheessa eriytetty normaali levyepiteeli [10], [11]. Ottaen huomioon todisteet, jotka osoittavat voimistumista tämän geenin premaligneja metaplastiset ja dysplastic lieriöepiteeliin, meidän tiedot viittaavat siihen, että surviviini yliekspressio voi olla varhainen geneettinen tapahtuma esiintyi histologisesti normaalissa esiintyvät levyepiteelillä ennen kehittämiseen metaplasiaa ja siirtymistä adenokarsinooma. Vaikka limakalvon vieressä kasvaimen väittää levyepiteelikarsinooma erilaistumista, siinä piilee yliekspressio tämän anti-apoptoottisen geenin, joka voisi olla mahdollinen kuljettaja kasvaimen. Vaihtoehtoisesti se voisi olettaisi, että perustuu korrelaatio toistumisen surviviiniperäiset ilmaisun CASE voitaisiin ajatella molekyyli- vastaavan positiivisen marginaalin ja /tai ennustaja etäpesäkkeenä. Jos potilaan surviviini tasoilla CASE edustaa molekyyli- näyttöä siitä, että viereiseen kudokseen on merkkejä maligniteetti, ennuste voi olla huonompi kuin on ennakoitu pTNM luokittelujärjestelmän. Voitaisiin olettaisi, että se, että ei ollut kasvua kuolleisuutta potilailla koholla surviviinille tasoilla CASE voisi edustaa tyypin II virhe toissijainen pienen otoskoon. Suuremmat tutkimukset voivat auttaa selvittämään nämä yhdistykset.

Se, että surviviinin ilmentyminen kasvainten ei korreloinut toistuminen voi olla siitä, että näillä potilailla oli kuollut ennen toistuminen olisi voitu dokumentoitu; Tämä olettamus tukee se, että oli enemmän potilailla, joilla on pitkälle edennyt tauti korkean riskin kasvain ilme ryhmä. Lisäksi on osoituksena aikaisemmista tutkimuksista, kukin kasvain osoittaa merkittävää heterogeenisyys sisäisiin kasvain vaihtelut somaattisista mutaatioista, alleeliset koostumus, tuumorisuppressoriproteiinia ja onkogeenisten säätelyhäiriö [30]. Hallitsevuus useita ainutlaatuisia kloonien näyte kasvainkudoksessa voi johtaa epäjohdonmukaiseen tuloksiin suoritettaessa molekyyli- profilointi tietyn syövän. Esillä olevassa tutkimuksessa kertainen muutos surviviinin mRNA oli erittäin vaihteleva kasvainkudoksessa verrattuna CASE, ja tämä voi olla kasvain heterogeenisyys että mahdollisesti selitys korrelaation puuttuminen tuumorin toistumisen. CASE osoittanut johdonmukaisempi tasoa ja on ehkä parempi substraatti arviointiin surviviinin ennustetyövälineenä merkki potilailla, joilla EAC. Nämä tiedot korostavat tarvetta yhteisiin toimiin pankkiin ja analysoida syöpää vieressä histologisesti normaalilta näyttäviä kudoksen molekyylien profiloinnin EAC ja ehkä muitakin kasvaimia.

Solun viiva analyysi tässä tutkimuksessa vahvistettiin selvä esto surviviinispesifisten kautta transfektion siRNA. Surviviinin tehokkaasti vaimentua ja pilkottiin kaspaasi 3 on reaktiossa kulutettu johtaa säätelyä pilkotun PARP, mikä osoittaa, että inhibitio surviviini johtaa aktivaatioon apoptoottisen reitin. Koska surviviini ole ilmaistu normaalissa kudoksessa, se on mahdollisesti ihanteellinen kohde uusien aineiden [10], [11]. Siksi tehokas esto kautta siRNA alavirran aktivaation apoptoosin tukee pätevyyttä tulevien kliinisten tutkimusten EAC tehokkuuden arvioinnissa uusi aine, joka käyttää siRNA tai muu estävä keinoja [10].

Yhteenvetona tämän tutkimuksen tuet säätelyä surviviini mahdollisena varhainen geneettinen muutos EAC esiintyvät normaalilta näyttäviä CASE. Surviviinispesifisiä ilme sisällä EAC kudos oli merkittävä kuolleisuuden ennustaja, kun ilmentymisen taso surviviinille CASE oli luotettavampi ennustaja kasvaimen uusiutumisen. Lisäksi meillä on myös osoittanut, että esto surviviinille EAC solulinjoissa johtaa säätelyä apoptoosin tukevat tutkitaan tarkemmin hoitostrategioita suunnattu tämä merkki.

rajoitukset Tutkimuksen sisältävät pienen otoksen koon ja suhteellisen lyhytkestoisemmat seuranta. Lisätutkimukset suurempi otoskoko ja pidempään seurata voi auttaa selventämään joitakin yhdistysten totesi tutkimuksissa surviviiniperäisiin ilmaisun EAC ja CASE. Tämä auttaisi myös ohjaus enemmän vaikuttavia tekijöitä toistuminen ja eloonjäämisen potilailla, joilla EAC.

Kiitokset

Tri. James D. Luketich hänen tuestaan ​​tutkimuksen.